MARTA B. WIŚNIEWSKA AUTOREFERAT

Transkrypt

1 MARTA B. WIŚNIEWSKA AUTOREFERAT Aktywność czynnika transkrypcyjnego β-katenina~lef1/tcf w neuronach występowanie, regulacja, geny docelowe, hipotetyczna funkcja Spis treści strona 1. Imię i nazwisko Dyplomy i stopnie naukowe Zatrudnienie w jednostkach naukowych Dorobek publikacyjny przed uzyskaniem stopnia doktora A. Praca magisterska tytuł i lista publikacji 3 4.B. Praca doktorska tytuł i lista publikacji 3 5. Omówienie dorobku publikacyjnego ze stażu podoktorskiego A. Tytuł i lista publikacji 4 5.B. Problematyka i cel badawczy 4 5.C. Podsumowanie wyników 6 6. Osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) 6.A. Tytuł osiągnięcia 9 6.B. Lista publikacji 9 6.C. Problematyka i cele badawcze 10 6.D. Opis i dyskusja wyników 13 6.E. Podsumowanie, wnioski i znaczenie badań Udział w innych projektach tytuły i lista publikacji... 23

2 1. Imię i nazwisko Marta B. Wiśniewska 2. Dyplomy i stopnie naukowe Magister biologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego; praca magisterska wykonana pod opieką Prof. Piotra Węgleńskiego w Zakładzie Genetyki; Doktor biologii ze specjalnością biologia molekularna, Instytut im. M. Nenckiego PAN w Warszawie; praca wykonana pod opieką Prof. Bożeny Kamińskiej w Pracowni Regulacji Transkrypcji 3. Zatrudnienie w jednostkach naukowych Asystent w Pracowni Regulacji Transkrypcji Instytutu im. M. Nenckiego PAN w Warszawie; realizacja pracy doktorskiej; Postdoc w Instytucie Pasteur a w Paryżu; praca pod kierunkiem Prof. Moshe Yaniv'a i Dr. Jonathana B. Weitzman a w Pracowni Ekspresji Genów i Patologii (Unité d Expression Génétique et Maladies); staż podoktorski; Badacz w Laboratorium Neurodegeneracji kierowanym przez Prof. Jacka Kuxnickiego w Międzynarodowym Instytutucie Biologii Molekularnej i Komórkowej (MIBMiK) w Warszawie; realizacja pracy habilitacyjnej; Adiunkt, kierownik Laboratorium Neurobiologii Molekularnej w Centrum Nowych Technologii Uniwersytetu Warszawskiego (CeNT-UW) 2

3 4. Dorobek publikacyjny przed uzyskaniem stopnia doktora 4.A. Praca magisterska - tytuł i lista publikacji Klonowanie i wstępna charakterystyka genu OtaA z Aspergillus nidulans 1. Dzikowska A, Swianiewicz M, Talarczyk A, Wisniewska M, Goras M, Scazzocchio C, Weglenski P; Cloning, characterisation and regulation of the ornithine transaminase (otaa) gene of Aspergillus nidulans; Curr Genet 1999, 35: B. Praca doktorska - tytuł i lista publikacji Regulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego NFAT w czasie apoptozy tymocytów indukowanej glukokortykoidami in vivo 2. Kaminska B, Mosieniak G, Wisniewska M; Współdziałanie czynników transkrypcyjnych AP-1 i NFAT w procesie regulacji eksprsji genów (Cross-talk between Transcription Factors AP-1 and NFAT in the regulation of gene expression); Postępy Biochemii 1996, 42: ; artykuł przeglądowy po polsku; 3. Wisniewska M, Stanczyk M, Grzelakowska-Sztabert B, Kaminska B; Nuclear Factor of Activated T cells (NFAT) is a possible target for dexamethasone in thymocyte apoptosis; Cell Biol Int 1997, 21: ; 4. Kaminska B, Pyrzynska B, Ciechomska I, Wisniewska M; Modulation of the composition of AP-1 complex and its impact on transcriptional activity; Acta Neurobiol Exp 2000, 60: ; artykuł przeglądowy; 5. Wisniewska M, Pyrzynska B, Kaminska B; Impaired AP-1 dimers and NFAT complex formation in immature thymocytes during in vivo glucocorticoid-induced apoptosis; Cell Biol Int 2004,28:

4 5. Omówienie dorobku publikacyjnego ze stażu dokotorskiego 5.A. Tytuł i lista publikacji Współdziałanie czynników transkrypcyjnych AP-1 i NFAT w regulacji ekspresji genów kodujących cytokiny w limfocytach T 6. Bakiri L, Matsuo K, Wisniewska M, Wagner EF, Yaniv M; Promoter specificity and biological activity of tethered AP-1 dimer; Mol Cell Biol 2002, 22: ; IF 9,84; 7. Ameyar M, Wisniewska M*, Weitzman JB; A role for AP-1 in apoptosis: the case for and against; Biochimie 2003, 20085: ; artykuł przeglądowy napisany na zaproszenie, IF 3.30; 8. Ameyar-Zazoua M, Wisniewska MB, Bakiri L, Wagner EF, Yaniv M, Weitzman JB; AP-1 dimers regulate transcription of the p14/p19arf tumor suppressor gene; Oncogene 2005, 24: ; IF 6.31; 9. Wisniewska MB**, Ameyar-Zazoua M, Bakiri L, Kaminska B, Yaniv M; Weitzman JB; Dimer composition and promoter context contribute to functional cooperation between AP-1 and NFAT; J Mol Biol 2007, 371: ; IF 4.89 * równy udział wszystkich autorów ** autor korespondencyjny 5.B. Problematyka i cel badawczy AP-1 (ang. Activator Protein) jest dimerycznym czynnikiem transkrypcyjnym, w skład którego wchodzą dwa białka JUN lub białko JUN i FOS [Ameyar i wsp., Oncogene 2003], ewentualnie białko JUN i ATF2 [van Dam & Castellazzi, Oncogene 2001], MAF [Kerppola & Curran, Oncogene 1994] lub BATF [Williams i wsp., Eur J Immunol 2001]. U ssaków występują trzy białka JUN: JUN (cjun), JUNB, JUND, i cztery białka FOS: FOS (cfos), FOSB, ΔFOSB, FOSL1 (FRA1) i FOSL2 (FRA2). Tworzenie się kompleksu AP-1 zachodzi poprzez dimeryzację α- helikalnych struktur suwaków leucynowych (ang. leucin zipper) podjednostek białkowych, na skutek oddziaływania równomiernie rozłożonych reszt leucynowych. AP-1 oddziałuje bezpośrednio ze specyficzną sekwencją TRE (ang. TPA Responsive Element) poprzez domenę zasadową (ang. basic domain) bogatą w leucyny i argininy. Ściśle rzecz biorąc, nie ma jednego czynnika AP-1, ale ponad 20 różnych dimerów AP-1. Dimery AP-1 mogą różnić się od 4

