ELEKTROFOREZA ŻELOWA KOLAGENU

ELEKTROFOREZA ŻELOWA KOLAGENU I. PRZYGOTOWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO DO ELEKTROFOREZY BIAŁEK W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH (SDS-PAGE) Żele poliakrylamidowe do elektroforezy wytwarza się poprzez wolnorodnikową polimeryzację monomerów akryl amidowych, których długie łańcuchy są łączone kowalencyjnie w wyniku działania czynnika sieciującego N,N'-metyleno-bis-akrylamidu. Gęstość żelu zależy od całkowitego stężenia obu składników, natomiast stopień usieciowania zależy od stężenia bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest inicjowana przez wolne rodniki dostarczone przez nadsiarczan amonu i katalizowana przez N,N,N,N -czterometyloetylenodwuaminę (TEMED). Reakcja trwa około 10-20 min, lecz czas ten może różnić się w zależności od stężeń nadsiarczanu amonu i TEMEDu. Polimeryzacja zachodzi bez dostępu tlenu, który jest inhibitorem tej reakcji. Możliwa jest także fotopolimeryzacja, czynnikiem inicjującym reakcję polimeryzacji jest wówczas UV. Akrylamid O O H 2 C CH 2 NH NH N,N'-Metylenodiakrylamid = Bisakrylamid N,N,N,N -czterometylo-etylenodwuamina = TEMED Rys. 1 Chemiczne struktury związków stosowanych do przygotowania żeli poliakrylamidowych. 1

SO 4 : + n H 2 C O NH 2 H 2 N O CH 2. CH 2. O NH 2 O NH 2 n Rys.2 Polimeryzacja bez udziału bisakrylamidu. Rys. 3 Polimeryzacja z udziałem bisakrylamidu. 2

Wielkość por w żelu poliakrylamidowym zależy od procentowej zawartości akrylamidów. Zwiększenie procentowości żelu prowadzi do zmniejszenia wielkości porów. Jeśli chcemy rozdzielić fragmenty charakteryzujące się szerokim zakresem wielkości, można zastosować żel gradientowy. W takim żelu wielkość porów jest większa u góry (przy studzienkach), zmniejszając się gradientowo w kierunku do dołu żelu. Elektroforezę białek w żelu poliakrylamidowym zazwyczaj prowadzi się w wersji dwuwarstwowej (górna, stosunkowo wąska warstwa żel zagęszczający i dolana, szersza warstwa żel rozwijający). Obie warstwy różnią się stężeniem akrylamidu, siłą jonową buforu i jego ph. Uwaga: Akrylamidy niespolimeryzowane są neurotoksyczne, efekt toksyczny ma charakter kumulatywny, tzn. objawy patologiczne mogą wystąpić po wielu latach niewielkiej, ale systematycznej ekspozycji, należy więc unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi!!! CZĘŚĆ I. PRZYGOTOWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM DO ELEKTROFOREZY BIAŁEK W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH (SDS-PAGE) Materiały Płytka szklana wewnętrzna o wymiarach Płytka szklana z przekładkami (spacer ami) Ramka do płytek Uszczelka sylikonowa so statywu Statyw Grzebień teflonowy Zlewki do przygotowania żeli Odczynniki chemiczne: Roztwór akrylamid : N, N-metyleno-bisakrylamid (37,5 : 1 ) Woda 2x dejonizowana 3

