Uniwersytet Łódzki. prof. dr hab. Wanda M. Krajewska Katedra Cytobiochemii Łódź 20 lipca 2016 r.

Transkrypt

1 Uniwersytet Łódzki prof. dr hab. Wanda M. Krajewska Katedra Cytobiochemii Łódź 20 lipca 2016 r. Opinia pracy doktorskiej mgr Jolanty Zięby Senescencja komórek glejaka wielopostaciowego in vitro poszukiwanie przyczyn i próba analizy mechanizmu Przedstawiona do oceny praca mgr Jolanty Zięby wykonana została w Zakładzie Biologii Nowotworów Uniwersytetu Medycznego w Łodzi kierowanym przez prof. dr hab. n. med. Piotra Rieske i stanowi kontynuację badań, których celem jest opracowanie procedury pozwalającej na otrzymywanie stabilnych linii komórek glejaka wielopostaciowego wyprowadzanych z hodowli pierwotnych. Standardem w leczeniu glejaków są zabiegi chirurgiczne wspomagane radio- i chemioterapią. Jednak ze względu na lokalizację i specyficzny sposób wzrostu tego nowotworu oraz wysoką odporność na konwencjonalne terapie, glejak wielopostaciowy jest najbardziej złośliwym oraz źle rokującym pierwotnym guzem mózgu. Warunkiem sine qua non dla poszukiwania nowych, bardziej skutecznych strategii terapeutycznych jest dostępność właściwych modeli badawczych, mających zastosowanie w badaniach zarówno biologii i biologii molekularnej tego nowotworu, jak i efektywności terapeutycznej nowych związków przeciwnowotworowych. Modelem badawczym pierwszego wyboru są linie komórkowe. Jednak jak udowodniono w pracach realizowanych przez zespół prof. Piotra Rieske hodowle pierwotnych komórek glejaka wielopostaciowego ulegają senescencji. Celem badań przedstawionych w ocenianej dysertacji doktorskiej było przybliżenie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Stabilizacja linii komórkowych in vitro jest warunkiem niezbędnym nie tylko dla zrozumienia mechanizmów prowadzących do 1

2 powstawania glejaka wielopostaciowego i testowania nowych związków o potencjalnych właściwościach przeciwnowotworowych, ale jej indukowanie może być wykorzystywane jako strategia terapeutyczna. Oceniana praca licząca 106 stron przygotowana została w klasycznym układzie w zakresie nauk biologii medycznej. W 16-stronicowym wstępie w zwięzły, kompetentny sposób przedstawiono zagadnienie dotyczące patogenezy, klasyfikacji i hipotez odnośnie do pochodzenia glejaka wielopostaciowego, a także zagadnienia związane z senescencją komórek i udziałem w tym procesie autofagii i zatrzymania proliferacji. Dobór zagadnień zaprezentowanych w tej części pracy, jako wprowadzenie w problematykę badawczą będącą przedmiotem badań, nie budzi wątpliwości. Logicznie zaplanowane eksperymenty zrealizowane zostały za pomocą analiz bioinformatycznych oraz szerokiego spektrum właściwych, adekwatnych do kolejnych zadań badawczych metod biologii komórkowej i molekularnej, w tym technik mikroskopowych enzymocytochemicznych i immunocytochemicznych, Western blot, PCR w czasie rzeczywistym, sekwencjonowania DNA, multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji, transdukcji genów, transfekcji komórek czy ksenoprzeszczepów komórek hodowli pierwotnej ludzkiego glejaka wielopostaciowego u myszy z niedoborem immunologicznym. Zakres badań i podejść metodycznych budzi uznanie. Badania realizowano na liniach wyprowadzonych z materiału pochodzącego od 56 pacjentów Wojewódzkiego Specjalistycznego Szpitala w Olsztynie, a także liniach komórkowych ustabilizowanych w Zakładzie Biologii Nowotworów UMed w Łodzi oraz liniach komórkowych komercyjnie dostępnych, o różnym, jak wykazano w pracy, poziomie senescencji. Obok hodowli komórek w warunkach standardowych oraz 3D prowadzono hodowle w obecności różnego mikrośrodowiska. Dla uwiarygodnienia wyników komórki glejaka wielopostaciowego i ich senescencję oceniano na podstawie wielu testów, w tym ekspresji kwaśnego białka włókienkowego (GFAP), inkorporacji bromodeoksyurydyny (BrdU), aktywacji β-galaktozydazy (SA-β-Gal) i występowania skupisk heterochromatyny związanych ze starzeniem komórkowym (SAHF), a także obecności uznanych markerów komórek macierzystych, tj. nestyny i białka SOX2. Wyniki przedstawiono w formie 5 zestawień tabelarycznych i 18 rycin, w tym prezentujących w sposób bardzo przekonywający wyniki analiz mikroskopowych. Na podkreślenie zasługuje fakt, że w pracy wykorzystano metodę 2