5 siebie wieloma parametrami, ale wszystkie rozpoznają tę samą sekwencję DNA, z powodu dużego podobieństwa w obszarze domen zasadowych podjednostek JUN i FOS. Białka JUN i FOS zaliczane są do grupy onkogenów, ponieważ ich nadmierna aktywność prowadzi do wzmożonej proliferacji komórek i transformacji nowotworowej [Angel & Karin, Biochim Biophys Acta 1991]. W warunkach fizjologicznych AP-1 aktywowany jest przez sygnały zewnątrzkomórkowe takie jak mitogeny, a także w odpowiedzi na stres komórkowy [Wisdom, Exp Cell Res 1999]. Aktywacja AP-1 zachodzi przez syntezę de novo i fosforylację [Karin, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1996; Lallemand i wsp., Oncogene 1997]. Ta ostatnia dotyczy przede wszystkim białka JUN, fosforylowanego przez kinazę JNK (ang. cjun N- terminal Kinase) należącą do kinaz MAP (ang. Mitogen Activated Protein kinases). Dodatkowo AP-1 może współdziałać z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, w szczególności z NFAT (ang. Nuclear Factor of Activated T cells), który wiąże się z DNA w kompleksie z AP-1 [Kaminska i wsp., Postępy Biochemii 1996; Rao i wsp., Annu Rev Immunol 1997]. Pierwszymi odkrytymi białkami dimeru AP-1 były FOS i JUN, a właściwie ich zmutowane formy vfos i vjun, sklonowane z wirusów wywołujących mięsaka odpowiednio u myszy i ptaków [Curran i wsp., Mol Cell Biol 1983; Maki i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 1987] i zdolne do pobudzenia proliferacji i transformacji nowotworowej komórek, jak już wspomniano. Wkrótce sklonowano kolejne białka z tej rodziny. W latach 90-tych stwierdzono, że AP-1 nie tylko indukuje proliferację, ale uczestniczy także w różnicowaniu komórek [Wang i wsp., Nature 1992; Lord i wsp., Mol Cell Biol 1993] i apoptozie [Ham i wsp., Neuron 1995; Bossy- Wetzel i wsp., EMBO J 1997; Weitzman i wsp., Mol Cell 2000]. Tym samym obraz roli czynnika AP-1 bardzo sie skomplikował. Białka JUN/FOS nie mogły już być traktowane jedynie jako czynniki onkogenne. Ponadto zdano sobie sprawę, że poszczególne białka z tej rodziny wywierają na komórki różny wpływ. Do tych odkryć przyczynił się miedzy innymi zespół prof. Yaniva, do którego dołaczyłam w 2001 roku, po uzyskaniu stopnia doktora. W Laboratorium Wirusów Onkogennych sklonowano gen Jund [Hirai i wsp., EMBO J 1989] i stworzono pozbawione go myszy [Thepot i wsp., Development 2000]. Stwierdzono, że JUND, w przeciwieństwie do białka JUN, blokuje proliferację fibroblastów indukowaną dodaniem surowicy i hamuje transformację nowotworową wywoływaną białkiem RAS [Pfarr i wsp., Cell 1994], a także chroni fibroblasty przed apoptazą wywoływaną UV i stresem cytotoksycznym [Weitzman i wsp., Mol Cell 2000]. 5

6 W czasie kiedy dołączyłam do zespołu prof. Yaniva, w środowisku badaczy zajmujących się AP-1 stawiano pytanie o specyficzność działania różnych białek JUN i FOS [Kaminska i wsp., Acta Neurobiol Exp 2000; Mechta-Grigoriou i wsp., Oncogene 2001]. Moje zainteresowania także kierowały się w tę stronę. Za cel badawczy postawiłam sobie określenie wpływu podjednostkowego składu dimeru AP-1 na jego współdziałanie z czynnikiem transkrypcyjnym NFAT w regulacji ekspresji cytokin w limfocytach T. 5.C. Podsumowanie wyników AP-1 czynnik pro- czy antyapoptyczny? (artykuł przeglądowy, nr 7) W związku z zaangażowaniem Laboratorium w badanie roli AP-1 w apoptozie i przeżywaniu komórek wraz z dr. Weitzmanem i dr Ameyar-Zazouą otrzymaliśmy propozycję napisania artykułu przeglądowego na ten temat [Ameyar-Zazoua i wsp., Biochimie 2003]. Postanowiliśmy pokazać, że AP-1 nie zawsze jest aktywatorem tego procesu, jak się do niedawna wydawało, ale może też promować przeżywanie komórek. Przeanalizowaliśmy pod względem udziału AP-1 trzy przypadki apoptozy: śmierć neuronów pozbawionych czynników wzrostowych, śmierć zależną od receptora Fas i jego liganda FasL, i w końcu apoptozę hepatocytów (tutaj właściwie dwa typy apotozy rozwojową i indukowaną przez lipopolisacharydy imitujące sepsę). W mojej części artykułu przedstawiłam niejasności dotyczące roli AP-1 w apoptozie zależnej od systemu Fas/FasL. Receptor Fas, zwany też receptorem śmierci, obecny jest na błonie większości komórek, a jego aktywność ujawnia się dopiero po związaniu liganda, błonowego białka FasL [Krammer, Nature 2000]. Wtedy dochodzi do aktywacji kaspaz, które przeprowadzają proces samobójczej śmierci. Ekspresja FasL aktywowana jest przez różnorodne czynniki stresowe, takie jak UV, promieniowanie γ, stres genotoksyczny czy szok cieplny, a także w apoptozie indukowanej aktywacją (AICD, ang. Activation Induced Apoptosis) obwodowych limfocytów T. Szereg badań in vitro pokazało krytyczny udział kinaz JNK i AP-1 w indukcji apoptozy zależnej od FasL i w samej aktywacji promotora FasL [Kasibhatla i wsp., Mol Cell 1998; Matsui i wsp., J Immunol 2000; Kolbus i wsp., Mol Cell Biol 2000]. Jednakże w przypadku AICD limfocytów T, która jest głównym mechanizmem kontrolowania populacji tych komórek, udział JNK był wątpliwy. W doświadczeniach in vitro ekspresja dominującego negatywnego (DN) mutanta JUN lub DN- JNK hamowała AICD w liniach limfocytów T [Zhang i wsp., J Exp Med 2000; Baumann i wsp., 6

