Raport zbiorczy z wykonanych badań

Transkrypt

1 Raport zbiorczy z wykonanych badań ZADANIE 2 Określenie aktywności przeciwpłytkowej preparatów polifenolowych pochodzenia roślinnego Zadanie badawcze projektu Przygotowanie preparatów polifenolowych pochodzenia roślinnego o właściwościach przeciwpłytkowych i kardioprotekcyjnych (FLAWOPIRYNA), współfinansowanego przez Unię Europejską, ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, nr UDA-POIG /08. Łódź

2 Spis treści 1 Dane ogólne Jednostka realizująca zadanie Kierownik jednostki wykonującej zadanie Wykonawcy Kierownicy zadania: Wykonawcy pracujący w szpitalu przy ul. Żeromskiego Wykonawcy pracujący w szpitalu przy ul. Sterlinga 1/ Podwykonawcy Okres wykonywania badań Osoby odpowiedzialne za sporządzenie raportu ( , telefon) Wprowadzenie Cel badań i uzasadnienie podjęcia tematu Pytania, na które chcemy otrzymać odpowiedź Ogólne założenia i projekt eksperymentu Wybór typu projektu eksperymentu Podstawowe cechy wybranego planu eksperymentu Zezwolenia na eksperymenty Zezwolenie na eksperymenty z udziałem ludzi Zezwolenie na eksperymenty na zwierzętach Sposób doboru próby Liczebność zbioru danych dla zapewnienia poprawności wyników Rodzaj i typ zmiennych Określenie jednostek obserwacyjnych Typ danych Materiał i metody Opis badanej populacji Pobieranie i opracowanie krwi do badań i przygotowanie materiału do badań Pobieranie krwi Przedwstępna selekcja preparatów... Błąd! Nie zdefiniowano zakładki Przygotowanie roztworów roboczych preparatów polifenolowych

3 4.3 Podstawowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi Badanie agregacji płytek krwi metodą impedancyjną Badanie agregacji płytek krwi metodą optyczną Badanie aktywacji płytek krwi metodą cytometrii przepływowej Kryteria punktowe stosowane do oceny przeciwpłytkowych właściwości badanych preparatów Dodatkowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi oraz metody badania układu krzepnięcia Ocena in vitro właściwości przeciwpłytkowchj preparatów polifenolowych poprzez pomiar poziomu fosforylacji białka VASP metodą cytometrii przepływowej Ocena in vitro właściwości przeciwzakrzepowych preparatów polifenolowych z wykorzystaniem trombolestometrii Ocena in vitro właściwości przeciwzakrzepowych preparatów polifenolowych z wykorzystaniem wybranych badań kolagulologicznych Opis analiz statystycznych i testów wykorzystanych w badaniu Wybór analizy statystycznej jedno- lub wielowymiarowej Wybór testów statystycznych dwu- lub jednostronnych Postać założeń wymaganych w analizie Czy zebrane dane są odpowiednie dla proponowanej analizy? Zastosowanie testów sparowanych Wyniki Wyniki badania pierwszej serii preparatów Wstępna ocena preparatów polifenolowych pierwszej serii Wprowadzenie do wyników badań zahamowania agregacji płytek krwi przez preparaty polifenolowe pierwszej serii Podsumowanie wyników uzyskanych w czasie badania pierwszej serii preparatów polifenolowych Wyniki badania drugiej serii preparatów Wprowadzenie do wyników badań zahamowania agregacji płytek krwi przez preparaty polifenolowe drugiej serii Wstępna ocena preparatów polifenolowych drugiej serii Podsumowanie wyników uzyskanych w czasie badania drugiej serii preparatów polifenolowych

4 5.3 Wyniki badania trzeciej serii preparatów Wprowadzenie do wyników badań zahamowania agregacji płytek krwi przez preparaty polifenolowe trzeciej serii Wstępna ocena preparatów polifenolowych trzeciej serii Podsumowanie wyników uzyskanych w czasie badania trzeciej serii preparatów polifenolowych Wyniki badań uzupełniających Wyniki badań in vitro oceniające właściwości przeciwpłytkowe preparatów polifenolowych poprzez pomiar poziomu fosforylacji białka VASP metodą cytometrii przepływowej Podsumowanie wyników badań Wyniki badań in vitro oceniające właściwości antykoagulacyjne preparatów polifenolowych z wykorzystaniem trombolestometrii Wpływ in vitro preparatów polifenolowych pochodzenia roślinnego na podstawowe parametry koagulologiczne Streszczenie wyników uzyskanych w czasie realizacji zadania nr Cel badań i uzasadnienie podjęcia tematu Materiał i metody Opis badanej populacji Podstawowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi Dodatkowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi oraz metody badania układu krzepnięcia Wyniki Wyniki badań podstawowych Wyniki badań dodatkowych

5 1 Dane ogólne 1.1 Jednostka realizująca zadanie Łódź, ul. Żeromskiego 113 tel. (042) , fax. (042) Kierownik jednostki wykonującej zadanie prof. dr hab. Cezary Watała, 1.3 Wykonawcy Kierownicy zadania: dr hab. Jacek Golański, biolog, diagnosta laboratoryjny, dr Marcin Różalski, biochemik, Wykonawcy pracujący w szpitalu przy ul. Żeromskiego 113 mgr Lidia Stańczyk Wykonawcy pracujący w szpitalu przy ul. Sterlinga 1/3 mgr Anna Kosiorek, biochemik mgr Kamila Syska, biochemik Podwykonawcy Poradnia wielospecjalistyczna Zdrowie Umowa /POIG/2010 z dnia 22 lutego 2010r., Rekrutacja, badania lekarskie oraz konsultacje wyników badań laboratoryjnych u 300 zdrowych dawców krwi i 240 pacjentów po interwencjach wieńcowych Samodzielny Publiczny Zakład Opieki Zdrowotnej Uniwersytecki Szpital Kliniczny im. Wojskowej Akademii Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi- Centralny Szpital Weteranów Umowy 3/4/POIG/ z dnia 22 lutego 2010r., Pobranie krwi od 440 pacjentów pozostających na długotrwałym leczeniu z zastosowaniem kwasu acetylosalicylowego oraz wykonanie podstawowych badań laboratoryjnych. 5

6 Pobranie krwi od 500 zdrowych dawców krwi, wykonanie podstawowych badań laboratoryjnych. Uniwersytet Łódzki. Umowa nt 4 POIG/7/2010 z dnia r. Wykonanie pomiarów aktywacji i reaktywności ludzkich płytek krwi oraz komórek śródbłonka naczyniowego metodą cytometrii przepływowej. Załącznik nr Okres wykonywania badań od r. do r. 1.5 Osoby odpowiedzialne za sporządzenie raportu ( , telefon) dr hab. Jacek Golański, biolog, diagnosta laboratoryjny, jacek.golanski@umed.lodz.pl dr Marcin Różalski, biochemik, marcin.rozalski@umed.lodz.pl 6

