Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek rezweratrolem.

Transkrypt

1 Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek rezweratrolem. Streszczenie Ogólnym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie funkcjonowania szlaku sygnalizacyjnego białka p53. Szczegółowym celem sformułowanym na początku projektu było poszukiwanie molekularnych przyczyn zróżnicowanego stopnia aktywacji szlaku p53, w komórkach U-2 OS i A549 traktowanych rezweratrolem oraz określenie biologicznych skutków tego traktowania. Wybór rezweratrolu początkowo był podyktowany zamiarem wykorzystania go jako aktywatora deacetylazy SIRT1, której właściwości były badane w naszym laboratorium. W trakcie badań postawiono hipotezę, że wiele właściwości rezweratrolu może wynikać z jego zdolności do generowania stresu replikacyjnego i aktywacji p53. Wyniki uzyskane w trakcie realizacji projektu badawczego skłoniły mnie do wykonania badań funkcjonalnych i epidemiologicznych dotyczących białka i genu PPM1D, który jest negatywnym regulatorem p53. Model badawczy zbudowałem w oparciu o linie komórkowe: niedrobnokomórkowego raka płuca A549 oraz mięsaka kościopochodnego U-2 OS. Są one powszechnie wykorzystywane w badaniach szlaku sygnalizacyjnego białka p53. Ich zaletą jest posiadanie prawidłowych sekwencje genów kodujących kluczowe regulatory cyklu komórkowego - p53 i RB. W badaniach stosowałem rezweratrol, polifenol roślinny, składnik niektórych produktów spożywczych, stosowany jako suplement diety. Zainteresowanie rezweratrolem wynika między innymi z jego właściwości przeciwnowotworowych. Eksperymenty dotyczące wpływu PPM1D na funkcjonowanie p53 prowadziłem na liniach komórkowych NCI-H1299 i SAOS-2, pozbawionych endogennego p53, w których za pomocą transfekcji uzyskałem ekspresję p53 i PPM1D z wektorów plazmidowych. Do badań wykorzystałem również linię U-2 OS, w której obniżono ekspresję endogennego PPM1D przy użyciu cząsteczek shrna wprowadzonych do komórek za pomocą dostępnych komercyjnie lentiwirusów. Badania rozpocząłem od określenia wpływu stężenia rezweratrolu na proces proliferacji komórek. Zastosowałem stężenia 5, 20 i 50 µm. Rezweratrol w stężeniu 50 µm równie silnie blokował proliferację obu linii komórkowych, dlatego to stężenie było wykorzystane w kolejnych doświadczeniach. Mieści się ono w zakresie stężeń stosowanych przez innych badaczy (Rusin i wsp., 2009). Określenie fazy cyklu komórkowego, w której rezweratrol hamuje podziały komórkowe stało się kolejnym krokiem badań. Eksperyment z wykorzystaniem cytometrii przepływowej wykazał, że już po 24 h w obu liniach komórkowych zanika pik charakterystyczny dla fazy G2 oraz że wraz z upływem czasu traktowania wzrastał odsetek komórek w fazie replikacyjnej (S). Ponadto można było zauważyć, że komórki A549 wykazują tendencję do zatrzymywania się w środkowej części fazy S, a komórki linii U-2 OS pod jej koniec. Obserwacje sugeruję, iż rezweratrol generuje stres replikacyjny (Rusin i wsp., 2009).