7 Oncogene 2003]. Z kolei w badaniach homeostazy komórek T in vivo, na myszach z nadekspresja DN-JNK lub delecją JNK2, kwestia AICD dojrzałych limfocytów T została pominięta lub wspomniano negatywne wyniki [Rincon i wsp., J Exp Med 1998; Sabapathy i wsp., Curr Biol 1999]. Dopiero całkiem niedawno powrócono do tego tematu badając limfocytarne białko BATF, które jest partnerem JUN i uważane jest za inhibitor aktywności AP-1 [Williams i wsp., Eur J Immunol 2001]. U myszy z nadekspresją BATF rozwija się choroba limfoproliferacyjna, prawdopodobnie na skutek zaburzenia apoptozy limfocytów T [Logan i wsp., Cell Death Dis 2012]. Odkrycie to otwiera nową perspektywę badania roli AP-1 w regulowaniu wielkości populacji limfocytów T, w tym AICD. Podsumowując nasze rozważania stwierdziliśmy, że AP-1 może wywierać zarówno projak i anty-apoptyczny efekt, działając w różnym kontekście komórkowym, a także postawiliśmy tezę, że działanie poszczególnych białek JUN i FOS lub ich kombinacji może być różne czy wręcz przeciwne. Duża liczba cytowań naszej pracy przeglądowej (79) świadczy o jej dobrym odbiorze i o wpływie, jaki wywarła na sposób widzenia regulacji procesów komórkowych przez czynnik AP-1. Różnicowa regulacji ekspresji cytokin przez dimery AP-1 i NFAT (artykuły nr 6, 8, 9) Na poczatku mojej współpracy z prof. Yanivem uczestniczyłam w przygotowaniu nowego narzędzia molekularnego, które miało umożliwić rozróżnianie funkcji poszczególnych dimerów AP-1. Narzędziem tym były konstrukty DNA kodujące dwa białka z rodziny JUN lub białka JUN i FOS, przedzielone 18-aminokwasowym linkerem bogatym w reszty glicynowe. Te jednołańcuchowe dimery AP-1 wykazywały zarówno specyficzność wiązania z DNA jak i potencjał transaktywacyjny podobny naturalnym dwubiałkowym dimerom AP-1 [Bakiri i wsp., Mol Cell Biol 2002]. Przygotowałyśmy 19 różnych dimerów AP- 1. Narzędzia tego użyliśmy w badaniu regulacji promotora genu supresora nowotworowego p14/p19arf [Amayar-Zazoua i wsp., Oncogene 2005]. Wykorzystałam je także przy realizacji własnego projektu, do zbadania efektywności poszczególnych dimerów AP-1 w aktywacji promotorów interleukiny 2 i 4 (IL2 i IL4) [Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007]. Czynniki transkrypcyjne AP-1 i NFAT, które ulegają aktywacji w limfocytach T na skutek pobudzenia receptora TCR (ang. T Cell Receptor), są jednymi z głównych regulatorów ekspresji cytokin. Leżące obok siebie miejsca wiązania NFAT i sekwencje podobne do sekwencji consensus dla AP-1 występują między innymi w promotorach genów kodujących 7

8 IL2 i 4, interferon gamma (IFNγ) oraz czynnik stymulujacy powstanie kolonii granulocytów i makrofagów (GMCSF), a więc cytokiny produkowane przez pomocnicze limfocyty T (Th, ang. T helper cells) [Macian i wsp., Oncogene 2001]. W zależności od profilu produkowanych cytokin, komórki Th, określane jako Th1 i Th2, pośredniczą odpowiednio w rozwoju komórkowej lub humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego [Kaiko i wsp., Immunology 2008]. Postawiłam hipotezę, że na profil ekspresji cytokin, a w konsekwencji typ odpowiedzi odpornościowej, wpływa między innymi skład dimeru AP-1. Stwierdziłam, że homodimery AP-1 (JUN/JUN), wykazujące w odróżnieniu od heterodimerów (JUN/FOS) bardzo słabą aktywność w stosunku do promotorów z elementami TRE [Bakiri i wsp., Mol Cell Biol 2002, Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007], we współpracy z czynnikiem NFAT efektywnie aktywują transkrypcję [Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007]. Wykazałam ponadto, że poszczególne dimery AP-1 różnicowo aktywują promotory genów Il2 i Il4. Dodatkowo, promotor Il4 okazał się w większym stopniu zależny od współpracy AP-1 z NFAT niż promotor Il2. Uzyskane wyniki sugerowały, że podjednostkowy skład AP-1 oraz poziom aktywacji NFAT może wpływać na dynamikę i typ odpowiedzi odpornościowej. Kontynuacją tych badań była wykonana przeze mnie charakterystyka komórek układu odpornościowego myszy Jund-/- w grasicy, śledzionie i szpiku kostnym oraz analizy profilu produkcji IL2, IL4 i IFNγ in vitro i in vivo w limfocytach Th. U myszy pozbawionych genu Jund zaobserwowałam między innymi deficyt limfocytów B i podwyższony, w porównaniu do myszy kontrolnych, udział aktywowanych limfocytów produkujących IFNγ w populacji limfocytów Th. To ostatnie świadczyło o nadmiernym rozwoju odpowiedzi Th1, co było szczególnie interesujące ze względu na fakt, że brak równowagi między profilem Th1 i Th2 obserwuje się u pacjentów z poważnymi chorobami autoimmunizacyjnymi, takimi jak stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, atopowe zapalenie skóry i astma oskrzelowa czy toczeń rumieniowaty układowy [Singh i wsp., J Immunol 1999]. Pod koniec mojego pobytu w Laboratorium prof. Yaniva inna grupa badawcza opublikowała wyniki podobnej analizy komórek T izolowanych ze śledziony myszy z nadekspresją Jund i myszy Jund-/-, dochodząc do podobnego wniosku, że JUND działa hamująco na odpowiedź Th1 [Meixner i wsp., EMBO J 2004]. Uniemożliwiło mi to opublikowanie własnych badań dotyczących komórek T, natomiast wątek komórek B nie był wystarczająco pogłębiony. Prowadzenie dalszych badań w tym kierunku nie było możliwe ze względu na koniec mojego stypendium i zamknięcie Laboratorium w związku z przejściem prof. Yaniva na emeryturę. 8

9 6. Osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) Pod koniec 2004 roku dołączyłam do zespołu prof. Kuźnickiego w MIBMiK, zajmującego się molekularnymi podstawami chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń poznawczych, żeby w ramach grantu europejskiego badać rolę β-kateniny w fizjologii neuronów. Wiązało się to z przemyślaną decyzją zmiany dziedziny badawczej na neurobiologię, przy wykorzystaniu zdobytej wiedzy o regulacji ekspresji genów, doświadczenia w stosowaniu technik biologii molekularnej i praktyki w pracy z modelami komórkowymi i zwierzęcymi. Badania przeprowadzone w MIBMiK stały się podstawą mojej pracy habilitacyjnej. 6.A. Tytuł osiągnięcia Aktywność czynnika transkrypcyjnego β-katenina~lef1/tcf w neuronach występowanie, regulacja, geny docelowe, hipotetyczna funkcja 6.B. Lista publikacji 10. Wisniewska MB**, Misztal K, Michowski W, Szczot M, Purta E, Lesniak W, Klejman ME, Dabrowski M, Filipkowski RK, Nagalski A, Mozrzymas JW, Kuznicki J; LEF1/β-catenin complex regulates transcription of the Cav3.1 calcium channel gene (Cacna1g) in thalamic neurons of the adult brain; J Neurosci 2010, 30: ; IF 7.18; 11. Misztal K, Wisniewska MB, Ambrozkiewicz M, Nagalski A, Kuznicki J; Wnt proteinindependent constitutive nuclear localization of β-catenin protein and its low degradation rate in thalamic neurons; J Biol Chem 2011, 286: ; IF 5.33; 12. Nagalski A, Irimia M, Szewczyk L, Ferran JL, Misztal K, Kuznicki J, Wisniewska MB**; Postnatal isoform switch and protein localization of LEF1 and TCF7L2 transcription factors, in cortical, thalamic, and mesencephalic regions of the adult mouse brain; Brain Struct Funct 2012, DOI /s ; IF 5.63; 13. Wisniewska MB**, Nagalski A, Dabrowski M, Misztal K, Kuznicki J; 2012; Novel betacatenin target genes identified in thalamic neurons encode modulators of neuronal excitability; BMC Genomics 13:635; IF 4.07; 14. Wisniewska MB**; Physiological role of β-catenin/tcf signaling in neurons of the adult brain; Neurochem Res 2013, DOI: /s ; artykuł przeglądowy napisany na zaproszenie; IF 2.24; ** autor korespondencyjny 9