7 2 Wprowadzenie Wszystkie preparaty otrzymywane z zadania nr 1 oznaczano odpowiednimi kodami. Analizowana była zdolność patentowa preparatów oraz wykonywano oznaczenia ich cytotoksyczności (zadanie 5) W kolejnych trzech transzach (cyklach badawczych) Preparaty poddano przedwstępnej selekcji zgodnie ustaloną procedurą. Wszystkie preparaty, które przeszły pozytywnie przedwstępną selekcję zostały zakwalifikowane do I etapu selekcji (pomiary agregometryczne). 4 preparaty były kwalifikowane do II etapu selekcji (agregacja przy niższych stężeniach badanych preparatów polifenolowych i metoda cytometrii przepływowej) i wyłaniano jeden preparat, przekazywany do opracowania przez następne zadania (3,4,6,7,8). W trakcie realizacji zadania 2, w trzech kolejnych cyklach badawczych, do dalszej fazy badań zakwalifikowano 3 preparaty polifenolowe. 2.1 Cel badań i uzasadnienie podjęcia tematu Realizacja zadania 2 miała na celu określenie właściwości przeciwpłytkowych preparatów polifenolowych dostarczanych w toku realizacji Zadania 1. Celem zadania 2 było ustalenie listy rankingowej preparatów. Preparaty na liście rankingowej są uszeregowane przy uwzględnieniem ich siły właściwości przeciwpłytkowych. Lista rankingowa powstała w toku realizacji zadania 2 została zweryfikowana w oparciu o dane uzyskane w toku realizacji zadania 5 (cytotoksyczność), co doprowadzi do powstania ostatecznej listy rankingowej. Preparaty zajmujące czołowe miejsca (1-3) na liście będą następnie testowane w zadaniach 3,4,6,7,8. Selekcja właściwości przeciwpłytkowych obejmowała dwa etapy. W etapie pierwszym badana była zdolność preparatów polifenolowych (w stężeniach 7,5 oraz 15 μg/ml) do hamowania agregacji płytek krwi metodą turbidymetryczną i impedancyjną. Preparaty, które uzyskały największą liczbę punktów i posiadały zdolność patentową badane były w drugim etapie w stężeniach 1,5; 3; 6 μg/ml. W tym etapie określany był wpływ preparatów na agregację płytek krwi oraz na ekspozycję na powierzchni płytek selektyny P i zdolność wiązania płytek krwi przeciwciał PAC Pytania, na które chcemy otrzymać odpowiedź Problem badawczy Ekstrakty roślinne bogate w polifenole powszechnie uznawane są za substancje o działaniu antyagregacyjnym. Do oceny przeciwpłytkowej aktywności leków powszechnie stosowana jest agregacja impedancyjna i turbidymetryczna. Na podstawie wyników badań z zastosowaniem w/w metod przyjęta została teoria badacza, mówiąca, że polifenole roślinne posiadają włąsciwości przeciwpłytkowe (hamują reaktywność płytek krwi), oraz że zastosowanie preparatów polifenolowych 7

8 do hamowania agregacji in vitro pozwoli ocenić ich zastosowanie jako potencjalnych leków przeciwpłytkowych Hipotezy dla I etapu selekcji preparatów Hipoteza badawcza 1 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 7,5; 15 μg/ml hamują w teście agregacji impedancyjnej reaktywność płytek krwi zdrowych dawców Hipoteza badawcza 2 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 7,5; 15 μg /ml hamują w teście agregacji turbidymetrycznej reaktywność płytek krwi zdrowych Hipoteza badawcza 3 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 7,5; 15 μg/ml hamują w teście agregacji impedancyjnej reaktywność płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA Hipoteza badawcza 4 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 7,5; 15 μg /ml hamują w teście agregacji turbidymetrycznej reaktywność płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA Hipotezy dla II etapu selekcji preparatów Hipoteza badawcza 1 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują w teście agregacji impedancyjnej reaktywność płytek krwi zdrowych dawców Hipoteza badawcza 2 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują w teście agregacji turbidymetrycznej reaktywność płytek krwi zdrowych. 8

9 Hipoteza badawcza 3 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują przyłączanie przeciwciał anty-cd62p do selektyny P w badaniu cytometrycznym płytek krwi zdrowych dawców po 60 nin. inkubacji pełnej krwi w temp. pokojowej Hipoteza badawcza 4 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują przyłączanie przeciwciał PAC-1 do receptora fibrynogenu w badaniu cytometrycznym płytek krwi zdrowych dawców po 60 nin. inkubacji pełnej krwi w temp. pokojowej Hipoteza badawcza 5 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują w teście agregacji impedancyjnej reaktywność płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA Hipoteza badawcza 6 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują w teście agregacji turbidymetrycznej reaktywność płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA Hipoteza badawcza 7 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują przyłączanie przeciwciał anty-cd62p do selektyny P w badaniu cytometrycznym płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA po 60 nin. inkubacji pełnej krwi w temp. pokojowej Hipoteza badawcza 8 W projekcie weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniach w przeliczeniu na kwas galusowy wynoszących: 1,5; 3; 6 g/ml hamują przyłączanie przeciwciał PAC-1 do receptora fibrynogenu w badaniu cytometrycznym płytek krwi pacjentów pozostających na leczeniu ASA po 60 nin. inkubacji pełnej krwi w temp. pokojowej. 9

10 3 Ogólne założenia i projekt eksperymentu Zarówno w przypadku pomiaru agregacji płytek krwi u pacjentów jak i dawców prowadzono pomiary kontrolne. Kontrole stanowiły osocze/krew pełna bez preparatu polifenolowego. Podobnie było w przypadku pomiarów z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Kontrolę stanowiła krew pełna bez preparatu. Nie wyodrębniono oddzielnej kontrolnej grupy pacjentów/dawców. 3.1 Wybór typu projektu eksperymentu Badania sparowane w układzie niekompletnie zrandomizowanym (randomizacja w warstwach). 3.2 Podstawowe cechy wybranego planu eksperymentu. Jednostką obserwacyjną jest osocze lub krew pełna pacjentów/zdrowych dawców. Eksperyment polegał na pomiarze agregacji płytek krwi u pacjentów/dawców wywołanej agonistą (ADP, kolagenem lub kwasem arachidonowym). Do każdej próby badanej dodano odpowiednią ilość testowanego preparatu polifenolowego. Preparaty polifenolowe w pierwszym etapie testowano w stężeniach 7,5 i 15 μg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy, zaś w etapie drugim w stężeniach 1,5; 3; 6 μg/ml. Ponad to, w etapie drugim badano także ekspresję selektyny P oraz przyłączanie do płytek krwi przeciwciała PAC-1 metodą cytometrii przepływowej po spontanicznej aktywacji płytek krwi (inkubacja 60 min). Do każdej próby badanej dodano odpowiednią ilość testowanego preparatu polifenolowego tak, aby jego stężenie w próbie wynosiło: 1,5; 3; 6 μg/ml. 3.3 Zezwolenia na eksperymenty Zezwolenie na eksperymenty z udziałem ludzi. Pobieranie krwi poprzedzone było wyrażeniem pisemnej zgody osoby na badania (po wyjaśnieniu celu i charakteru badania). Na przeprowadzenie eksperymentu została wydana zgoda Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi numer RNN/13/07/KB z dnia r Zezwolenie na eksperymenty na zwierzętach. Nie dotyczy. 10