2 W kolejnym eksperymencie za pomocą techniki immunodetekcji (ang. Western blotting), określiłem profil ekspresji białek związanych z kontrolą cyklu komórkowego. Wzrost ilości p53 występujący w traktowanych rezweratrolem komórkach A549 i U-2 OS wskazywał na jego uczestnictwo w zahamowaniu proliferacji. Wzrost poziomu całkowitego p53, jak i jego form z fosforylowaną seryną 15 i 37 (fosforylacje indukowane uszkodzeniami DNA) był związany z akumulacją białka p21 (inhibitora cyklinozależnych kinaz, zahamowującego cykl komórkowy) jedynie w linii A549. Linia A549 posiadała charakterystyczny profil zmian ilości białek związanych z aktywacją szlaku sygnalizacyjnego białka p53 i regulacją cyklu komórkowego. Długotrwała ekspozycja na rezweratrol była związana z silna akumulacją białka p21, zanikiem ekspresji cykliny B1 i białka BRCA1 oraz niskim poziomem fosforylacji białka RB. Odmienny profil ekspresji wspomnianych białek w komórkach U2-OS wskazuje, że białko p53, mimo akumulacji i fosforylacji, nie ma zdolności do wpływania na poziom ekspresji swoich genów docelowych (Rusin i wsp., 2009). Komórki po dłuższej ekspozycji na rezweratrol wykazywały morfologię komórek starzejących się o hipertroficznej cytoplazmie i dużych jadrach komórkowych. Przeprowadziłem barwienie wykrywające aktywność β-galaktozydazy charakterystycznej dla zestarzałych komórek. Barwienie potwierdziło, że rezweratrol indukował fenotyp zestarzałej komórki, a test na klonogenność wykazał, że komórki utraciły potencjał replikacyjny. Warto zauważyć, że komórki U-2 OS w większym stopniu utraciły zdolność klonogenną (Rusin i wsp., 2009). Wcześniejsze eksperymenty oraz doniesienia literaturowe wskazywały na możliwy wpływ rezweratrolu na generowanie uszkodzeń DNA. Poziom fosforylacji histonu H2AX odzwierciedla poziom występujących w genomie podwójnych pęknięć DNA, które mogą być generowane bezpośrednio lub pośrednio, w wyniku procesów naprawczych. Przeprowadziłem analizę immunocytochemiczną poziomu fosforylacji tego histonu w komórkach po różnym czasie ekspozycji na działanie rezweratrolu. Obie linie wykazywały po 48 godzinach silny wzrost ilości fosforylowanej formy histonu H2AX (γh2ax). Co ciekawe, po tym czasie ilość γh2ax spadała w komórkach A549 i pozostała niezmienna w U-2 OS. Przypomina to wzór zmian ekspresji całkowitej i fosforylowanej formy BRCA1 (Rusin i wsp., 2009). W kolejnym cyklu doświadczeń użyłem rezweratrolu jako genotoksycznego aktywatora białka p53 i porównałem mechanizm aktywacji p53 przez rezweratrol i niegenotoksyczną substancję o nazwie AICAR, która jako analog AMP symuluje stres metaboliczny (wysoki stosunek AMP/ATP). Genotoksyczność badanych substancji była określana w oparciu o ocenę fosforylacji H2AX oraz fosforylacji kinazy ATM na serynie 1981 (marker aktywacji ATM). Aktywacja p53 zarówno przez genotoksyczny rezweratrol jak i przez niegenotoksyczny AICAR była osłabiana przez działanie substancji o nazwie Ku-55933, która jest inhibitorem kinazy ATM. Zatem aktywacja p53 w komórkach traktowanych AICAR lub traktowanych rezweratrolem jest zależna od kinazy ATM (Zajkowicz i wsp., 2011).

3 Określiłem również wpływ rapamycyny, swoistego inhibitora kinazy mtor na aktywację szlaku p53 w komórkach traktowanych rezweratrolem lub AICAR-em. Kinaza mtor zwiększa tempo translacji niektórych cząsteczek mrna, a rapamycyna jest stosowana w terapii przeciwnowotworowej oraz jako immunosupresant w transplantologii. Rapamycyna znacząco osłabiała aktywację p53 przez AICAR. Wpływ rapamycyny na aktywację p53 przez rezweratrol był nieznaczny. Wspomniane zależności zaobserwowałem zarówno na poziomie ilości transkryptów jak i białek (MDM2, p21) genów aktywowanych przez p53. Wyniki