10 6.C. Problematyka i cele badawcze Znaczenie β-kateniny w organizmie ssaków β-katenina, kofaktor czynników transkrypcyjnych z rodziny LEF1/TCF, zaliczana jest do onkogenów, ponieważ jej nadmierna aktywność wiąże się z rozwojem nowotworów, przede wszystkim tych związanych z układem pokarmowym [Clevers & Nusse, Cell 2012]. W szczególności mutacje genu kodującego białko APC, które jest odpowiedzialne za utrzymanie w cytoplazmie niskiego poziomu β-kateniny, są przyczyną rodzinnej polipowatości jelita grubego. Tak jak wiele innych onkogenów, β-katenina odgrywa kluczową rolę w rozwoju organizmu [van Amerongen & Nusse, Development 2009]. Na jego wczesnych etapach inicjuje tworzenie się osi przód-tył zarodka i uczestniczy w morfogenezie. Na dalszych etapach odgrywa rolę w rozwoju poszczególnych tkanek i narządów, między innymi mózgu, wpływając na procesy proliferacji, różnicowania i apoptozy. Zakłócenie aktywności kanonicznego szlaku Wnt, którego efektorem jest β-katenina, prowadzi do letalnych zaburzeń rozwojowych. W organizmie dorosłym w warunkach fizjologicznych β-katenina zapewnia prawidłową homeostazę w niszach komórek macierzystych, między innymi w nabłonku jelita oraz warstwie podziarnistej zakrętu zębatego w mózgu [Wisniewska, Neurochem Res 2013; Kuhl & Kuhl, Biochim Biophys Acta 2013]. Badania prowadzone przeze mnie w ramach projektu habilitacyjnego (przedstawione w rozdziale Opis wynków) doprowadziły do wskazania nowego miejsca aktywności β-kateniny i czynników LEF1/TCF w dorosłym organizmie oraz zaproponowania ich nowej roli w mózgu. β-katenina pełni funkcję aktywatora ekspresji genów w odpowiedzi na sygnał (patrz kolejny podrozdział), warto jednak wspomnieć, że powszechnie i stale występuje pod błoną komórkową, gdzie służy do kotwiczenia białek adhezji komórkowej kadheryn w cytoszkielecie aktynowym (Ryc. 1A) [Valenta i wsp., EMBO J 2012; Wisniewska, Neurochem Res 2013]. Funkcje błonowej β-kateniny nie były jednak przedmiotem mojej pracy, w której koncentrowałam się na cytoplazmatycznej i jądrowej puli β-kateniny. 10

11 Fig.1. β-katenina pełni dwie główne funkcje w komórce. Z Wisniewska, J Neurochem 2013 A β-katenina oddziałuje z Kadherynami przy błonie komórkowej i kotwiczy je w cytoszkielecie aktynowym. B Cytoplazmatyczna β-katenina jest mediatorem kanonicznego szlaku Wnt. Pod nieobecność ligandów WNT, β- katenina jest fosforylowana przez GSK3α/β a nastepnie degradowana w proteasomie. Po stymulacji receptora Frizzled cząsteczką Wnt, dochodzi do dysocjacji kompleksu destrukcyjnego. β- katenina akumuluje się i przemieszcza do jądra komórkowego, gdzie aktywuje czynniki LtranskrypcyjneEF1/TCF. β-katenina, czynniki transkrypcyjne LEF1/TCF i kanoniczny szlak sygnałowy Wnt Niezwiązana z błonami β-katenina ulega fosforylacji na resztach seryn 33, 37 i 45 oraz treoniny 41 w tzw. kompleksie destrukcyjnym, składającym się z kinaz CK1 i GSK3α/β,a także białek rusztowania aksyny i APC [Clevers & Nusse, Cell 2012; Wisniewska, Neurochem Res 2013]. W formie ufosforylowanej β-katenina rozpoznawana jest przez receptor ligazy ubikwityny E3, a następnie jest ubikwitowana i degradowana w proteasomie. Klasyczną drogą aktywacji β-kateniny jest kanoniczny szlak sygnałowy Wnt, nazywany też szlakiem Wnt/β-katenina. Po zadziałaniu sygnału Wnt, czyli przyłączeniu się sekrecyjnej glikoproteiny WNT do receptora przezbłonowego Frizzled i koreceptora LRP5/6, dochodzi do rozpadu kompleksu destrukcyjnego, czego wynikiem jest nagromadzanie się β-kateniny w cytoplazmie (Ryc. 1B). β-katenina po przejściu do jądra komórkowego aktywuje czynniki z rodziny LEF1/TCF. U ssaków rodzinę tę tworzą cztery białka: LEF1, TCF7 (TCF1), TCF7L1 (TCF3) i TCF7L2 (TCF4), wiążące się ze specyficzną sekwencją DNA - WRE (ang. Wnt Responsive Element), poprzez domenę HMG (ang. High Mobility Group) [Archbold i wsp., Acta Physiol (Oxf) 2012]. β-katenina oddziałuje z czynnikami LEF1/TCF i rekrutuje do wspólnego kompleksu szereg koaktywatorów transkrypcji, takich jak białka p300 i CBP. Na skutek tych wydarzeń dochodzi do aktywacji ekspresji docelowych genów. Czy β-katenina i czynniki LEF1/TCF biorą udział w regulacji działania mózgu? Szereg obserwacji wskazuje na hipotetyczny związek między zaburzeniami psychicznymi o charakterze afektywnym i psychotycznym a aktywnością szlaku Wnt/βkatenina. Gdy rozpoczynałam pracę, wiadomo było że lit, lek z wyboru w leczeniu choroby afektywnej dwubiegunowej (ChAD), wykazuje aktywność inhibitora kinazy GSK3α/β [Stambolic i wsp., Current Biol 1996; Klein & Melton, Proc Natl Acad Sci USA 1996], która jest 11