11 3.4 Sposób doboru próby. Każdy preparat przebadano na losowo dobranej grupie zdrowych dawców oraz pacjentów przyjmujących leki przeciwpłytkowe. 3.5 Liczebność zbioru danych dla zapewnienia poprawności wyników. Szacowanie wielkości próby wykonano na podstawie parametru agregacji maksymalnej (A max ), przyjmując: Poziom istotności = 0.05 Moc testu = 0.8 Oznaczenia wykonywane są w układzie sparowanym (pomiary przed i po podaniu testowanego związku). Skuteczność inhibicyjna flawonoidów jest niska i szacujemy ją na 10%. Zmienność pomiarową przyjmujemy jako 10%. Po przyjęciu takich warunków minimalna liczba powtórzeń wynosi 10 osób. 3.6 Rodzaj i typ zmiennych Określenie jednostek obserwacyjnych. Jednostką obserwacyjną jest osocze bogatopłytkowe i krew pełna pobrane od zdrowych dawców i pacjentów przyjmujących leki przeciwpłytkowe Typ danych Cechy ilościowe (wartość agregacji płytek krwi wyrażona jako Aggregation Score (AS),będącego iloczynem AUC x Amax, odsetek obiektów posiadających antygen dla przeciwciała PAC-1 lub selektynę P). Dane sparowane. 4 Materiał i metody 4.1 Opis badanej populacji Właściwości przeciwpłytkowe preparatów polifenolowych testowano na grupie dawców i pacjentów. W zespole pracującym w szpitalu kardiologicznym przy ul. Sterlinga 1/3 przebadano 440 pacjentów przyjmujących leki przeciwpłytkowe (średnia wieku 58 lat). Stosunek płci przebadanych osób odzwierciedla stosunek płci w populacji osób przyjmujących leki przeciwpłytkowe. W zespole pracującym w szpitalu przy ul Żeromskiego przebadano 500 zdrowych dawców (średnia wieku 39,5 lata). 11

12 4.2 Pobieranie i opracowanie krwi do badań i przygotowanie materiału do badań Od każdej osoby biorącej udział w eksperymencie pobierano około 30 ml krwi żylnej. U wszystkich osób uczestniczących w badaniach, niezależnie od badania płytek krwi, wykonywano badanie morfologii krwi oraz badania biochemiczne Pobieranie krwi 1) Przygotować probówki (S-Monovette, Sarstedt) do pobrania krwi u pacjenta: - probówkę morfologiczną (z czerwonym korkiem) 1,2 ml krwi na EDTA - probówkę biochemiczną (z brązowym korkiem) 4,7 ml krwi na skrzep - dwie probówki Neutral S-Monovette na badanie agregacji (metoda turbidymetryczna) o objętości 7,5 ml (92 x 15 mm, 7.5 ml), do probówek dodać 0,75 ml 0,11 M buforowanego cytrynianu sodu. - jedną probówkę Neutral S-Monovette na badanie agregacji (Multiplate) o objętości 4,5 ml, do probówki dodać 0,45 ml hirudyny (Refludan- lepirudyna, syntetyczny analog hirudyny o stężeniu 250 g/ml). 2) Wypełnić skierowanie na badania analityczne zakreślając na formularzu: - morfologię krwi obwodowej - glukozę - lipidogram - hs-crp - Bilirubinę - ASPAT, ALAT - Mocznik i kreatyninę 3) Opisać probówki danymi dawcy. 4) Zanieść probówki do poradni kardiologicznej lub pokoju nr 30 i oczekiwać na przyjście umówionego dawcy. Przekazać dawcy informację o realizowanym projekcie, oraz uzyskać podpis pod zgodą na pobranie. 5) Od każdego zdrowego dawcy/pacjenta pobrać krew do uprzednio przygotowanych probówek, w zamkniętym systemie podciśnieniowym za pomocą igieł S-Monovette Needles (0.9 mm /38 mm) lub Multifly Needles (0.9 mm /19 mm) 6) Pobraną krew przenieść do pokoju nr 35 (Sterling) lub do pokoju nr 4 (Żeromski) w hermetycznym pojemniku oznakowanym nalepką skażenie biologiczne 7) Zaraz po pobraniu: Probówkę biochemiczną odstawić na 60 min (37 C). Po inkubacji odwirować(4000 obr./min, 10 min). Odporcjować 2 próbki po 150 l do oznaczenia TxB w surowicy, 2 x 12

13 500 l surowicy jako zapas do badań biochemicznych oraz 300 l na badania analityczne. Z probówki morfologicznej odpipetować: 1 x 500 l na badania genetyczne 8) Do laboratorium przekazać 300 l surowicy w probówce z analizatora biochemicznego (typ probówki uzgodnić z laboratorium) oraz resztę krwi w probówce morfologicznej na badanie morfologii (ze skierowaniem) Ocena przydatności preparatów do badań in vitro Problem badawczy Celem oceny przydatności preparatów do badań in vitro polifenolowych jest wybór preparatu, który spełnia następujące kryteria: jest rozpuszczalny w rozpuszczalnikach nieszkodliwych dla komórek, nie powoduje wytrącania składników osocza, nie powoduje zabarwienia osocza w sposób zakłócający pomiary agregacji płytek krwi metodą turbidymetryczną, nie zmienia ph środowiska. Ekstrakty roślinne bogate w polifenole są na ogół słabo rozpuszczalne w wodzie, opisano także wiązanie się polifenoli z białkami osocza i lipidami. Tego typu wiązanie może teoretycznie doprowadzić do powstawania nierozpuszczalnych związków i wytrącania się osadu. Ponadto naturalna barwa polifenoli może utrudniać odczyty agregacji turbidymetrycznej, a pozostałe po ekstrakcji w liofilizacje związki mogą zmieniać ph środowiska. Powyższe zestawienie wykazuje celowość badania wybranych fizyko-chemicznych właściwości przed przystąpieniem do testów hamowania aktywacji/reaktywności płytek krwi Hipotezy Hipoteza badawcza W zaplanowanym badaniu weryfikowana będzie ogólna hipoteza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe w stężeniu 15 μg kwasu galusowego/ml dodane do osocza nie zmieniają warunków prowadzenia badań w sposób uniemożliwiający wykonanie pomiarów agregacji metodą turbidymetryczną, umożliwiając przeprowadzenie czynnościowych badań płytek krwi. 13

14 Metodyka badań Materiał osocze ludzkie ubogopłytkowe polifenolowe ekstrakty roślinne Odczynniki: DMSO (stężenie docelowe 10%) PBS (ph=7,4, bez Ca i Mg) Metody: makroskopowa ocena obecności osadu pomiar ph Jednostki badawcze preparat spulowanego osocza Jednostki obserwacyjne Próbki osocza ubogopłytkowego z dodanym preparatem polifenolowym roztwory liofilizatów o stężeniu 7,5 mg liofilizowanego preparatu polifenolowego/ml W związku z tym, że wykorzystywane jest jednorodne osocze spulowane od wielu dawców, eksperyment dla danego preparatu dokonywany jest jednorazowo, natomiast pomiar wartości każdego parametru przeprowadzany jest w 3 powtórzeniach Wykonanie oceny przydatności preparatów do badań in vitro poprzedzających selekcję preparatów polifenolowych Zanim preparat zostanie zakwalifikowany do badań agregometrycznych, poddawany był ocenie przydatności do badań. Oceniany preparat powinien: po rozpuszczaniu w stężeniu docelowym dawać jednorodną mieszaninę, nie pozostawiać widocznego osadu po odwirowaniu, nie wytrącać osadu po dodaniu do osocza w założonym stężeniu końcowym (brak widocznego osadu po odwirowaniu), po dodaniu w założonym stężeniu końcowym do osocza nie zmieniać w znaczący sposób ph osocza, ETAP I rozpuszczalność ekstraktów (próby wykonywać w 3 powtórzeniach) 1. Odważyć 4-5 mg liofilizowanych ekstraktów polifenolowych. 14

