(21)Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK93/00288

Transkrypt

1 R Z E C Z PO SPO L IT A PO LSK A U rząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21)Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK93/00288 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO94/05258, PCT Gazette nr 07/94 (51) IntCl6: A 6 1 K 9/107 A61K 31/52 Przeciwwirusowo czynna emulsja farmaceutyczna typu olej w wodzie zawierająca 9-[(2- (54) hydroksyetoksy)metylo]guaninę (acyklowir) lub sól albo ester tego związku (73) Uprawniony z patentu: (30) Pierwszeństwo: A/S GEA Farmaceutisk Fabrik, Frederiks ,DK,1113/92 berg, DK (72) Twórcy wynalazku: (43) Zgłoszenie ogłoszono: Knud E. Gebhard-Hansen, Birker0d, DK BUP 13/95 Søren B. Pedersen, Hvidovre, DK Karen Bjørnsdottir, Vaerløse, DK Bodil G. Lissau, Frederiksberg, DK Børge I. F. Alhede, Greve Strand, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/97 (74) Pełnomocnik: Ostrowska Elżbieta, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Przeciwwirusowo czynna emulsja farmaceutyczna typu olej w wodzie zawierająca 9-[(2-hydroksyetoksy)metylo]guaninę (acyklowir) lub sól albo ester tego związku w wodnej fazie rozpraszającej, przy czym faza ta oprócz substancji czynnej i rozproszonej fazy olejowej zawiera mieszający się z wodą rozpuszczalnik organiczny, którego składnikiem może być alkohol wielowodorotlenowy, znamienna tym, że emulsja zawiera 1-10% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 20-50% wagowo/wagowych rozpuszczalnika organicznego zawierającego 5-50% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i 0-29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 15-40% wagowo/wagowych wody, przy czym podane procenty odnoszą się do całkowitego ciężaru preparatu.

2 Przeciwwirusowo czynna emulsja farmaceutyczna typu olej w wodzie zawierająca 9-[(2-hydroksyetoksy)metylo]guaninę (acyklowir) lub sól albo ester tego związku Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwwirusowo czynna emulsja farmaceutyczna typu olej w wodzie zawierająca 9-[(2-hydroksyetoksy)metylo]guaninę (acyklowir) lub sól albo ester tego związku w wodnej fazie rozpraszającej, przy czym faza ta oprócz substancji czynnej i rozproszonej fazy olejowej zawiera mieszający się z wodą rozpuszczalnik organiczny, którego składnikiem może być alkohol wielowodorotlenowy, znamienna tym, że emulsja zawiera 1-10% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 20-50% wagowo/wagowych rozpuszczalnika organicznego zawierającego 5-50% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i 0-29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 15-40% wagowo/wagowych wody, przy czym podane procenty odnoszą się do całkowitego ciężaru preparatu. 2. Emulsja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 2-5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 30-45% wagowo/wagowych rozpuszczalnika oraz % wagowo/wagowych wody. 3. Emulsja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 40% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną oraz 15-30% wagowo/wagowych wody. 4. Emulsja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 20% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną, 20% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 20-25% wagowo/wagowych wody. 5. Emulsja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 11% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną, 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 20-25% wagowo/wagowych wody. 6. Emulsja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że w postaci kremu zawiera białą wazelinę, ciekłą parafinę (olej parafinowy), monostearynian gliceryny i kwas stearynowy. * * * Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwwirusowo czynnej emulsji farmaceutycznej typu olej w wodzie zawierającej jako substancję czynną 9-[(2-hydroksyetyloksy)metylo]guaninę (acyklowir) lub sól albo ester tego związku w wodnej fazie rozpraszającej, przy czym faza ta oprócz substancji czynnej i rozproszonej fazy olejowej zawiera mieszający się z wodą rozpuszczalnik organiczny, którego składnikiem może być alkohol wielowodorotlenowy. W brytyjskim opisie patentowym nr ujawniono acyklowir i dopuszczalne farmaceutycznie sole oraz estry tego związku wykazujące przeciwwirusowe działanie, zarówno in vitro jak i in vivo, przeciwko różnym klasom wirusów DNA i RNA. Szczególnie, związek ten jest czynny przeciw wirusowi opryszczki zwykłej, który wywołuje opryszczkowe zapalenie rogówki u królików, opryszczkowe zapalenie mózgu u myszy i skórne opryszczki u świnek morskich. Acyklowir wykazuje słabą rozpuszczalność w wodzie i jest prawie nierozpuszczalny w układach rozpuszczalników hydrofobowych, co jest przyczyną, że trudno jest wyprodukować preparat do podawania miejscowego zawierający takie wysokie stężenie rozpuszczonego acyklowiru, umożliwiające jego stosowanie z pełną skutecznością. A więc, trudno jest otrzymać optymalne przenikanie tego związku przez skórę. Ponadto, oprócz odpowiedniego stężenia farmaceutycznie działającego związku, które między innymi zależy od wystarczającej szybkości rozpuszczania substancji czynnej, ważne jest,