12 zaangażowana, jak opisano wyżej, w degradację β-kateniny. Ponadto w ciągu ostatnich kilku lat pojawiły się nowe przesłanki wskazujące na możliwy udział β-kateniny i czynników LEF1/TCF w etiologii ChAD, depresji i schizofrenii. Stwierdzono, że białko kodowane przez gen DISC1 (ang. Disrupted in Schizophrenia 1) powiązany w badaniach genetycznych z występowaniem wspomnianych chorób, bezpośrednio oddziałuje z GSK3β i hamuje jej aktywność w neuronalnych komórkach progenitorowych, tym samym wpływając pozytywnie na poziom cytoplazmatycznej β-kateniny [Mao i wsp., Cell 2009]. Z kolei badania genetyczne przeprowadzone na kilkutysięcznej grupie pacjentów i ludzi zdrowych pokazały, że wariant genu TCF7L2 jest czynnikiem ryzyka rozwoju schizofrenii [Hansen i wsp., Biol Psychiatry 2011; Alkelai i wsp., PLOS One 2012]. Co więcej, myszy pozbawione jednej kopii tego genu wykazywały deficyty w testach behawioralnych [Savic i wsp., PLOS One 2011]. Powiązanie β-kateniny i czynników LEF1/TCF z zaburzeniami psychicznymi wskazywało, że białka te mogą pełnić pewne funkcje w mózgu dojrzałego organizmu, zadałam więc pytanie o ich fizjologiczne znaczenie w neuronach. Kwestia ta nie była wcześniej podejmowana. Wprawdzie niedługo przed rozpoczęciem mojej pracy ukazały się publikacje opisujące udział β-kateniny w działaniu synaps [Nishimura i wsp., J Neurosci 2002; Murase i wsp., Neuron 2002; Coussen i wsp., J Neurosci 2002], chodziło tu jednak o jej pulę oddziałującą z białkami błony synaptycznej, pełniącą między innymi funkcję strukturalną, nic natomiast nie było wiadomo o ewentualnej roli β-kateniny w regulacji ekspresji genów w dojrzałych neuronach mózgu. W tym właśnie kierunku zdecydowałam się rozwinąć badania. Szczegółowe cele badawcze 1. Pierwszym celem mojej pracy było zbadanie występowania i lokalizacji czynników LEF1/TCF oraz β-kateniny w dorosłym mózgu myszy i szczurów. Ten cel rozbudowaliśmy później o analizę absolutnego poziomu ekspresji Lef1 i Tcf7l2, a także analizę wariantów splicingowych mrna tych genów, przeprowadzoną wspólnie z mgr. Andrzejem Nagalskim wykonującym pracę doktorską pod moją opieką. 2. Po uzyskaniu wyników świadczących o stałej akumulacji β-kateniny specyficznie w neuronach wzgórza, kolejnym celem, jaki postawiłam, stało się wyjaśnienie mechanizmu tego zjawiska z wykorzystaniem pierwotnych hodowli neuronalnych. Podjęłam się jego realizacji razem z mgr Katarzyną Misztal, pełniąc rolę opiekunki jej pracy doktorskiej. 12

13 3. Zasadniczym celem mojego projektu habilitacyjnego była identyfikacja genów regulowanych przez kompleks β-katenina~lef1/tcf w neuronach wzgórza. Wykorzystałam tutaj metody in silico do wstępnej identyfikacji, a następnie cały szereg metod biologii molekularnej in vitro i in vivo do potwierdzenia regulacji wytypowanych genów. Poznanie specyficznie wzgórzowego programu zależnego od β-kateniny miało pozwolić na zaproponowanie nowej roli β-kateniny. 4. Jako ostatni i szczególnie ważny cel zaplanowałam weryfikację hipotetycznego wpływu β-kateniny na fizjologię neuronów, poprzez przeprowadzenie testu funkcjonalnego. 6.D. Opis i dyskusja wyników Występowanie i subkomórkowa lokalizacja β-kateniny i czynników LEF1/TCF 2 w mózgu szczura i myszy (artykuły nr 10, 11, 12) Gdy rozpoczynałam pracę, w literaturze brakowało kompleksowych analiz występowania wymienionych białek, które pozwoliłyby stwierdzić, czy w dorosłym mózgu może dochodzić do aktywacji transkrypcji przez β-kateninę. W zróżnicowanej tkance nie oczekiwano aktywności kompleksu β-katenina~lef1/tcf. Dopiero w 2004 i 2009 roku metodą hybrydyzacji in situ wykryto ekspresję genów Lef1 i Tcf7l2 we wzgórzu mózgu myszy i małp [Jones & Rubenstein, J Comp Neurol 2004; Shimogori i wsp., J Comp Neurol 2004; Lee i wsp., J Comp Neurol 2009]. Projekt rozpoczęłam od zbadania występowania i lokalizacji β-kateniny oraz białek LEF1 i TCF7L2 w skrawkach mózgowych myszy i szczura, stosując różne metody immunodetekcji: immunohistochemię, immunofluorescencję (współbarwienie z przeciwciałami specyficznymi dla markerów neuronalnych) oraz analizę Western-blot frakcji subkomórkowych izolowanych z różnych struktur mózgu. Podobne badania przeprowadziliśmy in vitro w pierwotnych hodowlach neuronów. Zaobserwowaliśmy, że β-katenina zlokalizowana jest przede wszystkim w błonach cytoplazmatycznych neuronów i astrocytów w całym mózgu, co było oczekiwane, ale także w ciele i jądrach komórkowych neuronów wzgórza [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010, Misztal i wsp.; J Biol Chem 2011]. Taka lokalizacja β-kateniny w komórkach zróżnicowanych jest ewenementem. Równie nietypowy jest wysoki poziom czynników 13

14 transkrypcyjnych LEF1 i TCF7L2, jaki zaobserwowaliśmy we wzgórzu nie tylko w czasie rozwoju, ale także u zwierząt dorosłych, zarówno na poziome mrna jak i białka [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010; Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012]. W przypadku RNA oszacowaliśmy, że średnio w jednej komórce wzgórza dorosłego osobnika znajduje się około 50 kopii Lef1 i 400 kopi Tcf7l2. Przeprowadziliśmy także analizę obecności izoform LEF1 i TCF7L2 za pomocą reakcji PCR i metody Western blot. Okazało się, że we wzgórzu embrionalnym przeważa dominująca negatywna izoforma TCF7L2, natomiast u myszy dorosłych TCF7L2 występuje w formie zdolnej do oddziaływania z β-kateniną, a więc zdolnej do aktywacji ekspresji genów [Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012]. β-katenina i czynniki LEF1 i TCF7L2 wydają się więc odgrywać szczególną rolę w neuronach wzgórzowych, także w dojrzałym mózgu. Czy wzgórze warto badać? Wzgórze jest bardzo ciekawą, choć do niedawna niedocenianą, częścią mózgu. Wszystkie informacje zmysłowe poza węchowymi docierają najpierw do wzgórza, i dopiero stamtąd kierowane są do kory mózgowej, w której zostają poddane analizie [Guillery & Sherman, Neuron 2002]. Neurony wzgórzowe, nazywane neuronami przekaźnikowymi, nie tylko po prostu przesyłają informacje do kory, ale w zależności od kontekstu behawioralnego są zdolne wpływać na ich format korzystając z możliwości generowania potencjałów czynnościowych w dwóch trybach, tonicznym i paczkowym [Sherman, Trends Neurosci 2001]. Ta szczególna właściwość, wraz z możliwością modulacji wielkości reakcji i synchronizacji neuronów, sprawia, że wzgórze aktywnie wpływa na procesy selektywnej uwagi, świadomej percepcji oraz regulacji stanów snu i czuwania [Basso i wsp., Neuron 2005; Saalmann & Kastner, Neuron 2011]. Nasze odkrycie aktywnej β-kateniny w neuronach wzgórzowych było szczególnie interesujące z dwóch powodów. Z jednej strony neurony wzgórzowe mogą uczestniczyć w etiologii zaburzeń afektywnych i psychotycznych. Rozwojowe zaburzenia wzgórza, takie jak zmniejszenie objętości niektórych obszarów, załamanie systemu neuroprzekaźnikowego, czy zaburzenie połączeń wzgórzowo-korowych, wskazuje się jako jedną z przyczyn schizofrenii i ChAD, natomiast powiększenie wzgórza stwierdzono w niektórych przypadkach ciężkich zaburzeń depresyjnych [Clinton i wsp., Am J Psychiatry 2005; Harms i wsp., J Neurosci 2007; Young i wsp., Br J Psychiatry 2008; Pinault, Schizophr Bull 2011; Marenco i wsp., Neuropsychopharmacology 2012]. Z drugiej strony, jak wspomniałam w rozdziale Problematyka i Cele badawcze, wyżej wymieniony choroby wiązane są z nieprawidłową aktywnością β-kateniny i czynnika TCF7L2. 14

