Podstawowe strategie i narzędzia genetyki molekularnej

Transkrypt

1 Podstawowe strategie i narzędzia genetyki molekularnej

2 Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro izolacja i amplifikacja DNA i cdna mapowanie i sekwencjonowanie DNA tworzenie nowych cząsteczek DNA przez rekombinację cząsteczek naturalnych przez syntezę de novo wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów modyfikacje syntezy białek ekspresja heterologiczna bioinformatyka

3 Organizmy modelowe Les éléments vitaux étant de nature semblable dans tous les êtres vivants, ils sont soumis aux mêmes lois organiques...!! Podstawowe jednostki życia, mając u wszystkich żyjących istot podobną naturę, rządzone są tymi samymi prawami organicznymi...! Claude BERNARD ( )

4 A co nie jest inżynierią genetyczną? Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

5 Zastosowania Badania podstawowe Biotechnologia! Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

6 Podstawowe techniki Izolacja DNA cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA Chemiczna synteza DNA de novo PCR Klonowanie DNA Mutageneza losowa i ukierunkowana w tym wprowadzanie modyfikacji do genomu Wykrywanie DNA, RNA i białek Sekwencjonowanie

7 Sekwencjonowanie - postęp techniczny Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie razy Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła razy Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne

8 Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe Tzw. deep sequencing, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów Pojedyncze odczyty krótkie ( bp) Zastosowania sekwencjonowanie nowych genomów resekwencjonowanie np. analiza zmienności badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna

9 Genomika Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów Badanie funkcji zawartych w nich genów

10 Metagenomika Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować

11 Metagenomika Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

12 RNA-seq

13 Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGT ATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTT ATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAA AATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTA AATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTAT TTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCT TTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACAT TCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAG TTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCAT AGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTA GTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAG ATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGA TTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAG TATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTT CTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCA CTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGAC ATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACAT CATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATG GTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAG TTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGA TTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTT GTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATA GGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGC TTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTT AAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAAC AGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATA GGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATT GCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTT CTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAA GAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATAT AAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAG ACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATC AGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT Mały fragment chromosomu 21

14 Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna! Funkcja (mutacja, fenotyp)! Gen (z sekwencji całego genomu)!! Klonowanie genu!! Inaktywacja genu!! Analiza sklonowanego genu!! Analiza uzyskanego fenotypu

15 Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację

16 Myszy transgeniczne Wprowadzanie nowych sekwencji do genomu np. geny reporterowe Delecje genów (knock-out) Wprowadzanie mutacji punktowych

17 Myszy knock-out Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty Dawcą jest mysz szczepu białego Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out

18 Myszy knock-out Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy szczepu szarego

19 Myszy knock-out Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES wszczepia się myszy matce zastępczej

20 Myszy knock-out Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej

21 Nagroda Nobla 2007 Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies Za opracowanie zasad wprowadzania specyficznych modyfikacji genowych u myszy za pomocą zarodkowych komórek macierzystych

22 Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA!! Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

23 Ekspresja heterologiczna Wektor ekspresyjny Oczyszczanie białka

24 Fuzje białkowe Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie znaczniki epitopowe GFP (zielone białko fluorescencyjne)

25 Ekspresja heterologiczna w biotechnologii Ludzka insulina z bakterii

26 Inżynieria przeciwciał Humanizowane i rekombinowane przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów!

27 Terapia genowa Zastępująca wprowadzenie genu, którego defekt powoduje chorobę Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji, zwłaszcza dla komórek nie dzielących się Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi (np. SCID gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi choroba Gauchera)! Inaktywująca zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (sirna, modyfikowane oligonukleotydy) Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne leki

28 Biologia molekularna genu - replikacja

29 Funkcje informacji genetycznej Replikacja powielanie genomu, utrzymywanie stabilności genomu Ekspresja Odczytywanie informacji, niezbędne do funkcjonowania komórki Regulowana