3 żeby preparaty zawierające farmaceutycznie czynny związek były trwałe, a więc nie traciły swojej siły podczas długotrwałego przechowywania, względnie zmieniały barwę lub po zastosowaniu powodowały nadmierne podrażnienia skóry lub błony śluzowej. Przykład 26 wspomnianego opisu patentowego brytyjskiego dotyczy kremu typu olej w wodzie zawierającego 5% wagowo/wagowych acyklowiru i 5% wagowo/wagowych glikolu propylenowego. W przykładzie tym funkcją glikolu propylenowego jest działanie jako środka zwilżającego, tj. jako składnika higroskopijnego, który poprawia odczucie kosmetyczne przy zastosowaniu kremu i dalsze ograniczanie odwodnienia podczas przechowywania. Prowadzone na zwierzętach testy tego kremu i innego kremu według B.P. (Brytyjska Farmakopea) zawierającego acyklowir nie zapewniły szczególnie szybkiego wyleczenia, prawdopodobnie z powodu niewystarczającej ilości rozpuszczonej substancji czynnej i w konsekwencji słabego przenikania acyklowiru przez skórę. Z powodu lipidowego charakteru powierzchni skóry, zwłaszcza warstwy rogowej, długo myślano, że w celu osiągnięcia dobrego przezskórnego przenikania przez skórę, składnik czynny w emulsji powinien być umieszczany w fazie olejowej, tak żeby mógł rozpościerać się na lipidowych składnikach skóry. Jednakże stwierdzono, że w celu otrzymania optymalnego uwalniania acyklowiru z preparatów do podawania miejscowego, zewnętrzna faza emulsji typu olej w wodzie powinna zawierać maksymalne stężenie rozpuszczonego leku. Europejski opis patentowy nr EP-A ujawnił, że przez stosowanie większego stężenia alkoholu wielowodorotle nowego niż 5% wagowo/wagowych, które znane jest ze wspomnianego opisu patentu brytyjskiego tj. co najmniej 50% objętościowo/objętościowych fazy wodnej, przez zwiększenie stężenia rozpuszczonego acyklowiru, można otrzymać wzmożone działanie i skuteczność preparatu w postaci emulsji. Stwierdzono, że preparaty acyklowiru do podawania miejscowego zawierające takie zwiększone stężenie alkoholu wielowodorotlenowego, jako współrozpuszczalnika w fazie wodnej, nie wywołują nadmiernego podrażnienia skóry lub błony śluzowej. W porównaniu do znanego ze stanu techniki preparatu zawierającego 5% wagowo/wagowych acyklowiru oraz tylko 5% wagowo/wagowych glikolu propylenowego, preparaty znane z opisu patentu europejskiego nr EP-A powodują, że acyklowir przenika przez skórę bardziej skutecznie i w większym stężeniu, przez co szybciej uzyskuje się wyleczenie infekcji. Korzyści te uzyskuje się gdy preparat zawiera od 1% do 10% wagowo/wagowych acyklowiru lub jego soli albo estru, od 30% do 50% wagowo/wagowych alkoholu wielowodorotlenowego oraz od 20% do 40% wagowo/wagowych wody, przy czym procenty te odnoszą się do całkowitego ciężaru preparatu. Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że znaczne zwiększenie stężenia rozpuszczonego acyklowiru i wzmożenie przenikania acyklowiru przez skórę można otrzymać przez zastosowanie emulsji typu olej w wodzie, rozwiązania z zastosowaniem, jako organicznego rozpuszczalnika, acetalu formaldehydu z gliceryną (mieszanina 75% 5-hydroksy-1,3-dioksanu i 25% 4-hydroksymetylo-1,3-dioksolanu) w ciągłej fazie wodnej zamiast alkoholu wielowodorotlenowego, względnie przez zastąpienie części alkoholu wielowodorotlenowego acetalem formaldehydu z gliceryną, a przeciwwirusowo czynna emulsja farmaceutyczna typu olej w wodzie według wynalazku charakteryzuje się tym, że emulsja ta zawiera 1% - 10% wagowo/wagowych acyklowiru, jego soli lub estru, 20% - 50% wagowo/wagowych organicznego rozpuszczalnika zawierającego 5% - 50% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i 0% - 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 15% - 40% wagowo/wagowych wody, przy czym procenty te odnoszą się do całkowitego ciężaru preparatu. Według korzystnego wykonania emulsja według wynalazku zawiera 2% - 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 30% - 45% wagowo/wagowych rozpuszczalnika i 15% - 35% wagowo/wagowych wody, korzystnie 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 40% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną oraz 15% - 30% wagowo/wagowych wody.

