Ekologia molekularna. wykład 11

Transkrypt

1 Ekologia molekularna wykład 11

2 Sekwencjonowanie nowej generacji NGS = next generation sequencing = high throughput sequencing = massive pararell sequencing =... Różne techniki i platformy Illumina (MiSeq, HiSeq) Roche 454 ThermoFisher (IonProton, IonTorrent) Next-next generation Oxford Nanopore Pacific Biosciences wykład 11/2

3 Sekwencjonowanie Sangera 2. elektroforeza 1. synteza DNA A C A T C T GCC A T A CGG T T A A C G ACA TC T A A G C T dntp A C T A ddntp A T G T C C T T G C

4 NGS: ogólna idea Sanger 1. wyizolować badany fragment 2. odczytać jego sekwencję NGS 1. pociąć genom na małe kawałki 2. zsekwencjonować (wiele kopii) 3. poskładać biblioteka assembling (mapping) A1 T fragment DNA T A2 tagi (barcody, indeksy) adaptery wykład 11/4

5 Technologia Roche 454 wykład 11/5

6 Technologia Roche Pocięcie DNA na fragmenty dodanie tagów i adapterów połączenie ze złożem (beads) 2. Zawieszenie w emulsji każda kropla zawiera jedną cząsteczkę DNA związaną na kulce (złożu) płyn wokół kulki zawiera odczynniki do PCR PCR w emulsji wiele kopii jednej cząsteczki DNA na złożu wykład 11/6

7 Technologia Roche Napełnianie komory i sekwencjonowanie jedna kulka jedna komórka w komorze synteza DNA na podstawie matrycy związanej ze złożem przyłączenie nukleotydu prowadzi do uwolnienia kwantu światła (lucyferyna lucyferaza) detekcja laserem wykład 11/7

8 Technologia Illumina 1. Pocięcie DNA na małe fragmenty (do 150bp) tagmentancja komora: oligonukleotydy wykład 11/8

9 Nowa nowa generacja 2. Przyczepienie do złoża w komorze i amplifikacja mostkowa 3. Stworzenie klastrów wykład 11/9

10 Technologia Illumina 4. Sekwencjonowanie w klastrze wykład 11/10

11 Technologia Ion Proton / Ion Torrent Detekcja na podstawie zmiany ph (a nie sygnał optyczny) Przyłączenie nukleotydu związane z wydzieleniem jonu H+ wykład 11/11

12 Nowa nowa generacja MinIon Oxford Nanopore bez etapu PCR wykorzystuje transport sekwencjonowanej cząsteczki przez nanopory mierzona jest zmiana natężenia pola elektrycznego wokół porów jednocześnie pomiar 5 nukleotydów wykład 11/12

13 Nowa nowa generacja Pacific Biosciences: SMRT technology sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki 1 cząsteczka polimerazy jest związana na dnie studzienki ZMW fluorescencyjny pomiar wbudowywania nowych nukleotydów objętość reakcji 20 zeptolitrów (20 X 10 21) wykład 11/13

14 Porównanie Sanger Illumina MiSeq 20 genów dł. < 800bp 100 osobników, F i R = zł kilkaset genów 100 osobników = zł fragmenty do 1000bp fragmenty do 200bp długi czas w labie prosta (choć żmudna) obróbka bioinformatyczna krótki czas pracy w labie sporo obróbki bioinformatycznej

15 Output (dane) read odczyt z maszyny (sekwencja fragmentu) coverage średnia liczba readów przypadających na odcinek DNA = rozdzielczość sekwencjonowania genom 5x 10x wykład 11/15

16 Output (dane) $ $ 1 Gb 15 Gb 40 Gb 85 Gb > 90 Gb wykład 11/16

17 Analiza danych z sekwenatora Ekblom & Wolf 2014 wykład 11/17

18 Analiza danych 3Gb xxx x 150bp z genomem referencyjnym x liczba komórek BARDZO DUŻO FRAGMENTÓW bez genomu referencyjnego wykład 11/18

19 Brak genomu referencyjnego: k-mery GTCCTGCGTG CCTGCGTGCC AGTCCTGCGT TCCTGCGTGC TGCGTGCCTA ready AGTCCTGCGT GTCCTGCGTG TCCTGCGTGC CCTGCGTGCC CTGCGTGCCT k-mery AGTCCTGCGTGCCTA contigi AGTCCGTTGAGTCCTGCGTGCCTATCAAAGC scaffolds wykład 11/19

20 Genom referencyjny...agtccgttgagtcctgcgtgcctatcaaagc... CCTATCAAAGC AGTCCGTTGAGTC AGTCCTGCGT GCGTGCCTATC GTCCTGCGTG CCTATCAAAGC TCCGTTAAGT CTATCAAAGC TGAGTCCTGC CTGCGTGCCTATC GTTAAGTCCTGCGT wykład 11/20

21 Błędy sekwencjonowania slajd David Langenberger

22 Genotypowanie SNP xxx wykład 11/22

23 NGS w badaniach ekol-ewol wykład 11/23

24 Zastosowania w genetyce populacyjnej Genomy referencyjne: 4988 eukariontów 16 ryb 2 płazy 10 gadów 53 ptaki 45 ssaków (>1% gatunków) + wiele genomów w stadium draft wykład 11/24

25 Po co nam to? Genomika porównawcza wnioskowanie o przebiegu ewolucji na podstawie zmienności w całym genomie, a nie wybranych genach możliwe badanie fragmentów niekodujących ewolucja specyficzna dla linii ewolucyjnych poszukiwanie fragmentów genomu pod dobrem wykład 11/25

26 RAD-seq Restriction site associated DNA (RAD) markers enzym restrykcyjny mniej informacji więcej osobników, duże pokrycie (coverage) nie trzeba znać genomu referencyjnego adapter ID osobnika odczyt określonej długości (np. 200bp) od miejsca restrykcyjnego wykład 11/26

27 ddrad-seq wykład 11/27

28 RAD-seq: przykłady Filogeografia komara Wyeomyia smithii Klady odpowiadają lokalizacjom geograficznym. Dokładna dywergencja między populacjami rozdzielonymi < lat temu. Nie trzeba zakładać neutralnej ewolucji mikrosatów. Emerson et al. PNAS 2010, 107 wykład 11/28

29 RAD-seq: przykłady Zróżnicowanie genetyczne między populacjami ciernika w Ameryce SNP, 3 populacje słodkowodne, 2 oceaniczne Populacje oceaniczne dały początek słodkowodnym Wykryto obszary pod doborem równoważącym i różnicującym ewolucja równoległa w populacjach słodkowodnych Nucleotide diversity (π) populacje słodkowodne populacje oceaniczne razem heterozygosity (H) population differentiation (FST) tu działa dobór równoważący Hohenlohe et al., PLoS Genet 2010

30 RAD-seq: przykłady wykład 11/30

31 RAD-seq: pułapki CCTGCA^GG AG^CT wykład 11/31

32 RNAseq transkryptom: całe RNA w komórce ale zwykle utożsamiany z mrna wykład 11/32

33 RNAseq: przykłady DGE: differential gene expression 18 % diff expressed genes Pemberton i in., Mol Ecol 2011 transdukcja sygnału metabolizm komórkowy wiązanie białek odp. immunologiczna śmierć komórki wykład 11/33

34 RNAseq Pardwy szkockie zarażone nicieniami Webster et al, Mol Ecol 2011 wykład 11/34

35 Wesołych Świąt! Następne zajecia