15 2. Odważki każdego rozpuścić w uprzednio przygotowanym rozpuszczalniku (0,9 % PBS z dodatkiem DMSO do końcowego stężenia DMSO 10% ) w przezroczystej probówce, tak aby otrzymać stężenie 7,5 mg liofilizatu/ml. 3. Wytrząsać - 1 min. (850 rpm, 37 C), a nastepnie - 15 min. (500 rpm, 37 C). Uwaga: pierwsze wytrząsanie ma na celu dokładne zamieszanie próbki, stąd wyższe rpm. 4. Roztwory odwirować (5 min obrotów/min na wirówce SIGMA 1K15 co odpowiada 9168xg). Ocenić makroskopowo obecność osadu oraz barwę roztworów. barwę stock solution rozpoznajemy na oko a jej interferencje z pomiarem agregacji optycznej oceniamy spektrofotometrycznie przy długości fali 800 nm w etapie III. 5. W przypadku braku osadu wykorzystać testowane roztwory w dalszych etapach. W przypadku obecności osadu do dalszych testów wykorzystywać supernatant. 6. Wszystkie próby przeznaczone do dalszych oznaczeń rozcieńczyć tak aby ostateczne stężenie kwasu galusowego w roztworze wynosiło 1,5 mg/ml. 7. Przygotowane roztwory liofilizatów rozporcjować po 100 μl i zamrozić ETAP II wytrącanie osadu w osoczu ubogopłytkowym 1. Sporządzić próbę kontrolną do 1 ml osocza dodać 10 μl rozpuszczalnika (PBS:DMSO 9:1) 2. Do sześciu przezroczystych probówek (2x3 powtórzenia) zawierających po 1 ml osocza dodać po 10 l uprzednio rozmrożonego roztworu testowanego preparatu. 3. Trzy próby inkubować w RT, natomiast trzy pozostałe w 37 C. Inkubację prowadzić przez 15 min. 4. Roztwory odwirować (5 min obrotów/min na wirówce SIGMA 1K15 co odpowiada 9168xg). Ocenić makroskopowo obecność osadu. 5. W przypadku braku osadu wykorzystać testowane roztwory w dalszych etapach. Na spektrofotometrze Ultrospec 2000 (PharmaciaBiotech) dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali 800 nm względem próby kontrolnej - 1 ml osocza z dodatkiem 10 l DMSO o stężeniu 10% ETAP III pomiar ph (próby wykonywać w 3 powtórzeniach) 1. Aparat phmetr ELEMETRON CP skalibrować na buforach do kalibracji o ph 7 i 9, Dokonać pomiaru ph próby kontrolnej - 3 ml osocza z dodatkiem 30 l DMSO o stężeniu 10%. 3. Oznaczyć ph testowanych roztworów (korzystać z roztworów przygotowanych w II etapie). 15

16 Uwaga: Ponieważ interesuje nas różnica ph między próbą badaną a kontrolną, bezwzględne wartości ph nie są dla nas istotne. Chcemy bowiem sprawdzić czy preparaty nie zmieniają wartości ph osocza o więcej niż 0,5 jednostki ph. Z opisu właściwości posiadanych elektrod do pomiaru ph wynika, że pomiar ph osocza za ich pomocą jest obarczony błędem systematycznym. Wartość ph w osoczu zmierzymy ale wartość ta nie pokrywa się z wartością rzeczywistą. Wstępne próby wykazały, że suplowane osocze zmierzone dwiema różnymi phmetrami ma ph 8,4. Nas interesuje jednak czy dodanie preparatu w końcowym stężeniu (15 g/ml, w przeliczeniu na kwas galusowy) nie zmienia tego ph o więcej niż 0,5 jednostki. Wartość 0,5 wzięła się stąd, że szacunkowa wielkość błędu pomiaru ph dla tych elektrod to około 0,1-0,2 jednostki ph stąd założony margines bezpieczeństwa 2,5-5 razy wyższy od błędu pomiaru. Wszelkie obserwacje oraz uzyskane wyniki należy zapisać w tabelach zamieszczonych poniżej. Uzyskane widma należy wydrukować i załączyć wraz z wynikami. Sformułować wstępne wnioski Przygotowanie roztworów roboczych preparatów polifenolowych Do każdego cyklu badań obejmujących 10 powtórzeń na 10 pacjentach należy przygotować roztwory robocze dwóch preparatów polifenolowych (E1, E2) o stężeniu w przeliczeniu na kwas galusowy 1,5 mg/ml w 10% DMSO: sporządzić roztwory wyjściowe o stężeniu 7,5 mg liofilizowanego ekstraktu/ml: 7,5 mg liofilizowanego ekstraktu polifenolowego rozpuścić w 1000 l uprzednio sporządzonego roztworu (PBS bez Ca i Mg z dodatkiem DMSO do końcowego stężenia10%) wytrząsać 1 min. (850 rpm, 37 C) i 15 min. (500 rpm, 37 C) roztwory odwirować (5 min obrotów/min na wirówce SIGMA 1K15 co odpowiada 9168xg) w przypadku obecności osadu do dalszych testów ściągnąć supernatant roztwory, w których nie wystąpił osad oraz supernatanty rozcieńczyć tak, aby ostateczne stężenie kwasu galusowego w roztworach wynosiło 1,5 mg/ml obliczenia pomocnicze: obliczyć współczynnik ze wzoru: 16

17 obliczyć objętość końcową roztworu Vk według wzoru: gdzie: V k objętość końcowa roztworu, V p objętość wyjściowa, objętość roztworu o stężeniu liofilizatu 7,5 mg/ml przygotowane roztwory liofilizatów rozporcjować po 50 μl i zamrozić Stężenie docelowe kwasu galusowego: 7,5; 15 agregacji odpowiednio 200 i 100 razy. g/ml; rozcieńczenia w badaniu 4.3 Podstawowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi Badanie agregacji płytek krwi metodą impedancyjną Badanie agregacji płytek krwi w pełnej krwi metodą impedancyjną z zastosowaniem analizatora Multiplate wykonano według instrukcji producenta Pierwszy etap selekcji preparatów Przygotowanie odczynników: a. rozmrozić porcję dla dwóch preparatów polifenoli (E1 i E2) b. przygotować roztwory agonistów: ADP (ADPtest)- końcowe stężenie 6,4 M AA (ASPItest)- końcowe stężenie 0,5 mm Kolagenu (COLtest) - końcowe stężenie 3,2 g/ml zgodnie z zaleceniem producenta odczynników Dynabyte medical 17