10% roztwór SDS (dodecylo siarczan sodu) 10% roztwór APS (nadsiarczan amonu) 1.5 M bufor Tris-HCl (ph 8.8) 0,5 M bufor Tris-HCl (ph 6.8) TEMED - N, N, N, N - tetrametyloetylenodiamina Przygotowanie żelu poliakrylamidowego SDS-PAGE - Wykonanie 1. Starannie umyć szybki detergentem (płyn do mycia naczyń, roztwór SDS), osuszyć czystym ręcznikiem papierowym i przetrzeć wewnętrzne powierzchnie szybek etanolem lub denaturatem. 2. Ustaw płytkę z krawędziami zgodnie z oznaczeniem up i włóż złożone ze sobą płytki do ramki do wylewania żelu, tak, aby krótsza płytka znalazła się od strony zacisków ramki. Uwaga: Płytki muszą być ułożone równolegle do siebie. 3. Zabezpieczone w ramce do wylewania żelu płytki umieść w statywie z dopasowaną uszczelką. 4. Sporządzić roztwór żelu rozdzielającego (wg Tabeli 1). Polimeryzacja zaczyna się, gdy w mieszaninie znajdują się nadsiarczan amonu i TEMED, dlatego należy je dodawać na końcu. Tabela 1. Składniki żelu rozdzielającego, całkowita objętość 10 ml. % żelu H2O [ml] Akrylamid/ Bis [ml] 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 [ml] 10% SDS [ml] TEMED [µl] 10% APS [µl] 5% 5,7 1,7 2,5 0,1 5 50 8% 4,7 2,7 2,5 0,1 5 50 10% 4,1 3,2 2,5 0,1 5 50 12% 3,4 4,0 2,5 0,1 5 50 5. Przy pomocy pipety wlać żel rozdzielający (4-5 ml). Wyrównać powierzchnie żelu przez kołysanie. 6. Warstwę żelu rozdzielającego zalać wodą (zabezpieczy przed wysuszeniem powierzchni żelu i przyspieszy polimeryzację. 4

7. Sporządzić roztwór żelu zagęszczającego (wg Tabeli 2). Tabela 1. Składniki żelu zagęszczającego, całkowita objętość 5 ml. % żelu H2O [ml] Akrylamid/ Bis [ml] 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 [ml] 10% SDS [ml] TEMED [µl] 10% APS [µl] 5% 2,85 0,85 1,25 0,05 5 25 8% 2,35 1,85 1,25 0,05 5 25 10% 2,05 1,6 1,25 0,05 5 25 8. Po zakończeniu polimeryzacji żelu rozdzielającego (około 30 min) wylać wodę i odsączyć jej resztki przy pomocy ligniny lub ręcznika papierowego. 9. Przy pomocy pipety wlać żel zagęszczający (ok. 1.5 ml), umieścić grzebień teflonowy w żelu tak aby leązł równolegle z brzegiem krótszej płytki szklanej. Pozostaw na około 20 30 minut, aby żel spolimeryzował. 10. Po zakończeniu polimeryzacji żelu zagęszczającego wyjąć grzebień, zdjąć żel (tzn. żel z szybami pomiędzy którymi się znajduje) z ramki do wylewania i żel wraz z płytkami umieścić w ramce wewnętrznej. Zamknąć płytki z żelem w ramce, używając przystosowanych do tego zacisków. 11. Przepłukać studzienki wodą i odsączyć resztki wody ligniną lub ręcznikiem papierowym. II. ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH. DETEKCJA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM ELEKTROFOREZA POLIAKRYLAMIDOWA BIAŁEK W WARUNKACH NATYWNYCH (ELEKTROFOREZA NATYWNA) Elektroforeza pozwala na rozdzielanie białek ze względu na ich gęstość ładunku, w tym przypadku ruchliwość elektroforetyczna składników próbki zależy zarówno od ładunku molekuł, jak i ich masy. Bufory użyte podczas elektroforezy natywnej pozwalają na utrzymanie białek w stanie niedenaturowanym. Enzymy po elektroforezie zachowują swoją aktywność. Elektroforeza natywna jest używana głównie do określenia czystości białek np. oznaczenia czystości preparatyki enzymów. W elektroforezie natywnej białek używa się nieciągłego 5