4 Korzystnie, emulsja według wynalazku zawiera 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 20% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną, 20% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 20% - 25% wagowo/wagowych wody. Szczególnie korzystnie, emulsja według wynalazku zawiera 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, 11 % wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną, 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz 20% - 25% wagowo/wagowych wody. W przypadku gdy emulsja ma postać kremu to zawiera białą wazelinę, ciekłą parafinę (olej parafinowy), monostearynian gliceryny i kwas stearynowy. Stwierdzono, że emulsja według niniejszego wynalazku daje w rezultacie zasadniczy wzrost przenikania substancji czynnej, acyklowiru, przez skórę, przy czym wzrost ten jest spowodowany zastosowaniem acetalu formaldehydu z gliceryną jako organicznego rozpuszczalnika w emulsji względnie jako znaczącego składnika tego rozpuszczalnika. Wzrost rozpuszczalności acyklowiru otrzymany przez zastosowanie acetalu formaldehydu z gliceryną zamiast glikolu propylenowego lub zastąpienie części glikolu propylenowego zawartego w emulsji typu olej w wodzie zawierającej mieszający się z wodą rozpuszczalnik organiczny ukazany jest w następującym teście. Rozpuszczalność acyklowiru w mieszaninach acetal formaldehydu z gliceryną/woda i w mieszaninach acetal formaldehydu z gliceryną/glikol propylenowy/woda. W temperaturze pokojowej nadmiar acyklowiru dodaje się do mieszanin acetal formaldehydu z gliceryną/woda i mieszanin acetal formaldehydu z gliceryną/glikol propylenowy/woda i następnie mieszaniny te mieszano przez 2 godziny i przesączono. Kolejno, po odpowiednim rozcieńczeniu za pomocą 0,1 N NaOH, zbadano spektrofotometrycznie przy 260 nm wspomniane roztwory i 0,1 N NaOH. Jako standard stosuje się 0,01% roztwór acyklowiru w 0,1 N NaOH. Tabela 1 Rozpuszczalność acyklowiru w mieszaninie acetalu formaldehydu z gliceryną i wody: Procenty objętościowe acetalu formaldehydu z gliceryną w Rozpuszczalność acyklowiru mg/ml wodzie 0 1, , , , , , , ,27