te wskazują, że dla aktywacji p53 przez AICAR wymagana jest aktywność kinazy mtor, natomiast jej wpływ na aktywację p53 przez rezweratrol jest stosunkowo niewielki. Co ciekawe zastosowanie dłuższego czasu ekspozycji komórek z rezweratrolem lub AICAR wykazało, że ten pierwszy jest znacznie silniejszym aktywatorem p53 i w przeciwieństwie do AICAR generuje fenotyp zestarzałej komórki (Zajkowicz i wsp., 2011). W kolejnej fazie projektu prowadziłem poszukiwanie przyczyn niezdolności komórek U-2 OS do aktywacji genów zależnych od p53 w warunkach traktowania rezweratrolem. Rozpocząłem od analizy poziomu mrna białek p21 i MDM2 (kodowanych przez markerowe geny aktywowane przez p53). Analiza wskazała, że upośledzenie aktywacji genów MDM2 i p21 w komórkach U-2 OS jest widoczne na poziomie ilości transkryptów (Zajkowicz i wsp., 2013). W celu sprawdzenia czy upośledzenie charakteryzujące komórki U-2 OS ma związek z niezdolnością do przeprowadzenia kluczowych modyfikacji potranslacyjnych, przeanalizowałem za pomocą dostępnych przeciwciał, zmiany fosforylacji i acetylacji aminokwasów w obrębie p53. W linii U-2 OS, poza nieznacznie słabszą fosforylacją seryny 37, nie ma różnic we wzorze modyfikacji potranslacyjnych p53 w porównaniu z komórkami A549 (Zajkowicz i wsp., 2013). Immunodetekcja niebadanych wcześniej regulatorów cyklu komórkowego w komórkach U-2 OS i A549, potwierdziła niezdolność komórek U-2 OS do represji genów białek regulujących cykl komórkowy i zależnych od p53 (CDC2, PLK1). Równocześnie potwierdziłem utrzymywanie się aktywacji kinazy ATM i zależnej od niej kinazy CHK2 w komórkach U-2 OS, co znacząco kontrastowało z wygaszeniem aktywności CHK2 w komórkach A549 po 96 godzinach traktowania rezweratrolem. Zmniejszenie ilości fosforylowanej formy CHK2 w linii A549 po 96 godzinach traktowania, jest związane z wzrostem ilości białka WIP1 (PPM1D), fosfatazy posiadającej zdolność defosforylowania ATM, CHK2 i p53. Co ciekawe, mimo bardzo silnej akumulacji fosfatazy WIP1 w komórkach U-2 OS nie można zauważyć jej związku ze stopniem fosforylacji ATM lub CHK2. Mimo wysokiej ekspresji WIP1 w komórkach U-2 OS, występuje w nich również duża ilość fosforylowanej kinazy ATM (Ser1981), co wydaje się sprzeczne w świetle wiedzy dotyczącej negatywnego wpływu WIP1 na fosforylację seryny 1981 ATM. Zwiększonej ilości białka WIP1 w komórkach U-2 OS towarzyszy również zwiększona ilość jego mrna. Wysoka akumulacja fosfatazy WIP1 w komórkach U-2 OS mogła świadczyć o mutacji w jej genie. Zdarza się

4 bowiem, że mutacjom generującym substytucje aminokwasowe towarzyszy wzrost ekspresji białka, czego dobrą ilustracją jest p53 (Zajkowicz i wsp., 2013). W celu sprawdzenia występowania mutacji w genie PPM1D w komórkach U-2 OS zsekwencjonowałem jego cdna. Okazało się, że w pozycji 1604 występuje substytucja nukleotydowa C>T. Heterozygotyczna zmiana nukleotydowa powoduje w kodonie 458 kodującym argininę pojawienie się kodonu STOP. Białko syntezowane przez transkrypt zawierający mutację jest około 25% krótsze od formy dzikiej. Na tym etapie badań założyłem, że powstające zmutowane białko jest niestabilne i ulega szybkiej degradacji, a obserwowana forma o długości około 70 kda (zgodnej z przewidywaną masą 67 kda) jest prawidłowym białkiem kodowanym przez dziki allel (Zajkowicz i wsp., 2013). Kolejnym etapem badań stało się określenie jaki wpływ ma akumulacja WIP1 na aktywację szlaku p53. Do tego celu wykorzystałem komórki U-2 OS z ekspresją WIP1 wyciszoną przy pomocy cząsteczek shrna, dostarczonych za pomocą lentiwirusów. Kontrolę stanowiły komórki traktowane lentiwirusem z konstruktami o przypadkowej sekwencji shrna. Przeprowadzony eksperyment w warunkach