OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej

Transkrypt

1 prof. dr hab. Barbara Zabłocka Pracownia Biologii Molekularnej Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN ul. Pawińskiego 5, Warszawa tel: bzablocka@imdik.pan.pl OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej Przedstawiona mi do recenzji praca dotyczy badania mechanizmu transportu i dojrzewania białka dysmutazy ponadtlenkowej typu 1 w mitochondriach. Białko to kodowane jest w DNA jądrowym, a aktywność wykrywana jest zarówno w cytoplazmie jak i w mitochondriach i zależy od uformowania cząsteczki, która w swej strukturze zawiera mostek dwusiarczkowy oraz jony miedzi i cynku. Mechanizmy importu białek występujących w podwójnej lokalizacji komórkowej, które nie mają pre-sekwencji adresującej je wyłącznie do mitochondriów nie są w pełni poznane i stanowią spore wyzwanie intelektualne, zwłaszcza, że obecnie problem ten może dotyczyć coraz większej liczby białek wykrywanych w mitochondriach w różnych stanach fizjopatologicznych komórek. Mitochondria się bowiem coraz częściej postrzegane jako specyficzne węzły w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Od wielu lat w centrum zainteresowania badaczy znajduje się pytanie jak przenoszone są do mitochondriów białka typowo mitochondrialne kodowane w DNA jądrowym oraz te, które znajdują się w mitochondriach i innych lokalizacjach komórkowych a także takie, które znajdują się w mitochondriach okazjonalnie. Błony mitochondrialne stanowią bariery rozdzielające cytoplazmę od zawartości międzybłonowej i macierzy mitochondrialnej, a przenoszenie białek pomiędzy tymi przedziałami jest bardzo skomplikowane i kontrolowane. Wielobiałkowe kompleksy zlokalizowane w błonach mitochondrialnych oraz w przestrzeni międzybłonowej są wyspecjalizowane w transporcie i modyfikacjach przenoszonych cząsteczek. Badania pani Aksany Varabyovej dotyczą molekularnego mechanizmu importu białka Sod1 do przestrzeni międzybłonowej mitochondriów i prowadzone były w MIBMiK w 1

2 Warszawie pod kierunkiem pani prof. dr hab. Agnieszki Chacińskiej. Wybrane do badań zagadnienie jest dodatkowo ważne z powodu udziału Sod1 w patogenezie nieuleczalnej choroby neurodegeneracyjnej, ALS. Wyniki doświadczeń, prowadzone na modyfikowanych genetycznie bardzo wielu szczepach komórek drożdży stanowią treść omawianej rozprawy doktorskiej. Dysertację czytałam z przyjemnością. Jest to praca skomplikowana merytorycznie i metodycznie. Modelowy organizm jakim są drożdże pozwolił doktorantce na wykorzystanie istniejących oraz stworzenie wielu własnych szczepów, które można traktować jako narzędzia molekularne do badania udziału poszczególnych białek w mechanizmie importu mitochondrialnego Sod1. Praca napisana jest jasno i pozwala z łatwością śledzić tok rozumowania Doktorantki. Jest zwarta i ma nieco nietypowy układ dla tego rodzaju opracowań. Rozdział Wyniki stanowi zasadniczą część pracy, i co nie jest często spotykane zawiera szczegółowe uzasadnienia prowadzenia kolejnych doświadczeń i omówienia wyników, których interpretacja nie zawsze jest oczywista i tylko wprawne oko doktorantki i Jej Opiekunki pozwoliło na prawidłową ich ocenę i wyciągniecie wniosków. Takie przedstawienie wyników doświadczeń i rozbudowane ich wyjaśnianie zasługuje na aplauz, bo nie pozostawia czytelnika w gąszczu zdjęć Western blotów, tylko prowadzi za rękę w kierunku ostatecznego wniosku. Doktorantka za cel pracy postawiła sobie wyjaśnienie mechanizmów transportu do mitochondriów białka Sod1 w formie prawidłowej cząsteczki oraz z wprowadzonymi mutacjami znajdowanym u chorych z ALS. Ponadto starała się wyjaśnić jaka rolę w imporcie Sod1 do mitochondriów pełni mitochondrialne białko opiekuńcze Ccs1 oraz białka z kompleksów Mia i MICOS, które regulują stan oksydo-redukcyjny białek wprowadzanych do mitochondriów. W rozdziale Materiały i Metody znajdują się szczegółowe opisy hodowli drożdży i manipulacji genetycznych wykorzystanych w pracy. Przedstawiono przygotowanie narzędzi do realizacji celów badań, m.in. otrzymywanie znakowanych białek rekombinowanych czy syntezę in vitro białek znakowanych izotopami promieniotwórczymi. Przedstawiono też kilka typów doświadczeń, w których analizowano oddziaływania pomiędzy badanymi białkami. Z lektury tej części pracy przebija rzetelność w opisywaniu warunków doświadczenia, a duża liczba tabel porządkuje te informacje. Wydaje mi się jednak, że pominięto tabelę opisującą dokładniej przeciwciała stosowane do Western blot. 2

3 W rozdziale Wyniki można wydzielić dwie części przedstawionych badań: pierwsza opisuje molekularne mechanizmy transportujące prawidłową Sod1 do mitochondriów, a druga odnosi się do zmutowanych wariantów Sod1. W każdej części konsekwentnie przedstawiane są kolejne etapy badań z zastosowaniem różnych podejść doświadczalnych. Przekonujące jest podejście do badania lokalizacji białka w mitochondriach z zastosowaniem trawienia proteinazą K lub trypsyną całych mitochondriów i mitoplastów. Badano też aktywność enzymatyczną Sod1 w żelu po manipulacjach genetycznych oraz poszukiwano kompleksów białkowych tworzonych w mitochondriach wokół znakowanej, rekombinowanej Sod1. Na wstępie potwierdzono obecność Sod1 w mitochondriach drożdży oraz zależność lokalizacji od obecności białka Ccs1. Sprawdzono także oddziaływanie Ccs1 z białkiem MIA40, które bierze udział w tworzeniu mostków dwusiarczkowych w dojrzewającym w mitochondriach białku Sod1. Kolejne doświadczenia wykazały nowe, nieznane dotychczas fakty dotyczące transportu Sod1 do mitochondriów. Doktorantka wykazała, że zredukowana forma Sod1 występuje w mitochondriach pozbawionych białka Ccs1, natomiast w procesie importu istotny jest udział białka MIA40 oraz białek kompleksu MICOS, ważnego dla prawidłowej struktury grzebieni mitochondrialnych. Tu pojawiają się ciekawe obserwacje dotyczące proporcji pomiędzy ilością zredukowanej a utlenionej formy Sod1 w przypadku usunięcia kompleksu MICOS. Zastanawiam się czy na mitochondrialny import białka Sod1, oraz szerzej, różnych białek znajdujących się w mitochondriach okazjonalnie, ma wpływ morfologia grzebieni mitochondrialnych? Czy Doktorantka zwróciła uwagę na zmiany w strukturze mitochondriów po różnych modyfikacjach genetycznych białek mitochondrialnych w komórkach drożdży? W drugim etapie podjęto próbę sprawdzenia mechanizmu molekularnego, który może być zaangażowany w neurodegenerację w stwardnieniu zanikowym bocznym. Podjęto próby sprawdzenia, czy mutacje w genie Sod1 wywołują jakiekolwiek wtórne skutki na poziomie innych białek mitochondrialnych, innymi słowy czy maja wpływ na ich ilość w mitochondriach. Nie stwierdzono takiego wpływu w stosunku do białek MIA40, składowych kompleksu MICOS oraz wybranych białek łańcucha oddechowego. Istotne wydaje się jednak zwiększenie udziału zredukowanej formy zmutowanej Sod1, które nie zależy od białka Ccs1 oraz obserwacja, ze pozbawienie komórek Sod1 skutkuje rozchwianiem stanu redoks 3

4 białek kompleksów łańcucha oddechowego. To ostatnie może być wynikiem braku aktywności Sod1 i wzrostem ilości reaktywnych form tlenu. I znów zastanawia mnie czy brak Sod1 zmienia strukturę grzebieni mitochondrialnych i całych organelli, które mogą być w dalszym etapie usuwane. Czy obserwowano różnice w ilości wolnych rodników tlenowych w szczepach o dużej zawartości zredukowanej formy mitochondrialnej Sod1? Wszystkie skomplikowane układy doświadczalne prezentowane w tej dysertacji kończą się immunodetekcją białek mitochondrialnych po rozdziale elektroforetycznym. Czy rozważano zastosowanie spektrometrii mas, która bardziej specyficznie wykrywa białka np. w kompleksach, a ponadto może wskazać potencjalnie oddziaływania między Sod1 a białkami, których dotychczas nie badano w tym aspekcie. Z drugiej strony, metoda Western blot, wydaje się być czulsza niż spektrometria mas, w odniesieniu do ilości białka, jednak na wiele ograniczeń. Jak weryfikowano specyficzność stosowanych przeciwciał oraz oceniano równość nałożenia prób na żel? Wyniki przedstawione są w postaci zdjęć reprezentatywnych Western blotów, a w kilku przypadkach dotyczących zmian w stanie zredukowania/utlenienie cząsteczki Sod1 w mitochondriach izolowanych z różnie zmodyfikowanych genetycznie szczepów drożdży (ryciny 20, 23, 24 i 25) pokuszono się o analizy densytometryczne otrzymanych obrazów. Tylko w jednym przypadku (rycina 20) przedstawiono analizę z podaniem liczby powtórzeń i odchyleniem standardowym, natomiast brakuje tych informacji w kolejnych doświadczeniach. Podanie liczby powtórzeń każdego z doświadczeń uwiarygodniłoby otrzymane wyniki. W rozdziale Dyskusja wyniki własnych doświadczeń podsumowano oraz interpretowano na tle dostępnej literatury. Jest to ciekawe przedstawienie i krytyczna analiza, zwłaszcza w kontekście nowych danych dotyczących importu prawidłowej jak i zmutowanej, patogennej formy Sod1 do mitochondriów. Badania przedstawione w tej dysertacji nie zamykają tematu ale przyczyniają się do uzupełnienia dotychczasowej wiedzy o nowe odkrycia, a zarazem stają się źródłem kolejnych pytań dotyczących mitochondrialnej biogenezy oraz fizjologicznych skutków obecności zmutowanych form Sod1 w tym przedziale komórkowym. Szczególnie intersujące wydają się dalsze badania roli kompleksu MICOS w imporcie, dojrzewaniu i działaniu mitochondrialnych form SOD1, w normie i patologii ALS. Połączenie badań molekularnych w modelu drożdży z badaniami na komórkach i tkankach ssaków może przynieść kolejne dane przybliżające do poznania mechanizmu tej strasznej choroby. 4

5 Podsumowując, przedstawiona do recenzji dysertacja doktorska to bardzo dobra, rzetelna i wartościowa praca, a uzyskane wyniki są nowatorskie. Przeprowadzone badania odpowiadają na bardzo szczegółowe pytania dotyczące molekularnego mechanizmu transportu białka dysmutazy ponadtlenkowej typu 1 do mitochondriów. Różne, uzupełniające się podejścia badawcze sprawiają, ze wyniki są wiarygodne. Dyskusja jest zwięzła i wskazuje, ze przedstawione przez Doktorantkę badania uzupełniają wiedze o biogenezie prawidłowej oraz patogennych form mitochondrialnego białka Sod1. Z całym przekonaniem stwierdzam, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska spełnia warunki określone w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule naukowym w zakresie sztuki (Dz.U. nr 65, poz. 595 z późn. zm.) i wnoszę do Wysokiej Rady Naukowej Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN o dopuszczenie pani Aksany Varabyovej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Na podstawie przedstawionych argumentów i mojej bardzo wysokiej oceny recenzowanej tu dysertacji, składam do Rady Naukowej IBD im. M. Nenckiego wniosek o wyróżnienie tej pracy. Warszawa, dnia 28 maja 2015 roku. 5