15 Mechanizm cytoplazmatyczno-jądrowej lokalizacji β-kateniny w neuronach wzgórza niezależność od szlaku Wnt (artykuł nr 11) Powyżej opisane wyniki skłoniły mnie do zadania pytania o mechanizm specyficznej lokalizacji subkomórkowej β-kateniny w neuronach wzgórzowych. W dorosłym mózgu obserwuje się ekspresję genów kodujących białka kanonicznego szlaku Wnt [Shimogori i wsp., J Comp Neurol 2004], między innymi receptory Frizzled we wzgórzu. Przypuszczaliśmy więc początkowo, że przyczyną stałej aktywności β-kateniny w neuronach wzgórzowych jest para- lub autokrynne działanie cząsteczek WNT. A jednak mimo zastosowania kilku różnych podejść eksperymentalnych nie udało się uzyskać wyników potwierdzających tę hipotezę. Pozbawienie neuronów wzgórzowych naturalnego mikrośrodowiska, poprzez hodowanie ich w nieobecności neuronów korowych i astrocytów, nie wpłynęło na lokalizację β-kateniny, wykluczając mechanizmy parakrynne [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Co więcej, na β- kateninę nie wypływało ani zahamowanie koreceptora LRP5/6 antagonistą DKK1, ani zaburzenie wewnątrzkomórkowego szlaku przekazywania sygnału Wnt poprzez nadekspresję białka DVL z dominującą negatywną mutacją [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Mieliśmy więc mocne podstawy, by twierdzić, że akumulacja β-kateniny w cytoplazmie i jej jądrowa lokalizacja w neuronach wzgórzowych nie jest zależna od sygnału Wnt. Była to kolejna nietypowa obserwacja. Nasza praca została zauważona przez edytorkę Science Signalling, która w rubryce Editors Choice zamieściła na jej temat komentarz pod tytułem A Wnt-Less Journey to the Nucelus [Adler, Science Signalling 2011]. Jaki więc mechanizm powoduje stałą akumulację β-kateniny w cytoplazmie i jądrze neuronów wzgórza? W trakcie naszych badań okazało się, że w porównaniu z innymi częściami mózgu, poziom białek kompleksu destrukcyjnego β-kateniny, a więc APC, Aksyny i GSK3α/β, jest we wzgórzu około trzykrotnie niższy [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Uznaliśmy więc za możliwe, że degradacja β-kateniny nie zachodzi w tych komórkach wystarczająco wydajnie. Faktycznie, eksperyment pulse-chase pokazał, że tempo degradacji cytoplazmatycznej β-kateniny jest w neuronach wzgórzowych ponad dwukrotnie wolniejsze niż w neuronach korowych [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Wydaje się więc, że obecność β-kateniny w cytoplazmie i jądrach neuronów wzgórza jest cechą autonomiczną tych komórek, związaną, przynajmniej częściowo, ze spowolnieniem jej degradacji. 15

16 Docelowe geny dla kompleksu β-katenin~lef1/tcf w neuronach wzgórzowych (artykuły nr 10 i 13) Aby przybliżyć się do poznania roli β-kateniny w dorosłym mózgu postanowiłam określić jej docelowy program genetyczny w neuronach wzgórza. Przyjęłam następujący plan badawczy: przeprowadzenie analiz in silico w celu wytypowania potencjalnych genów, wykonanie profilowania tych genów w mózgu aby skorelować ich ekspresję z występowaniem czynników LEF1/TCF i jądrową lokalizacją β-kateniny, i w końcu eksperymentalna weryfikacja regulacji danych genów przez β-kateninę. W pierwszej fazie szukaliśmy motywów wiązania czynników LEF1/TCF w konserwowanych regionach genów leżących w obszarach +/- 10 kb od startu transkrypcji w genomie szczurzym i ludzkim. Grupa genów z co najmniej dwoma konserwowanymi motywami LEF1/TCF w co najmniej jednym konserwowanym regionie (851 genów) była w sposób statystycznie istotny wzbogacona w znane geny docelowe szlaku Wnt. Co ciekawe, analiza ontologiczna pokazała, że grupa z motywami LEF1/TCF jest także wzbogacona w geny kodujące białka synaptyczne i bramkowane kanały jonowe, a więc białka o kluczowej funkcji w odbieraniu i przekazywaniu sygnału nerwowego [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. W dalszych badaniach skupiliśmy się na tych genach (41 genów), ponieważ dawało to duże szanse na znalezienie nowych, neuronalnych, genów docelowych dla β-kateniny przy jednoczesnym znacznym zmniejszeniu kosztów eksperymentów. Kolejnym etapem była analiza profilu ekspresji genów wyłonionych in silico, w której posłużyliśmy się zaprojektowanymi przez nas macierzami PCR. Ponad 20% badanych genów (9 genów) ulegało wyraźnie wyższej ekspresji we wzgórzu niż w korze mózgowej i hipokampie, podczas gdy poziom ekspresji badanych genów w korze i hipokampie był zbliżony [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Kontrolna grupa genów nie wykazywała takiej preferencyjnej ekspresji we wzgórzu. Tak więc wyraźny był związek między występowaniem potencjalnych miejsc wiązania czynników LEF1/TCF w genie, a relatywnym poziomem jego ekspresji we wzgórzu. Został on także potwierdzony analizą statystyczną. Dalsze eksperymenty zmierzały do weryfikacji hipotezy, że te wzgórzowe geny z konserwowanymi motywami LEF1/TCF: Cacna1g, Cacna2d2, Kcna6, Kcnh8, Drd3, Gabra3, Glra1, Grid2 i Calb2, są faktycznie regulowane przez kompleks β-katenina~lef1/tcf. Zastosowaliśmy dwa podejścia badawcze. Po pierwsze, wykonaliśmy eksperyment typu loss of function : hamowaliśmy β-kateninę in vitro w hodowli neuronów wzgórzowych poprzez 16