5 Z tabeli 1 widać, że acyklowir nieoczekiwanie lepiej rozpuszcza się w mieszaninie acetalu formaldehydu z gliceryną i wody niż odpowiednio w glicerynie i wodzie oraz, że maksymalną rozpuszczalność uzyskuje się przy proporcji około 60 objętościowo/objętościowej gliceryny i 40 objętościowo/objętościowej wody. Tabela 2 Rozpuszczalność acyklowiru w mieszaninie acetalu formaldehydu z gliceryną, glikolu propylenowego i wody. Acetal formaldehydu z gliceryną/glikolpropyle Rozpuszczalność acyklowiru w mg/ml nowy/woda (g/g/ml) 0/40/20 3,44 11/29/20 4,71 20/20/20 4,60 30/10/20 5,20 40/0/20 5,73 Z tabeli 2 wynika, że acyklowir rozpuszcza się coraz lepiej, gdy w mieszaninie glikolu propylenowego i wody, glikol propylenowy zastępuje się acetalem formaldehydu z gliceryną. Farmakologiczne działanie emulsji według wynalazku wykazano w poniższych testach. Szereg testów przenikania przez skórę prowadzonych in vitro na ludzkiej skórze wykazało zwiększone przenikanie przez skórę w wyniku zastosowania emulsji typu olej w wodzie według wynalazku w porównaniu do przenikania uzyskanego przy zastosowaniu emulsji znanej z europejskiego opisu patentu nr EP-A W celu skriningu preparatów emulsyjnych w postaci kremów z różnymi środkami, tak zwanymi Franz Diffusion Cells, zastosowano składający się ze szklanych komór, otoczonych przez termostatycznie regulowany płaszcza wodny. Kawałki skóry (z plastycznych operacji chirurgicznych) umocowano na szczycie komór z licówką warstwy rogowej naskórka skierowaną ku górze, komory napełniono fizjologicznym płynem (płyn zbiornikowy). Krem poddawany badaniu nanoszono na skórę i w odpowiednich odstępach próbki płynu zbiornikowego brano do analizy substancji czynnej (acyklowiru). W celu zminimalizowania zmian między właściwościami barierowymi poszczególnych kawałków skóry, najpierw prowadzono pomiar przepuszczalności wody każdego kawałka skóry. Kawałek skóry odrzucano w przypadku dwóch wysokich lub dwóch niskich wartości. Z powodu możliwości wystąpienia wewnątrz-indywidualnych odmian, ważnym jest aby dobierać kawałki skóry w taki sposób, żeby kremy, które porównuje się, nanosić na skórę z tego samego dawcy i na taką samą powierzchnię skóry. W ewnątrz-indy widualne odmiany powodują, że wynik różnych testów nie może być zawsze bezpośrednio porównywany. Kremy stosowane do testów na przenikanie przez skórę zawsze zawierały 5% wagowo/wagowych acyklowiru oraz następujący stosunek glikolu propylenowego i acetalu formaldehydu z gliceryną:

6 Procenty wagowe acetalu formaldehydu z gliceryną Procenty wagowe glikolu propylenowego Procenty wagowe wody 1* ,32 2 * ,18 3* ,32 4* ,32 5* ,20 6** *** 0 40 * Kremy o zasadniczo takim samym składzie, z wyjątkiem acetalu formaldehydu z gliceryną/glikolem propylenowym, krem nr 2 zawierał dodatkowo około 10% wagowo/wagowych wody, tak więc wszystkie pięć kremów zawierało około 61% wagowo/wagowych fazy wodnej. ** Skład środka według europejskiego opisu patentowego EP-A *** Krem Zovirax Dokładny skład siedmiu wspomnianych kremów przedstawiono w następującej tabeli 3. Tabela 3 Skład podano w % wagowo/wagowych 1* 2* 3* 4* 5* 6** patent EP nr Acyklowir Biała wazelina 12, 65 12,65 12,65 12,65 12,65 12,5 Ciekła parafina (olej parafinowy) Alkohol cetylowo stearylowy Monostearynian gliceryny 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 5,0 5,25 5,25 5,25 5,25 5,25 Kwas stearynowy 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 6,75 Siarczan 0,75 laurylowosodowy Trietanoloamina 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 Glikol propylenowy Acetal formaldehydu z gliceryna , Oczyszczona woda 21,32 31,18 21,32 21,32 21,2 30,00 p-hydroksybenzoesan 0,15 0,1 0,15 0,15 0,1 metylu p-hydroksybenzoesan 0,08 0 0,08 0,08 0 propylu 7 * * * Zovirax 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