traktowania rezweratrolem wykazał wzrost fosforylacji Ser15 i Ser37, niewielki wzrost ekspresji p21 i niewielki wzrost fosforylacji CHK2 (Thr68) w komórkach z wyciszonym WIP1. Tak więc zwiększona ekspresja WIP-1 w U-2 OS osłabia stopień aktywacji p53 (Zajkowicz i wsp., 2013). W celu sprawdzenia czy upośledzenie stymulacji szlaku p53 w komórkach U-2 OS występuje w przypadku innych aktywatorów tego białka, potraktowałem komórki nutliną-3a - związkiem blokującym negatywne oddziaływanie MDM2 w stosunku do p53. Zaobserwowałem, że komórki U-2 OS traktowane nutliną wykazywały prawidłowy profil aktywacji (bądź represji) genów zależnych od p53 (p21, MDM2, CDC2, PLK1). W celu sprawdzenia jak nutlina wpłynie na aktywację p53 wywołaną rezweratrolem, komórki U-2 OS i A549 potraktowałem równocześnie oboma substancjami. Nutlina osłabiła wywołaną rezweratrolem aktywację kinaz ATM i CHK2 oraz obniżyła poziom fosforylacji p53, zwłaszcza w linii A549. Spadek aktywności kinaz obserwowano jako spadek poziomu fosforylacji aminokwasów służących za markery aktywacji. Immunocytochemiczne barwienie fosforylowanego histonu H2AX (modyfikowanego przez kinazy ATM, ATR), potwierdziło spadek aktywności systemów sygnalizacji uszkodzeń DNA w komórkach U-2 OS poddanych działaniu rezweratrolu i nutliny. Tak więc zastosowanie nutliny-3a, w nieznany sposób, zmniejsza oznaki genotoksycznego działania rezweratrolu. Temu zmniejszeniu towarzyszyła również modulacja przez nutlinę biologicznych skutków działanie rezweratrolu. Test klonogenności wykazał, że nutlina-3a chroni przed utratą potencjału replikacyjnego jaką wywołuje rezweratrol. Obie linie komórkowe traktowane 96 godzin rezweratrolem, nutliną lub oboma substancjami równocześnie wykazywały znaczne zahamowanie przyrostu populacji (test krótkoterminowy). Analiza ilości klonów uzyskanych po 10 dniach od wysiania komórek uprzednio traktowanych przez 96 godzin rezweratrolem, nutliną lub równocześnie nutliną i rezweratrolem wykazała, iż nutlina chroniła komórki przed utratą potencjału replikacyjnego wywołaną dziełaniem rezweratrolu. Ochronne działanie nutliny może być

5 związane z jej zdolnością do blokowania komórek w fazie G1 lub G2 cyklu komórkowego. Zakładając, że cytostatyczne działanie rezweratrolu ma miejsce w fazie syntezy DNA, nutlina blokuje komórki przed wchodzeniem w najbardziej wrażliwą fazę cyklu komórkowego. Efekt ochronny nuliny był wyraźniejszy w komórkach U-2 OS niż w A549 (Zajkowicz i wsp., 2013). Ostatnia część projektu dotyczyła funkcjonalnej charakterystyki mutacji genu PPM1D wykrytej w komórkach U-2 OS oraz poszukiwania mutacji w genie PPM1D w DNA krwi obwodowej pacjentów z niedobnokomórkowym rakiem płuca. Obecność mutacji PPM1D w komórkach U-2 OS została wykryta i opublikowana równolegle przez innych badaczy, którzy dodatkowo przeprowadzili funkcjonalną analizę zmutowanej wersji i wykazali, że mimo skrócenia białka generuje ona aktywną fosfatazę akumulującą się w komórce ze względu na większą stabilność. Celem mojego badania była weryfikacja tych wyników oraz ocena funkcjonalna jednego z rzadkich wariantów genu PPM1D (469:Lys>Glu) wykrytego we krwi pacjenta z rakiem płuca (Zajkowicz i wsp., 2015). W wyniku klonowania molekularnego otrzymałem wektory ekspresyjne (w oparciu o wektor pcdna3.1): pierwszy kodujący poprawną sekwencję cdna białka WIP1, drugi zawierający formę z mutacją w kodonie 469 (Lys>Glu) i trzeci wektor kodujący zmutowaną formę wykrytą w komórkach U-2 OS. Korzystając z komórek pozbawionych dzikiego białka p53 (NCI-H1299) ustaliłem, że przygotowane wektory produkują białko WIP1. Co ciekawe, zmutowane i skrócone białko ulega bardzo silnej akumulacji w transfekowanych komórkach. Analiza