17 nadekspresję Aksyny 2, białka z kompleksu destrukcyjnego, po czym badaliśmy poziom ekspresji powyższych genów [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Po drugie, przeprowadziliśmy immunoprecypitację chromatyny izolowanej ze wzgórza i innych części mózgu przeciwciałem skierowanym przeciwko β-kateninie, a następnie wykrywaliśmy obecność wytypowanych fragmentów genów metodą ilościowego PCR [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010; Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Cztery geny pozytywnie przeszły oba testy: Cacna1g, Kcna6, Gabra3 i Calb2, co daje podstawy by twierdzić, że geny te są we wzgórzu bezpośrednio regulowane przez β-kateninę. Wymienione geny są pierwszymi poznanymi genami docelowymi β-kateniny o specyficznie neuronalnych funkcjach. Cacna1g i Kcna6 kodują kanały jonowe bramkowane napięciem, odpowiednio kanał wapniowy Cav3.1 i potasowy Kv1.6 [Catterall i wsp., Pharmacol Rev 2005; Gutman i wsp., Pharmacol Rev 2005]. Aktywność takich kanałów wpływa na parametry przewodnictwa elektrycznego błony komórkowej neuronów. Gabra3 jest genem dla jednego z receptorów neurotransmitera GABA (kwasu γ-aminomasłowego), który wywiera hamujący wpływ na przekazywanie sygnału elektrycznego przez neurony [Farrant & Kaila, Prog Brain Res 2007]. Warto tutaj wspomnieć, że nokaut genu Gabra3 powoduje u myszy zaburzenia w hamowaniu czuciowo-motorycznym, co jest jedną z cech schizofrenii [Yee i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 2005]. W końcu Calb2 koduje Calbindynę 2 (znaną także jako Calretynina), wewnątrzkomórkowy bufor wapniowy, którego jedną z funkcji jest modulowanie odpowiedzi neuronów [Winsky & Kuznicki, J Neurochem 1995; Gall i wsp., J Neurosci 2003]. Sugeruje to udział β-kateniny w utrzymywaniu się prawidłowej pobudliwości neuronów wzgórza poprzez regulację ekspresji genów. β-katenina jako regulator pobudliwości neuronów wzgórzowych szczegółowa analiza regulacji promotora Cacna1g i test funkcjonalny (artykuł nr 10) Moje szczególne zainteresowanie wzbudził gen Cacna1g. Duża gęstość kodowanych przez niego kanałów Cav3.1 [Talley i wsp., J Neurosci 1999], przez które płyną prądy wapniowe typu T, umożliwia neuronom wzgórza przesyłanie informacji do kory mózgowej we wspomnianych wcześniej formatach paczkowym lub tonicznym [Kim i wsp., Neuron 2001]. Znany jest także związek Cav3.1 z padaczką z napadami nieświadomości [Singh i wsp., Hum Mutat 2007; Ernst i wsp., J Neurosci 2009]. Zdecydowaliśmy się na pogłębioną analizę regulacji promotora Cacna1g przez kompleks β-katenina~lef1/tcf oraz wykonanie 17

18 wstępnych testów funkcjonalnych, mogących dostarczyć dalszych wskazówek co do roli β- kateniny w neuronach wzgórza. Sklonowaliśmy ludzki i mysi promotor genu Cacna1g. Oba promotory wykazywały podwyższoną aktywność w komórkach z nadekspresję β-kateniny i LEF1 [Wisniewska i wsp. J Neurosci 2010]. Analiza mutacyjna pozwoliła na wyznaczenie obszaru promotora odpowiadającego na β-kateninę i LEF1 był nim fragment znajdujący się pomiędzy alternatywnymi miejscami startu transkrypcji. Aby dokładniej zmapować miejsca wiązania się białka LEF1 z DNA promotora Cacna1g, przeprowadziliśmy footprinting z samodzielnie przygotowanym rekombinowanym białkiem LEF1 i znakowanymi radioaktywnie fragmentami promotora [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010]. Równoległe sekwencjonowanie pozwoliło nam precyzyjnie wyznaczyć sekwencje DNA tych miejsc. W badanym obszarze, o długości prawie 600 par zasad, znaleźliśmy cztery miejsca wiązania w promotorze ludzkim i homologiczne z nimi miejsca w promotorze mysim. Wyniki te potwierdziły bezpośrednią regulację genu Cacna1g przez kompleks β-katenina~lef1. Dalsze nieopublikowane badania pokazały, że również kompleks β-katenina~tcf7l2 jest aktywatorem promotora Cacna1g, nawet o większym potencjale niż β-katenina~lef1. Czy udział β-kateniny w regulacji ekspresji genu dla kanału wapniowego Cav3.1 jest na tyle istotny, że jej aktywność wpływa na właściwości elektrofizjologiczne neuronów wzgórzowych? By się o tym przekonać, nawiązałam współpracę z elektrofizjologami, którzy przeprowadzili rejestrację charakterystycznych dla kanału Cav3.1 prądów wapniowych T, płynących w poprzek błon komórkowych neuronów wzgórzowych traktowanych in vitro rekombinowanym białkiem WNT3A, posługując się techniką patch-clamp [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010]. Pod wpływem WNT w neuronach dochodziło do wzrostu poziomu β- kateniny oraz do wzrostu ekspresji Cacna1g. Rosło także istotnie natężenie prądów T w porównaniu do neuronów kontrolnych. Tak więc w zastosowanym modelu in vitro przy aktywacja β-kateniny dochodziło do zwiększenia prądów T, co wskazuje na udział β-kateniny w utrzymywaniu fizjologicznych właściwości neuronów wzgórzowych. Nasze odkrycie wzbudziło zainteresowanie; między innymi zacytowano je i zilustrowano na rycinie w artykule przeglądowym o rozwoju wzgórza w czasopiśmie Frontiers in Neuroscience [Hagemann & Scholpp, Front Neurosci 2012]. 18

19 Rola szlaku Wnt/β-katenina w neurogenezie dorosłych (artykuł przeglądowy, nr 14) W trakcie realizacji projektu habilitacyjnego w literaturze pojawiły się prace podejmujące temat aktywności β-kateniny w dorosłym mózgu od innej strony niż nasze badania. Zwrócono przede wszystkim uwagę na rolę β-kateniny w neurogenezie dorosłych w zakręcie zębatym hipokampa i w strefie podkomorowej komór bocznych mózgu. Korzystając z zaproszenia do napisania pracy przeglądowej do specjalnego numeru Neurochemical Research, przedstawiłam własną interpretację tych wyników oraz wyników własnych [Wisniewska, Neurochem Res 2013]. Badania na temat roli szlaku Wnt/β-katenina w proliferacji i różnicowaniu pluripotencjalnych prekursorowych komórek nerwowych (NPCs, ang. Neuronal Precursor Cells) w dorosłym mózgu wpisują się w klasyczny nurt badań nad rolą kanonicznego szlaku Wnt w rozwoju organizmu. Wyniki większości eksperymentów wskazują na pozytywny wpływ aktywacji szlaku Wnt/β-katenina na proliferację komórek prekursorowych i/lub ich różnicowanie się w kierunku neuronów, można jednak znaleźć dowody świadczące o czymś przeciwnym [Lie i wsp., Nature 2005; Yu i wsp., Mol Cell Biochem 2006; Adachi i wsp., Stem Cells 2007; Qu i wsp., Nat Cell Biol 2010; Marinaro i wsp., Cereb Cortex 2012]. Nie musi być w tych obserwacjach sprzeczności; doskonale wiadomo, że β-katenina i czynniki LEF1/TCF mogą aktywować różne programy genetyczne, zależnie od kontekstu komórkowego, między innymi obecności innych współregulatorów. Na przykład rolę swoistego przełącznika między programem proliferacji a programem różnicowania mogłaby odgrywać kinaza HIPK1, która modyfikuje odpowiedź transkrypcyjną na kompleks β-katenina~/lef1/tcf, a której ekspresję obserwuje się w NPCs [Marinaro i wsp., Cereb Cortex 2012]. Panuje więc przekonanie, że β-katenina bierze udział w neurogenezie dorosłych, choć jej faktyczna rola jest nieco kontrowersyjna. Moje wątpliwości budzi jednak brak bezpośredniego dowodu na aktywność β-kateniny i czynników LEF1/TCF w strefach neurogenezy w dorosłym mózgu. My także nie wykryliśmy w tych obszarach ani czynników LEF1 czy TCF7L2, ani jądrowej β-kateniny. Jeżeli więc dochodzi do aktywacji β- kateniny, jest ona albo bardzo krótkotrwała albo/i na niskim poziomie. Nie jest też wykluczone, że to nie β-katenina, ale inne białka aktywowane lub hamowane w szlaku Wnt, wpływają na neurogenezę w dorosłym mózgu [Hirsh i wsp., Exp Cell Res 2007]. 19