systemu buforowego. Stosowane są dwa żele zagęszczający o niższym stężeniu akrylamidów i niższym ph, oraz rozdzielający o mniejszych porach (wyższe stężenie akrylamidów) i wyższe ph. Rozwiązanie to, stosowane także w żelach denaturujących, umożliwia uzyskanie zagęszczenia preparatu na styku żeli i migracji białek w żelu rozdzielającym w postaci ostrych prążków. ELEKTROFOREZA POLIAKRYLAMIDOWA BIAŁEK W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH (SDS-PAGE) Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest użyteczną i powszechnie stosowaną metodą rozdzielania i charakterystyki białek. Jest to stosunkowo prosta i szybka technika. Na jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie analizę wielu próbek, a rozdzielone białka można skutecznie wykrywać w żelu np. metodami barwienia, immunoprecypitacji czy autoradiografii. Można więc stosować tę technikę na przykład przy analizie białek we frakcjach zbieranych w trakcie rozdzielania na kolumnie chromatograficznej. W SDS-PAGE stwarza się warunki, w których wszystkie składniki próbki mają ten sam ładunek; ich ruchliwość jest więc jedynie funkcją mas cząsteczkowych (SDS-PAGE). Użycie anionowego detergentu soli sodowej kwasu dodecylosiarkowego (SDS ang. Sodium Dodecyl Sulfate) pozwala na rozdzielenie elektroforetytczne białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, który łączy się z białkami specyficznie w stosunku masowym 4,1:1. Zapewnia to przejęcie przez białko ujemnego ładunku elektrycznego netto o stałej gęstości bez względu na jego długość. Dla całkowitego rozwinięcia polipeptydu i zapewnienia mu pierwszorzędowej struktury, niezbędne jest dodatkowo zniszczenie mostków dwusiarczkowych (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Opłaszczenie białka przez SDS oraz redukcja mostków dwusiarczkowych pozwalają na separację białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich wielkość, a zatem pośrednio masę cząsteczkową. Szybkość migracji w SDS-PAGE nie jest determinowana przez ładunek elektryczny białka zależny od ph i konformacji białka. Dzięki możliwości rozdzielenia białek na podstawie ich wielkości możemy oznaczyć masę cząsteczkową nieznanego białka, porównując jego położenie w żelu w stosunku do innych białek (tzw. białek wzorcowych) po zakończonej migracji i wybarwieniu. 6

BARWIENIE I DOKUMENTACJA Ukończenie rozdzielania elektroforetycznego nie kończy procedury. Większość białek i kwasów nukleinowych nie jest widoczna w świetle białym. Niezbędne jest ich wybarwienie (wizualizacja) w żelach lub na membranach, tak aby uzyskać informację o dystansie ich migracji i ich ilości w prążku. Stosowanych jest wiele metod wizualizacji żeli i membran. Białka najczęściej wybarwia się stosując naturalne barwniki, takie jak błękit kumassi (ang. Coomassie Brilant Blue) czy czerń amidową. Barwnik dodawany jest zwykle do roztworu utrwalającego położenie białka w żelu (denaturacja i unieruchomienie molekuł), po czym nadmiar barwnika jest wymywany. Pozostaje tylko barwnik związany z białkami. Czułość takiej detekcji białek jest stosunkowo dobra. Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku. Znacznie bardziej czułą metodą jest barwienie srebrem. Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. Przy pomocy srebra można również wybarwić kwasy nukleinowe oraz oligonukleotydy, a czułość detekcji zbliżona jest również do 10 ng DNA na prążek. Rys. 4. Przykładowe rozdzielenie białek w żelu poliakrylamidowym przedstawiono na rysunku. Żel barwiono Coomassie Brilliant Blue R-250. Najprostszą formą dokumentacji rozdzielonych w procesie elektroforezy w żelach poliakrylamidowych składników jest ich wysuszenie pomiędzy warstwą bibuły i celofanu lub pomiędzy dwoma warstwami celofanu. Wysuszony w ten sposób żel można przechowywać dowolnie długo bez widocznego uszczerbku w jakości tego dokumentu. Żele poliakrylamidowe przygotowane na folii można suszyć bez okrywania celofanem. Trudności pojawiają się wtedy, gdy trzeba wysuszyć żel o zawartości akrylamidu powyżej 15%. Odwodnienie żelu powoduje silne jego obkurczenie i w rezultacie pękanie. Można temu przeciwdziałać wypierając z żelu 7

wodę przez dodanie glicerolu. Żele takie pozostają jednak nieco lepkie i muszą być okryte folią. Żele agarozowe nie poddają się jednak tej formie dokumentowania. Najprostszym sposobem utrwalenia informacji zawartej w żelu agarozowym jest sporządzenie jego fotografii lub skanu. Technikę tę można zastosować również do żeli poliakrylamidowych. Od kilku lat do dokumentacji rozdziałów elektroforetycznych stosuje się z powodzeniem kamery cyfrowe, a uzyskany obraz przechowywany jest w formie elektronicznej w pamięci komputera lub na innych nośnikach pamięci. Kamery cyfrowe pozwalają na uzyskanie i przetworzenie obrazu żeli i membran wizualizowanych barwieniem, z zastosowaniem znaczników fluorescencyjnych. KOLAGEN Kolagen jest szeroko rozpowszechnionym białkiem, stanowiącym główny składnik większości tkanek łącznych u ssaków, pełniącym funkcje strukturalne. Będąc najważniejszym składnikiem zewnątrzkomórkowej macierzy jest dla skóry białkiem kluczowym, odpowiadającym za jej elastyczność i wytrzymałość. Do białek kolagenu zalicza się 28 typów, zbudowanych z co najmniej 46 różnych łańcuchów polipeptydowych. Wspólną cechą strukturalną kolagenów jest obecność potrójnej spirali, której zawartość w poszczególnych typach waha się od 96% do 10%. Ze względu na swoje właściwości biologiczne jest powszechnie stosowany w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym oraz medycynie estetycznej. CZĘŚĆ II Materiały Aparat do elektroforezy (moduł elektrody + ramka zewnętrzna + mini tank + pokrywa) Zasilacz prądu stałego Pipety automatyczne Probówki typu Eppendorff 0,5 ml Łopatka do usuwania żelu z płytki Naczynia do wybarwiania żeli 8