18 Randomizacja kanałów pomiarowych Przed serią oznaczeń dla danego polifenolu wygenerować za pomocą programu Stats Direct kolejne pozycje probówek. Najpierw losowana jest kolejność agonistów (serii pomiarowych), następnie kolejność kanałów pomiarowych dla poszczególnych prób. Uzyskany wynik przenieść odpowiednio do tabeli: kolejność agonistów agonista ADP Kol AA próby kontrola E1 (7,5 μg/ml) E1 (15 μg/ml) E2 (7,5 μg/ml) E2 (15 μg/ml) 1. Wylosować kolejność agonistów: Wylosować dla każdego agonisty kolejność kanałów: Dla AA zespół Sterling losuje tylko numer kanału, w którym mierzona będzie kontrola Wykonanie pomiarów a. włączyć agregometr Multiplate i uruchomić program pomiarowy przez wpisanie User name: multiplate Password: multiplate na 30 minut przed wykonaniem pomiaru; przygotować probówkę z 0,9% NaCl i umieścić ją w termobloku aparatu; przygotować kuwety pomiarowe b. przeprowadzić kontrolę elektroniczną aparatu (zaleca się wykonanie kontroli raz dziennie) - w tym celu po nagrzaniu aparatu do temp.37 C, umieścić wszystkie 5 kabli w gniazdach pulpitu (oba końce kabli w gniazdach pulpitu, nie łączyć ich z kuwetami!) i wybrać z menu Multiplate > Electronic control c. zaleca się, aby raz na miesiąc przeprowadzić kontrolę aparatu z użyciem roztworów kalibrujących Multiplate - Liquid control set- Level 1, Level 2 zgodnie z procedurą zaleconą przez producenta agregometru f. Dynabyte medical (załącznik Procedura kalibracji agregometru ) d. jeżeli wszystkie kanały pomiarowe działają sprawnie, umieścić kuwety w gniazdach pomiarowych termobloku i połączyć je kablami z aparatem. e. Uwaga! Jeżeli kontrola elektroniczna wykaże, że któryś z kanałów nie pracuje właściwie należy wymienić kabel i ponowić kalibrację f. wprowadzić w ustawieniach aparatu 15 minutowy czas pomiaru przez wybranie z menu Service > Device configuration g. Ogólne ustawienia dotyczące pomiarów (parametry stałe na czas badania) należy wybrać z menu opcje Service > Password administrator: multiplates > 18

19 Measurement control: lower threshold for control (AU) - 10 allowed minimal correlation coefficient - 0,98 allowed difference from mean Przygotowanie materiału do badania agregacji a. przygotować 5 probówek Eppendorf (Kontrola, E1_7,5; E1_15; E2_7,5; E2_15) i odpipetować po 350 µl krwi; dokładna objętość krwi 350 µl x 5 pomiarów x oznaczenie AA = 3850 µl krwi od jednego dawcy b. do dwóch próbek krwi dodać po 1,75 µl roztworu roboczego każdego z polifenoli (stężenie końcowe w przeliczeniu na kwas galusowy 7,5 µg/ml) do dwóch kolejnych próbek po 3,5 µl (stężenie końcowe w przeliczeniu na kwas galusowy 15 µg/ml), piąta próbka stanowi kontrolę i nie zawiera polifenolu, po dodaniu polifenolu do krwi delikatnie zamieszać c. krew inkubować w temperaturze pokojowej 12 min, mieszać delikatnie co 2-3 minuty Wykonanie pomiaru (zgodnie z protokołem Dynabyte) a. po zakończeniu inkubacji z polifenolami przenieść po 300 µl krwi do kuwet pomiarowych zawierających 300 µl soli fizjologicznej; wybór kanałów pomiarowych dla określonej próbki krwi zgodny z wcześniej wygenerowaną listą randomizacyjną. b. rozcieńczoną krew inkubować 3 minuty w agregometrze wciskając przycisk F2: Start timer c. po zakończeniu inkubacji dodać do kuwety 20 µl agonisty (dla serii 5 pomiarów kolejno: ADP, kolagenu i AA) i po zaznaczeniu uruchomić pomiar przyciskiem F3: Start test lub Measurement > Start > All free channels; łącznie wykonać 12 pojedynczych pomiarów (12 kuwet) d. przyciskiem F6: Print uruchomić drukowanie wyniku badania e. przygotować aparat do serii pomiarów z kolejnym agonistą usuwając zapis z ekranu F7: Clear channels i odłączając zużyte kuwety Archiwizacja i opracowanie wyników badań a. wyniki badań: parametry A max -wartość maksymalnej agregacji oraz AUC- pole pod krzywą przenieść do arkusza Excel w katalogu dla danego polifenolu (wydruki agregacji przechowywać w segregatorze) 19

20 b. opracowanie wyników badań: wyliczenie dla każdego pomiaru Aggregation Score (AS), będącego iloczynem AUC x A max oraz wykonanie obliczeń statystycznych po zakończeniu badań w grupie co najmniej 6 dawców dla każdego preparatu polifenolu Drugi etap selekcji preparatów Przygotowanie odczynników: a. rozmrozić porcję po 50 µl dla dwóch preparatów polifenoli (E1 i E2) b. przygotować roztwory agonistów zgodnie z zaleceniem producenta odczynników Dynabyte medical ADP (ADPtest)- końcowe stężenie w próbie badanej 6,4 M AA (ASPItest)- końcowe stężenie w próbie badanej 0,5 mm Kolagenu (COLtest)- końcowe stężenie w próbie badanej 3,2 g/ml Uwaga! Liofilizaty ADP, AA i kolagenu zrekonstruować dodając 1,0 ml wody destylowanej. Roztwory agonistów przechowywać w lodówce do chwili wykonania pomiaru w oryginalnych fiolkach. Stabilność ADP i kolagenu 14 dni w temp. 2-8 C. Stabilność AA 24 h w temp. 2-8 C. W przypadku ADP i AA tuż po rekonstrukcji odczynniki można rozporcjować po 200 l i zamrozić w temperaturze < -20. Odczynniki mrożone zużyć w ciągu 4 tygodni. Roztworów kolagenu nie zamrażać! Randomizacja kanałów pomiarowych Przed serią oznaczeń dla danego polifenolu wygenerować za pomocą programu Stats Direct kolejne pozycje probówek. Najpierw losowana jest kolejność agonistów (serii pomiarowych), następnie kolejność kanałów pomiarowych dla poszczególnych prób. Uzyskany wynik przenieść odpowiednio do tabeli: kolejność agonistów agonista próby kontrola E1 (1,5 μg/ml) E1 (3 μg/ml) E1 (6 μg/ml) ADP Kol AA kolejność agonistów agonista próby kontrola E2 (1,5 μg/ml) E2 (3 μg/ml) E2 (6 μg/ml) ADP Kol AA 20

21 1.Wylosować kolejność preparatów 2. Wylosować kolejność agonistów : Wylosować dla każdego agonisty kolejność kanałów: Dla AA losuje się tylko numer kanału, w którym mierzona będzie kontrola Badanie agregacji płytek krwi metodą optyczną Badanie agregacji płytek krwi w osoczu bogato płytkowym metodą optyczną z zastosowaniem agregometru Chrono-Log 490 2D lub 490 4D. wykonano według instrukcji producenta Pierwszy etap selekcji preparatów W pierwszym etapie selekcji stężenie docelowe stężenie preparatów polifenolowych w przeliczeniu na kwas galusowy wynosiło: 7,5; 15 g/ml Przygotowanie odczynników a. przygotować roztwór 1mM ADP w NaCl, rozpipetować do ependorfów po 50µl, opisać i zamrozić b. Przed każdym badaniem agregacji rozmrozić jedną porcję ADP i jedną porcję roztworu polifenolu Randomizacja kanałów pomiarowych a. losowanie kanałów odbywa się przed każdą serią 10 dawców (przy użyciu programu statystycznego) b. randomizowane kanały zapisane zostaną w 10 tabelkach (jedna tabelka jeden dawca) nr prob. Agonista. E1_7,5 E1_15 E_7,5 E2_15 K 1 ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (10 µm/l) ADP (10 µm/l) ADP (10 µm/l)