3 barwienia preparatów mikroskopowych pozwalającą na ocenę proliferacji, senescencji i fenotypu na poziomie pojedynczej komórki, która po raz pierwszy zastosowana została w Zakładzie Biologii Nowotworów UMed w Łodzi. Uzyskane wyniki właściwie zinterpretowano i omówiono w kontekście dostępnej literatury przedmiotu w 14-stronicowej dyskusji zakończonej wnioskami sformułowanymi w opisowej formie. Najważniejszymi osiągnięciami w prezentowanej pracy jest wykazanie, że senescencja komórek glejaka wielopostaciowego w hodowlach pierwotnych nie jest zależna w sposób bezpośredni od: Współwystępowania mutacji genów TP53 i CDKN2A stwierdzanych w ponad 40% linii komórkowych, szczególnie, że współistnienie tych mutacji identyfikuje się jedynie w około 4% materiału uzyskanego od pacjentów (Tab. 5 i 6). Mutacji w onkogenie HRAS prowadzącej do podstawienia reszty glicyny w pozycji 12. kodowanego białka resztą waliny. Mutacji w regionie od -124 do -146 promotora genu htert kodującego podjednostkę katalityczną telomerazy, skutkujących obniżeniem poziomu tego enzymu i w konsekwencji skracaniem telomerów. Aktywowania przez duży antygen T wirusa SV40 oraz białko Bmi1 hamujące starzenie się komórek i apoptozę, szlaków przekazywania sygnałów prowadzących do immortalizacji,. Autofagii jako procesu, który może towarzyszyć senescencji. Obecności w hodowli komórek glejaka wielopostaciowego inaktywowanych mitomycyną fibroblastów i inhibitora Rho-zależnej kinazy stymulującej proliferację. Ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrośrodowisku. Propagacji in vivo komórek hodowanych in vitro. Uzyskane w pracy wyniki pozwalają z jednej strony wskazać, które z zaburzeń na poziomie molekularnym i komórkowym nie wydają się być odpowiedzialne za senescencję hodowli pierwotnych komórek glejaka wielopostaciowego, z drugiej natomiast, co zasługuje na szczególne podkreślenie, że powszechnie stosowane pojęcie senescencja odnosi się do zjawisk bardziej złożonych niż mogłoby to wynikać z prostej definicji. Wydaje się, że w przypadku komórek nowotworowych senecesja 3