Odczynniki chemiczne Marker białek firmy Life Technologies Ekstrakty białek kolagenu Bufor redukujący z SDS do barwienia i denaturacji próbek (62,5 mm Tris-HCl ph 6,8; 25% glicerol; 2% SDS; 0,05% błękit bromofenylowy; 2-merkaptoetanol 5%) Bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE ( Tris-base; glicyna; SDS) Bufor Tris/HCl 0,5M ph = 10 Roztwór barwiący (100 ml) 50 ml metanolu 10 ml lodowatego kwasu octowego 0.25 g Coomassie blue R-250 40 ml wody Roztwór odbarwiający (1000 ml) 300 ml metanolu 100 ml lodowatego kwasu octowego 600 ml wody Czułość: do 0.1 μg Zaletą metody jest prostota wykonania i niezawodność. Wadą jest niewielka relatywnie czułość. Wymagane środki ostrożności W trakcie wykonywania ćwiczenia student powinien nosić odzież ochronną. Roztworów nie należy wdychać i pipetować ustami. Identyfikacja zagrożeń (Klasyfikacja zgodnie z dyrektywami UE 67/548/EWG lub 1999/45/WE): Akryloamid - T Produkt toksyczny R25, R48/23/24/25, R45, R46, R62; Xn Produkt szkodliwy R20/21; Xi Produkt drażniący R36/38, R43 Nadsiarczan amonu - O Produkt utleniający R 8; Xn Produkt szkodliwy R22; Xi Produkt drażniący R36/37/38, R42/43 TEMED - F Produkt wysoce łatwopalny R11; C Produkt żrący R34; Xn Produkt szkodliwy R20/22 9

2-merkaptoetanol - T, N Produkt toksyczny, Produkt niebezpieczny dla środowiska R23/24/25, R38, R41, R43, R48/22, R50/53 Metanol F, T Produkt wysoce latwopalny, Produkt toksyczny R11, R23/24/25, R39/23/24/25 Kwas octowy Latwopalna ciecz i pary, R10, C, R35 Pierwsza pomoc: - w razie kontaktu ze skórą: spłukać dużą ilością wody. - w razie kontaktu z oczami: przepłukać dużą ilością wody, przy szeroko otwartej powiece. - jeżeli osoba poszkodowana oddycha, przenieść na świeże powietrze. Jeżeli osoba poszkodowana nie oddycha, zastosować sztuczne oddychanie. Zasięgnąć porady medycznej. - w przypadku wystąpienia podrażnień skontaktować się z lekarzem. - w razie spożycia: przepłukać usta wodą. Dokładne instrukcje postępowania są zawarte w dołączonych kartach charakterystyk substancji. Wykonanie Rozdzielanie elektroforetyczne białek w żelu poliakrylamidowym: 1. W celu wykonania rozdzielenia elektroforetycznego należy umocować żel (znajdujący się pomiędzy szybkami) w ramce wewnętrznej z zaciskami, tak żeby okienko do wprowadzania próbek znajdowało się od wewnętrznej strony górnej części aparatu. Krawędź szybki z przekładkami powinna znajdować się na równi z krawędzią górnej części aparatu. Niestaranne przymocowanie szybek z żelem do aparatu może powodować przelewanie buforu elektroforetycznego z górnej części aparatu do dolnej oraz może być przyczyną nierównego rozdzielenia elektroforetycznego. 2. Po przeciwnej stronie aparatu należy w analogiczny sposób zamontować drugi żel lub samą szybkę, stanowiącą w drugim przypadku zaporę dla buforu znajdującego się w górnej komorze. Górną część aparatu z przymocowanymi żelami należy umieścić w dolnej komorze (mini tank). 3. Następnie należy nalać bufor elektroforetyczny do obydwu komór, w taki sposób, aby bufor ten dochodził do górnej i dolnej krawędzi żelu, wypełnił studzienki, umożliwiając w ten sposób przepływ prądu (obwód zamknięty). 4. Ekstrakty kolagenu z próbek tkanek dla każdego ze stężeń kwasu octowego należy zmieszać z odpowiednią ilością buforu redukujacego (95 µl buforu denaturującego + 5 µl MeSH) do nanoszenia białek oraz buforem stabilizującym ph próbki Tris/HCl 1 0