22 8 ADP (10 µm/l) ADP (10 µm/l) ADP (10 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) Przygotowanie zaplecza badawczego: Przed pomiarem agregacji należy włączyć: a. Spektrofotometr (autokalibracja aparatu trwa kilka minut) b. Wirówkę Jouan MR1822 i nastawić na program 1 (chwile trwa zanim wirówka nagrzeje się do 37ºC), upewnić się, że wirówka się nagrzała c. Wirówkę SIGMA i ustawić temperaturę 37ºC, upewnić się, że wirówka się nagrzała d. Agregometr ChronoLog oraz komputer obsługujący agregometr, należy się upewnić, że kanały agregometru osiągnęły temperaturę 37ºC Przygotowanie materiału do badania agregacji a. Krew pobraną na cytrynian przelać do probówki z czerwonym korkiem firmy Sarstedt (120x17mm, 15ml) zwaną dalej maliną. b. Do drugiej maliny wlać tyle wody aby zrównoważyć probówkę z krwią c. Obie probówki umieścić w rotorze wirówki Jouan MR1822, zamknąć pokrywę wirówki i włączyć PROGRAM 1 ( rotor 125 mm, 190g/12minut, 37ºC) d. Po odwirowaniu zebrać plastikową pipetą osocze bogatopłytkowe (PRP) do probówki, probówkę wstawić do cieplarki e. Malinę po odciągnięciu PRP wstawić do wirówki SIGMA (razem z drugą maliną z wodą, dla równowagi) f. Zamknąć pokrywę wirówki i nastawić warunki wirowania: rotor 11192, 2000g/12 minut, 37ºC włączyć wirowanie. g. Po odwirowaniu zebrać do probówki osocze ubogopłytkowe (PPP), wstawić do cieplarki h. Doprowadzenie miana płytek w osoczu bogatopłytkowym do wartości 2 x 10 8 plt/ml: PRP rozcieńczyć solą fizjologiczną 20x i 40x, w objętości 1 ml Zmierzyć absorpcję rozcieńczeń PRP (długość fali 800 nm, aparat wyzerowany względem rozcieńczonego osocza ubogopłytkowego solą fizjologiczną odpowiednio 20x i 40x) Miano płytek wyliczyć ze wzoru wg. Bogdana Walkowiaka: Miano plt=[(6,23/2,016-a 800nm )-3,09]x rozc. 22

23 Doprowadzić miano płytek w PRP do wartości 2 x 10 8 plt/ml, za pomocą PPP Wykonanie pomiaru a. Przed pomiarem rozmrozić probówkę z porcją 0,5mM ADP b. Włączyć program Agrolink w komputerze obsługującym agregometr c. Upewnić się, że kanały agregometru są nagrzane do 37ºC i mają włączone mieszała (przełącznik STIRRER musi być przełączony na ON) d. Przełącznik PPP, SAMPLE powinien być ustawiony w pozycji 1 (dla kanałów: 2, 3 i 4). e. Do czterech kuwet szklanych odpipetować po 300 µl PRP o mianie 2x10 8 f. Odpipetować odpowiednią ilość roztworu polifenolu do PRP w kuwetach (1,5 µl dla stężenia przeliczeniu na kwas galusowy 7,5 g/ml oraz 3,0 µl dla stężenia 15 g/ml), odpipetować 2,25 µl 10%DMSO w PBS do kuwety KONTROLA(K) g. Wymieszać delikatnie, kuwety wstawić do cieplarki (37ºC) na 15 minut h. Po inkubacji kuwety umieścić w kanałach pomiarowych agregometru, w każdej kuwecie umieścić mieszadło i. W kanale PPP SAMPLE umieścić kuwetę szklaną z 500 µl PPP j. W oknie programu Agrolink, na pasku MENU włączyć RUN NEW k. Opisać pomiar : data(rok,miesiac,dzien)_inicjalydawcy_numer układu pomiarowego (np _MG_1), opisać każdy kanał: polifenol_stężenie końcowe polifebnolu_stężenie końcowe ADP (np. EL3_7,5_ADP5) l. W kuwetach umieścić mieszadełką i wykalibrować każdy kanał : naciskając kolejno przycisk kalibracyjny w panelu agregometru (należy przytrzymać tak długo, aż linia krzywej agregacyjnej dotrze do poziomu zero) m. Na pasku Menu programu Agrolink nacisnąć RUN NEW (pokaże się okno, w którym należy wybrać OK.) n. Kiedy linie wykresu kanałów (linie niebieska, czarna, czerwona i zielona) pojawią się w oknie Graph należy dodać do każdego kanału odpowiednią ilośc ADP (dla końcowego stężenia 5 M 3 l, dla stężenia 10 M 6 l) o. Kiedy wykres przekroczy linie 12 minut wcisnąć START na pasku menu i zapisać pomiar (naciskając ikonę dyskietki na pasku menu) Opracowanie wyników badań a. Wyniki można opracować na komputerze bazowym aparatu ChronoLog w programie Agrolink lub na każdym komputerze mającym zainstalowany program Agrolink b. Otworzyć pomiar wchodząc w OPEN i znajdując pomiar po dacie pomiaru, inicjałach dawcy oraz numerze serii pomiarowej c. W zakładce VIEW zaznaczyć opcję GRAPH 23

24 d. Zaznaczyć opcję SET START STOP LINES w pasku menu; w oknie, które się pojawi zaznaczyć opcję SET ALL a następnie zaznaczając kolejne kanały ustawić linie START I STOP tak, aby pomiar trwał 10 minut od momentu dodania ADP e. Po ustawieniu wszystkich kanałów zaznaczyć DONE, następnie w pasku menu funckję CALCULATE -> OK f. W zakładce VIEW zaznaczyć GRAPH AND DATA i odczytać wyniki Amax (Amplitude) oraz AUC (Area Under) g. wyliczenie dla każdego pomiaru Aggregation Score (AS), będącego iloczynem AUC x A max oraz wykonanie obliczeń statystycznych po zakończeniu badań w grupie 10 dawców dla każdego preparatu polifenolu Uwaga! Zaleca się, aby wszystkie pomiary agregacji wykonać maksymalnie w ciągu 4 godzin od pobrania krwi ( Platelets Function Testing by Aggregometry; Approved Guideline November 2008 Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI document H-58A Wayne, Pennsylvania, USA) Drugi etap selekcji preparatów W drugim etapie selekcji stężenie docelowe stężenie preparatów polifenolowych w przeliczeniu na kwas galusowy wynosiło: 1,5; 3; 6 g/ml Przygotowanie odczynników a. przygotować roztwór 0.5 mm ADP w NaCl, rozpipetować do ependorfów po 80 µl, opisać i zamrozić b. Przed każdym badaniem agregacji rozmrozić jedną porcję ADP i jedną porcję roztworu polifenolu. Dodawać 3 µl dla stężenia końcowego 5 M ADP Randomizacja kanałów pomiarowych a. losowanie kanałów odbywa się przed każdą serią 10 dawców (przy użyciu programu statystycznego, StatsDirect) b. randomizowane kanały zapisane zostaną w 10 tabelkach (jedna tabelka jeden dawca) Przed serią oznaczeń dla danego polifenolu wygenerować za pomocą programu Stats Direct kolejne pozycje probówek. Poniżej wypisano kolejność losowań. nr prob. Agonista. Stężenie preparatu polifenolowego [ g/ml] E 1 1,5 E 1 3 E 1 6 K 1 ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l)