30 Materiał genetyczny Bakterie zawierają czynnik transformujący, zdolny do przekazania informacji z martwych bakterii do żywych Frederick Griffiths, 1928

31 DNA Czynnikiem transformującym jest DNA Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty, 1943

32 Materiał genetyczny Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe Materiałem genetycznym organizmów komórkowych jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

33 DNA zbudowany jest z nukleotydów Budowa DNA

34 Zasada komplementarności Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici komplementarnej 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5

35 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA!! RNA!!! BIAŁKO

36 Replikacja Model semikonserwatywny:! w każdej cząsteczce potomnej jedna nić rodzicielska i jedna nowa

37 Inne modele replikacji Rozproszony!!! Semikonserwatywny!!! Konserwatywny

38 Doświadczenie Meselsona i Stahla

39 Doświadczenie Meselsona i Stahla

40 Etapy replikacji Inicjacja Elongacja Terminacja

41 Inicjacja u bakterii Replikacja rozpoczyna się w miejscu ori Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA

42 Inicjacja u Eukaryota

43 Elongacja

44 Replikacja małego genomu kolistego pętla D

45 Replikacja małego genomu kolistego rolling circle

46 Problem topologiczny Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty) W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców

47 Problem topologiczny - topoizomerazy Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce Topoizomerazy typu II nacinają obie nici

48 Synteza DNA - polimeraza Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy OH na końcu 3 syntetyzowanej cząsteczki Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA) Polimeraza DNA potrafi dobudowywać nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy

49 Startery

50 Prymaza U Eukaryota: kompleks pol α: podjednostki prymazy i polimerazy DNA Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża.

51 Aktywności polimeraz DNA Synteza DNA Egzonukleaza 3-5 korekcja błędów Egzonukleaza 5-3 naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

52 Problem nici nieciągłej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki

53 Maszyneria replikacyjna

54 Maszyneria replikacyjna Topoizomeraza - usuwa naprężenia Helikaza (DnaB) - rozdziela nici SSB stabilizuje jednoniciowy DNA Prymaza syntetyzuje startery Polimeraza (-y) Ligaza skleja fragmenty

55 Widełki replikacyjne - topologia

56

57 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen Kompleks białkowy w formie pierścienia przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji Koordynuje różne etapy replikacji i syntezy DNA

58 Inne kompleksy białkowe MCM Mini Chromosome Maintenance pierścień przesuwający się razem z widełkami replikacyjnymi GINS (Go, Ichi, Ni, San; 5,1,2,3) pierścień współdziałający z MCM, przejście z fazy inicjacji do elongacji i utrzymanie elongacji GINS

59 Polimerazy bakteryjne PolIII (PolC) główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3-5 (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s PolIII nie ma aktywności Exo5-3 PolI (PolA) ma dodatkowo aktywność Exo 5-3, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą)

60 Polimerazy bakteryjne c.d. PolII (PolB) naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej! PolIV i polv synteza DNA w fazie stacjonarnej (poliv) i przy znacznych uszkodzeniach genomu (polv)

61 Polimerazy Eukaryota Pol α prymaza, wydłuża startery Pol β naprawa DNA Pol δ główny enzym replikacyjny Pol ε replikacja, kontrola cyklu kom., naprawa DNA Pol γ replikacja DNA w mitochondriach Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5-3, startery RNA usuwają nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka

62 Dwie klasy polimeraz O dużej wierności mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy zatrzymują się w miejscu uszkodzenia standardowe enzymy replikacyjne O niskiej wierności więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy TLS (trans-lesion synthesis) mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu)

63 Rola PCNA Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną

64 Trochę zamieszania Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori

65 Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA? Odkryty w 2013 enzym PrimPol, aktywny w mitochondriach ssaków Jest polimerazą DNA typu TLS Jest w stanie zainicjować syntezę DNA od startera z DNA!!

66 Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori? Szczep Haloferax volcanii (Archaea) pozbawiony wszystkich miejsc ori Rośnie nawet szybciej od dzikiego Inicjacja replikacji przez rekombinację