20 6.E. Podsumowanie, wnioski i znaczenie badań Podsumowanie wyników 1. Stwierdziliśmy, że w neuronach dorosłych gryzoni w specyficznym obszarze mózgu, we wzgórzu, β-katenina występuje nie tylko w błonach komórkowych ale także w cytoplazmie i jądrach komórkowych. W neuronach tych z β-kateniną współwystępują regulowane przez nią czynniki transkrypcyjne LEF1 i TCF7L2. 2. Wykazaliśmy, że zahamowanie aktywacji kanonicznego szlaku Wnt nie wpływa na poziom β-kateniny w neuronach wzgórza, co wskazuje na inny, nietypowy, mechanizm aktywacji jej cytoplazmatycznej puli. Zaobserwowaliśmy natomiast, że poziom białek tworzących kompleks destrukcyjny β-kateniny, GSK3α/β, APC i Aksyny, jest niższy w neuronach wzgórza niż w neuronach hipokampa czy kory mózgowej, in vivo i in vitro. Niższe jest również tempo degradacji cytoplazmatycznej puli β-kateniny. Powodem stałej akumulacji β-kateniny w neuronach wzgórza może być więc jej nieefektywna degradacja. 3. Znaleźliśmy nowe geny docelowe dla kompleksu β-katenina~lef1/tcf w neuronach wzgórzowych. Są to Cacna1g, Kcna6, Gabra3, Calb2, a możliwe, że także inne geny kodujące kanały jonowe bramkowane napięciem, receptory neurotransmiterów, czy białka synaptyczne. Sugeruje to udział β-kateniny w elektrofizjologii tych neuronów na poziomie regulacji ekspresji genów. 4. Pokazaliśmy, że po podwyższeniu poziomu β-kateniny w neuronach wzgórzowych in vitro wzrasta natężenie prądów wapniowych T płynących przez błonę komórkową. Świadczy to o większej gestości kanałów Cav3.1, kodowanych przez jeden z nowych genów docelowych β-kateniny Cacna1g. Jest to pierwsze funkcjonalne potwierdzenie istotnej roli β- kateniny w utrzymywaniu prawidłowej pobudliwości neuronów wzgórza. 20

21 Fig. 2. Proponowane role β-kateniny w neuronach dorosłego mózgu. Z Wisniewska 2013, Journal of Neurochemistry A Hipotetyczny model mitogennej i neurogenicznej roli kompleksów β-katenina~lef1/tcf w neuronalnych komórkach prekursorowych podczas neurogenezy dorosłych, modulowanej przez białko HIPK1 [Marinaro et al. 2012]. B Stała i niezależna od Wnt aktywność kompleksów β-katenina~lef1/tcf we neuronach wzgórza i kontrola ekspresji genów kodujących białka związane z przekazywaniem sygnału w neuronach [Wisniewska et al. 2010, Misztal et al. 2011, Wisniewska et al. 2012]. Wnioski i znaczenie badań Na podstawie powyższych wyników proponuję nową funkcję β-kateniny w dorosłym mózgu, obok jej roli w plastyczności synaptycznej (błonowa β-katenina, tutaj nie opisywana) i w neurogenezie dorosłych (kanoniczny szlak Wnt i jądrowa β-katenina, Ryc. 2A) [Wisniewska, Neurochem Res 2013]. W neuronach wzgórzowych w sposób niezależny od aktywności szlaku Wnt utrzymuje sie wysoki poziom β-kateniny w cytoplazmie i jądrze komórkowym [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010; Misztal i wsp., J Biol Chem 2011] oraz wysoki poziom czynników transkrypcyjnych LEF1 i TCF7L2 [Wisniewska i wsp, J Neurosci. 2010; Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012], których β-katenina jest kofaktorem. Wszystko wskazuje na to, że jest to cecha wewnętrzna tych komórek, odróżniająca je od innych neuronów mózgu. Uzasadnione jest więc przypuszczenie, że kompleksy β- katenina~lef1 i β-katenina~tcf7l2 pełnią funkcję ostatecznych selektorów (ang. terminal selector) dla neuronów wzgórza, czyli czynników transkrypcyjnych określający i podtrzymujących cechy różnicowe tych komórek [Hobert, Annu Rev Cell Dev Biol 2011]. Bardzo mocno przemawia za tym fakt, że wzgórzowe geny docelowe β-kateniny kodują białka określające właściwości elektrofizjologiczne neuronów (Ryc. 2B) [Wisniewska i wsp., 21

22 BMC Genomics 2012], w szczególności kanał Cav3.1. Na podstawie pomiarów prądów T przeprowadzonych na pierwotnych hodowlach neuronów wzgórzowych, można przypuszczać, że β-katenina warunkuje prawidłową pobudliwość neuronów wzgórza [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010]. Planowane badania in vivo na nowych modelach zwierzęcych mają na celu zweryfikowanie tej hipotezy. Jak wspomniałam wcześniej, postuluje się związek między zaburzeniami afektywnymi i psychotycznymi a nieprawidłową aktywnością β-kateniny i czynnika TCF7L2. Na podstawie naszych badań stawiam tezę, że jedną z przyczyn tych zaburzeń jest rozregulowanie ekspresji genów zależnych od kompleksu β-katenina~lef1/tcf7l2 we wzgórzu. Uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy taki związek faktycznie istnieje i czy dotyczy on (także) funkcjonowania wzgórza, wymaga jeszcze wielu badań, które mam nadzieje przeprowadzić. Na koniec chcę podkreślić, że nasze badania były nowatorskie, jeżeli chodzi o stawiane hipotezy, i wymagały zastosowania bardzo różnorodnych technik. Myślę, że między innymi z tych powodów zespół, w którym pracowałam i którego pracą kierowałam realizując projekt habilitacyjny, wspierana przez prof. Jacka Kuźnickiego, został wyróżniony nagrodą im. Jerzego Konorskiego przyznaną przez Polskie Towarzystwo Badania Układu Nerwowego i Polski Komitet Neurobiologii za najlepszą polską publikację w dziedzinie neurobiologii w roku

23