25 4 ADP (5 µm/l) Stężenie preparatu polifenolowego [ g/ml] nr prob. Agonista. E 2 1,5 E 2 3 E ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) ADP (5 µm/l) K Badanie aktywacji płytek krwi metodą cytometrii przepływowej Ocenę ekspresji wybranych receptorów płytkowych wykonywana jest na cytometrze przepływowym FACS LSR. Płytki we krwi pełnej są inkubowane z preparatem polifenolowym w temp. pokojowej przez 60 min. (spontaniczna aktywacja) Po procedurze utrwalania i znakowania wykonywane są oznaczenia: ekspresji selektyny P (CD62P/PE), przyłączania PAC-1 (PAC-1/FITC). Do bramkowania każdorazowo będą wykorzystane przeciwciała anty-cd61/percp. Procedura znakowania - modyfikacja wg Boncler Zmodyfikowana procedura badania cytometrycznego Przygotowanie odczynników Do wykonania znakowania konieczny są przeciwciała firmy Becton Dickinson i odczynników: 1. anty-cd62p/pe (badanie ekspresji selektyny P), 2. PAC-1/FITC) (badanie aktywacji receptora GPIIb/IIIa), 3. anty-cd61/percp (bramkowanie), 4. przeciwciała izotopowe FITC 5. przeciwciała izotopowe PE 6. PBS (do rozcieńczeń), 7. 1% DMSO (do kontroli spontanicznej aktywacji), 8. CellFix: 10% roztwór wyjściowy rozcieńczyć 10x wodą destylowaną, 9. roztwór 0,5mM ADP w NaCl (do kontroli pozytywnej i ustawiania kompensacji). Dodawać 6 µl dla stężenia 20 M. 10. roboczy roztwór polifenolu przygotować poprzez 10-krotne rozcieńczenie roztworu wyjściowego PBS-em. Otrzymany w ten sposób roztwór roboczy ma stężenie 150 µg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy, zawartość DMSO wynosi 1%. 25

26 Przed każdym badaniem agregacji rozmrozić jedną porcję ADP i jedną porcję roztworu badanego polifenolu Przygotowanie probówek do znakowania 1. Opisać probóweki cytometryczne i inkubacyjne w dniu poprzedzającm badanie. UWAGA stosować różne kolory do opisu probówek przygotowanych przez dwa zespoły. 2. Nanieść przeciwciała po 2.5 µl, wg schematu przedstawionego w tabeli Schemat znakowania do oznaczenia trzykolorowego. Początek pracy na godzinę przed pobraniem krwi. 3. Przygotować szereg probówek do inkubacji krwi z agonistą i polifenolami. 4. Przygotować szereg probówek z buforem rozcieńczającym dodać (po 90 l PBS). Układ analogiczny do opisanego wyżej Znakowanie 1. Niezwłocznie po pobraniu krwi nanieść po 150 l krwi do wszystkich probówek inkubacyjnych, włączyć minutnik na 60 min (aktywacja spontaniczna). 2. Włączyć minutnik na 10 min dla układu kontroli pozytywnej z ADP. 3. W czasie aktywacji układu kontrolnego rozcieńczyć krew w przygotowanym PBS (układ kontrolny), dodać rozcieńczoną krew do falcona 1 oraz połączyć z przeciwciałami w falconach od 2 do 4. Zamieszać i znakować 30 min. w ciemni w temp. pokojowej. UWAGA! Ten etap znakowania należy skończyć przed upływem 10 min. 4. Po zakończeniu aktywacji z zastosowanie ADP, wykonać rozcieńczenie i znakowanie w falconach 5 7). 5. Po uływie 60 min spontanicznej aktywacji (konieczne mieszanie co 10 min.), krew zamieszać, rozcieńczyć we właściwym buforze i znakować 30 min. w ciemności w temp. pokojowej (falcony od 8 do 11, dla pierwszego polifenolu oraz od 12 do 15, dla drugiego polifenolu). 26

27 4.3.4 Kryteria punktowe stosowane do oceny przeciwpłytkowych właściwości badanych preparatów Preparat zostaje uznany za posiadający właściwości przeciwpłytkowe jeżeli uzyskuje określoną liczbę punktów (co najmniej 1 punkt) Zasady przydzielania punktów w pierwszym etapie selekcji preparatów Tabela 1. Kryteria punktowe do selekcji preparatów w Etapie I a) Stężenie preparatu polifenolowego 7,5 g/ml Zdrowi dawcy Chorzy przyjm. ASA ADP Kol. AA ADP Kol. 0/1 0/1 Agreg. PRP (5 M ADP) Agreg. PRP (10 ADP) M 0/2 0/2 Agreg. Multiplate 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0 brak istotnego hamowania agregacji 1 - istotne hamowanie agregacji (przy niskim stężeniu agonisty ADP) 2 istotne hamowanie agregacji b) Stężenie preparatu polifenolowego 15 g/ml Zdrowi dawcy Chorzy przyjm. ASA ADP Kol. AA ADP Kol. 0/0,5 0/0,5 Agreg. PRP (5 M ADP) Agreg. PRP (10 ADP) M 0/1 0/1 Agreg. ADP Multiplate 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0 brak istotnego hamowania agregacji istotne hamowanie agregacji (przy niskim stężeniu agonisty ADP) 1 istotne hamowanie agregacji Preparaty mogły uzyskać w pierwszym etapie selekcji od 0 do 24 punktów. 27

28 Zasady przydzielania punktów w drugim etapie selekcji preparatów Etap II - potwierdzanie właściwości przeciwpłytkowych preparatów wytypowanych w pierwszym etapie z zastosowaniem niższych stężeń preparatów (1,5; 3; 6 g/ml) we krwi pobranej na cytrynian sodu( środowisku sprzyjające wykazywaniu hamującego efektu preparatów). Etap II obejmuje: - Badane wyselekcjonowanych preparatów oboma metodami agregometrycznymi i metodą cytometrii przepływowej Tabela 2. Kryteria punktowe działania antyagregacyjnego preparatu polifenolowego w etapie II badania u zdrowych dawców/pacjentów Agreg. PRP (5 M ADP) Multiplate (6,4 M ADP) Łączna punktacja 0-7 Stężenie preparatu polifenolowego [ g/ml] 1, /2 0/1 0/0,5 0/2 0/1 0/0,5 - Badane wyselekcjonowanych preparatów metodą cytometrii przepływowej u zdrowych dawców i pacjentów przyjmujących ASA. W projekcie zaplanowaliśmy prześledzenie ekspresji następujących antygenów: CD61-PerCP, PAC-1- FITC, CD62P-PE. Tabela 3. Kryteria punktowe działania hamującego preparatu polifenolowego (metodą cytometrii przepływowej) w Etapie II badania u zdrowych dawców/pacjentów Spontaniczna aktywacja (60 min RT) Łączna punktacja 0-7 Stężenie badanych preparatów polifenolowych ( g/ml) 1,5 3 6 CD62 PAC CD62 PAC CD62 PAC 0/2 0/2 0/1 0/1 0/0,5 0/0,5 Preparaty mogły uzyskać w drugim etapie selekcji od 0 do 14 punktów. 28