7 Siedem wspomnianych kremów poddawano trzem następującym testom: 1. Krem nr 4 porównano z kremem nr 7, ilość acyklowiru rozpuszczoną w płynie zbiornikowym oznaczano odpowiednio po 24, 48, 72, 96, 120, 144 i 168 godzinach, następnie po naniesieniu kremu na kawałek skóry. 2. Porównywano kremy nr 1, nr 3 i nr 4, ilość acyklowiru rozpuszczonego w płynie zbiornikowym oznaczano odpowiednio po 24, 48, 72 i 96 godzinach, następnie po naniesieniu kremu na kawałek skóry. 3. Porównywano kremy nr 1, nr 2 i nr 5 z kremem nr 6 za pomocą pomiaru ilości rozpuszczonego acyklowiru w płynie zbiornikowym, odpowiednio po 24, 4 8, 72 i 96 godzinach, następnie po naniesieniu kremu na kawałek skóry. Otrzymane w testach wyniki przedstawiono na rysunku, z których: Figura 1 przedstawia nagromadzoną ilość acyklowiru w ciągu siedmiu dni w płynach zbiornikowych z kremu nr 4 i kremu nr 7 oraz rozkład wyników, Figury 2 i 4 przedstawiają nagromadzoną ilość acyklowiru w ciągu czterech dni, w płynach zbiornikowych z kremu nr 1, 3 i 4, a fig. 4 dodatkowo ukazuje rozkład wyników (N = 5 lub 4), Figury 3 i 5 przedstawiają nagromadzoną w ciągu czterech dni ilość acyklowiru w płynach zbiornikowych z kremu 1, 2, 5 i 6, a fig. 5 dodatkowo ukazuje rozkład wyników (N = 8). Najlepszy sposób wykonania wynalazku Z figury 1 wynika, że wartości dla kremu Zovirax są zgodnie niższe niż wartości dla kremu zawierającego 11% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego. Wielofunkcyjna analiza wariancyjna ukazuje, że różnice są znaczne we wszystkich czasach pomiaru (p mniejsze niż 0,05 na dzień 1, 4, 5, 6 i 7; p mniejsze niż 0,01 na dzień 2 i 3). Tak więc, test 1 ukazuje, że stosując krem nr 4 zawierający 11% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego uzyskuje się zwiększone przenikanie przez skórę, podczas gdy w wyniku zastosowania kremu nr 4 otrzymuje się szybszy efekt niż w przypadku zastosowania kremu Zovirax, ponieważ szybciej uzyskuje się odpowiednie stężenie acyklowiru w miejscu infekcji. Figury 2 i 4 ukazują, że zwiększenie stężenia acetalu formaldehydu z gliceryną z 11% wagowo/wagowych do 20% wagowo/wagowych i 40% wagowo/wagowych oraz równoczesne zmniejszenie stężenia glikolu propylenowego z 29% wagowo/wagowych do 20% wagowo/wagowych i 0% wagowo/wagowych powoduje zwiększenie stężenia rozpuszczonego acyklowiru, a więc przyspieszenie przenikania acyklowiru przez skórę. Wielofunkcyjna analiza wariancyjna (wartości p przedstawiono na fig. 4) ukazuje, że kremy zawierające, odpowiednio, 40% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną /0% wagowo/wagowych glikolu propylenowego i 11% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną /29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego glikolu propylenowego różnią się znacznie pod względem przenikania acyklowiru po 48, 72 i 96 godzinach. Figury 3 i 5 ukazują, że kremy zawierające 40% wagowo/wagowych albo 30% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną bez jakiejkolwiek zawartości glikolu propylenowego powodują zwiększenie przenikania acyklowiru w porównaniu z kremami zawierającymi 40% wagowo/wagowych glikolu propylenowego i nie zawierają acetalu formaldehydu z gliceryną. Wielofunkcyjna analiza wariancyjna (wartości p przedstawiona na fig. 5) ukazuje, że krem zawierający 40% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną różni się znacznie od kremów zawierających 40% wagowo/wagowych glikolu propylenowego pod względem przenikania acyklowiru po 24, 48, 72 i 96 godzinach. Podsumowując, trzy testy ukazały, że zastosowanie acetalu formaldehydu z gliceryną jako rozpuszczalnika w emulsji typu olej w wodzie powoduje zwiększenie przenikania acyklowiru przez skórę w porównaniu z zastosowaniem glikolu propylenowego. Ten nieoczekiwany wynik jest bardzo ważny w leczeniu opryszczki (wargowej), w którym ważnym jest żeby czynny medycznie związek osiągał zakażone miejsce szybko i w odpowiedniej ilości.