(przygotowanie próbki: ekstrakt ze skóry kurczaka 15 µl, bufor denaturujący 10 µl, bufor Tris/HCl 10 µl). Bufor redukujacy powoduje denaturację białek, nadaje białkom wypadkowy ładunek ujemny, obciąża próbkę, dzięki czemu łatwo można ją nanieść do studzienek żelu oraz zawiera barwnik umożliwiający kontrolę postępu elektroforezy. 5. Podłączyć elektrody do zasilacza. 6. Włączyć zasilacz i ustawić napięcie o wartości 150 V w czasie 60 minut. 7. Po zakończonej elektroforezie białek, odłączyć aparat do elektroforezy od prądu i wyciągnąć ramkę wewnętrzną z żelami. 8. Wyciągnąć żele z ramki wewnętrznej. 9. Delikatnie odrzucić mniejszą szybkę. 10. Za pomocą łopatki zsunąć żel z płytki szklanej i umieścić żel w roztworze barwiącym. 11. Żel w roztworze barwiącym inkubować przy delikatnym kołysaniu przez 30-60 min lub dłużej w celu zwiększenia czułości detekcji. 12. Zlać roztwór barwiący (można wykorzystać do kolejnych barwień), odmyć resztki roztworu barwiącego wodą destylowaną, zalać roztworem odbarwiającym. 13. Inkubować 2-16 h przy delikatnym kołysaniu. Wymiana roztworu odbarwiającego przyspiesza i poprawia jakość detekcji. 14. Umieścić żel w wodzie. Żele mogą być przechowywane przez czas praktycznie nieokreślony w wodzie bez utraty intensywności prążków, ale przy dłuższym przechowywaniu w wodzie pęcznieją. Aby zapobiec pęcznieniu można dolać 20 glicerolu. Przechowywanie w buforze odbarwiającym prowadzi do osłabienia intensywności prążków. 15. W celu trwałej archiwizacji żel przełożyć do przezroczystej folii i zeskanować. Przyspieszenie odbarwiania: - częsta zmiana buforu - inkubacja w temperaturze do 45 C - dodanie kawałka gąbki pochłaniającego kumarynę. Sprawozdanie W sprawozdaniu z wykonanych ćwiczeń należy umieścić krótki wstęp teoretyczny, zawierający informacje o podstawowej technice elektroforezy, jak również, informacje o innych 1 1

modyfikacjach tej metody oraz o metodach barwienia białek w żelach poliakrylamidowych. Podać cel ćwiczenia i opisać poszczególne jego etapy. Przeprowadzić analizę żelu (umieścić zdjęcie żelu wraz z opisem). Zmierzyć drogę migracji poszczególnych białek wzorcowych. Odczytać wartości mas cząsteczkowych nieznanych białek. Przeprowadzić dyskusję wyników i podać wnioski. Literatura 1. "Techniki elektromigracyjne - teoria i praktyka" [Red.] Buszewski B., Dziubakiewicz E., Szumski M., Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2012, ISBN 978-83-925269-9-5. 2. Berg J.M, Tymoczko J.L, Stryer L. (2005) Biochemia. (według V wyd. amerykańskiego) Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 3. Jóźwiak Z., Bartosz G. Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami. PWN (2007) 4. http://www.kucharczyk.com.pl/ (Przepisy i porady) 5. D. Żelaszczyk, A. Waszkiewicz, H. Marona, Kolagen - struktura oraz zastosowanie w kosmetologii I medycynie estetycznej, Estetol Med Kosmetol 2012; 2(1): 14-20 1 2