29 4.4 Dodatkowe metody badania aktywacji i reaktywności płytek krwi oraz metody badania układu krzepnięcia Ocena in vitro właściwości przeciwpłytkowchj preparatów polifenolowych poprzez pomiar poziomu fosforylacji białka VASP metodą cytometrii przepływowej Cele eksperymentu Celem eksperymentu jest ocena skuteczności preparatu polifenolowego EO4(3) i EZ14 w stężeniach 3 i 7,5 ug/ml we wspomaganiu leczenia przeciwpłytkowego u pacjentów przyjmujących klopidogrel i kwas acetylosalicylowy. Weryfikowana była hipoteza badawcza, która zakłada, że ekstrakty polifenolowe EO4(3)/EZ14 w stężeniach 3 i 7,5 ug/ml w przeliczeniu na kwas galusowy obniżają indeks reaktywności płytek wyznaczany poprzez pomiar stopnia fosforylacji białka VASP metodą cystometrii przepływowej u pacjentów leczonych podwójną terapią przeciwpłytkową (ASA i klopidogrel) Zadania badawcze Wykonane na grupie pacjentów uzupełniające badanie skuteczności preparatu polifenolowego EO4(3)/EZ14 w stężeniach 3 i 7,5 ul/ml we wspomaganiu leczenia przeciwpłytkowego w oparciu o ocenę fosforylacji białka VASP metodą cytometrii przepływowej. Dalsze badania nad preparatem polifenolowym EO4(3)/EZ14 pozwolą uzupełnić wiedzę na temat wspomagania leczenia przeciwpłytkowego o wyniki z metody obecnie wysoce cenionej i szeroko polecanej. Wyniki będą stanowiły ciekawe uzupełnienie dotychczas otrzymanych danych na temat tego preparatu Metody, materiał badawczy i odczynniki Skuteczność preparatów polifenolowych oznaczana będzie poprzez pomiar stopnia fosforylacji białka VASP metodą cytometrii przepływowej test VASP. - krew pobrana od pacjentów przyjmujących leki przeciwpłytkowe na buforowany cytrynian sodu - preparat polifenolowy EO4(3)/EZ14, roztwór w DMSO - zestaw odczynników PLT VASP/P2Y12 (Biocytex) 29

30 Procedura przygotowania próbek do oznaczeń cytometycznych - VASP Przygotować odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta (test PLT VASP, Biocytex) Odczynniki 1, 3, 4a, 4b, 5 są gotowe do pomiarów. Ich stabilność w temperaturze 2-8 C wynosi 2 miesiące. Odczynniki 2a i 2b zrekonstruować dodając 400 μl wody destylowanej. Wymieszać na vortexie przez 5 sekund. Stabilność odczynników po rozpuszczeniu w temperaturze 2-8 C wynosi 1 miesiąc. Wyjąć z zamrażalnika 1 eppendorff z preparatem EO4(3)/EZ14 o stężeniu 1,5 mg/ml w celu rozmrożenia preparatu. Preparat rozcieńczyć 10-krotnie 1% roztworem DMSO w PBS w celu otrzymania roztworu roboczego preparatu o stężeniu 150 ug/ml. Przygotowanie materiału a. przygotować 3 probówki Eppendorf i odpipetować do każdej odpowiednią ilość krwi pobranej na cytrynian sodu oraz odpowiednią ilość roboczego preparatu EO4(3)/EZ14 według schematu: Numer probówki Stężenie preparatu w próbie [ug/ml] Ilość dodawanego preparatu [μl] (wyjściowe stężenie preparatu 150 ug/ml) Ilość krwi [μl] I II III 7, Inkubować 15 min w temperaturze pokojowej b. Przygotować 5 falconów i oznaczyć je odpowiednio: T1-T5 c. Do probówki T1 odpipetować 5 μl odczynnika 2a i 5 μl krwi z probówki Eppendorf oznaczonej jako I. Do probówek T2 oraz T3 odpipetować 5 μl odczynnika 2b i 5 μl krwi z probówki Eppendorf oznaczonej jako I. Do probówki T4 odpipetować 5 μl odczynnika 2b i 5 μl krwi z probówki Eppendorf oznaczonej jako II. Do probówki T5 odpipetować 5 μl odczynnika 2b i 5 μl krwi z probówki Eppendorf oznaczonej jako III. Mieszać 1-2 sekundy. Prowadzić inkubację w czasie 10 min w temperaturze pokojowej. b. Do wszystkich probówek odpipetować 5 μl odczynnika 3, zamieszać (1-2s). Inkubować 5 min w temperaturze pokojowej. c. Do probówek T1, T2, T4, T5 dodać 5 μl odczynnika 4a. 30

31 Do probówek T3 dodać 5 μl odczynnika 4b. Mieszać 1-2 s, inkubować 5 min w temperaturze pokojowej d. Do wszystkich probówek dodać 5 μl odczynnika 5, zamieszać a następnie inkubować 5 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji do wszystkich probówek odpipetować 1 ml odczynnika 1. Próbki wstawić natychmiast do temperatury 2-8 C. Nie później niż 2 godziny potem, wykonać pomiar. Archiwizacja i opracowanie wyników badań Po wykonaniu pomiaru obliczyć indeksy reaktywności płytek. MFIc (PGE1) = MFIc (T1) = MFI (T1) MFI (T3) MFIc (PGE1 + ADP) = MFIc (T2) = MFI (T2) MFI (T3) Platelet reactivity index (PRI) = [(MFIc PGE1 MFIc (PGE1 + ADP) ) / MFIc PGE1] x Ocena in vitro właściwości przeciwzakrzepowych preparatów polifenolowych z wykorzystaniem trombolestometrii Tromboelastometria umożliwia graficzne i numeryczne przedstawienie dynamiki procesu hemostazy oraz właściwości fizycznych tworzącego się skrzepu pełnej krwi. Badania wykonano wykorzystując aparat ROTEM delta firmy Pentapharm Cel eksperymentu Celem eksperymentu jest ocena aktywności antykoagulacyjnej preparatów polifenolowych w stężeniach 3 i 7,5 ug/ml. Weryfikowana była hipoteza badawcza zakładająca, że preparaty polifenolowe pochodzenia roślinnego wydłużają: czas krzepnięcia (CT)i czas tworzenia skrzepu (CTF) oraz zmniejszają wartość parametrów: kąt alfa i maksymalna spoistośc skrzepu (MCF) Analizowane parametry krzywej tromboelastometrycznej Czas krzepnięcia (CT) Definicja: czas krzepnięcia (CT, jednostka: sek.) jest to czas potrzebny do uformowania się skrzepu o spójności 2mm liczony od rozpoczęcia testu, czyli od dodania aktywatora (odczynniki i wapń) Czas tworzenia się skrzepu (CFT) Definicja: Czas tworzenia się skrzepu (CFT, jednostka: sek.) charakteryzuje kolejną fazę krzepnięcia, kinetykę tworzenia się stabilnego skrzepu zarówno z płytek jak i z fibryny. CFT definiuje się jako czas, który upłynął między spójnością skrzepu 2mm a 20 mm. 31