8 W korzystnych wykonaniach emulsji według wynalazku, emulsja ta zawiera około 5% wagowo/wagowych acyklowiru lub soli albo estru tego związku, około 20% wagowo/wagowych acetalu formaldehydu z gliceryną i około 20% wagowo/wagowych glikolu propylenowego, względnie, odpowiednio, około 11 % acetalu z gliceryną i około 29% wagowo/wagowych glikolu propylenowego oraz od 20% do 25% wagowo/wagowych wody. Emulsja może korzystnie być w postaci kremu, który zawiera białą wazelinę, ciekłą parafinę (olej parafinowy), monostearynian gliceryny i kwas stearynowy. W tabeli 3 krem nr 4 według wynalazku badano za pomocą testu prowadzonego na zwierzętach i następnie porównywano z kremem Zovirax zawierającym 40% wagowo/wagowych glikolu propylenowego. Prowadzony na zwierzętach test 1 Działanie na zakażone skórnym wirusem opryszczki świnki morskie Wirus HSV-1 wszczepiono do naskórka skóry grzbietowej 30 zwierząt, wszczepienia dokonano w sześciu miejscach każdego zwierzęcia. Czterdzieści godzin p wszczepieniu, w miejscach wszczepienia, zaobserwowano obrzęk i rumień i rozpoczęto leczenie. Zwierzętom podawano dwa razy dziennie przez sześć dni po wszczepieniu 0,05 ml kremu na jedno miejsce. Leczenie było przypadkowe i błyskawiczne. Leczenie zwierzęcia nr 1 w sześciu zakażonych miejscach można zilustrować następująco. Krem placebo Krem acyklowiru według wynalazku Krem Zovirax Krem placebo Krem Zovirax Krem acyklowiru według wynalazku Zwierzę badano codziennie, aż wszystkie zakażone owrzodzenia zostały całkowicie wyleczone (dzień 20) i owrzodzenia te oceniano według ich stanu rozwoju i ustępowania choroby za pomocą arbitralnej skali od 0 do 3. Na zakończenie testu skuteczność każdego leczenia oceniono następująco: 1) Liczba dni do wyleczenia owrzodzenia, oraz 2) Nagromadzone przez dwadzieścia dni punkty owrzodzeń. Liczby dni do wyleczenia przypadające na leczenie (średnia geometryczna) są następujące: Leczenie Dni Współczynnik zmienności Krem acyklowiru 6,9 0,38 według wynalazku Krem Zovirax 8,5 0,31 Krem placebo 10,5 0,21 Stwierdzono statystycznie znaczne różnice między trzema leczeniami (p<0,00001). Miejsca leczone kremem acyklowiru według wynalazku dawały najszybsze cofanie się owrzodzeń po tym jak miejsca te leczono kremem Zovirax, który stosowano na miejsca leczone kremem placebo. Nagromadzona przez dwadzieścia dni (średnia geometryczna) liczba owrzodzeń jest następująca:

9 L e c z e n ie L ic z b a 95% p r z e d z i a ł u f n o ś c i u Krem a c y k lo w ir u 7,1 6,09-8,1 2 w e d łu g w y n a la z k u Krem Z o v ira x 9,0 8, ,0 Krem placebo 1 6,3 1 5, ,2 5 Między trzema kremami stosowanym do leczenia stwierdzono znaczne różnice (p<0,00001) statystyczne. Krem acyklowiru według wynalazku dawał najniższą liczbę nagromadzoną po czym następuje krem Zovirax, a następnie krem placebo. Podsumowanie wyniku badania działania kremów na skórne zakażenie wirusem opryszczki u świnek morskich jasno wykazuje działanie kremów acyklowiru na skórne zakażenia wirusem opryszczki u świnek morskich. W związku z powyższymi testami przenikania przez skórę, badanie ponadto wskazuje na zależność między wynikami testów in vitro ze skórą człowieka i wynikami testów in vivo ze świnkami morskimi. Krem acyklowiru według wynalazku wykazuje szybsze przenikanie przez skórę i lepsze wyniki leczenia in vivo w porównaniu z kremem Zovirax. Prowadzony na zwierzętach test 2 Czternastodniowe badanie drażniące skórę prowadzone na królikach Przez 14 dni sześć królików na wygolonych grzbietach poddano działaniu kremu acyklowiru według wynalazku, kremu Zovirax i 2% kremu mocznika. Dawka wynosiła 0,05 ml na poddawane działaniu miejsce na jeden dzień. Rumień skórny oceniano arbitralnie jeden raz dziennie za pomocą następującego systemu oceniającego. Grubość skóry mierzono także codziennie za pomocą grubościomierza. T w o rzen ie s i ę r u m ie n ia i s tr u p a o w r z o d z e n ia W a r to ść B ez r u m ie n ia 0 B a rd z o s ł a b y ru m ie ń 1 W y raźn y ru m ie ń 2 U m iark o w an y i s i l n y ru m ie ń 3 S i l n y ru m ie ń (b u ra c z k o w a c z e rw o n o ś ć ) i s ł a b e 4 t w o r z e n i e s i ę s t r u p a ( g łę b o k ie z m ia n y ) Łuszczenie się bez rumienia określono 1. Wskaźnik kumulacyjny na jedno traktowanie obliczono w odniesieniu do rumienia. Maksymalnie otrzymany wskaźnik wynosił 40. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4. Łuszczącą się skórę w miejscach poddanych działaniu kremu Zovirax zaobserwowano w trzech przypadkach. Traktowanie kremem Zovirax spowodowało znacznie większy wskaźnik podrażnienia skóry w porównaniu do traktowania kremem według wynalazku z acyklowirem i 2% kremem z mocznikiem (p = 0,0002).

10 Wskaźnik podrażnienia skóry na traktowanie obliczono w odniesieniu do zmiany w grubości skóry (pierwotny pomiar dla akumulacji płynu). Z pomiaru tego nie można wywnioskować żadnego dającego się otrzymać wskaźnika. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4. Nie stwierdzono żadnych istotnych różnic w grubości skóry (p>0,05). Tabela 4 Wskaźnik podrażnienia skóry odnoszący się do rumienia i zmiany w grubości skóry Preparat Rumień Zmiana w grubości skóry 5% Krem acyklowiru 15,0 0,148 według wynalazku 5% Krem Zovirax 23,2 0,198 2% Krem mocznika 12,5 0,157 Badanie podrażnienia skóry z zastosowaniem powyższych kremów zawierających acyklowir wykazuje, że krem według wynalazku znacznie mniej podrażnia skórę królika w porównaniu z kremem Zovirax. Jednakże obydwa kremy wywołują łatwo zauważalny rumień, którego nie powodował krem mocznikowy stosowany jako odniesienie, przy czym krem mocznikowy jest powszechnie stosowanym środkiem zmiękczającym. Najwyższa punktacja rumienia otrzymana w badaniu wynosiła 3, i odpowiada umiarkowanemu i silnemu rumieniowi. Skóra królika jest około cztery razy przepuszczalna w porównaniu do skóry człowieka, ale jednak porównywalna z zabezpieczoną skórą człowieka, a silne zmiany skórne nie są możliwe do zauważenia u istot ludzkich. Przykład 1. Krem acyklowirowy według wynalazku można wytwarzać w prosty sposób przez rozpuszczenie, podczas ogrzewania do 80 C, substancji (środków konserwujących) podanych w punkcie I tabeli 5 w oczyszczonej wodzie (II) po czym domieszkuje się rozpuszczalnik organiczny zawierający acetal formaldehydu z gliceryną i ewentualnie glikol propylenowy oraz trietanoloaminę (III). Następnie w mieszaninie tej dysperguje się acyklowir (V) i temperaturę ustawia się między 57 C i 63 C. Substancje podane w klatce IV stapia się razem i domieszkuje się w tej temperaturze, po czym prowadzi się emulgowanie z wytworzeniem trwałej emulsji typu olej w wodzie. Wykończoną emulsję podczas ciągłego mieszania chłodzi się do temperatury pokojowej. Przykład 2. Krem zawierający 5% acyklowiru (1 kg) V. Acyklowir 50,0 g IV. Biała wazelina 126,5 g Ciekła parafina 114,0 g Jednostearynian gliceryny 52,5 g Kwas stearynowy 27,5 g III. Trietanoloamina 14,0 g Glikol propylenowy 290,0 g Acetal formaldehydu z gliceryną 110,0 g II. Oczyszczona woda 213,2 g I. p-hydroksybenzoesan metylu 1,5 g p-hydroksybenzoesan propylu 0,8 g Razem: 1000,0 g