4 może być zjawiskiem odwracalnym, a odwracalność tego zjawiska może zależeć od mechanizmu je wywołującego. W świetle zaprezentowanych w pracy wyników wykazujących, że z 56 wyprowadzanych hodowli pierwotnych 7, tj. około 12% udało się ustabilizować, a także udokumentowanej niejednorodności genetycznej co najmniej dwóch podtypów glejaka wielopostaciowego powstaje pytanie czy na senecesję czy jej brak w określonych hodowlach pierwotnych nie ma wpływu heterogenność materiału klinicznego i zróżnicowanie profilu genetycznego komórek. Innymi słowy czy zakładając hodowlę pierwotną i poszukując mechanizmu senescencji nie powinno uwzględniać się podtypu glejaka wielopostaciowego? Proszę Doktorantkę o przedstawienie komentarza w tej kwestii. Pozostałe uwagi i pytania: Przy bardzo rzetelnej dokumentacji rezultatów prowadzonych badań dziwi brak wyników dotyczących unieśmiertelnionych perycytów, jako kontroli pozytywnej po transdukcji genami SV40 i Bmi1. Proszę o doprecyzowanie informacji odnośnie do liczby ustabilizowanych pierwotnych hodowli glejaka wielopostaciowego na stronie 47 podano liczbę 7, a na stronie 62 liczbę 10. W opisie materiału nie zawarto informacji o wszystkich wykorzystywanych w badaniach liniach komórkowych, na przykład raka prostaty, fibroblastów czy perycytów (str ). Czy ustabilizowaną linię GB1, która ustabilizowała się spontanicznie pomimo obecności wysokiego odsetka komórek senescentnych w pierwszych pasażach i może stanowić szczególny model w badaniach mechanizmów senescencji, otrzymano podczas realizacji ocenianej pracy? Czy nie byłoby wskazanym przeanalizowanie wyników uzyskanych dla tej linii? Stwierdzenie cyt. Komórki prawidłowe, w których zachowana jest niewielka ekspresja tego enzymu (telomerazy) to limfocyty, komórki nabłonkowe oraz komórki rozrodcze. (str. 18) wymagałoby doprecyzowania. Mutacja onkogenu RAS powoduje aktywację nie tylko szlaku RAF/MEK/ERK jak podano na stronie 19, ale również wielu innych szlaków sygnałowych, na przykład z udziałem białek PI3K, PLC, RAL czy JNK. Białko Kip1 w przeciwieństwie do WAF1 ma masę cząsteczkową 27 kda, a nie 21 kda, skąd jego akronimem jest p27 Kip1, a nie p21 Kip1 (str. 21). 4

5 Wirus EBV to wirus Epsteina-Barra a nie Epstein-Ball (str. 25). Oceniając stronę formalną dysertacji stwierdzam, że układ pracy jest poprawny, rozprawa przygotowana została z bardzo dużą starannością pod względem zarówno językowym i edytorskim, jak i dokumentacji wyników. W pracy wykorzystano około 140 pozycji literaturowych, a jej przejrzystość wzbogaca wykaz skrótów i symboli oraz streszczenie w języku polskim i angielskim. Uchybienia są bardzo nieliczne, jak na przykład odwoływanie się do dwóch prac autorstwa Stoczyńska-Fidelus i wsp. z roku 2014, bez zaznaczenia, o którą pracę chodzi (np. str. 47, 48, 69, 71); przyjętym zwyczajem jest opisywanie pochodzących z tego samego roku prac kolejnymi, małymi literami alfabetu. Podsumowanie Pracę doktorską mgr Jolanty Zięby pt. Senescencja komórek glejaka wielopostaciowego in vitro poszukiwanie przyczyn i próba analizy mechanizmu oceniam w pełni pozytywnie. Przedstawiona dysertacja jest dowodem znaczącej aktywności naukowej Doktorantki i opanowania bogatego warsztatu badawczego. Praca zawiera wyniki oryginalnych poszukiwań mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za senecesję komórek glejaka wielopostaciowego w hodowlach in vitro. Uzyskane wyniki wzbogacają wiedzę nie tylko odnośnie do biologii komórek glejaka wielopostaciowego, ale zjawiska senescencji komórek nowotworowych w ogóle. Podsumowując stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr Jolanty Zięby spełnia wymogi obowiązujących przepisów zawartych w art. 13 znowelizowanej ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki z dnia 14 marca 2003 roku (Dz. U. nr 65, poz. 595, obecnie Dz. U. z 22 grudnia 2014 r., poz. 1852, tekst jednolity). Biorąc pod uwagę wartość naukową rozprawy, rozległy zakres badań, a także fakt, że wyniki stanowiące jej podstawę weszły w skład 6 artykułów opublikowanych w międzynarodowych czasopismach indeksowanych przez Journal Citation Reports, tj. Anticancer Research (2014, 2015), BMC Cancer (2014), PLoS One (2014, 2015) i Tumor Biology (2014), praca w mojej opinii zasługuje na wyróżnienie. 5