masy molekularnej białek produkowanych przez plazmidy doprowadziła do wniosku, że białko WIP1 wykrywane metodą Western blotting w komórkach U-2 OS jest zmutowaną, stabilną formą białka. Wcześniejsze założenia okazały się niepoprawne z tego powodu, że rzeczywisty rozmiar prawidłowego białka jest znacznie większy niż rozmiar wynikający z sekwencji aminokwasowej. W konsekwencji rozmiar białka skróconego jest bardzo podobny do oczekiwanego rozmiaru białka prawidłowego (Zajkowicz i wsp., 2015). Następnie sprawdziłem jak poszczególne formy WIP1 modulują zdolność białka p53 (produkowanego z wektora plazmidowego) do regulacji ekspresji genów. Badania wykonałem przy pomocy podwójnego testu lucyferazowego. Jako wektory reporterowe wykorzystałem plazmidy zawierające promotory genów zależnych od p53 (BAX i MDM2). Obecność p53 znacząco aktywowała testowane promotory. Jednak żadna z badanych form WIP1 nie modulowała zdolności p53 do aktywacji testowanych promotorów. Możliwe wyjaśnienia tej niespodziewanej obserwacji zostały przedstawione w Dyskusji załączonej publikacji (Zajkowicz i wsp., 2015). Inny rodzaj funkcjonalnej analizy mutantów WIP1 polegał na sprawdzeniu ich wpływu na stopień fosforylacji p53 produkowanego z wektora ekspresyjnego. Do komórek NCI- H1299 lub SAOS-2, oprócz wektora p53 wprowadziłem również wektory produkujące dziką lub zmutowane formy WIP1. Dodatkowo komórki SAOS-2 poddałem działaniu kamptotecyny (inhibitor topoizomerazy I silnie aktywujący p53). Ekspresja białek WIP1 znacząco osłabiała fosforylację seryny 15 p53. Dzikie białko oraz mutant kodonu 469 wpływały w podobnym

6 stopniu na fosforylację tego aminokwasu. Mutacja w kodonie 458, powodująca skrócenie białka, produkowała formę cechującą się zwiększoną zdolnością defosforylacji seryny 15 p53. Zauważyłem również, że ekspresja badanych form WIP1 nie wpływa na zdolność p53 do indukcji ekspresji endogennych białek p21 i MDM2, co potwierdza wniosek z eksperymentu z wektorami reporterowymi. Uzyskane wyniki potwierdziły więc wnioski innych badaczy, że mutant wykryty w komórkach U-2 OS koduje białko o zwiększonej stabilności, silnie akumulujące się w komórce i mające zdolność defosforylacji p53. Testowany przeze mnie wariant 469:Lys>Glu okazał się funkcjonalnie neutralny (Zajkowicz i wsp., 2015). U niewielkiego odsetka pacjentów (ok. 1%) z nowotworami okrężnicy, piersi lub jajnika, wykrywano w leukocytach mutacje powodujące przedwczesne zakończenie syntezy łańcucha białka PPM1D (podobne do mutacji wykrytej w komórkach U-2 OS). Przeprowadzone przez autorów testy funkcjonalne wykazały, że tego typu mutacje powodują zwiększoną aktywność PPM1D. Postanowiłem sprawdzić czy w DNA krwi obwodowej pacjentów z rakiem płuca, leczonych w Centrum Onkologii w Gliwicach, występują podobne mutacje. Badane próbki DNA zgromadzono w ramach innych projektów badawczych. W celu poszukiwania mutacji zsekwencjonowałem odpowiedni fragment genu PPM1D w próbkach DNA z krwi obwodowej 543 pacjentów. U pięciu pacjentów wykryłem delecje nukleotydowe powodujące przesunięcie ramki odczytu i skrócenie białka. Obraz elektroforetyczny sugeruje, że wykryte zmiany sekwencji mają charakter mutacji mozaikowych. Jest to pierwsza obserwacja mutacji genu PPM1D we krwi obwodowej pacjentów z rakiem płuca. Sposób powstawania (spontaniczne lub indukowane chemioterapią) i znaczenie kliniczne takich mutacji nie jest znane. Jest to bardzo oryginalna obserwacja mogąca mieć potencjalne znaczenie praktyczne, jeśli okaże się, że przebieg choroby pacjentów z podobnymi mutacjami jest inny niż u pacjentów bez mutacji. Ten temat badawczy będzie przedmiotem dalszych analiz w ramach innych projektów naukowych (Zajkowicz i wsp., 2015).