11 Składnik (I) rozpuszczono w składniku (II), a następnie zmieszano ze składnikiem (III). W mieszaninie tej zdyspergowano acyklowir (składnik V) w temperaturze 57 C < t < 63 C. Składniki (IV) stopiono razem i zmieszano w tej temperaturze, a następnie zemulgowano w odpowiednim emulgatorze. Na koniec, podczas mieszania, emulsję ochłodzono do temperatury pokojowej i wypełniono odpowiednie tubki. V I V III II I 6 Tabela 5 Zestawy składników kremów w % wagowo/wagowych ,65 12,65 11,4 11,4 7,2 1,8 5,25 5,25 2,75 2,75 1,4 1, ,77 21,32 21,32 0,15 0,15 0,08 0,08 0, 15 0, , 0 g 1 0 0,0 g 1 0 0,0 g 5 12,65 11,4 5,25 2,75 1, ,32 0,15 0,08 10,0g A c y k lo w ir Biała w a z e lin a Ciekła p a r a f i n a (olej p a r a fin o w y ) Cetom akrogol 1000 Alkohol c e t y lo w o - s t e a r y lo w y J e d n o s t e a r y n ia n g l i c e r y n y Kwas ste a ry n o w y T r ie t a n o lo a m in a G lik o l p ro p y le n o w y Acetal fo rm a ld e h y d u z g l i c e r y n ą Oczyszczona woda p -H y d ro k s y b e n z o e s a n m e ty lu p -H y d ro k s y b e n z o e s a n p r o p y lu

12 Przenikanie przez skórą oznaczone in vitro, trzy różne kremy zawierające 5% acyklowiru. Zakumulowana w płynie zbiornikowym ilość acyklowiru, przedstawiona jako funkcja czasu. Fig. 2

13 Przenikanie przez skórę oznaczone in vitro, cztery różne kremy zawierające 5% acyklowiru. Ilość acyklowiru zakumulowana w płynie zbiornikowym, przedstawiona jako funkcja czasu. Fig. 3

14 Przenikanie przez skórę oznaczone in vitro, trzy różne kremy zawierające 5% acyklowiru Ilość acyklowiru zakumulowana w ciągu dnia w płynie zbiornikowym, odchylenie standardowe Fig. 4

15 Przenikanie przez skórę oznaczone in vitro, cztery różne kremy zawierające 5% acyklowiru Ilość acyklowiru zakumulowana w ciągu dnia w płynie zbiornikowymodchylenie standardowe Fig. 5

16 TESTY PRZENIKANIA PRZEZ SKÓRĘ Ilość acyklowiru zakumulowana w płynie zbiornikowym przez 7 dni Fig. 1 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł