(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C07D 487/04 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/23 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: BENZOKSAZOLOWE INHIBITORY KINAZ I SPOSOBY ZASTOSOWANIA (30) Pierwszeństwo: US P US P US P US US P US (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/38 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/11 (73) Uprawniony z patentu: Intellikine, LLC, La Jolla, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PINGDA REN, San Diego, US YI LIU, San Diego, US LIANSHENG LI, San Diego, US KATRINA CHAN, San Diego, US TROY EDWARD WILSON, San Marino, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Monika Refczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O. O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 21P38439PL00 EP B1 Opis Tło wynalazku [0001] Aktywność komórek może być regulowana przez sygnały zewnętrzne, które stymulują lub inhibitują zdarzenia wewnątrzkomórkowe. Proces za pomocą którego stymulujące lub inhibitujące sygnały są przesyłane do i wewnątrz komórki, aby uzyskać odpowiedź wewnątrzkomórkową, jest nazywany transdukcją sygnału. W ciągu ostatnich dziesięcioleci zostały objaśnione kaskady zdarzeń transdukcji sygnałów i stwierdzono, że odgrywają one główną rolę w różnych odpowiedziach biologicznych. Stwierdzono, że defekty w różnych komponentach szlaków transdukcji sygnału wyjaśniają ogromną liczbę chorób obejmujących liczne postacie nowotworu, choroby zapalne, zaburzenia metaboliczne, choroby naczyniowe i neuronowe (Gaestel i in., Current Medicinal Chemistry (2007) 14: ). [0002] Kinazy stanowią klasę ważnych cząsteczek sygnałowych. Kinazy można zasadniczo podzielić na kinazy białkowe i kinazy lipidowe, a pewne kinazy wykazują podwójną specyficzność. Kinazy białkowe są enzymami, które fosforylują inne białka i/lub same siebie (tj. autofosforylacja). Kinazy białkowe można ogólnie podzielić na trzy główne grupy w oparciu o ich wykorzystanie substratów: kinazy tyrozynowe, które głównie fosforylują substraty na resztach tyrozynowych (np. erb2, receptor PDGF, receptor EGF, receptor VEGF, src, abl), kinazy serynowo-treoninowe, które głównie fosforylują substraty na resztach serynowych i/lub treoninowych (np. mtorc1, mtorc2, ATM, ATR, DNA-PK, Akt) oraz kinazy o podwójnej specyficzności, które fosforylują substraty na resztach tyrozynowych, serynowych i/lub treoninowych. [0003] Kinazy lipidowe są enzymami, które katalizują fosforylację lipidów. Te enzymy i powstające fosforylowane lipidy i biologicznie aktywne cząsteczki organiczne pochodzące od lipidów odgrywają rolę w wielu różnych procesach fizjologicznych, w tym proliferacji, migracji, adhezji i różnicowaniu komórek. Niektóre kinazy lipidowe są związane z błoną i katalizują fosforylację lipidów zawartych w błonach komórkowych lub z nimi związanych. Przykłady takich enzymów obejmują kinazę fosfoinozytydu(ów) (takie jak kinazy PI3, kinazy PI4), kinazy diacyloglicerolu oraz kinazy sfingozyny. [0004] Szlak sygnałowy 3-kinazy fosfoinozytydu (PI3K) jest jednym z najbardziej

3 2 zmutowanych układów w ludzkich nowotworach. Sygnalizacja PI3K jest również kluczowym czynnikiem w wielu innych chorobach u ludzi. Sygnalizacja PI3K bierze udział w wielu stanach chorobowych, w tym w alergicznym kontaktowym zapaleniu skóry, reumatoidalnym zapaleniu stawów, chorobie zwyrodnieniowej stawów, nieswoistym zapaleniu jelit, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, łuszczycy, stwardnieniu rozsianym, astmie, zaburzeniach związanych z powikłaniami cukrzycowymi oraz powikłaniach zapalnych układu sercowo-naczyniowego, takich jak ostry zespół wieńcowy. [0005] PI3K są członkami unikalnej i konserwowanej rodziny wewnątrzkomórkowych kinaz lipidowych, które fosforylują grupę 3'-OH na fosfatydyloinozytolach lub fosfoinozytydach. Rodzina PI3K obejmuje 15 kinaz z odmiennymi specyficznościami substratowymi, wzorcami ekspresji i sposobami regulacji (Katso i in., 2001). PI3K klasy I (p110α, p110β, p110δ i p110γ) są zwykle aktywowane przez kinazy tyrozynowe lub receptory sprzężone z białkiem G z wytworzeniem fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforanu (PIP 3 ), który angażuje późniejsze efektory, takie jak te w szlaku Akt/PDK1, mtor, kinazy rodziny Tec oraz GTP-azy rodziny Rho. Kinazy PI3K klasy II i III odgrywają kluczową rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym poprzez syntezę PI(3)P oraz PI(3,4)P2. Kinazy PIKK to kinazy białkowe, które kontrolują wzrost komórek (mtorc1) lub monitorują integralność genomu (ATM, ATR, DNA-PK i hsmg-1). [0006] Wytwarzanie PIP3 inicjuje silne sygnały wzrostu i przeżycia. W niektórych nowotworach nabłonkowych szlak PI3K jest aktywowany przez bezpośrednią mutację genetyczną. Ponieważ szlak sygnałowy PI3K odgrywa kluczową rolę w proliferacji i różnicowaniu komórek, inhibicja tego szlaku jest uważana za korzystną w chorobach hiperproliferacyjnych. [0007] Dalsze mediatory szlaku transdukcji sygnału PI3K obejmują Akt i ssaczy cel rapamycyny (mtor). Akt posiada domenę homologiczną do plekstryny (PH), która wiąże PIP3, co prowadzi do aktywacji kinazy Akt. Akt fosforyluje wiele substratów i jest głównym dalszym efektorem PI3K dla różnych odpowiedzi komórkowych. Pełna aktywacja Akt wymaga zwykle fosforylacji T308 w pętli aktywacyjnej i S473 w motywie hydrofobowym. Jedną z ważnych funkcji Akt jest zwiększanie aktywności mtor poprzez fosforylację TSC2 i inne mechanizmy. [0008] mtor jest kinazą serynowo-treoninową związaną z kinazami lipidowymi rodziny PI3K. Stwierdzono, że mtor odgrywa rolę w wielu procesach biologicznych, w tym we wzroście komórek, proliferacji komórek, ruchliwości i przeżyciu komórek.

4 3 Rozregulowanie szlaku mtor stwierdzono w różnych typach nowotworu. mtor jest wielofunkcyjną kinazą, która integruje sygnały czynnika wzrostu i substancji odżywczych w celu regulacji translacji białka, wchłaniania składników odżywczych, autofagii oraz funkcji mitochondriów. [0009] mtor występuje w dwóch kompleksach mtorc1 i mtorc2. mtorc1 zawiera podjednostkę raptor, a mtorc2 zawiera rictor. Kompleksy te są różnie regulowane i mają różne specyficzności wobec substratów i czułość na rapamycynę. Na przykład mtorc1 fosforyluje kinazę S6 (S6K) oraz 4EBP1, stymulując zwiększoną translację i biogenezę rybosomów z ułatwieniem wzrostu komórek i progresji cyklu komórkowego. S6K działa również w szlaku sprzężenia zwrotnego w celu osłabienia aktywacji PI3K/Akt. mtorc2 jest ogólnie nieczuły na rapamycynę. Uważa się, że mtorc2 moduluje sygnał czynnika wzrostu przez fosforylowanie C-końcowego motywu hydrofobowego niektórych kinaz AGC, takich jak Akt. W wielu kontekstach komórkowych, mtorc2 jest wymagany dla fosforylacji miejsca S473 Akt. [0010] W ciągu ostatniej dekady, mtor przyciągnął wiele uwagi ze względu na swoją rolę w kontrolowaniu wzrostu komórek oraz swój udział w chorobach ludzkich. mtor powiązano z wieloma zaburzeniami obejmującymi, ale bez ograniczeń, nowotwór, cukrzycę, otyłość, choroby sercowo-naczyniowe i zaburzenia neurologiczne. Wykazano, że mtor moduluje wiele fundamentalnych procesów biologicznych, w tym transkrypcję, translację, autofagię, organizację aktyny i biogenezę rybosomów przez integrację sygnałów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, takich jak sygnały, w których pośredniczą czynniki wzrostu, substancje odżywcze, poziomy energii i stres komórkowy. [0011] Jako takie kinazy, szczególnie kinazy białkowe, takie jak mtor i Akt, a także kinazy lipidowe, takie jak kinazy PI3K, są głównymi celami w opracowywaniu leków. Niniejszy wynalazek odpowiada na tą potrzebę w stanie techniki przez dostarczenie nowej klasy inhibitorów kinaz. [0012] US 2007/ ujawnia inhibitory kinazy PI3 i ich medyczne zastosowanie w leczeniu nowotworu. [0013] US 2007/ ujawnia inhibitory mtor, które są użyteczne w leczeniu raka. Streszczenie wynalazku [0014] Niniejszy wynalazek dostarcza związek i jego zastosowanie jako leku, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Ujawnione są również związki

5 4 lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, w których: X 1 oznacza N lub C-E 1, X 2 oznacza N, X 3 oznacza C, a X 4 oznacza C-R 9 lub N; albo X 1 oznacza N lub C-E 1, X 2 oznacza C, X 3 oznacza N i X 4 oznacza C-R 9 lub N; R 1 oznacza H, -L-C 1-10 alkil, -L-C 3-8 cykloalkil, -L-C 1-10 alkilo-c 3-8 cykloalkil, -L-aryl, -Lheteroaryl, -L-C 1-10 alkiloaryl, -L-C 1-10 alkiloheteroaryl, -L-C 1-10 alkiloheterocyklil, -L-C 2-10 alkenyl, -L-C 2-10 alkinyl, -L-C 2-10 alkenylo-c 3-8 cykloalkil, -L-C 2-10 alkinylo-c 3-8 cykloalkil, -L-heteroalkil, -L-heteroalkiloaryl, -L-heteroalkiloheteroaryl, -Lheteroalkiloheterocyklil, -L-heteroalkilo-C 3-8 cykloalkil, -L-aralkil, -L-heteroaralkil lub -Lheterocyklil, z których każdy jest niepodstawiony lub jest podstawiony przez jeden lub więcej niezależnych R 3 ; L jest nieobecny, oznacza -(C=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)N(R 31 )-, -S-, -S(O)-, -S(O) 2 -, -S(O) 2 N(R 31 )- lub -N(R 31 )-; M 1 oznacza benzoksazolil podstawiony przez -(W 2 ) k -R 2 lub benzoizoksazolil podstawiony przez -(W 2 ) k -R 2 ; k oznacza 0 lub 1; E 1 i E 2 oznaczają niezależnie -(W 1 ) j -R 4 ; j w E 1 lub j w E 2 oznacza niezależnie 0 lub 1; W 1 oznacza -O-, -NR 7 -, -S(O) 0-2 -, -C(O)-, -C(O)N(R 7 )-, -N(R 7 )C(O)-, -N(R 7 )S(O)-, -N(R 7 )S(O) 2 -, -C(O)O-, -CH(R 7 )N(C(O)OR 8 )-, -CH(R 7 )N(C(O)R 8 )-, -CH(R 7 )N(SO 2 R 8 )-, -CH(R 7 )N(R 8 )-, -CH(R 7 )C(O)N(R 8 )-, -CH(R 7 )N(R 8 )C(O)-, -CH(R 7 )N(R 8 )S(O)- lub -CH(R 7 )N(R 8 )S(O) 2 -; W 2 oznacza -O-, -NR 7 -, -S(O) 0-2 -, -C(O)-, -C(O)N(R 7 )-, -N(R 7 )C(O)-, -N(R 7 )C(O)N(R 8 )-, -N(R 7 )S(O)-, -N(R 7 )S(O) 2 -, -C(O)O-, -CH(R 7 )N(C(O)OR 8 )-, -CH(R 7 )N(C(O)R 8 )-, -CH(R 7 )N(SO 2 R 8 )-, -CH(R 7 )N(R 8 )-, -CH(R 7 )C(O)N(R 8 )-, -CH(R 7 )N(R 8 )C(O)-, -CH(R 7 )N(R 8 )S(O)- lub -CH(R 7 )N(R 8 )S(O) 2 -; R 3 i R 4 oznaczają niezależnie atom wodoru, atom halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3,

6 5 -OR 31, -NR 31 R 32, -NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 R 31, -SO 2 NR 31 R 32, -SO 2 NR 34 R 35, -NR 31 C(=O)R 32, -NR 31 C(=O)OR 32, -NR 31 C(=O)NR 32 R 33, -NR 31 S(O) 0-2 R 32, -C(=S)OR 31, -C(=O)SR 31, -NR 31 C(=NR 32 )NR 33 R 32, -NR 31 C(=NR 32 )OR 33, -NR 31 C(=NR 32 )SR 33, -OC(=O)OR 33, -OC(=O)NR 31 R 32, -OC(=O)SR 31, -SC(=O)OR 31, -P(O)OR 31 OR 32, -SC(=O)NR 31 R 32, aryl, heteroaryl, C 1-4 alkil, C 1-10 alkil, C 3-8 cykloalkil, C 1-10 alkilo-c 3-8 cykloalkil, C 3-8 cykloalkilo-c 1-10 alkil, C 3-8 cykloalkilo-c 2-10 alkenyl, C 3-8 cykloalkilo-c 2-10 alkinyl, C 1-10 alkilo-c 2-10 alkenyl, C 1-10 alkilo-c 2-10 alkinyl, C 1-10 alkiloaryl, C 1-10 alkiloheteroaryl, C 1-10 alkiloheterocyklil, C 2-10 alkenyl, C 2-10 alkinyl, C 2-10 alkenylo-c 1-10 alkil, C 2-10 alkinylo-c 1-10 alkil, C 2-10 alkenyloaryl, C 2-10 alkenyloheteroaryl, C 2-10 alkenyloheteroalkil, C 2-10 alkenyloheterocyklil, C 2-10 alkenylo-c 3-8 cykloalkil, C 2-10 alkinylo-c 3-8 cykloalkil, C 2-10 alkinyloaryl, C 2-10 alkinyloheteroaryl, C 2-10 alkinyloheteroalkil, C 2-10 alkinyloheterocyklil, C 2-10 alkinylo-c 3-8 cykloalkenyl, C 1-10 alkoksy-c 1-10 alkil, C 1-10 alkoksy-c 2-10 alkenyl, C 1-10 alkoksy-c 2-10 alkinyl, heterocyklil, heterocyklilo-c 1-10 alkil, heterocyklilo-c 2-10 alkenyl, heterocyklilo-c 2-10 alkinyl, arylo-c 1-10 alkil, arylo-c 2-10 alkenyl, arylo-c 2-10 alkinyl, aryloheterocyklil, heteroarylo-c 1-10 alkil, heteroarylo-c 2-10 alkenyl, heteroarylo-c 2-10 alkinyl, heteroarylo-c 3-8 cykloalkil, heteroalkil, heteroaryloheteroalkil lub heteroaryloheterocyklil, przy czym każde ze wspomnianych ugrupowań arylowych lub heteroarylowych jest niepodstawione lub jest podstawione przez jeden lub więcej niezależnych atomów halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3, -OR 31, -NR 31 R 32, -NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 R 31, -SO 2 NR 31 R 32, -SO 2 NR 34 R 35, -NR 31 C(=O)R 32, -NR 31 C(=O)OR 32, -NR 31 C(=O)NR 32 R 33, -NR 31 S(O) 0-2 R 32, -C(=S)OR 31, -C(=O)SR 31, -NR 31 C(=NR 32 )NR 33 R 32, -NR 31 C(=NR 32 )OR 33, -NR 31 C(=NR 32 )SR 33, -OC(=O)OR 33, -OC(=O)NR 31 R 32, -OC(=O)SR 31, -SC(=O)OR 31, -P(O)OR 31 OR 32 lub -SC(=O)NR 31 R 32 i przy czym każde ze wspomnianych ugrupowań alkilowych, cykloalkilowych, heterocyklilowych lub heteroalkilowych jest niepodstawione lub jest podstawione przez jeden lub więcej atomów halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3, -OR 31, -O-aryl, -NR 31 R 32, -NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 34 R 35 lub -C(=O)NR 31 R 32 ; R 2 oznacza atom wodoru, atom halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3, -OR 31, -NR 31 R 32, -NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 R 31, -SO 2 NR 31 R 32, -SO 2 NR 34 R 35, -NR 31 C(=O)R 32, -NR 31 C(=O)OR 32, -NR 31 C(=O)NR 32 R 33, -NR 31 S(O) 0-2 R 32, -C(=S)OR 31, -C(=O)SR 31, -NR 31 C(=NR 32 )NR 33 R 32, -NR 31 C(=NR 32 )OR 33, -NR 31 C(=NR 32 )SR 33, -OC(=O)OR 33, -OC(=O)NR 31 R 32,

7 6 -OC(=O)SR 31, -SC(=O)OR 31, -P(O)OR 31 OR 32, -SC(=O)NR 31 R 32, aryl (np. bicykliczny aryl, niepodstawiony aryl lub podstawiony monocykliczny aryl), heteroaryl, C 1-10 alkil, C 3-8 cykloalkil, C 1-10 alkilo-c 3-8 cykloalkil, C 3-8 cykloalkilo-c 1-10 alkil, C 3-8 cykloalkilo- C 2-10 alkenyl, C 3-8 cykloalkilo-c 2-10 alkinyl, C 1-10 alkilo-c 2-10 alkenyl, C 1-10 alkilo-c 2-10 alkinyl, C 1-10 alkiloaryl (np. C 2-10 alkilo-monocykliczny aryl, C 1-10 alkilo-podstawiony monocykliczny aryl lub C 1-10 alkilobicykloaryl), C 1-10 alkiloheteroaryl, C 1-10 alkiloheterocyklil, C 2-10 alkenyl, C 2-10 alkinyl, C 2-10 alkenylo-c 1-10 alkil, C 2-10 alkinylo-c 1-10 alkil, C 2-10 alkenyloaryl, C 2-10 alkenyloheteroaryl, C 2-10 alkenyloheteroalkil, C 2-10 alkenyloheterocyklil, C 2-10 alkenylo-c 3-8 cykloalkil, C 2-10 alkinyloaryl, C 2-10 alkinyloheteroaryl, C 2-10 alkinyloheteroalkil, C 2-10 alkinyloheterocyklil, C 2-10 alkinylo-c 3-8 cykloalkenyl, C 1-10 alkoksy-c 1-10 alkil, C 1-10 alkoksy-c 2-10 alkenyl, C 1-10 alkoksy-c 2-10 alkinyl, heterocyklil, heteroalkil, heterocyklilo-c 1-10 alkil, heterocyklilo-c 2-10 alkenyl, heterocyklilo-c 2-10 alkinyl, arylo-c 1-10 alkil (np. monocykliczny arylo-c 2-10 alkil, podstawiony monocykliczny arylo-c 1-10 alkil lub bicykloarylo-c 1-10 alkil), arylo-c 2-10 alkenyl, arylo-c 2-10 alkinyl, aryloheterocyklil, heteroarylo-c 1-10 alkil, heteroarylo-c 2-10 alkenyl, heteroarylo-c 2-10 alkinyl, heteroarylo-c 3-8 cykloalkil, heteroaryloheteroalkil lub heteroaryloheterocyklil, przy czym każde ze wspomnianych bicyklicznych arylowych lub heteroarylowych ugrupowań jest niepodstawione lub przy czym każde spośród bicyklicznego arylowego, heteroarylowego ugrupowania lub monocyklicznego arylowego ugrupowania jest podstawione przez jeden lub więcej niezależnych alkili, heteroalkili, alkenyli, alkinyli, cykloalkili, heterocykloalkili, aryli, aryloalkili, heteroaryli, heteroaryloalkili, atomów halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3, -OR 31, -NR 31 R 32, NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 R 31, -SO 2 NR 31 R 32, -SO 2 NR 34 R 35, -NR 31 C(=O)R 32, -NR 31 C(=O)OR 32, -NR 31 C(=O)NR 32 R 33, -NR 31 S(O) 0-2 R 32,-C(=S)OR 31, -C(=O)SR 31, -NR 31 C(=NR 32 )NR 33 R 32, -NR 31 C(=NR 32 )OR 33, -NR 31 C(=NR 32 )SR 33, -OC(=O)OR 33, -OC(=O)NR 31 R 32, -OC(=O)SR 31, -SC(=O)OR 31, -P(O)OR 31 OR 32 lub -SC(=O)NR 31 R 32 i przy czym każde ze wspomnianych ugrupowań alkilowych, cykloalkilowych, heterocyklilowych lub heteroalkilowych jest niepodstawione lub jest podstawione przez jeden lub więcej alkili, heteroalkili, alkenyli, alkinyli, cykloalkili, heterocykloalkili, aryli, aryloalkili, heteroaryli, heteroaryloalkili, atomów halogenu, -OH, -R 31, -CF 3, -OCF 3, -OR 31, -O-aryli, -NR 31 R 32, -NR 34 R 35, -C(O)R 31, -CO 2 R 31, -C(=O)NR 34 R 35 lub -C(=O)NR 31 R 32 ; każdy spośród R 31, R 32 i R 33 niezależnie oznacza H lub C 1-10 alkil, przy czym C 1-10 alkil jest niepodstawiony lub jest podstawiony przez jedną lub więcej grup arylowych,

8 7 heteroalkilowych, heterocyklilowych lub heteroarylowych, przy czym każda ze wspomnianych grup arylowych, heteroalkilowych, heterocyklilowych lub heteroarylowych jest niepodstawiona lub jest podstawiona przez jeden lub więcej spośród następujących: atom halogenu, -OH, -C 1-10 alkil, -CF 3, -O-aryl, -OCF 3, -OC 1-10 alkil, -NH 2, -N(C 1-10 alkilo)(c 1-10 alkil), -NH(C 1-10 alkil), -NH(aryl), -NR 34 R 35, -C(O)(C 1-10 alkil), -C(O)(C 1-10 alkiloaryl), -C(O)(aryl), -CO 2 -C 1-10 alkil, -CO 2 -C 1-10 alkiloaryl, -CO 2 -aryl, -C(=O)N(C 1-10 alkilo)(c 1-10 alkil), -C(=O)NH(C 1-10 alkil), -C(O)NR 34 R 35, -C(=O)NH 2, -OCF 3, -O(C 1-10 alkil), -O-aryl, -N(arylo)(C 1-10 alkil), -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 C 1-10 alkil, -S(O) 0-2 C 1-10 alkiloaryl, -S(O) 0-2 aryl, -SO 2 N(aryl), - SO 2 N(C 1-10 alkilo)(c 1-10 alkil), -SO 2 NH(C 1-10 alkil) lub -SO 2 NR 34 R 35 ; R 34 i R 35 w -NR 34 R 35, -C(=O)NR 34 R 35 lub -SO 2 NR 34 R 35 są brane razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, z wytworzeniem 3-10-członowego nasyconego lub nienasyconego pierścienia; przy czym wspomniany pierścień jest niezależnie niepodstawiony lub jest podstawiony przez jeden lub więcej -NR 31 R 32, hydroksyli, atomów halogenu, grup okso, aryli, heteroaryli, C 1-6 alkili lub O-aryli oraz przy czym wspomniany 3-10-członowy nasycony lub nienasycony pierścień zawiera niezależnie 0, 1 lub 2 heteroatomy dodatkowo do atomu azotu; każdy spośród R 7 i R 8 oznacza niezależnie atom wodoru, C 1-10 alkil, C 2-10 alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocyklil lub C 3-10 cykloalkil, z których każdy z wyjątkiem atomu wodoru jest niepodstawiony lub jest podstawiony przez jeden lub więcej niezależnych R 6 ; R 6 oznacza atom halogenu, -OR 31, -SH, -NH 2, -NR 34 R 35, - NR 31 R 32, -CO 2 R 31, -CO 2 aryl, -C(=O)NR 31 R 32, C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 C 1-10 alkil, -S(O) 0-2 aryl, -SO 2 NR 34 R 35, -SO 2 NR 31 R 32, C 1-10 alkil, C 2-10 alkenyl, C 2-10 alkinyl; arylo-c 1-10 alkil, arylo- C 2-10 alkenyl, arylo-c 2-10 alkinyl, heteroarylo-c 1-10 alkil, heteroarylo-c 2-10 alkenyl, heteroarylo-c 2-10 alkinyl, przy czym każda ze wspomnianych grup alkilowych, alkenylowych, alkinylowych, arylowych, heteroalkilowych, heterocyklilowych lub heteroarylowych jest niepodstawiona albo jest podstawiona przez jeden lub więcej niezależnych atomów halogenu, grup cyjanowych, grup nitrowych, -OC 1-10 alkili, C 1-10 alkili, C 2-10 alkenyli, C 2-10 alkinyli, halogeno-c 1-10 alkili, halogeno-c 2-10 alkenyli, halogeno-c 2-10 alkinyli, -COOH, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -SO 2 NR 34 R 35, -SO 2 NR 31 R 32, -NR 31 R 32, lub -NR 34 R 35 ; oraz R 9 oznacza H, atom halogenu, -OR 31, -SH, -NH 2, -NR 34 R 35, -NR 31 R 32, -CO 2 R 31, -CO 2 aryl, -C(=O)NR 31 R 32, C(=O)NR 34 R 35, -NO 2, -CN, -S(O) 0-2 C 1-10 alkil, -S(O) 0-2 aryl, -SO 2 NR 34 R 35, -SO 2 NR 31 R 32, C 1-10 alkil, C 2-10 alkenyl, C 2-10 alkinyl; arylo-c 1-10 alkil, arylo-

9 8 C 2-10 alkenyl, arylo-c 2-10 alkinyl, heteroarylo-c 1-10 alkil, heteroarylo-c 2-10 alkenyl, heteroarylo-c 2-10 alkinyl, przy czym każda ze wspomnianych grup alkilowych, alkenylowych, alkinylowych, arylowych, heteroalkilowych, heterocyklilowych lub heteroarylowych jest niepodstawiona albo jest podstawiona przez jeden lub więcej niezależnych atomów halogenu, grup cyjanowych, grup nitrowych, -OC 1-10 alkili, C 1-10 alkili, C 2-10 alkenyli, C 2-10 alkinyli, halogeno-c 1-10 alkili, halogeno-c 2-10 alkenyli, halogeno-c 2-10 alkinyli, -COOH, -C(=O)NR 31 R 32, -C(=O)NR 34 R 35, -SO 2 NR 34 R 35, -SO 2 NR 31 R 32, -NR 31 R 32, lub -NR 34 R 35. [0015] W niektórych wykonaniach związku do zastosowania w sposobach według wynalazku, inhibicja zachodzi u pacjenta cierpiącego na zaburzenie wybrane z grupy składającej się z nowotworu, choroby nerek, zaburzenia kości, choroby zapalnej, choroby immunologicznej, choroby układu nerwowego, choroby metabolicznej, choroby układu oddechowego, choroby mięśnia sercowego i jakichkolwiek innych stanów tutaj ujawnionych. Ponadto, w niektórych wykonaniach sposobu według wynalazku podawany jest drugi środek terapeutyczny. [0016] W innym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza związek do zastosowania w sposobie znacznej inhibicji proliferacji komórek nowotworowych, obejmującym kontaktowanie komórki ze skuteczną ilością związku według wynalazku, który inhibituje pełną aktywację Akt w komórce i środkiem przeciwnowotworowym, przy czym wspomniana inhibicja proliferacji komórek jest zwiększona przez synergistyczne działanie wspomnianego związku i wspomnianego środka przeciwnowotworowego. [0017] W niektórych innych wykonaniach, środek przeciwnowotworowy stosowany w przedmiotowych sposobach może obejmować, ale bez ograniczenia, rapamycynę, Gleevec lub ich pochodną, która inhibituje ssaczy cel rapamycyny lub Gleevec'u. [0018] Duża liczba stanów nowotworowych może być leczona przy użyciu jednej lub więcej przedmiotowych kompozycji. Stany takie obejmują, ale bez ograniczenia, stan nowotworowy taki jak restenoza, nowotwór wybrany spośród chłoniaka z komórek B, chłoniaka z komórek T, niedrobnokomórkowego raka płuc oraz białaczkę lub zaburzenie autoimmunologiczne. [0019] Związek według wynalazku i/lub środek przeciwnowotworowy mogą być podawane pozajelitowo, doustnie, dootrzewnowo, dożylnie, dotętniczo, przezskórnie, domięśniowo, liposomalnie, przez dostarczanie miejscowe przez cewnik lub stent, podskórnie, do tkanki tłuszczowej lub dokanałowo.

10 9 Krótki opis rysunków [0020] Nowe cechy wynalazku są przedstawione szczegółowo w załączonych zastrzeżeniach. Lepsze zrozumienie cech i zalet niniejszego wynalazku będzie możliwe przez odniesienie do poniższego szczegółowego opisu, który przedstawia ilustrujące przykłady wykonania, w których wykorzystywane są zasady wynalazku, oraz do załączonych rysunków, spośród których: Figura 1A-1B podsumowuje wyniki badań inhibicji proliferacji komórek wykonanych z wieloma liniami komórek nowotworowych in vitro z zastosowaniem konwencjonalnych leków przeciwnowotworowych lub związku według niniejszego wynalazku i związków pokrewnych z Tabeli 1. Procedura eksperymentalna jest opisana w niniejszym opisie, np. w przykładzie 17. Stopień inhibicji jest przedstawiony na figurze jako +, ++, +++, ++++ lub w kolejności wzrastającego stopnia inhibicji proliferacji komórek. Wyniki pokazują, że związki z Tabeli 1 dają 50% inhibicję proliferacji komórek przy stężeniu, które jest jeden lub dwa rzędy wielkości mniejsze niż w przypadku konwencjonalnych leków przeciwnowotworowych, przy badaniu w tych samych warunkach. Figura 2 przedstawia analizę western blot ilustrującą zależną od dawki skuteczność związku z Tabeli 1 w inhibicji fosforylacji pakt na reszcie 47, jak również innych cząsteczek sygnałowych dalszych niż mtor w tym p4ebp1 i pras40. Wyniki pokazują, że przedmiotowy inhibitor mtor według wynalazku jest bardziej skuteczny w inhibicji fosforylacji Akt w porównaniu z rapamycyną. Figura 3A przedstawia skuteczność in vivo związku z Tabeli 1 według przedmiotowego wynalazku w inhibicji wzrostu guza w modelu nowotworu, takim jak mysi model ksenoprzeszczepu ludzkiego glejaka U87 w ciągu około 14 dni badania po podaniu związku w dawce 3 mg/kg, 1 mg/kg lub 0,3 mg/kg. Figura 3B pokazuje zwierzęta testowe i wielkość guzów pobranych od zwierząt stanowiących kontrolę negatywną (traktowanych PEG400) albo od zwierząt testowych traktowanych dawką wynoszącą 0,3 mg/kg raz na dobę, 1 mg/kg raz dziennie lub 3 mg/kg co drugi dzień związku z Tabeli 1. Figura 3C przedstawia wykres mas ciała zwierząt kontroli negatywnej i testowych, mierzonych w trakcie leczenia. Wyniki pokazują, że związek jest dobrze tolerowany i nie wykryto żadnej znaczącej utraty masy w okresie leczenia oraz że wzrost guzów jest znacznie hamowany przez podawanie jednego lub więcej związków według niniejszego wynalazku w testowanych warunkach. Figura 4A ilustruje procedurę eksperymentalną do badania zdolności związku według

11 10 wynalazku do inhibitowania sygnalizacji mtor, zwłaszcza fosforylacji AKT(473), PRAS40, S6(240) oraz 4EBP-1. Schemat fosforylacji tych cząsteczek sygnałowych przedstawiono na Figurze 4B. Figura 5 przedstawia wyniki badania selektywności kinazy lipidowej i białkowej ze związkiem z Tabeli 1. Figura 6 przedstawia wpływ związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku na proliferację komórek PC3, aktywację pakt PC3 i proliferację pierwotnych nowotworowych linii komórkowych. Ponadto specyficzność związku z Tabeli 1 badano przez hodowanie komórek Jurakt w pełnej krwi w celu zbadania niespecyficznego wiązania /inaktywacji jednego lub więcej związków przez składniki pełnej krwi. Figura 7A-7B przedstawia wpływ związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku na proliferację komórkową i aktywację szlaku PI3K w porównaniu do rapamycyny. Figura 7A przedstawia wykres pokazujący krzywą dawka-odpowiedź proliferacji komórek PC3 w odpowiedzi na rapamycynę i związek według wynalazku z Tabeli 1. Figura 7B przedstawia analizę western blot inhibicji fosforylacji celów szlaku PI3K przez jeden lub więcej związków wybranych z Tabeli 1 w porównaniu z rapamycyną. Figura 8A-8B przedstawia porównanie wpływu związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku na proliferację wskazanych linii komórkowych. Figura 8A przedstawia wartość IC50 dla związku dla inhibicji linii komórkowych pochodzących z płuc i okrężnicy i podaje odpowiednie mutacje aktywujące proliferację związane z tymi liniami komórkowymi. Figura 8B przedstawia wpływ związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku na proliferację linii komórkowych zawierających różne wskazane mutacje aktywujące w porównaniu do inhibicji zapewnianej przez inhibitor kinazy Pan PI3 lub inhibitor kinazy Pan PI3, który inhibituje także mtor. Figura 9A-9B przedstawia wpływ związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku na progresję cyklu komórkowego w komórkach HCT116 i SW620 w porównaniu do różnych innych związków. Figura 9A przedstawia inhibitujące działanie związku przy 500 nm na progresję cyklu komórkowego w porównaniu z kontrolą w nośniku DMSO oraz w porównaniu z 10 µm doksorubicyną. Figura 9B ilustruje wpływ wskazanych związków na populację komórek przebywających w fazie G 0 /G 1 podczas hodowli dla dwóch różnych linii komórkowych. Figura 10 przedstawia analizę western blot wpływu związku według niniejszego wynalazku na fosforylację w komórkach nowotworowych z mysiego modelu nowotworu ksenoprzeszczepu U87-MG.

12 11 Figura 11A-11D przedstawia skuteczność podawania doustnego związku według niniejszego wynalazku w inhibicji wzrostu nowotworów ksenoprzeszczepu U87-MG, A549, ZR-75-1 i 786-O u samic atymicznych nagich myszy. Figura 12 przedstawia wyniki barwienia TUNEL masy guza nowotworów ksenoprzeszczepu U87-MG wyciętych z myszy, którym podawano doustnie nośnik, 1 mg/kg lub 3 mg/kg związku według wynalazku. Wyniki te pokazują zwiększoną apoptozę in vivo, w obecności związku z Tabeli 1 według niniejszego wynalazku. Figura 12 ponadto przedstawia wielkość wyciętych guzów U87, która zmniejsza się wraz z rosnącą dawką związku według niniejszego wynalazku. Szczegółowy opis wynalazku [0021] O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe stosowane tutaj mają takie samo znaczenie, jak jest to powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. [0022] Tak jak jest to stosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, formy liczby pojedynczej obejmują odniesienia mnogie, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. [0023] Określenie "skuteczna ilość" lub "terapeutycznie skuteczna ilość" odnosi się do takiej ilości związku tutaj opisanego, która jest wystarczająca do osiągnięcia zamierzonego zastosowania, w tym, ale bez ograniczenia, leczenia chorób, jak zdefiniowano poniżej. Terapeutycznie skuteczna ilość może się zmieniać w zależności od zamierzonego zastosowania (in vitro lub in vivo) lub pacjenta i stanu chorobowego, który się leczy, np. masy i wieku pacjenta, ciężkości stanu chorobowego, sposobu podawania i tym podobnych, co może być łatwo określone przez specjalistę w tej dziedzinie. Termin odnosi się również do dawki, która będzie indukować konkretną odpowiedź w komórkach docelowych, np. zmniejszenie adhezji płytek krwi i/lub migracji komórek. Konkretna dawka będzie się zmieniać w zależności od konkretnych wybranych związków, schematu dawkowania, który ma być stosowany, od tego czy jest ona podawana w kombinacji z innymi związkami, czasu podawania, tkanki, do której się ją podaje i fizycznego układu dostarczania, w którym jest przenoszona. [0024] Tak jak stosuje się tutaj terminy "leczenie" lub "leczyć", lub "uśmierzanie", lub "łagodzenie" stosuje się tutaj zamiennie. Określenia te odnoszą się do podejścia w celu uzyskiwania korzystnych lub pożądanych wyników, w tym, ale bez ograniczenia, korzyści terapeutycznych i/lub korzyści profilaktycznych. Przez terapeutyczną korzyść rozumie się

13 12 usunięcie lub złagodzenie zasadniczego zaburzenia, które się leczy. Ponadto korzyść terapeutyczną osiąga się przez usunięcie lub złagodzenie jednego lub więcej objawów fizjologicznych związanych z zasadniczym zaburzeniem tak, że obserwuje się poprawę u pacjenta, pomimo tego, że pacjent może wciąż być dotknięty zasadniczym zaburzeniem. W celach profilaktycznych kompozycje można podawać pacjentowi u którego występuje ryzyko rozwoju konkretnej choroby lub pacjentowi zgłaszającemu jeden lub więcej spośród fizjologicznych objawów choroby, nawet jeśli diagnoza tej choroby nie mogła być dokonana. [0025] Termin "efekt terapeutyczny", jak jest tu stosowany, obejmuje korzyści terapeutyczne i/lub korzyści profilaktyczne, jak opisano powyżej. Efekt profilaktyczny obejmuje opóźnienie lub wyeliminowanie pojawienia się choroby lub stanu, opóźnienie lub wyeliminowanie wystąpienia początku objawów choroby lub stanu, spowolnienie, zatrzymanie lub odwrócenie postępu choroby lub stanu, lub dowolną ich kombinację. [0026] Terminy "jednoczesne podawanie", "podawany w kombinacji z" i ich odpowiedniki gramatyczne, jak stosowane tutaj, obejmują podawanie dwóch lub więcej środków zwierzęciu tak, że oba środki i/lub ich metabolity obecne są w pacjencie w tym samym czasie. Jednoczesne podawanie obejmuje równoczesne podawanie w oddzielnych kompozycjach, podawanie w różnych czasach w oddzielnych kompozycjach lub podawanie w kompozycji, w której oba środki są obecne. [0027] Termin "farmaceutycznie dopuszczalna sól" odnosi się do soli utworzonych z różnych organicznych i nieorganicznych przeciwjonów dobrze znanych w dziedzinie i obejmuje, wyłącznie przykładowo, sole sodu, potasu, wapnia, magnezu, amonu, tetraalkiloamonu i podobne, gdy cząsteczka zawiera kwasowe grupy funkcyjne; a gdy cząsteczka zawiera zasadowe grupy funkcyjne, sole organicznych lub nieorganicznych kwasów, takich jak chlorowodorek, bromowodorek, winian, mesylan (metanosulfonian), etanosulfonian, octan, maleinian, szczawian, fosforan i tym podobne. W związku z więcej niż jedną grupą zasadową, więcej niż jedna z grup zasadowych może być przekształcana do postaci soli, w tym, lecz bez ograniczenia, bis- lub tris- soli. Alternatywnie, związek posiadający więcej niż jedną grupę zasadową może tworzyć sól przy tylko jednej z grup zasadowych. [0028] Terminy "antagonista" i "inhibitor" są stosowane zamiennie i odnoszą się do związku mającego zdolność inhibitowania funkcji biologicznej docelowego białka, czy przez inhibitowanie aktywności czy też ekspresji docelowego białka. W związku z tym terminy "antagonista" oraz "inhibitory" są zdefiniowane w kontekście roli biologicznej

14 13 docelowego białka. Chociaż tutaj korzystni antagoniści specyficznie oddziałują z celem (np. wiążą się z nim), związki, które inhibitują aktywność biologiczną docelowego białka przez oddziaływanie z innymi członkami szlaku transdukcji sygnału, którego docelowe białko jest członkiem, są również konkretnie zawarte w tej definicji. Korzystna aktywność biologiczna inhibitowana przez antagonistę jest związana z rozwojem, wzrostem lub rozprzestrzenianiem się nowotworu. [0029] Termin "agonista", jak stosowany jest tutaj, odnosi się do związku mającego zdolność do inicjowania lub wzmacniania funkcji biologicznej docelowego białka, czy to przez inhibitowanie aktywności czy też ekspresji białka docelowego. W związku z powyższym, termin "agonista" jest zdefiniowany w kontekście roli biologicznej docelowego polipeptydu. Chociaż tutaj korzystni agoniści specyficznie oddziałują z celem (np. wiążą się z nim), związki, które inicjują lub wzmacniają aktywność biologiczną docelowego polipeptydu przez oddziaływanie z innymi członkami szlaku transdukcji sygnału, którego docelowy polipeptyd jest członkiem, są również konkretnie zawarte w tej definicji. [0030] Tak jak stosuje się to tutaj, "środek" lub "biologicznie aktywny środek" odnosi się do biologicznego, farmaceutycznego lub chemicznego związku lub innego ugrupowania. Nieograniczające przykłady obejmują proste lub złożone cząsteczki organiczne lub nieorganiczne, peptyd, białko, oligonukleotyd, przeciwciało, pochodną przeciwciała, fragment przeciwciała, pochodną witaminy, węglowodan, toksynę lub związek chemioterapeutyczny. Można syntetyzować różne związki, na przykład, małe cząsteczki i oligomery (np. oligopeptydy i oligonukleotydy) oraz syntetyczne związki organiczne na bazie różnych struktur podstawowych. Ponadto, różne źródła naturalne mogą dostarczyć związki do badań, takie jak ekstrakty roślinne lub zwierzęce i tym podobne. [0031] "Transdukcja sygnału" jest to proces, podczas którego stymulujące lub inhibitujące sygnały są przesyłane do i wewnątrz komórki z wywołaniem odpowiedzi wewnątrzkomórkowej. Modulator szlaku transdukcji sygnału odnosi się do związku, który moduluje aktywność jednego lub więcej białek komórkowych przypisanych do tego samego konkretnego szlaku transdukcji sygnału. Modulator może zwiększać (agonista) lub tłumić (antagonista) aktywność cząsteczki sygnałowej. [0032] "Środek przeciwnowotworowy" lub "środek chemioterapeutyczny" odnosi się do dowolnego środka użytecznego w leczeniu stanu nowotworowego. Jedna z klas środków przeciwnowotworowych obejmuje środki chemioterapeutyczne. "Chemioterapia" oznacza podawanie jednego lub więcej leków chemioterapeutycznych i/lub innych środków

15 14 pacjentowi z nowotworem, różnymi sposobami, w tym dożylnym, doustnym, domięśniowym, dootrzewnowym, dopęcherzowym, podskórnym, przezskórnym, dopoliczkowym lub przez inhalację albo w postaci czopka. [0033] Termin "proliferacja komórek" odnosi się do zjawiska, za pomocą którego liczba komórek zmieniła się w wyniku podziału. Termin ten obejmuje również wzrost komórek, za pomocą którego morfologia komórki się zmieniła (np. wzrósł rozmiar) zgodnie z sygnałem proliferacyjnym. [0034] Termin "selektywna inhibicja" lub "selektywnie inhibitować" w odniesieniu do biologicznie czynnego środka, odnosi się do zdolności środka do preferencyjnego zmniejszania aktywności sygnałowej celu w porównaniu do aktywności sygnałowej poza celem, poprzez bezpośrednie lub pośrednie oddziaływanie z celem. [0035] "Aktywność mtorc1 i/lub mtorc2" w odniesieniu do biologicznie aktywnego środka odnosi się do zdolności środka do modulowania transdukcji sygnału, w którym pośredniczy mtorc1 i/lub mtorc2. Na przykład o modulacji aktywności mtorc1 i/lub mtorc2 świadczy zmiana wyniku sygnałowego szlaku PI3K/Akt/mTor. [0036] Termin "B-ALL", jak stosowany jest tutaj, odnosi się do ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek B. [0037] "Pacjent" odnosi się do zwierzęcia, takiego jak ssak, na przykład człowieka. Sposoby opisane tutaj mogą być przydatne zarówno w terapii ludzi jak i zastosowaniach weterynaryjnych. W niektórych wykonaniach, pacjentem jest ssak, a w niektórych wykonaniach pacjentem jest człowiek. [0038] "Radioterapia" oznacza wystawienie pacjenta, stosując rutynowe sposoby i kompozycje znane praktykującemu, na emitery promieniowania, takie jak radionuklidy emitujące cząstki alfa (np. radionuklidy aktynu i toru), emitery promieniowania o niskim liniowym przenoszeniu energii (LET) (tj. emitery beta), emitery elektronów konwersji (np. stront-89 i samar-153-edtmp) lub promieniowanie o wysokiej energii, w tym, bez ograniczenia, promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma oraz neutrony. [0039] "Środek przeciwnowotworowy" lub "środek chemioterapeutyczny" odnosi się do dowolnego środka użytecznego w leczeniu stanu nowotworowego. Jedna z klas środków przeciwnowotworowych obejmuje środki chemioterapeutyczne. "Chemioterapia" oznacza podawanie jednego lub więcej leków chemioterapeutycznych i/lub innych środków pacjentowi z nowotworem, różnymi sposobami, w tym dożylnym, doustnym, domięśniowym, dootrzewnowym, dopęcherzowym, podskórnym, przezskórnym, dopoliczkowym lub przez inhalację albo w postaci czopka.

16 15 B. Schematy reakcji [0040] Związki według wynalazku można wytworzyć drogami opisanymi niżej. Materiały tutaj użyte są albo dostępne w handlu albo wytworzone sposobami syntezy powszechnie znanymi w tej dziedzinie. [0041] W jednym wykonaniu, związki syntetyzuje się na drodze kondensacji sfunkcjonalizowanego heterocyklu A-1 z formamidem w celu dostarczenia pirazolopirymidyny A-2. Pirazolopirymidynę traktuje się N-jodosukcynoimidem, co wprowadza podstawnik jodowy w pierścieniu pirazolowym jak w A-3. Podstawnik R1 jest wprowadzany przez reakcję pirazolopirymidyny A3 ze związkiem o wzorze R 1 -Lg w obecności zasady, takiej jak węglan potasu, w celu wytworzenia związku o wzorze A-4. Inne zasady, które są odpowiednie do stosowania w tym etapie, obejmują, ale nie wyłącznie, wodorek sodu, t-butanolan potasu. Związek o wzorze R 1 -Lg ma grupę R 1, jak zdefiniowano dla R 1 w związku o wzorze I'-A', jak określono powyżej, i przy czym -Lg oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak halogenkowa (w tym bromowa, jodowa i chlorowa), tosylanowa lub inna odpowiednia grupa opuszczająca. [0042] Podstawniki odpowiadające M1 są następnie wprowadzane przez reakcję kwasów arylo- lub heteroaryloboronowych ze związkiem o wzorze A-4 z otrzymaniem związku A- 5.

17 16 [0043] Alternatywnie, można zastosować chemię Mitsunobu do uzyskania alkilowanej pirazolopirymidyny A-4, tak jak pokazano na schemacie A-1. Jodopirazolopirymidynę A- 3 poddaje się reakcji z odpowiednim alkoholem w obecności trifenylofosfiny i azodikarboksylanu diizopropylu (DIAD) z wytworzeniem pirazolopirymidyny A-4. [0044] Związki według wynalazku mogą być syntetyzowane za pomocą schematu reakcji przedstawionego ogólnie na schemacie B. Synteza przebiega poprzez sprzęganie związku o wzorze A ze związkiem o wzorze B z otrzymaniem związku o wzorze C. Etap sprzęgania typowo katalizowany jest za pomocą np. katalizatora palladowego, w tym, lecz nie ograniczając, tetrakis(trifenylofosfino)palladu. Generalnie sprzęganie przeprowadza się w obecności odpowiedniej zasady, której nieograniczającym przykładem jest węglan sodu. Jednym przykładem odpowiedniego rozpuszczalnika dla reakcji jest wodny dioksan. [0045] Związek o wzorze A do zastosowania na schemacie B ma strukturę o wzorze A, przy czym T 1 oznacza triflat lub atom halogenu (w tym brom, chlor i jod) i przy czym R 1, X 1, X 2, X 3, R 31 i R 32 są takie jak zdefiniowano dla związku o wzorze I'-A'. Dla kwasów boronowych i pochodnych kwasowych, jak przedstawiono we wzorze B, M oznacza albo M 1 albo M 2. M 1 jest taki jak zdefiniowano dla związku o wzorze I'-A'. Na przykład M 1 może oznaczać grupę 5-benzoksazolilową lub 6-benzoksazolilową, w tym, lecz nie ograniczając, te grupy M 1, które są tutaj ujawnione. M 2 oznacza grupę, która jest przekształcana syntetycznie z utworzeniem M 1, po tym jak grupa M2 zostaje sprzężona z bicyklicznym rdzeniem związku o wzorze A. [0046] Dla związku o wzorze B, G oznacza atom wodoru lub R G1, przy czym R G1 oznacza alkil, alkenyl albo aryl. Alternatywnie, B(OG) 2 jest brane razem z wytworzeniem 5- lub 6- członowej grupy cyklicznej. W niektórych wykonaniach, związek o wzorze B jest związkiem mającym strukturę o wzorze E:

18 17 [0047] przy czym G oznacza H lub R G1 ; R G1 oznacza alkil, alkenyl albo aryl. Alternatywnie, tworzy 5- lub 6-członową grupę cykliczną; a R 2 oznacza ugrupowanie R G2, przy czym ugrupowanie R G2 oznacza H, acyl lub grupę zabezpieczającą grupę aminową, w tym, ale nie wyłącznie, karbaminian tert-butylu (BOC), karbobenzyloksyl (Cbz), benzyl (Bz), fluorenylometyloksykarbonyl (FMOC), p- metoksybenzyl (PMB) i tym podobne. [0048] W niektórych wykonaniach, związkiem o wzorze B jest związek o wzorze B', przy czym G oznacza R G1. lub związek o wzorze B'', przy czym G oznacza atom wodoru. Schemat C przedstawia przykładowy schemat syntezy związku o wzorze B' lub, ewentualnie, wzorze B" do stosowania na schemacie reakcji C. Reakcja ta zachodzi przez poddanie związku o wzorze D reakcji z boranem trialkilu lub pochodną kwasu boronowego z wytworzeniem związku o wzorze B'. Reakcję typowo prowadzi się w rozpuszczalniku, takim jak dioksan lub tetrahydrofuran. Boran trialkilu obejmuje, ale nie ograniczając, boran triizopropylu, a pochodna kwasu boronowego obejmuje, ale nie ograniczając, bis(pinakolato)dibor. [0049] Gdy reakcję prowadzi się z boranem trialkilu, zasada, taka jak n-butylolit, jest najpierw dodawana do związku o wzorze D w celu wytworzenia anionu przed dodawaniem boranu. Gdy reakcję prowadzi się z pochodną kwasu boronowego, taką jak bis(pinakolato)dibor, stosuje się katalizator palladowy i zasadę. Typowe katalizatory palladowe obejmują, ale nie ograniczając, chlorek((difenylofosfino)ferroceno)palladu. Odpowiednia zasada obejmuje, ale nie ograniczając, octan potasu. [0050] Związek o wzorze D do zastosowania na schemacie C oznacza związek, w którym T 2 oznacza atom halogenu lub inną grupę opuszczającą, a M jest taki jak zdefiniowano powyżej na schemacie B. Związek o wzorze B' może być dalej przekształcany w związek

19 18 o wzorze B'' przez traktowanie kwasem, takim jak kwas chlorowodorowy. [0051] W jednym wykonaniu związku o wzorze B, B', B'' lub E, grupy G oznaczają atom wodoru. W innym wykonaniu związku o wzorze B, B', B" lub E, grupy G oznaczają R G1. [0052] W niektórych wykonaniach, nie przeprowadza się żadnej dalszej przemiany syntetycznej ugrupowania M 1 po reakcji sprzęgania, gdy np. M 1 oznacza 2-Nacetylobenzoksazol-5-il. [0053] Niektóre przykładowe związki o wzorze B, które mogą być syntetyzowane za pomocą schematu C, obejmują, ale bez ograniczenia, związki o następujących wzorach: [0054] W innych wykonaniach wynalazku, związek o wzorze E otrzymuje się ze związku o wzorze F, jak przedstawiono na schemacie C-1:

20 19 [0055] Schemat C-1 przedstawia przykładowy schemat syntezy związku o wzorze E. Reakcja ta zachodzi przez poddanie związku o wzorze F reakcji z boranem trialkilu lub pochodną kwasu boronowego z wytworzeniem związku o wzorze E. Warunki reakcji są, takie jak opisano powyżej na schemacie C. [0056] Związek o wzorze F do stosowania na schemacie C-1 to związek, w którym T 2 oznacza atom halogenu (w tym Br, Cl i I) lub inną grupę opuszczającą (w tym, lecz nie wyłącznie, triflat, tosylan i mesylan), a ugrupowanie G p oznacza H, acyl lub grupę zabezpieczającą grupę aminową, w tym, ale nie wyłącznie, karbaminian tert-butylu (BOC), karbobenzyloksyl (Cbz), benzyl (Bz), fluorenylometyloksykarbonyl (FMOC), p- metoksybenzyl (PMB) i tym podobne. [0057] Związek o wzorze E, w którym G oznacza alkil, można dalej przekształcić w związek o wzorze E, w którym G oznacza atom wodoru, przez traktowanie kwasem, takim jak kwas chlorowodorowy. [0058] W razie potrzeby, odbezpieczenie podstawnika (np. usuwanie zabezpieczenia Boc z podstawnika aminowego) na ugrupowaniu benzoksazolilu (tj. M 1 we wzorze C) przeprowadza się po sprzęganiu związku o wzorze B ze związkiem o wzorze A. [0059] Niektóre przykładowe związki z takimi grupami zabezpieczającymi obejmują, ale bez ograniczenia, związki o następujących wzorach: [0060] Przykładową transformację M 2 do M 1 można przeprowadzić za pomocą schematu D, jak przedstawiono poniżej.

21 20 [0061] W etapie 1 związek o wzorze 3-1 poddaje się reakcji z kwasem boronowym 3-2 w obecności tetrakis(trifenylofosfino)palladu i odpowiedniej zasady, takiej jak węglan sodu w wodno/organicznej mieszaninie rozpuszczalników z wytworzeniem związku o wzorze 3-3. W etapie 2 związek o wzorze 3-3 poddaje się reakcji z około 2 równoważnikami kwasu azotowego w kwasie octowym jako rozpuszczalniku z wytworzeniem związku o wzorze 3-4. Dwa alternatywne przekształcenia mogą być wykorzystane do przeprowadzenia następnego przekształcenia z etapu 3. W pierwszym sposobie związek o wzorze 3-4 jest traktowany ditionianem sodu i wodorotlenkiem sodu w wodzie z wytworzeniem związku o wzorze 3-5. Alternatywnie, związek o wzorze 3-4 redukuje się z użyciem palladu na węglu w odpowiednim rozpuszczalniku w atmosferze wodoru z wytworzeniem związku o wzorze 3-5. [0062] W etapie 4 związek 3-5 poddaje się reakcji z około 1,2 równoważnika bromku cyjanu w rozpuszczalniku, takim jak mieszanina metanol/tetrahydrofuran z wytworzeniem związku o wzorze 3-6. Związek o wzorze 3-6 można dalej przekształcać za pomocą innego podstawienia lub tworzenia pochodnych. [0063] Związek o wzorze 3-1 przydatny w sposobie według schematu D to związek mający strukturę o wzorze 3-1, przy czym T 1 oznacza triflat lub atom halogenu (w tym brom, chlor i jod) i przy czym R 1, X 1, X 2, X 3, R 31 i R 32 są takie jak zdefiniowano dla związku o wzorze I'-A'. [0064] Przykładowe związki mające rdzeń pirazolopirymidynowy można syntetyzować za pomocą schematu E.

22 21 [0065] W etapie 1 na schemacie E, związek A-2 w dimetyloformamidzie (DMF) poddaje się reakcji z N-halogenosukcynoimidem (NT 1 S) w około 80 C z wytworzeniem związku 4-1, w którym T 1 oznacza jod lub brom. W etapie 2, związek 4-1 w DMF poddaje się reakcji ze związkiem R 1 T x, w obecności węglanu potasu, z wytworzeniem związku 4-2. W etapie 4, związek 4-2 jest sprzęgany ze związkiem o wzorze B z użyciem katalizatora palladowego, takiego jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad, w obecności węglanu sodu, z wytworzeniem związku pirazolopirymidyny, jak pokazano. [0066] Związek o wzorze R 1 T x nadający się do stosowania na schemacie reakcji E to związek, w którym R 1 oznacza cykloalkil lub alkil, a T x oznacza atom halogenu (w tym brom, jod lub chlor) lub grupę opuszczającą, w tym, ale bez ograniczenia, mesylan lub tosylan. [0067] Schematy reakcji F-M ilustrują sposoby syntezy reagentów boranowych przydatnych do wytwarzania związków pośrednich stosowanych do syntezy związków według wynalazku, jak opisano na powyższych schematach reakcji A, B i E, w celu wprowadzenia podstawników M 1.

23 22

24 23

25 24

26 25 [0068] W alternatywnym sposobie syntezy, związek o wzorze N-1 i związek N-2 sprzęga się z wytworzeniem związku o wzorze C. Etap sprzęgania jest zwykle katalizowany za pomocą, np. katalizatora palladowego, w tym, ale bez ograniczenia, tetrakis(trifenylofosfino)palladu. Generalnie sprzęganie przeprowadza się w obecności odpowiedniej zasady, a jej nieograniczającym przykładem jest węglan sodu. Jednym przykładem odpowiedniego rozpuszczalnika dla reakcji jest wodny dioksan. [0069] Związek o wzorze N-1 do zastosowania na schemacie N ma strukturę o wzorze N- 1, przy czym G oznacza atom wodoru lub R G1, przy czym R G1 oznacza alkil, alkenyl albo aryl. Alternatywnie, B(OG) 2 w związku o wzorze N-1 jest brane razem z wytworzeniem 5- lub 6-członowej grupy cyklicznej. R 1, X 1, X 2, X 3, R 31 i R 32 w związku o wzorze N-1 są takie jak zdefiniowano dla związku o wzorze I'-A'. [0070] Związek o wzorze N-2 do zastosowania na schemacie N ma strukturę o wzorze N- 2, w którym T 1 oznacza triflat lub atom halogenu (w tym brom, chlor i jod). M w związku o wzorze N-2 oznacza albo M 1 albo M 2. M 1 jest takie jak zdefiniowano dla związku o wzorze I. Na przykład M 1 może oznaczać grupę 5-benzoksazolilową lub 6- benzoksazolilową, w tym, ale bez ograniczenia, te grupy M 1, które tutaj ujawniono. M 2 oznacza grupę, która jest przekształcana syntetycznie z wytworzeniem M 1, po tym jak

27 26 grupa M 2 zostanie sprzężona z bicyklicznym rdzeniem związku o wzorze N-1. [0071] Związek o wzorze N-1 można zsyntetyzować jak pokazano na schemacie N-1. Związek o wzorze N-1 poddaje się reakcji z boranem trialkilu lub pochodną kwasu boronowego z wytworzeniem związku o wzorze N-1. Reakcję typowo prowadzi się w rozpuszczalniku, takim jak dioksan lub tetrahydrofuran. Boran trialkilu obejmuje, ale bez ograniczenia, boran triizopropylu, a pochodna kwasu boronowego obejmuje, ale bez ograniczenia, bis(pinakolato)dibor. [0072] Gdy reakcję prowadzi się z boranem trialkilu, do związku o wzorze N-3 dodawana jest najpierw zasada, taka jak n-butylolit, w celu wytworzenia anionu przed dodawaniem boranu. Gdy reakcję prowadzi się z pochodną kwasu boronowego, taką jak bis(pinakolato)dibor, stosuje się katalizator palladowy i zasadę. Typowe katalizatory palladowe obejmują, ale bez ograniczenia, chlorek((difenylofosfino)ferroceno)palladu. Odpowiednia zasada obejmuje, ale bez ograniczenia, octan potasu. [0073] Związek o wzorze N-3 odpowiedni do zastosowania na schemacie N-1 to związek, w którym T 2 oznacza atom halogenu lub inną grupę opuszczającą, taką jak mesylan, tosylan lub triflat. X 1, X 2, X 3, R 1, R 31 i R 32 w związku o wzorze N-3 są takie jak zdefiniowano dla związku o wzorze I'-A'. [0074] W niektórych wykonaniach wynalazku, związek o wzorze A, B, B', B'', C, C'', D, E, E'', 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1'', N-3'', 3-1'', 3-3'', 3-4'', 3-5'', 3-6'', N-1'' lub N-3'' jest dostarczany jako jego sól, w tym, ale bez ograniczenia, chlorowodorek, octan, mrówczan, azotan, siarczan i boran. [0075] W niektórych wykonaniach wynalazku, związek palladu, w tym, ale bez ograniczenia, chlorek((difenylofosfino)ferroceno)palladu i tetrakis(trifenylofosfino)pallad, stosuje się w syntezie związku o wzorze A, B, B', B", C, C", D, E, E", 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1", N-3", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", N-1" lub N-3". Gdy związek palladu jest obecny w syntezie związku o wzorze A, B, B', B", C, C", D, E, E", 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1", N-3", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", N-1" lub N-3", jest on obecny w ilości w

28 27 zakresie od około 0,005 równoważnika molowego do około 0,5 równoważnika molowego, od około 0,05 równoważnika molowego do około 0,20 równoważnika molowego, od około 0,05 równoważnika molowego do około 0,25 równoważnika molowego, od około 0,07 równoważnika molowego do około 0,15 równoważnika molowego lub od około 0,8 równoważnika molowego do około 0,1 równoważnika molowego związku o wzorze A, B, B', B", C, D, E, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1 lub N-3. W niektórych wykonaniach, związek palladu, w tym, ale bez ograniczenia, chlorek ((difenylofosfino)ferroceno)palladu i tetrakis(trifenylofosfino)pallad, występuje w syntezie związku o wzorze A, B, B', B", C, C", D, E, E", 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1", N-3", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", N-1" lub N-3" w ilości około 0,07, około 0,08, około 0,09, około 0,10, około 0,11, około 0,12, około 0,13, około 0,14 lub około 0,15 równoważników molowych materiału wyjściowego o wzorze A, B, B', B", C, C", D, E, E", 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1", N-3", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", N-1" lub N-3", który jest stosowany do syntezy związku o wzorze A, B, B', B", C, C", D, E, E", 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1", N-3", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", N-1" lub N-3". [0076] W niektórych wykonaniach powyższych schematów reakcji B, D, E, N lub N-1, inne wykonanie związków o wzorze A, C, 3-1, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, A-2, 4-1, 4-2, N-1 i N-3 jest takie jak pokazano na schematach B', D', E', N' lub N-1' poniżej. W tych alternatywnych syntezach, w wytwarzaniu związku o wzorze C, 3-1, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, A- 2, 4-1, 4-2, N-1 lub N-3, stosuje się związki, które zawierają grupę aminową z grupą R G2 obecną podczas jednego lub więcej etapów syntezy, przy czym R G2 oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, w tym, ale bez ograniczenia, karbaminian t-butylu (BOC), karbobenzyloksyl (Cbz), benzyl (Bz), fluorenylometyloksykarbonyl (FMOC), p- metoksybenzyl (PMB) i tym podobne. Związki te obejmują związek o wzorze A", C", 3-1", 3-3", 3-4", 3-5", 3-6", A-2", 4-1", 4-2", N-1" lub N-3". [0077] Grupa RG 2 jest usuwana za pomocą odpowiednich sposobów, w dowolnym pożądanym momencie, po czym związek o wzorze C, 3-1, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, A-2, 4-1, 4-2, N-1 lub N-3 ma atom wodoru jako R 31 zastępujący grupę R G2 na grupie aminowej. Przekształcenie to jest szczegółowo zilustrowane dla konwersji związku o wzorze C'' do związku C (tj. tak jak w etapie 4 na schemacie E') oraz dla konwersji związku o wzorze 3-6" do związku o wzorze 3-6 (tj. tak jak w etapie 5 na schemacie D'). Ilustracja ta nie jest w żaden sposób ograniczająca, jeśli chodzi o wybór etapów, przy czym związek zawierający grupę NR 31 R G2 można przekształcić do związku zawierającego grupę NR 31 R 32, w którym grupa R 32 oznacza atom wodoru.

29 28

30 29 [0078] Ponadto wynalazek obejmuje sposoby syntezy związków A, B, B', B", C, E, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, N-1 lub N-3, przy czym jeden lub więcej M, M 1 lub R 1 ma zabezpieczającą grupę obecną podczas jednego lub więcej etapów syntezy. Grupy zabezpieczające odpowiednie do stosowania dla grupy M, M 1 albo R 1, są dobrze znane w dziedzinie, jak również sposoby włączania i usuwania oraz odczynniki odpowiednie do takich transformacji. [0079] Związki według wynalazku, w których X 4 oznacza C-R 9 mogą być otrzymane sposobami analogicznymi do tych opisanych na schematach zilustrowanych powyżej. Tabela 1. Aktywność biologiczna związku według wynalazku (1) i kilku innych związków ilustracyjnych. IC 50 IC 50 IC 50 IC 50 IC 50 EC 50 Struktura mtor PI3K α PI3K β PI3K γ PI3K δ PC3 (nm) (nm) (nm) (nm) (nm) (nm)

31

32

33

34

35 [0080] Tabela 1 przedstawia aktywność biologiczną kilku związków w badaniach kinazy mtor i PI3K, w tym związku (1), związku według wynalazku. Skala stosowana w Tabeli 1 jest następująca: ++++ mniej niż 100 nm; +++ mniej niż 1,0 µm; ++ mniej niż 10 µm; oraz + więcej niż 10 µm. [0081] Dowolny z przedstawionych powyżej związków może wykazywać aktywność biologiczną w badaniu inhibicji mtor lub PI3K wynoszącą od około 0,5 nm do 25 µm (IC 50 ). [0082] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może wiązać się specyficznie z kinazą PI3 lub kinazą białkową wybraną z grupy obejmującej mtor, kinazę białkową zależną od DNA (numer dostępu do białka Pubmed (PPAN) AAA79184), kinazę tyrozynową Abl (CAA52387), Bcr-Abl, kinazę komórek hematopoetycznych (PPAN CAI19695), Src (PPAN CAA24495), receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (PPAN ABB82619), receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (PPAN ABB82619), receptor czynnika wzrostu naskórka (PPAN AG43241), receptor B4 EPH (PPAN EAL23820), receptor czynnika komórek macierzystych (PPAN AAF22141), receptor TIE-2 białkowej kinazy tyrozynowej (PPAN Q02858), tyrozynową

36 35 kinazę 3 podobną do fms (PPAN NP_004110), receptor alfa płytkopochodnego czynnika wzrostu (PPAN NP_990080), RET (PPAN CAA73131), oraz wszelkie inne kinazy białkowe wymienione w załączonych tabelach i na rysunkach, a także dowolne ich funkcjonalne mutanty. W niektórych wykonaniach, wartość IC50 związku z Tabeli 1 dla p110α, p110β, p110γ lub p110δ wynosi mniej niż około 1 µm, mniej niż około 100 nm, mniej niż około 50 nm, mniej niż około 10 nm, mniej niż 1 nm lub nawet mniej niż około 0,5 nm. W niektórych wykonaniach, wartość IC50 związku według wynalazku dla mtor wynosi mniej niż około 1 µm, mniej niż około 100 nm, mniej niż około 50 nm, mniej niż około 10 nm, mniej niż 1 nm lub nawet mniej niż około 0,5 nm. W niektórych innych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 wykazuje podwójną specyficzność wiązania i jest zdolnych do inhibitowania kinazy PI3 (np. kinazy PI3 klasy I), jak również kinazy białkowej (np. mtor) przy wartości IC50 wynoszącej mniej niż około 1 µm, mniej niż około 100 nm, mniej niż około 50 nm, mniej niż około 10 nm, mniej niż 1 nm lub nawet mniej niż około 0,5 nm. W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może być w stanie inhibitować kinazy tyrozynowe, w tym, na przykład, kinazę białkową zależną od DNA (numer dostępu do białka Pubmed (PPAN) AAA79184), kinazę tyrozynową Abl (CAA52387), Bcr-Abl, kinazę komórek hematopoetycznych (PPAN CAI19695), Src (PPAN CAA24495), receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (PPAN ABB82619), receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (PPAN ABB82619), receptor czynnika wzrostu naskórka (PPAN AG43241), receptor EPH B4 (PPAN EAL23820), receptor czynnika komórek macierzystych (PPAN AAF22141), receptor TIE-2 białkowej kinazy tyrozynowej (PPAN Q02858), tyrozynową kinazę 3 podobną do fms (PPAN NP_004110), receptor alfa płytkopochodnego czynnika wzrostu (PPAN NP_990080), RET (PPAN CAA73131) oraz ich funkcjonalne mutanty. W niektórych wykonaniach, kinazą tyrozynową jest Abl, Bcr-Abl, EGFR lub Flt-3 oraz dowolne inne kinazy wymienione tutaj w Tabelach. [0083] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 uzyskuje selektywną inhibicję transdukcji sygnału, w którym pośredniczy mtor w porównaniu do wczesnych PI3K. W niektórych innych wykonaniach, związki tutaj dostarczane mogą inhibitować aktywność, w której pośredniczy mtor skuteczniej niż rapamycyna, a tym samym dostarczając alternatywne terapie dla stanów opornych na rapamycynę. [0084] W niektórych wykonaniach, związki z Tabeli 1 selektywnie inhibitują zarówno aktywność mtorc1 jak i mtorc2 w stosunku do jednej, dwóch, trzech lub wszystkich 3-kinaz fosfatydyloinozytolu typu I (kinaz PI3). Jak wspomniano powyżej, kinazy PI3

37 36 typu I to kinaza PI3 α, kinaza PI3 β, kinaza PI3 γ i kinaza PI3 δ. Na przykład, jeden lub więcej związków według wynalazku może inhibitować mtorc1 i mtorc2 przy wartości IC50, która wynosi 1/10-tą, 1/20-tą, 1/25-tą, 1/50-tą, 1/100-ą, 1/200-ą, 1/300-ą, 1/400-ą, 1/500-ą, 1/1000-ą, 1/2000-ą lub mniej niż IC50 dla jednej lub więcej kinaz PI3 typu I obejmujących kinazę PI3 α, kinazę PI3 β, kinazę PI3 γ i kinazę PI3 δ. W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 jest zasadniczo nieskutecznych w inhibicji kinazy PI3 typu I przy stężeniu 100 nm, 200 nm, 500 nm lub 1 µm, 5 µm lub 10 µm albo wyższym w badaniu kinazy in vitro. [0085] W innych wykonaniach, związki z Tabeli 1 w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 i inne podane w Tabeli 1 selektywnie inhibitują zarówno aktywność mtorc1 jak i mtorc2 w stosunku do jednej, dwóch, trzech lub wszystkich kinaz PI3 typu II lub III, na przykład, PI3KC2α, PI3KC2β i VPS34. W szczególności jeden lub więcej związków według wynalazku może inhibitować mtorc1 i mtorc2 przy wartości IC50, która wynosi 1/10-tą, 1/20-tą, 1/25-tą, 1/50-tą, 1/100-ą, 1/200-ą, 1/300-ą, 1/400-ą, 1/500-ą, 1/1000-ą, 1/2000-ą lub mniej niż wartość IC50 dla jednej lub więcej kinaz PI3 typu II lub III. [0086] W jeszcze innym wykonaniu, związki z Tabeli 1 selektywnie inhibitują zarówno aktywność mtorc1 jak i mtorc2 w stosunku do jednej lub więcej kinaz PI4, takich jak PI4Kα i PI4Kβ. Na przykład jeden lub więcej związków według wynalazku może inhibitować mtorc1 i mtorc2 przy wartości IC50, która wynosi 1/10-tą, 1/20-tą, 1/25- tą, 1/50-tą, 1/100-ą, 1/200-ą, 1/300-ą, 1/400-ą, 1/500-ą, 1/1000-ą, 1/2000-ą lub mniej niż wartość IC50 dla jednej lub więcej kinaz PI4. [0087] W jeszcze innym wykonaniu, związki z Tabeli 1 selektywnie inhibitują zarówno aktywność mtorc1 jak i mtorc2 w stosunku do jednej lub więcej kinaz białkowych, w tym kinaz serynowo-treoninowych, takich jak DNA-PK. Taka selektywna inhibicja może być potwierdzona poprzez, np. wartość IC50 związku według wynalazku, która może wynosić ½, 1/3-cią, 1/4-tą, 1/5-tą, 1/7-ą, 1/10-ą, 1/15-tą, 1/20-tą, 1/25-tą, 1/30-tą, 1/40-tą, 1/50-tą, 1/100-ą, 1/150-tą, 1/200-ą, 1/300-ą, 1/400-tą, 1/500-tą, 1/1000-ą, 1/2000-ą lub mniej w stosunku do odnośnej kinazy białkowej. W niektórych przypadkach, związki według wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, te przedstawione w Tabeli 1 nie posiadają istotnej reaktywności krzyżowej z co najmniej około 100, 200, 300 lub więcej kinazami białkowymi innymi niż mtorc1 i mtorc2. Brak znaczącej reaktywności krzyżowej z innymi kinazami białkowymi nie będącymi mtor można potwierdzić poprzez, np. co najmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub większą aktywność kinazy

38 37 utrzymaną, gdy związek według wynalazku stosuje się z kinazą białkową w stężeniu 1 µm, 5 µm, 10 µm lub większym. [0088] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 selektywnie inhibituje zarówno aktywność mtor z wartością IC50 około 100 nm, 50 nm, 10 nm, 5 nm, 100 pm, 10 pm jak i nawet 1 pm lub mniej, jak stwierdzono w badaniu kinazy in vitro. [0089] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 inhibituje fosforylację Akt (S473) i Akt (T308) skuteczniej niż rapamycyna przy badaniu w porównywalnym stężeniu molowym w badaniu kinazy in vitro. [0090] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 konkuruje z ATP o wiązanie do miejsca wiązania ATP na mtorc1 i/lub mtorc2. [0091] W niektórych wykonaniach, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 jest zdolnych do inhibicji i/lub innego modulowania transdukcji sygnału komórkowego za pośrednictwem jednej lub więcej kinaz białkowych lub kinaz lipidowych tutaj ujawnionych. Na przykład jeden lub więcej związków według wynalazku jest zdolnych do inhibicji lub modulowania wyniku szlaku transdukcji sygnału. Wynik transdukcji sygnału danego szlaku może być mierzony poziomem fosforylacji, defosforylacji, fragmentacji, redukcji, utlenienia cząsteczki sygnałowej w badanym szlaku. W innym konkretnym wykonaniu, wynik szlaku może być wynikiem komórkowym lub fenotypowym (np. modulacja/inhibicja proliferacji komórkowej, śmierci komórek, apoptozy, autofagii, fagocytozy, progresji cyklu komórkowego, przerzutów, inwazji komórek, angiogenezy, waskularyzacji, ubikwitynacji, translacji, transkrypcji, transportu białka, funkcji mitochondriów, funkcji Golgiego, funkcji retikulum endoplazmatycznego itd.). W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej związków według wynalazku jest zdolnych przykładowo do powodowania apoptozy, powodowania zatrzymania cyklu komórkowego, inhibicji proliferacji komórek, inhibicji wzrostu nowotworu, inhibicji angiogenezy, inhibicji waskularyzacji, inhibicji przerzutów i/lub inhibicji inwazji komórek. [0092] W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 powoduje apoptozę wspomnianej komórki lub zatrzymanie cyklu komórkowego. Cykl komórkowy może być zatrzymany w fazie G0/G1, fazie S i/lub fazie G2/M przez przedmiotowe związki. [0093] W pewnych przykładach wykonania, jeden lub więcej związków według wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związki wymienione w Tabeli 1 są zdolne do

39 38 inhibicji proliferacji komórek. Na przykład w niektórych przypadkach jeden lub więcej związków wymienionych w Tabeli 1 może inhibitować proliferację komórek nowotworowych lub linii komórek nowotworowych o szerokiej gamie struktury genetycznej. W niektórych przypadkach, związki według wynalazku mogą inhibitować proliferację komórek PC3 in vitro lub w modelu in vivo, takim jak mysi model ksenoprzeszczepu. W niektórych przypadkach, proliferacja komórek PC3 hodowanych in vitro może być inhibitowana przy wartości IC50 mniejszej niż 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm, 15 nm, 10 nm, 5 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm, 0,5 nm, 0,1 nm lub mniejszej przez jeden lub więcej związków według wynalazku wymienionych w Tabeli 1. [0094] W niektórych przypadkach, fosforylacja AKT może być inhibitowana przy wartości IC50 mniejszej niż 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm, 15 nm, 10 nm, 5 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm, 0,5 nm, 0,1 nm lub mniejszej przez jeden lub więcej związków według wynalazku wymienionych w Tabeli 1. Inhibicja fosforylacji AKT może być częściowo lub całkowicie zablokowana przez dodanie ludzkiej pełnej krwi. W niektórych przypadkach, jeden lub więcej związków według wynalazku wymienionych w Tabeli 1 wykazuje specyficzne wiązanie i/lub inhibicję mtor, czego dowodzi mały (na przykład mniej niż około 0,5-krotny, 1-krotny, 2-krotny lub 3-krotny) wzrost wartości IC50 dla inhibicji fosforylacji AKT komórek hodowanych w pełnej krwi, w porównaniu do standardowej pożywki hodowlanej (np. DMEM 10% FBS). [0095] W niektórych przypadkach, proliferacja nowotworów pierwotnych pochodzących od pacjentów (np. pacjentów z nowotworem) może być inhibitowana przez związek według wynalazku, co wykazano w badaniach in vitro, lub w modelach in vivo (np. z użyciem komórek nowotworowych pacjenta do generowania modelu ksenoprzeszczepu). W niektórych przypadkach, proliferacja pierwotnych nowotworowych linii komórkowych może być inhibitowana przy wartości IC50 mniejszej niż 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm, 15 nm, 10 nm, 5 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm, 0,5 nm, 0,1 nm lub nawet mniejszej przez jeden lub więcej związków według wynalazku wymienionych w Tabeli 1. W niektórych przypadkach, średnie wartości IC50 dla związku według wynalazku do inhibitowania panelowych 10, 20, 30, 40, 50, 100 lub więcej pierwotnych komórek nowotworowych może wynosić około 200 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm, 15 nm, 10 nm, 5 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm, 0,5 nm, 0,1 nm lub nawet mniej. Komórki nowotworowe, które mogą być inhibitowane przez związki według niniejszego wynalazku obejmują, ale bez ograniczenia, komórki trzustkowe, nerkowe (nerek), kości, nosogardzieli, gastryczne, żołądka, jajników, jamy ustnej, piersi, krwi, prostaty, odbytu, okrężnicy, jelita grubego,

40 39 glejowe, neuronowe, płuc i skóry. [0096] W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest skuteczny w blokowaniu sygnałów proliferacji komórkowej w komórkach z niedoborem aktywności PTEN, ale eksprymujących PI3Kα. W niektórych przypadkach, sygnalizacja proliferacji komórek może być inhibitowana przez związki według wynalazku obejmujące te przedstawione w Tabeli 1, jak wynika z analizy Western blot fosforylacji białek, takich jak Akt (fosforylacja na T308 lub S473), 4EBP1 (fosforylacja na S65), S6 (fosforylacja na S240/244), FOXO1 (fosforylacja na T24/3a T32), GSK3β (fosforylacja na S9), PRAS40 (fosforylacja na T246) lub fosforylacji MAPK. W niektórych przypadkach, związki mogą inhibitować fosforylację któregokolwiek z tych celów w stopniu większym niż rapamycyna w testowanych warunkach. W pozostałych przypadkach, związki według wynalazku mogą inhibitować fosforylację białek sygnałowych i tłumić proliferację komórek zawierających te białka sygnałowe, ale są odporne na istniejące środki chemioterapeutyczne, w tym, ale bez ograniczenia, rapamycynę, Gleevec, dazatynib, środki alkilujące, antymetabolity, antracykliny, alkaloidy roślinne, inhibitory topoizomerazy i inne środki przeciwnowotworowe tutaj ujawnione. [0097] W niektórych przykładach wykonania, związki wymienione w Tabeli 1 mogą inhibitować komórki nowotworowe zawierające szereg mutacji aktywujących lub wywołujących nowotwór. Takie mutacje obejmują, ale bez ograniczenia, mutacje w KRAS, PI3KCα, BRAF, TSC1/2, klasy A PBK, LAT1 oraz PTEN. Na przykład jeden lub więcej związków z Tabeli 1, w tym związek 1, może inhibitować proliferację komórek nowotworowych zawierających mutacje w KRAS przy G12, G13 lub mutacje w Q61 w tym, ale bez ograniczenia, mutacje G12V, G12S, G13D, Q61K i Q61H. W innym przykładzie, jeden lub więcej z tych związków może inhibitować proliferację komórek nowotworowych zawierających mutacje w BRAF przy V600, w tym, ale bez ograniczenia, mutację V600E. W innym przykładzie, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może inhibitować proliferację komórek nowotworowych zawierających mutację w PI3KCα przy E545, P449 lub H1047 w tym, ale bez ograniczenia, mutacje E545K, H1047R oraz P449T. W jeszcze innym przykładzie, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może inhibitować proliferację komórek nowotworowych zawierających aktywujące mutacje w jednej lub większej liczbie kombinacji genów, takie jak na przykład mutacje aktywujące w PTEN i KRAS, PTEN i BRAF lub PTEN i PI3KCα. W jeszcze innym przykładzie, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może inhibitować komórki nowotworowe lub linie komórek nowotworowych zawierających aktywujące mutacje w

41 40 jednej lub większej liczbie kombinacji genów, takie jak na przykład mutacje aktywujące w BRAF i PI3KCα. [0098] W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej związków z Tabeli 1 może powodować zatrzymanie cyklu komórkowego. W niektórych przypadkach, komórki potraktowane związkiem 1 i innymi w Tabeli 1 mogą się zatrzymać lub przechodzić dłużej przez jeden lub więcej etapów cyklu komórkowego, takich jak G 0 /G 1, S lub G 2 /M. Przykładowo komórki traktowane jednym lub większą liczbą związków z Tabeli 1 mogą zatrzymać się lub przechodzić dłużej przez stadium cyklu komórkowego G 0 /G 1. W niektórych przypadkach, około 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% lub więcej komórek traktowanych jednym lub większą liczbą związków według wynalazku może być w stadium cyklu komórkowego G 0 /G 1.W niektórych przypadkach, komórki wykazujące zatrzymanie cyklu komórkowego w stadium cyklu komórkowego G 0 /G 1 w odpowiedzi na traktowanie związkami według wynalazku to komórki nowotworowe albo szybko dzielące się komórki. W niektórych przypadkach, komórki wykazujące zatrzymanie cyklu komórkowego w stadium cyklu komórkowego G 0 /G 1 w odpowiedzi na traktowanie jednym lub większą liczbą związków według niniejszego wynalazku to komórki HCT116 lub komórki SW620. W niektórych przypadkach, jeden lub większa liczba związków z Tabeli 1, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1, wykazuje porównywalny lub większy stopień zatrzymania G 0 /G 1 w porównaniu z inhibitorem, który inhibituje jedną lub więcej kinaz PI3. W niektórych przypadkach, związki według wynalazku wykazują porównywalny lub większy stopień zatrzymania G 0 /G 1 w porównaniu do inhibitora, który inhibituje zarówno mtor jak i jedną lub więcej kinaz PI3K w komórkach nowotworowych. W niektórych przypadkach, związki według wynalazku wykazują porównywalny lub większy stopień zatrzymania G 0 /G 1 w porównaniu do rapamycyny lub doksorubicyny. [0099] W niektórych przykładach wykonania, sygnalizacja komórkowa w komórkach nowotworowych przeszczepianych za pomocą ksenoprzeszczepu do samic atymicznych nagich myszy może być inhibitowana przez jeden lub większą liczbę związków z Tabeli 1, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1. W niektórych przypadkach, sygnalizacja komórkowa może być inhibitowana przez te związki, o czym świadczy detekcja Western blot fosforylacji białek ekstrahowanych z homogenizowanych nowotworów, taka jak fosforylacja AKT na T308 lub S473, fosforylacja 4EBP1 na S65, fosforylacja S6 na S240/244. W niektórych przypadkach, inhibicja fosforylacji może być porównywalna lub większa niż dostarczona przez znane inhibitory fosforylacji, takie jak inhibitor Pan PI3K,

42 41 który inhibituje także jedną lub więcej izoform mtor (inhibitor Pan PI3K/mTOR) w testowanych warunkach. W innych przypadkach, jeden lub więcej związków według wynalazku może inhibitować fosforylację białek, na które inne inhibitory, takie jak inhibitory Pan PI3K/mTOR nie mają wpływu albo mają niewielki wpływ np. na fosforylację AKT na T308 i S473. [0100] W niektórych przykładach wykonania, związek 1 i inne podane w Tabeli 1 powodują zmniejszenie objętości guza nowotworów ksenoprzeszczepu u samic nagich atymicznych myszy. Na przykład leczenie jednym lub większą liczbą związków według wynalazku powoduje zmniejszenie wzrostu lub objętości guza wywołanego wszczepieniem komórek nowotworowych U87-MG, A549, ZR-75-1 lub 786-O u nagich myszy. Związek według wynalazku może być podawany doustnie, podskórnie lub dożylnie lub za pomocą dowolnych innych dostarczanych tutaj sposobów podawania związku. W niektórych przypadkach, związki mogą być podawane raz w tygodniu, co drugi dzień, raz dziennie, dwa razy dziennie, trzy razy dziennie, cztery razy dziennie lub więcej. W niektórych przypadkach podaje się 0,01 mg/kg związku, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg lub więcej związku podaje się na raz. W niektórych przypadkach, znaczne zmniejszenie objętości guza może być wykryte w 5, 10, 15, 20, 25 lub 30 dniu od wszczepienia nowotworu. [0101] Wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą związki według wynalazku. W pewnych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza kompozycje farmaceutyczne do leczenia zaburzeń, takich jak zaburzenia hiperproliferacyjne w tym, ale bez ograniczenia, nowotwory, takie jak ostra białaczka szpikowa, chłoniak, nowotwór grasicy, mózgu, płuc, nowotwór płaskonabłonkowy, skóry, oczu, siatkówczak, czerniak wewnątrzgałkowy, międzybłoniak, nowotwór śródpiersia, jamy ustnej i części ustnej gardła, pęcherza, gastryczny, żołądka, trzustki, pęcherza, piersi, szyjki macicy, głowy, szyi, nerkowy, nerki, wątroby, układu żółciowo-wątrobowego, jelita cienkiego, okrężnicy, odbytnicy, odbytu, endometrium, prostaty, jelita grubego, moczowodu, przełyku, jądrowy, ginekologiczny, penisa, jądra, jajnika, układu hormonalnego, skóry, tarczycy, CNS, PNS, związany z AIDS (np. chłoniak i mięsak Kaposiego), inne nowotwory wywołane wirusami, mięsaki tkanki miękkiej i kości oraz czerniaki pochodzenia skórnego i wewnątrzgałkowego. Nowotwory obejmują nowotwory lite, jak i hematologiczne nowotwory złośliwe. Ponadto, można leczyć nowotwór w każdym stadium rozwoju, na przykład nowotwory pierwotne, przerzutowe i nawrotowe.

43 42 [0102] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną do leczenia zaburzeń wzroku. Kompozycja jest sformułowana do podawania do oka i zawiera skuteczną ilość związku według niniejszego wynalazku i farmaceutyczną zaróbkę odpowiednią do podawania do oka. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku odpowiednie do podawania do oka mogą występować jako oddzielne postacie dawkowania, na przykład jako krople lub spraye, każdy zawierający z góry określoną ilość składnika aktywnego, jako roztwór lub zawiesina w wodnej lub niewodnej cieczy, emulsja olej-w-wodzie lub ciekła emulsja woda-w-oleju. Krople do oczu mogą być wytwarzane przez rozpuszczenie składnika aktywnego w sterylnym roztworze wodnym, takim jak sól fizjologiczna, roztwór buforujący itd. lub przez połączenie kompozycji proszkowej do rozpuszczania przed użyciem. Inne nośniki mogą być wybierane zgodnie z wiedzą w tej dziedzinie, w tym, lecz bez ograniczenia, spośród zrównoważonego roztworu soli, roztworu soli fizjologicznej, rozpuszczalnych w wodzie polieterów, takich jak glikol polietylenowy, poliwinyli, takich jak alkohol poliwinylowy i powidon, pochodnych celulozy, takich jak metyloceluloza i hydroksypropylometylo-celuloza, pochodnych ropy naftowej, takich jak olej mineralny i wazelina, tłuszczy zwierzęcych, takich jak lanolina, polimerów kwasu akrylowego, takich jak żel karboksypolimetylenowy, tłuszczy roślinnych, takich jak olej arachidowy i polisacharydów, takich jak dekstrany, i glikozaminoglikanów, takich jak hialuronian sodu. Jeśli jest to potrzebne, mogą być dodawane środki pomocnicze zwykle stosowane w kroplach do oczu. Takie środki pomocnicze obejmują środki izotonizujące (np. chlorek sodu itd.), środek buforowy (np. kwas borowy, monowodorofosforan sodu, diwodorofosforan sodu itd.), środki konserwujące (np. chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy, chlorobutanol itd.), środki zagęszczające (np. sacharyd taki jak laktoza, mannitol, maltoza itd.).; np. kwas hialuronowy lub jego sól, taka jak hialuronian sodu, hialuronian potasu itd.; np. mukopolisacharydy takie jak siarczan chondroityny itd.; np. poliakrylan sodowy, polimer karboksywinylowy, usieciowany poliakrylan, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, karboksymetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza lub inne środki znane specjalistom w tej dziedzinie). [0103] Przedmiotowe kompozycje farmaceutyczne są na ogół formułowane w celu dostarczenia terapeutycznie skutecznej ilości związku według niniejszego wynalazku jako składnika aktywnego lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, proleku, solwatu, hydratu lub jego pochodnej. Gdy jest to pożądane, kompozycje farmaceutyczne zawierają

44 43 farmaceutycznie dopuszczalną sól i/lub jej kompleks koordynacyjny oraz jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, nośników, obejmujących obojętne stałe rozcieńczalniki i wypełniacze, rozcieńczalników, w tym sterylny roztwór wodny i różne rozpuszczalniki organiczne, środków zwiększających przenikanie, środków zwiększających rozpuszczalność i adiuwantów. [0104] Przedmiotowe kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane samodzielnie lub w kombinacji z jednym lub większą liczbą innych środków, które są również zwykle podawane w postaci kompozycji farmaceutycznych. Gdy jest to pożądane, związek według wynalazku i inny(e) środek(i) mogą być mieszane w preparacie lub obydwa składniki mogą być formułowane w osobnych preparatach do zastosowania ich w kombinacji, oddzielnie lub w tym samym czasie. [0105] W pewnych przykładach wykonania, stężenie jednego lub więcej związków dostarczanych w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku wynosi mniej niż 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% lub 0,0001% wag./wag., wag./obj. lub obj./obj. [0106] W pewnych przykładach wykonania, stężenie związku według wynalazku wynosi więcej niż 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25%, 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25%, 18%, 17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25%, 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25%, 15%, 14,75%, 14,50%, 14,25%, 14%, 13,75%, 13,50%, 13,25%, 13%, 12,75%, 12,50%, 12,25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25%, 11%, 10,75%, 10,50%, 10,25%, 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25%, 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25%, 8%, 7,75%, 7,50%, 7,25%, 7%, 6,75%, 6,50%, 6,25%, 6%, 5,75%, 5,50 %, 5,25%, 5%, 4,75%, 4,50%, 4,25%, 4%, 3,75%, 3,50%, 3,25%, 3%, 2,75%, 2,50%, 2,25%, 2%, 1,75%, 1,50%, 125%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% lub 0,0001% wag./wag., wag./obj. lub obj./obj. [0107] W pewnych przykładach wykonania, stężenie związku według wynalazku jest w zakresie od około 0,0001% do około 50%, około 0,001% do około 40%, około 0,01% do około 30%, około 0,02% do około 29%, około 0,03% do około 28%, około 0,04% do

45 44 około 27%, około 0,05% do około 26%, około 0,06% do około 25%, około 0,07% do około 24%, około 0,08% do około 23%, około 0,09% do około 22%, około 0,1% do około 21%, około 0,2% do około 20%, około 0,3% do około 19%, około 0,4% do około 18%, około 0,5% do około 17%, około 0,6 % do około 16%, około 0,7% do około 15%, około 0,8% do około 14%, około 0,9% do około 12%, około 1% do około 10% wag./wag., wag./obj. lub obj./obj. [0108] W pewnych przykładach wykonaniach, stężenie związku według wynalazku jest w zakresie od około 0,001% do około 10%, około 0,01% do około 5%, około 0,02% do około 4,5%, około 0,03% do około 4%, około 0,04% do około 3,5%, około 0,05% do około 3%, około 0,06% do około 2,5%, około 0,07% do około 2%, około 0,08% do około 1,5%, około 0,09% do około 1%, około 0,1% do około 0,9% wag./wag., wag./obj. lub obj./obj. [0109] W niektórych przykładach wykonania, ilość związku według wynalazku jest równa lub mniejsza niż 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, 6,5 g, 6,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,65 g, 0,6 g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,06 g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,006 g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,0006 g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, lub 0,0001 g. [0110] W pewnych przykładach wykonania, ilość związku według wynalazku wynosi więcej niż 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,0006 g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,006 g, 0,0065 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g, 0,06 g, 0,065 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g, 0,5 g, 0,55 g, 0,6 g, 0,65 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, 6 g, 6,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g lub 10 g. [0111] W niektórych przykładach wykonania, ilość związku według wynalazku jest w zakresie 0, g, 0, g, 0,001 8 g, 0,005 7 g, 0,01 6 g, 0,05 5 g, 0,1 4 g, 0,5 4 g lub 1 3 g. [0112] Związek według wynalazku jest skuteczny w szerokim zakresie dawkowania. Przykładowo w leczeniu ludzi dorosłych dawki od 0,01 do 1000 mg, od 0,5 do 100 mg, od 1 do 50 mg dziennie i od 5 do 40 mg dziennie to przykłady dawek, które mogą być

46 45 stosowane. Przykładowa dawka wynosi od 10 do 30 mg dziennie. Dokładna dawka będzie zależeć od drogi podawania, postaci, w której związek jest podawany, leczonego pacjenta, masy ciała leczonego pacjenta oraz od preferencji i doświadczenia lekarza prowadzącego. [0113] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera typowo składnik aktywny (np. związek) według niniejszego wynalazku lub farmaceutycznie dopuszczalną sól i/lub jej kompleks koordynacyjny oraz jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, nośników, w tym, ale bez ograniczenia, obojętne stałe rozcieńczalniki i wypełniacze, rozcieńczalniki, w tym sterylny roztwór wodny i różne rozpuszczalniki organiczne, środki zwiększające przenikanie, środki zwiększające rozpuszczalność i adiuwanty. [0114] Poniżej opisano nieograniczające przykładowe kompozycje farmaceutyczne i sposoby ich wytwarzania. [0115] Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego. W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego zawierającą związek według wynalazku i farmaceutyczną zaróbkę odpowiednią do podawania doustnego. [0116] W niektórych przykładach wykonania, niniejszy wynalazek dostarcza stałą kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego zawierającą: (i) skuteczną ilość związku według wynalazku; ewentualnie (ii) skuteczną ilość drugiego środka; oraz (iii) farmaceutyczną zaróbkę odpowiednią do podawania doustnego. W niektórych przykładach wykonania, kompozycja dodatkowo zawiera: (iv) skuteczną ilość trzeciego środka. [0117] W pewnych przykładach wykonania, kompozycją farmaceutyczną może być ciekła kompozycja farmaceutyczna odpowiednia do przyjmowania doustnego. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku odpowiednie do podawania doustnego mogą występować jako oddzielne postacie dawkowania, na przykład jako kapsułki, opłatki lub tabletki, lub ciecze lub spreje aerozolowe, każdy zawierający z góry określoną ilość składnika aktywnego jako proszek lub granulki, roztwór lub zawiesina w wodnej lub niewodnej cieczy, emulsja olej-w-wodzie lub ciekła emulsja woda-w-oleju. Takie postacie dawkowania można wytworzyć dowolnym ze sposobów farmacji, ale wszystkie sposoby obejmują etap doprowadzania składnika aktywnego do połączenia z nośnikiem, który stanowi jeden lub więcej niezbędnych składników. Na ogół kompozycje wytwarza się przez jednorodne i dokładne zmieszanie składnika aktywnego z ciekłymi nośnikami lub drobno podzielonymi stałymi nośnikami lub obydwoma, a następnie, w razie potrzeby,

47 46 uformowanie produktu do żądanej postaci. Przykładowo tabletkę można wytworzyć poprzez sprasowanie lub formowanie, ewentualnie z jednym lub więcej dodatkowych składników. Sprasowane tabletki można wytworzyć przez sprasowanie w odpowiednim urządzeniu składnika czynnego w postaci sypkiej, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie zmieszanego z zaróbką, taką jak, ale bez ograniczenia, spoiwo, środek poślizgowy, obojętny rozcieńczalnik i/lub środek powierzchniowo czynny lub dyspergujący. Uformowane tabletki można wytwarzać przez formowanie w odpowiednim urządzeniu mieszaniny sproszkowanego związku zwilżonego obojętnym ciekłym rozcieńczalnikiem. [0118] Ten wynalazek obejmuje ponadto bezwodne kompozycje farmaceutyczne i postacie dawkowania zawierające składnik aktywny, ponieważ woda może zwiększać degradację niektórych związków. Na przykład można dodać wodę (np. 5%) w dziedzinie farmaceutycznej jako środek do symulacji długoterminowego przechowywania w celu określenia parametrów takich jak okres przechowywania lub trwałość preparatów w czasie. Bezwodne kompozycje farmaceutyczne i postacie dawkowania według wynalazku można wytworzyć, stosując składniki bezwodne lub o niskiej zawartości wilgoci i warunki o niskiej wilgotności lub niskiej wilgoci. Kompozycje farmaceutyczne i postacie dawkowania według wynalazku, które zawierają laktozę, mogą być wykonane jako bezwodne, jeśli oczekuje się istotnego kontaktu z wilgocią i/lub wilgotnością podczas wytwarzania, pakowania i/lub przechowywania. Bezwodną kompozycję farmaceutyczną można wytwarzać i przechowywać tak, że jej bezwodna natura jest zachowywana. W związku z tym kompozycje bezwodne mogą być pakowane przy użyciu materiałów znanych z tego, że zapobiegają ekspozycji na wodę, tak że mogą być zawarte w odpowiednich zestawach recepturowych. Przykłady odpowiedniego opakowania obejmują, ale bez ograniczenia, hermetycznie zamykane folie, plastikowe lub tym podobne, pojemniki na dawki jednostkowe, opakowania typu blistra oraz opakowania paskowe. [0119] Składnik aktywny może być połączony w jednorodnej mieszaninie z nośnikiem farmaceutycznym zgodnie z konwencjonalnymi technikami formułowania mieszanek farmaceutycznych. Nośnik może występować w różnorodnych postaciach w zależności od postaci preparatu pożądanej do podawania. Przy przygotowywaniu kompozycji dla doustnej postaci dawkowania, jako nośniki można stosować dowolne ze zwykłych ośrodków farmaceutycznych, takich jak na przykład, woda, glikole, oleje, alkohole, środki smakowe, środki konserwujące, środki barwiące i tym podobne w przypadku ciekłych

48 47 preparatów doustnych (takich jak zawiesiny, roztwory i eliksiry) lub aerozoli; lub można stosować nośniki takie jak skrobie, cukry, mikrokrystaliczna celuloza, rozcieńczalniki, środki granulujące, środki smarujące, spoiwa i środki rozsadzające w przypadku doustnych preparatów stałych, w niektórych przykładach wykonania bez stosowania laktozy. Na przykład nośniki odpowiednie ze stałymi preparatami doustnymi obejmują proszki, kapsułki i tabletki. Jeśli jest to pożądane, tabletki mogą być powlekane standardowymi technikami wodnymi lub niewodnymi. [0120] Spoiwa odpowiednie do zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych i postaciach dawkowania obejmują, ale bez ograniczenia, skrobię kukurydzianą, skrobię ziemniaczaną lub inne skrobie, żelatynę, naturalne i syntetyczne gumy, takie jak guma arabska, alginian sodu, kwas alginowy, inne alginiany, sproszkowaną tragakantę, gumę guar, celulozę i jej pochodne (na przykład etylocelulozę, octan celulozy, karboksymetylocelulozę wapniową, karboksymetylocelulozę sodową), poliwinylopirolidon, metylocelulozę, skrobię preżelowaną, hydroksypropylometylocelulozę, celulozę mikrokrystaliczną oraz ich mieszaniny. [0121] Przykłady odpowiednich wypełniaczy do stosowania w kompozycjach farmaceutycznych i postaciach dawkowania tutaj ujawnionych obejmują, ale bez ograniczenia, talk, węglan wapnia (np. granulki lub proszek), celulozę mikrokrystaliczną, sproszkowaną celulozę, dekstrany, kaolin, mannitol, kwas krzemowy, sorbitol, skrobię, skrobię preżelowaną i ich mieszaniny. [0122] Substancje rozsadzające mogą być stosowane w kompozycjach według wynalazku w celu dostarczenia tabletek ulegających rozpadowi w kontakcie ze środowiskiem wodnym. Zbyt duża ilość środka rozsadzającego może wytwarzać tabletki, które mogą się rozpadać w butelce. Zbyt mała ilość może być niewystarczająca dla zajścia rozpadu i może zatem zmieniać się szybkość i stopień uwalniania składnika(ów) aktywnego(ych) z postaci dawkowania. Tak więc, wystarczająca ilość środka rozsadzającego, która nie jest ani za mała, ani za duża, aby w niekorzystny sposób zmieniać uwalnianie składnika(ów) aktywnego(ych), może być stosowana do wytworzenia postaci dawkowania związków tutaj ujawnianych. Ilość zastosowanego środka rozsadzającego może się różnić w zależności od typu preparatu i sposobu podawania i może być łatwa do określenia przez specjalistów w tej dziedzinie. Od około 0,5 do około 15 procent wagowych środka rozsadzającego lub od około 1 do około 5 procent wagowych środka rozsadzającego może być stosowane w kompozycji farmaceutycznej. Środki rozsadzające, które mogą być zastosowane do wytworzenia kompozycji farmaceutycznych i postaci dawkowania

49 48 według wynalazku obejmują, ale bez ograniczenia, agar-agar, kwas alginowy, węglan wapnia, celulozę mikrokrystaliczną, kroskarmelozę sodową, krospowidon, polakrylinę potasową, sodowy glikolan skrobi, skrobię ziemniaczaną lub z tapioki, inne skrobie, skrobię preżelowaną, inne skrobie, glinki, inne alginy, inne celulozy, gumy lub ich mieszaniny. [0123] Środki smarujące, które mogą być zastosowane do wytworzenia kompozycji farmaceutycznych i postaci dawkowania według wynalazku obejmują, ale bez ograniczenia, stearynian wapnia, stearynian magnezu, olej mineralny, lekki olej mineralny, glicerynę, sorbitol, mannitol, glikol polietylenowy, inne glikole, kwas stearynowy, laurylosiarczan sodu, talk, uwodorniony olej roślinny (np. olej arachidowy, olej z nasion bawełny, olej słonecznikowy, olej sezamowy, oliwa z oliwek, olej kukurydziany i olej sojowy), stearynian cynku, oleinian etylu, laurynian etylu, agar lub ich mieszaniny. Dodatkowe środki smarujące obejmują na przykład silikażel syloid, koagulowany aerozol syntetycznej krzemionki albo ich mieszaniny. Środek smarujący może być ewentualnie dodany w ilości mniejszej niż około 1 procent wagowy kompozycji farmaceutycznej. [0124] Gdy wodne zawiesiny i/lub eliksiry są pożądane do podawania doustnego, składnik aktywny można łączyć z różnymi środkami słodzącymi lub smakowymi, substancją barwiącą lub barwnikami oraz, jeśli jest to pożądane, środkami emulgującymi i/lub zawieszającymi, wraz z takimi rozcieńczalnikami jak woda, etanol, glikol propylenowy, gliceryna i różne ich kombinacje. [0125] Tabletki mogą być niepowlekane lub powlekane za pomocą znanych technik w celu opóźnienia rozpadu i wchłaniania w przewodzie żołądkowo-jelitowym i tym samym dostarczenia przedłużonego działania przez dłuższy okres. Na przykład można zastosować materiał opóźniający taki jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu. Preparaty do stosowania doustnego mogą również występować jako twarde kapsułki żelatynowe, w których składnik aktywny jest zmieszany z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem, na przykład węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem, lub jako miękkie kapsułki żelatynowe, w których składnik aktywny jest zmieszany z wodą lub ośrodkiem olejowym, na przykład olejem arachidowym, ciekłą parafiną lub oliwą z oliwek. [0126] Środek powierzchniowo czynny, który można stosować do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych i postaci dawkowania według wynalazku obejmuje, ale bez ograniczenia, hydrofilowe środki powierzchniowo czynne, lipofilowe środki

50 49 powierzchniowo czynne i ich mieszaniny. Oznacza to, że można stosować mieszaninę hydrofilowych środków powierzchniowo czynnych, można stosować mieszaninę lipofilowych środków powierzchniowo czynnych albo można stosować mieszaninę co najmniej jednego hydrofilowego środka powierzchniowo czynnego i co najmniej jednego lipofilowego środka powierzchniowo czynnego. [0127] Odpowiedni hydrofilowy środek powierzchniowo czynny może w ogólności mieć wartość HLB co najmniej 10, a odpowiednie lipofilowe środki powierzchniowo czynne mogą w ogólności mieć wartość HLB około 10 lub mniej. Empirycznym parametrem stosowanym do charakteryzowania względnej hydrofilowości i hydrofobowości niejonowych związków amfifilowych jest równowaga hydrofilowo-lipofilowa (wartość "HLB"). Środki powierzchniowo czynne o niższych wartościach HLB są bardziej lipofilowe lub hydrofobowe i mają większą rozpuszczalność w olejach, a środki powierzchniowo czynne o wyższych wartościach HLB są bardziej hydrofilowe i mają większą rozpuszczalność w roztworach wodnych. Za hydrofilowe środki powierzchniowo czynne na ogół uważa się te związki o wartości HLB większej niż około 10, jak również anionowe, kationowe lub obojnacze związki, dla których skala HLB na ogół nie jest stosowana. Podobnie lipofilowe (tj. hydrofobowe) środki powierzchniowo czynne to związki mające wartość HLB równą lub mniejszą niż około 10. Jednakże wartość HLB środka powierzchniowo czynnego jest jedynie orientacyjnym wskaźnikiem powszechnie stosowanym, aby umożliwić formułowanie przemysłowych, farmaceutycznych i kosmetycznych emulsji. [0128] Hydrofilowe środki powierzchniowo czynne mogą być albo jonowe albo niejonowe. Odpowiednie jonowe środki powierzchniowo czynne obejmują, ale nie są do nich ograniczone, sole alkiloamoniowe; sole kwasu fusydowego; pochodne kwasów tłuszczowych i aminokwasów, oligopeptydów i polipeptydów; glicerydowe pochodne aminokwasów, oligopeptydów i polipeptydów; lecytyny i uwodornione lecytyny; lizolecytyny i uwodornione lizolecytyny; fosfolipidy oraz ich pochodne; lizofosfolipidy i ich pochodne; sole estru kwasu tłuszczowego i karnityny; sole alkilosiarczanów; sole kwasów tłuszczowych; dokuzan sodu; acylomleczany; estry mono- i di-acetylowanego kwasu winowego i mono- i di-glicerydów; sukcynylowane mono- i diglicerydy; estry kwasu cytrynowego i mono- i diglicerydów; i ich mieszaniny. [0129] W wyżej wspomnianej grupie, jonowe środki powierzchniowo czynne obejmują, na przykład: lecytyny, lizolecytynę, fosfolipidy, lizofosfolipidy i ich pochodne; sole estru kwasu tłuszczowego i karnityny; sole alkilosiarczanów; sole kwasów tłuszczowych;

51 50 dokuzan sodu; acylomleczany; estry mono- i di-acetylowanego kwasu winowego i monoi di-glicerydów; sukcynylowane mono- i di-glicerydy; estry kwasu cytrynowego i mono- i diglicerydów; i ich mieszaniny. [0130] Jonowe środki powierzchniowo czynne mogą być zjonizowaną postacią lecytyny, lizolecytyny, fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy, fosfatydyloglicerolu, kwasu fosfatydowego, fosfatydyloseryny, lizofosfatydylocholiny, lizofosfatydyloetanoloaminy, lizofosfatydyloglicerolu, kwasu lizofosfatydowego, lizofosfatydyloseryny, PEGfosfatydyloetanoloaminy, PVP-fosfatydyloetanoloaminy, estrów mleczanowych (laktylowych) kwasów tłuszczowych, stearoilo-2-mleczanu, stearoilomleczanu, sukcynylowanych monoglicerydów, estrów mono/diacetylowanego kwasu winowego i mono/diglicerydów, estrów kwasu cytrynowego i mono/diglicerydów, cholilosarkozyny, kapronianu, kaprylanu, kaprynianu, laurynianu, mirystynianu, palmitynianu, oleinianu, rycynolanu, linolanu, linolenianu, stearynianu, laurylosiarczanu, teracecylosiarczanu, dokuzanu, lauroilokarnityn, palmitoilokarnityn, mirystoilokarnityn i ich soli i mieszanin. [0131] Hydrofilowe niejonowe środki powierzchniowo czynne mogą obejmować, ale nie są do nich ograniczone, alkiloglukozydy; alkilomaltozydy; alkilotioglukozydy; laurylomakrogologlicerydy; alkilowe etery polioksyalkilenowe, takie jak etery alkilowe glikolu polietylenowego; polioksyalkilenowe alkilofenole, takie jak alkilofenole glikolu polietylenowego; estry polioksyalkilenowego alkilofenolu i kwasów tłuszczowych, takie jak monoestry glikolu polietylenowego i kwasów tłuszczowych i diestry glikolu polietylenowego i kwasów tłuszczowych; estry kwasów tłuszczowych, gliceryny i glikolu polietylenowego; poliglicerolowe estry kwasów tłuszczowych; polioksyalkilenowe estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu, takie jak estry kwasu tłuszczowego, sorbitanu i glikolu polietylenowego; hydrofilowe produkty transestryfikacji poliolu z co najmniej jednym członkiem grupy składającej się z glicerydów, olejów roślinnych, uwodornionych olejów roślinnych, kwasów tłuszczowych i steroli; sterole polioksyetylenowe, ich pochodne i analogi; polioksyetylowane witaminy i ich pochodne; kopolimery blokowe polioksyetylen-polioksypropylen; i ich mieszaniny; estry kwasów tłuszczowych, sorbitanu i glikolu polietylenowego oraz hydrofilowe produkty transestryfikacji poliolu z co najmniej jednym członkiem grupy składającej się z triglicerydów, olejów roślinnych i uwodornionych olejów roślinnych. Poliolem może być glicerol, glikol etylenowy, glikol polietylenowy, sorbitol, glikol propylenowy, pentaerytrytol lub sacharyd. [0132] Inne hydrofilowe niejonowe środki powierzchniowo czynne obejmują, bez ograniczenia, PEG-10 laurynian, PEG-12 laurynian, PEG-20 laurynian, PEG-32 laurynian,

52 51 PEG-32 dilaurynian, PEG-12 oleinian, PEG-15 oleinian, PEG-20 oleinian, PEG-20 dioleinian, PEG-32 oleinian, PEG-200 oleinian, PEG-400 oleinian, PEG-15 stearynian, PEG-32 distearynian, PEG-40 stearynian, PEG-100 stearynian, PEG-20 dilaurynian, PEG- 25 trioleinian glicerylu, PEG-32 dioleinian, PEG-20 laurynian glicerylu, PEG-30 laurynian glicerylu, PEG-20 stearynian glicerylu, PEG 20 oleinian glicerylu, PEG 30 oleinian glicerylu, PEG-30 laurynian glicerylu, PEG-40 laurynian glicerylu, PEG-40 olej z nasion palmy, PEG-50 utwardzony olej rycynowy, PEG-40 olej rycynowy, PEG-35 olej rycynowy, PEG-60 olej rycynowy, PEG-40 utwardzony olej rycynowy, PEG-60 utwardzony olej rycynowy, PEG-60 olej kukurydziany, PEG-6, kaprynianowe/kaprylanowe glicerydy, PEG-8 kaprynianowe/kaprylanowe glicerydy, poliglicerylo-10-laurynian, PEG-30 cholesterol, PEG-25 fitosterol, PEG-30 sterol sojowy, PEG-20 trioleinian, PEG-40 oleinian sorbitanu, PEG-80 laurynian sorbitanu, polisorbat 20, polisorbat 80, POE-9 eter laurylowy, POE-23 eter laurylowy, POE-10 eter oleilowy, POE-20 eter oleilowy, POE-20 eter stearylowy, tokoferylo PEG-100 bursztynian, PEG-24 cholesterol, poliglicerylo-10-oleinian, Tween 40, Tween 60, monostearynian sacharozy, monolaurynian sacharozy, monopalmitynian sacharozy, seria PEG nonylofenolu, seria PEG oktylofenolu oraz poloksamery. [0133] Odpowiednie lipofilowe środki powierzchniowo czynne obejmują, jedynie przykładowo, alkohole tłuszczowe; estry kwasu tłuszczowego i glicerolu; acetylowane estry kwasu tłuszczowego i glicerolu; estry kwasów tłuszczowych i niższego alkoholu; estry kwasu tłuszczowego i glikolu propylenowego; estry sorbitanu i kwasu tłuszczowego; estry kwasu tłuszczowego, sorbitanu i glikolu polietylenowego; sterole i pochodne steroli; polioksyetylowane sterole i pochodne steroli; etery alkilowe glikolu polietylenowego; estry cukrów; etery cukrów; pochodne kwasu mlekowego i mono- i di-glicerydów; hydrofobowe produkty transestryfikacji poliolu z co najmniej jednym członkiem grupy składającej się z glicerydów, olejów roślinnych, utwardzanych olejów roślinnych, kwasów tłuszczowych i steroli; rozpuszczalne w oleju witaminy/pochodne witamin; i ich mieszaniny. W obrębie tej grupy, korzystne lipofilowe środki powierzchniowo czynne obejmują estry kwasu tłuszczowego i glicerolu, estry kwasu tłuszczowego i glikolu propylenowego oraz ich mieszaniny lub są hydrofobowymi produktami transestryfikacji poliolu z co najmniej jednym członkiem grupy składającej się z olejów roślinnych, utwardzanych olejów roślinnych oraz triglicerydów. [0134] W jednym przykładzie wykonania, kompozycja może zawierać środek zwiększający rozpuszczalność w celu zapewnienia dobrej solubilizacji i/lub rozpuszczania

53 52 związku według niniejszego wynalazku i zminimalizowania wytrącania związku według niniejszego wynalazku. Może to być szczególnie ważne dla kompozycji do użytku innego niż doustny, np. kompozycji do wstrzykiwania. Środek zwiększający rozpuszczalność można również dodawać w celu zwiększenia rozpuszczalności leku hydrofilowego i/lub innych składników, takich jak środki powierzchniowo czynne, lub w celu utrzymania kompozycji w postaci stabilnego lub homogenicznego roztworu lub dyspersji. [0135] Przykłady odpowiednich środków zwiększających rozpuszczalność obejmują, ale bez ograniczenia, następujące: alkohole i poliole, takie jak etanol, izopropanol, butanol, alkohol benzylowy, glikol etylenowy, glikol propylenowy, butanodiole oraz ich izomery, glicerol, pentaerytrytol, sorbitol, mannitol, transkutol, dimetyloizosorbid, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy, alkohol poliwinylowy, hydroksypropylometylocelulozę i inne pochodne celulozy, cyklodekstryny i pochodne cyklodekstryn; etery glikoli polietylenowych o średniej masie cząsteczkowej około 200 do około 6000, takie jak eter alkoholu tetrahydrofurfurylowego i PEG (glikofurol) lub metoksy PEG; amidy i inne związki zawierające azot, takie jak 2-pirolidon, 2-piperydon, ε-kaprolaktam, N-alkilopirolidon, N-hydroksyalkilopirolidon, N-alkilopiperydon, N- alkilokaprolaktam, dimetyloacetamid i poliwinylopirolidon; estry, takie jak propionian etylu, cytrynian tributylu, cytrynian acetylotrietylu, cytrynian acetylotributylu, cytrynian trietylu, oleinian etylu, kaprylan etylu, maślan etylu, triacetyna, monooctan glikolu propylenowego, dioctan glikolu propylenowego, ε-kaprolakton i jego izomery, δ- walerolakton i jego izomery, β-butyrolakton i jego izomery; oraz inne środki zwiększające rozpuszczalność znane w dziedzinie, takie jak dimetyloacetamid, izosorbid dimetylu, N- metylopirolidony, monoktanoinę, eter monoetylowy glikolu dietylenowego i wodę. [0136] Mogą być również stosowane mieszaniny środków zwiększających rozpuszczalność. Przykłady obejmują, ale bez ograniczenia, triacetynę, cytrynian trietylu, oleinian etylu, kaprylan etylu, dimetyloacetamid, N-metylopirolidon, N- hydroksyetylopirolidon, poliwinylopirolidon, hydroksypropylometylocelulozę, hydroksypropylocyklodekstryny, etanol, glikol polietylenowy , glikofurol, transkutol, glikol propylenowy i izosorbid dimetylu. Szczególnie korzystne środki zwiększające rozpuszczalność obejmują sorbitol, glicerol, triacetynę, alkohol etylowy, PEG-400, glikofurol i glikol propylenowy. [0137] Ilość środka zwiększającego rozpuszczalność, który może być włączany, nie jest szczególnie ograniczona. Ilość danego środka zwiększającego rozpuszczalność może być ograniczona do biodopuszczalnej ilości, która może być łatwo określona przez specjalistę

54 53 w dziedzinie. W niektórych przypadkach, może być korzystne włączenie środków zwiększających rozpuszczalność w ilości znacznie powyżej ilości biodopuszczalnych, na przykład w celu maksymalizacji stężenia leku, przy czym nadmiar środka zwiększającego rozpuszczalność jest usuwany przed dostarczeniem kompozycji do pacjenta za pomocą konwencjonalnych technik, takich jak destylacja czy odparowanie. Zatem, jeśli jest obecny, środek zwiększający rozpuszczalność może występować w stosunku masowym 10%, 25%, 50%, 100%, lub do około 200% wagowych w przeliczeniu na łączną masę leku i innych zaróbek. Jeśli jest to pożądane, można także stosować bardzo małe ilości środka zwiększającego rozpuszczalność, takie jak 5%, 2%, 1% lub nawet mniej. Typowo, środek zwiększający rozpuszczalność może być obecny w ilości od około 1% do około 100%, bardziej typowo od około 5% do około 25% wagowych. [0138] Kompozycja może ponadto zawierać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych substancji pomocniczych i zaróbek. Takie substancje pomocnicze i zaróbki obejmują, ale bez ograniczeń, środki zmniejszające kleistość, środki przeciw pienieniu, środki buforujące, polimery, przeciwutleniacze, środki konserwujące, środki chelatujące, modulatory lepkości, środki tonizujące, środki smakowe, barwniki, środki zapachowe, środki zmętniające, środki zawieszające, spoiwa, wypełniacze, plastyfikatory, środki smarujące i ich mieszaniny. [0139] Ponadto, kwas lub zasada mogą być włączone do kompozycji w celu ułatwienia przetwarzania, w celu zwiększenia stabilności, lub z innych powodów. Do przykładów farmaceutycznie dopuszczalnych zasad należą aminokwasy, estry aminokwasów, wodorotlenek amonu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek sodu, wodorowęglan sodu, wodorotlenek glinu, węglan wapnia, wodorotlenek magnezu, krzemian magnezowoglinowy, syntetyczny krzemian glinowy, syntetyczny hydrokalcyt, wodorotlenek magnezowo-glinowy, diizopropyloetyloamina, etanoloamina, etylenodiamina, trietanoloamina, trietyloamina, triizopropanoloamina, trimetyloamina, tris(hydroksymetylo)aminometan (TRIS) i tym podobne. Również odpowiednie są zasady, które są solami farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów, takich jak kwas octowy, kwas akrylowy, kwas adypinowy, kwas alginowy, kwas alkanosulfonowy, aminokwasy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas borowy, kwas masłowy, kwas węglowy, kwas cytrynowy, kwasy tłuszczowe, kwas mrówkowy, kwas fumarowy, kwas glukonowy, kwas hydrochinosulfonowy, kwas izoaskorbinowy, kwas mlekowy, kwas maleinowy, kwas szczawiowy, kwas para-bromofenylosulfonowy, kwas propionowy, kwas p- toluenosulfonowy, kwas salicylowy, kwas stearynowy, kwas bursztynowy, kwas

55 54 taninowy, kwas winowy, kwas tioglikolowy, kwas toluenosulfonowy, kwas moczowy i tym podobne. Sole kwasów wieloprotonowych, takie jak fosforan sodu, wodorofosforan disodu oraz diwodorofosforan sodu również można stosować. Gdy zasadę stanowi sól, kationem może być dowolny dogodny i farmaceutycznie dopuszczalny kation, taki jak amonowy, metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i tym podobne. Przykład może obejmować, ale bez ograniczenia, sód, potas, lit, magnez, wapń i amon. [0140] Odpowiednimi kwasami są farmaceutycznie dopuszczalne kwasy organiczne lub nieorganiczne. Przykłady odpowiednich kwasów nieorganicznych obejmują kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas borowy, kwas fosforowy i tym podobne. Przykłady odpowiednich kwasów organicznych obejmują kwas octowy, kwas akrylowy, kwas adypinowy, kwas alginowy, kwas alkanosulfonowy, aminokwasy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas borowy, kwas masłowy, kwas węglowy, kwas cytrynowy, kwasy tłuszczowe, kwas mrówkowy, kwas fumarowy, kwas glukonowy, kwas hydrochinosulfonowy, kwas izoaskorbinowy, kwas mlekowy, kwas maleinowy, kwas metanosulfonowy, kwas szczawiowy, kwas para-bromofenylosulfonowy, kwas propionowy, kwas p- toluenosulfonowy, kwas salicylowy, kwas stearynowy, kwas bursztynowy, kwas taninowy, kwas winowy, kwas tioglikolowy, kwas toluenosulfonowy, kwas moczowy i tym podobne. [0141] Kompozycje farmaceutyczne do wstrzykiwania. W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza kompozycje farmaceutyczne do wstrzykiwania zawierające związek według niniejszego wynalazku i zaróbkę farmaceutyczną odpowiednią do wstrzykiwania. Składniki i ilości środków w kompozycjach są takie, jak tu opisano. [0142] Postacie, w jakich nowatorskie kompozycje według wynalazku mogą być zrealizowane do podawania przez wstrzykiwanie, obejmują wodne lub olejowe zawiesiny lub emulsje, z olejem sezamowym, olejem kukurydzianym, olejem bawełnianym lub olejem arachidowym, jak również eliksirami, mannitolem, dekstrozą albo sterylne roztwory wodne i podobne nośniki farmaceutyczne. [0143] Wodne roztwory w soli fizjologicznej są także konwencjonalnie stosowane do iniekcji. Mogą być również stosowane etanol, glicerol, glikol propylenowy, ciekły glikol polietylenowy i tym podobne (oraz odpowiednie ich mieszaniny), pochodne cyklodekstryny i oleje roślinne. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez stosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, do utrzymania wymaganej wielkości cząstek w

56 55 przypadku dyspersji i przez użycie środków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można uzyskać stosując różne środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, na przykład parabeny, chlorobutanol, fenol, kwas sorbinowy, timerosal i tym podobne. [0144] Sterylne roztwory do wstrzykiwania wytwarza się przez wprowadzenie związku według niniejszego wynalazku w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z różnymi innymi składnikami wymienionymi powyżej, tak jak potrzeba, a następnie przeprowadza się sterylizację poprzez filtrację. Na ogół, dyspersje wytwarza się przez włączenie różnych sterylizowanych składników aktywnych do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowy ośrodek dyspersji i inne wymagane składniki spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania sterylnych roztworów do wstrzykiwania, pewne pożądane sposoby wytwarzania to techniki suszenia próżniowego i liofilizacji, które dają proszek składnika aktywnego z dowolnym dodatkowym pożądanym składnikiem z jego uprzednio sterylizowanego przez filtrację roztworu. [0145] Kompozycje farmaceutyczne do dostarczania miejscowego (np. przezskórnego). W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza kompozycje farmaceutyczne do dostarczania przezskórnego zawierające związek według niniejszego wynalazku i zaróbkę farmaceutyczną odpowiednią do dostarczania przezskórnego. [0146] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być formułowane w preparaty w postaci stałej, pół-stałej lub ciekłej odpowiedniej do podawania lokalnego lub miejscowego, takiej jak żele, rozpuszczalne w wodzie galaretki, kremy, płyny, zawiesiny, pianki, proszki, szlamy, maści, roztwory, oleje, pasty, czopki, spreje, emulsje, roztwory w soli fizjologicznej, roztwory oparte na dimetylosulfotlenku (DMSO). W ogólności nośniki o większych gęstościach są w stanie zapewnić obszar z przedłużoną ekspozycją na składniki czynne. Jednak preparat w postaci roztworu może zapewnić bardziej natychmiastową ekspozycję składnika aktywnego na wybranym obszarze. [0147] Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać odpowiednie nośniki lub zaróbki stałe lub w fazie żelowej, które są związkami, które pozwalają na zwiększenie penetracji albo pomagają w dostarczaniu terapeutycznych cząsteczek przez barierę przepuszczalności warstwy rogowej skóry. Wiele z tych cząstek zwiększających penetrację znanych jest dla specjalistów w dziedzinie preparatów miejscowych. Do przykładów takich nośników i zaróbek należą, lecz nie są do nich ograniczone, substancje pochłaniające wilgoć (np. mocznik), glikole (np. glikol propylenowy), alkohole (np.

57 56 etanol), kwasy tłuszczowe (np. kwas oleinowy), środki powierzchniowo czynne (np. mirystynian izopropylu i laurylosiarczan sodu), pirolidony, monolaurynian glicerolu, sulfotlenki, terpeny (np. mentol), aminy, amidy, alkany, alkanole, woda, węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry, skrobie, pochodne celulozy, żelatyna i polimery takie jak glikole polietylenowe. [0148] Inny przykładowy preparat do zastosowania w sposobach według niniejszego wynalazku wykorzystuje urządzenia do dostarczania przezskórnego ("plastry"). Takie plastry przezskórne mogą być stosowane, aby zapewniać ciągłą lub przerywaną infuzję związku według niniejszego wynalazku w kontrolowanych ilościach, z innymi środkami albo bez nich. [0149] Budowa i zastosowanie plastrów przezskórnych do dostarczania środków farmaceutycznych jest dobrze znane w dziedzinie. Zobacz, np. Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej nr , oraz Takie plastry mogą być skonstruowane do dostarczania środków farmaceutycznych w sposób ciągły, pulsacyjny lub na żądanie. [0150] Kompozycje farmaceutyczne do inhalacji. Kompozycje do inhalacji lub insuflacji obejmują roztwory i zawiesiny w farmaceutycznie dopuszczalnych, wodnych lub organicznych rozpuszczalnikach lub ich mieszaninach oraz proszki. Kompozycje ciekłe lub stałe mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, jak opisano powyżej. Korzystnie kompozycje podaje się przez ustną lub nosową drogę oddechową dla działania miejscowego lub układowego. Kompozycje w korzystnych farmaceutycznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach można rozpylać przez zastosowanie gazów obojętnych. Rozpylone roztwory można inhalować bezpośrednio z urządzenia rozpylającego albo urządzenie rozpylające może być przyłączone do maski na twarz lub urządzenia do okresowego oddychania z dodatnim ciśnieniem. Kompozycje w postaci roztworu, zawiesiny lub proszku mogą być podawane, korzystnie doustnie lub donosowo, z urządzeń, które dostarczają preparat we właściwy sposób. [0151] Inne kompozycje farmaceutyczne. Kompozycje farmaceutyczne mogą być również wytworzone z kompozycji tutaj opisanych i jednej lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek odpowiednich do podawania podjęzykowego, podpoliczkowego, doodbytniczego, doszpikowego, śródgałkowego, donosowego, zewnątrzoponowego lub dordzeniowego. Preparaty do takich kompozycji farmaceutycznych są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz, np. Anderson, Philip O.; Knoben, James E.; Troutman, William G, ed., Handbook of Clinical Drug Data, wydanie dziesiąte, McGraw-Hill, 2002; Pratt i

58 57 Taylor, ed., Principles of Drug Action, wydanie trzecie, Churchill Livingston, Nowy Jork, 1990; Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, wydanie dziewiąte, McGraw Hill, 20037ybg; Goodman i Gilman, ed., The Pharmacological Basis of Therapeutics, wydanie dziesiąte, McGraw Hill, 2001; Remingtons Pharmaceutical Sciences, wydanie dwudzieste, Lippincott Williams & Wilkins., 2000; Martindale, The Extra Pharmacopoeia, wydanie trzydzieste drugie (The Pharmaceutical Press, Londyn, 1999). [0152] Podawanie związku lub kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku można przeprowadzić dowolnym sposobem, który umożliwia dostarczanie związków do miejsca działania. Te sposoby obejmują drogi doustne, drogi dodwunastnicze, wstrzyknięcie pozajelitowe (w tym dożylne, dotętnicze, podskórne, domięśniowe, donaczyniowe, dootrzewnowe lub infuzję), podawanie miejscowe (np. stosowanie przezskórne), podawanie doodbytnicze, na drodze dostarczania miejscowego przez cewnik lub stent lub przez inhalację. Związek może być także podawany do tkanki tłuszczowej lub dokanałowo. [0153] Ilość podawanego związku będzie zależeć od leczonego pacjenta, ciężkości zaburzenia lub stanu, szybkości podawania, dyspozycji związku i uznania lekarza przepisującego lek. Jednakże, skuteczna dawka jest w zakresie od około 0,001 do około 100 mg na kg masy ciała na dzień, korzystnie od około 1 do około 35 mg/kg/dzień w dawkach pojedynczych lub podzielonych. Dla człowieka ważącego 70 kg ilość ta wynosiłaby od około 0,05 do 7 g/dzień, korzystnie od około 0,05 do około 2,5 g/dzień. W pewnych przypadkach, poziomy dawkowania poniżej dolnej granicy wspomnianego zakresu mogą być bardziej niż odpowiednie, natomiast w innych przypadkach można stosować jeszcze większe dawki bez powodowania jakichkolwiek szkodliwych skutków ubocznych, np. przez dzielenie takich większych dawek na kilka małych dawek do podawania przez cały dzień. [0154] W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest podawany w pojedynczej dawce. Typowo, takie podawanie będzie się odbywało przez wstrzyknięcie, np. wstrzyknięcie dożylne, w celu wprowadzenia środka szybko. Jednakże, w razie potrzeby mogą być stosowane inne drogi. Pojedyncza dawka związku według wynalazku może być również stosowana w leczeniu ostrego stanu. [0155] W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest podawany w dawkach wielokrotnych. Dawkowanie może odbywać się około raz, dwa razy, trzy razy, cztery razy, pięć razy, sześć razy lub ponad sześć razy dziennie. Dawkowanie może odbywać się około raz na miesiąc, raz na dwa tygodnie, raz na tydzień lub raz na dwa dni.

59 58 W innym przykładzie wykonania, związek według wynalazku i inny środek podaje się razem od około jeden raz dziennie do około 6 razy dziennie. W innym przykładzie wykonania, podawanie związku według wynalazku i środka trwa mniej niż około 7 dni. W jeszcze innym przykładzie wykonania, podawanie trwa dłużej niż około 6, 10, 14, 28 dni, dwa miesiące, sześć miesięcy lub jeden rok. W niektórych przypadkach osiąga się dawkowanie ciągłe i utrzymuje się je tak długo, jak jest to konieczne. [0156] Podawanie związków według wynalazku może trwać tak długo, jak jest to konieczne. W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku podaje się więcej niż 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 lub 28 dni. W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku podaje się mniej niż 28, 14, 7, 6, 5, 4, 3, 2 lub 1 dzień. W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest podawany przewlekle w sposób ciągły, np. do leczenia objawów przewlekłych. [0157] Skuteczna ilość związku według wynalazku może być podawana albo w dawkach pojedynczych albo wielokrotnych dowolnym z przyjętych sposobów podawania środków o podobnym zastosowaniu, w tym drogą doodbytniczą, dopoliczkową, donosową i przezskórną, przez wstrzykiwanie dotętnicze, dożylnie, dootrzewnowo, pozajelitowo, domięśniowo, podskórnie, doustnie, miejscowo lub jako środek wziewny. [0158] Kompozycje według wynalazku mogą także być dostarczane poprzez impregnowane lub powlekane urządzenie, takie jak na przykład stent lub wprowadzony do tętnicy cylindryczny polimer. Taki sposób podawania może być, na przykład, pomocny w zapobieganiu lub łagodzeniu restenozy po zabiegach takich jak angioplastyka balonowa. Bez wiązania się z teorią, związki według wynalazku mogą spowolnić lub inhibitować migrację i proliferację komórek mięśni gładkich w ścianie tętnicy, co przyczynia się do restenozy. Związek według wynalazku można podawać, na przykład, poprzez dostarczanie miejscowe z rozpórek stentu, ze stentgraftu, z wszczepów albo z pokrycia lub powłoki stentu. W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest zmieszany z matrycą. Taka matryca może być matrycą polimerową i może służyć do wiązania związku do stentu. Matryce polimerowe odpowiednie do takiego zastosowania, obejmują, na przykład, poliestry lub kopoliestry na bazie laktonu takie jak polilaktyd, polikaprolaktonoglikolid, poliortoestry, polibezwodniki, poliaminokwasy, polisacharydy, polifosfazeny, kopolimery poli(ester-eter) [0159] (np. PEO-PLLA); polidimetylosiloksan, poli(etylen-octan winylu), polimery lub kopolimery na bazie akrylanu (np. metylometakrylan polihydroksyetylu, poliwinylopirolidynon), fluorowane polimery, takie jak politetrafluoroetylen i estry

60 59 celulozy. Odpowiednie matryce mogą być niedegradujące lub mogą się degradować w czasie, uwalniając związek lub związki. Związek według wynalazku może być nakładany na powierzchnię stentu za pomocą różnych sposobów, takich jak powlekanie przez zanurzenie/wirowanie, powlekanie przez natryskiwanie, powlekanie przez zanurzanie, powlekanie i/lub powlekanie szczotkowe. Związki te mogą być stosowane w rozpuszczalniku i rozpuszczalnik można pozostawić do odparowania, w ten sposób tworząc warstwę związku na stencie. Alternatywnie, związek może być umieszczony w korpusie stentu lub wszczepu, na przykład w mikrokanalikach lub mikroporach. Po wszczepieniu, związek dyfunduje z korpusu stentu i kontaktuje się ze ścianą tętnicy. Stenty tego typu można wytworzyć przez zanurzenie stentu wyprodukowanego tak, aby zawierał takie mikropory lub mikrokanaliki, w roztworze związku według wynalazku w odpowiednim rozpuszczalniku, a następnie odparowanie rozpuszczalnika. Nadmiar leku na powierzchni stentu można usunąć poprzez dodatkowe krótkie przemywanie rozpuszczalnikiem. W jeszcze innych przykładach wykonania, związki według wynalazku mogą być kowalencyjnie związane ze stentem lub wszczepem. Można zastosować kowalencyjny łącznik, który degraduje się in vivo, co prowadzi do uwolnienia związku według wynalazku. W takim celu może być stosowane każde biologicznie labilne wiązanie, takie jak wiązanie estrowe, amidowe lub bezwodnikowe. Związek według wynalazku może być dodatkowo podawany donaczyniowo z balonu stosowanego podczas angioplastyki. Pozanaczyniowe podawanie związków poprzez zastosowanie preparatów według wynalazku przez osierdzie lub przez przydankę może być również wykonane w celu zmniejszenia restenozy. [0160] Wiele urządzeń stentowych, które mogą być stosowane, tak jak opisano, ujawniano na przykład w następujących odnośnikach: Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr ; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Nr

61 60 [0161] Związek według wynalazku może być podawany w dawkach. Wiadome jest w dziedzinie, że ze względu na zmienność międzyosobniczą w farmakokinetyce związków, indywidualizacja schematu dawkowania jest konieczna do optymalnego leczenia. Dawkowanie związku według wynalazku można określić w rutynowych doświadczeniach w świetle niniejszego ujawnienia. [0162] Gdy związek według wynalazku jest podawany w kompozycji zawierającej jeden lub więcej środków, a środek ma krótszy okres półtrwania niż związek według wynalazku, postacie dawki jednostkowej środka oraz związku według wynalazku mogą być odpowiednio dostosowane. [0163] Przedmiotowa kompozycja farmaceutyczna może być przykładowo w postaci odpowiedniej do podawania doustnego jako tabletka, kapsułka, pigułka, proszek, preparaty do podtrzymywanego uwalniania, roztwór, zawiesina, do iniekcji pozajelitowej jako sterylny roztwór, zawiesina lub emulsja, do podawania miejscowego jako maść lub krem lub do podawania doodbytniczego jako czopek. Kompozycja farmaceutyczna może być w postaciach dawki jednostkowej odpowiednich do pojedynczego podawania dokładnych dawek. Kompozycja farmaceutyczna będzie zawierać zwykły farmaceutyczny nośnik lub zaróbkę oraz związek według wynalazku jako składnik aktywny. Ponadto może ona zawierać inne środki medyczne lub farmaceutyczne, nośniki, adiuwanty itd. [0164] Przykładowe pozajelitowe postacie podawania obejmują roztwory lub zawiesiny związku aktywnego w sterylnych roztworach wodnych, na przykład, wodnych roztworach glikolu propylenowego lub dekstrozy. Takie postacie dawkowania mogą być odpowiednio buforowane, jeśli jest to pożądane. [0165] Wynalazek dostarcza także zestawy. Zestawy zawierają związek lub związki według niniejszego wynalazku, jak tu opisano, w odpowiednim opakowaniu, oraz materiał pisemny, który może zawierać instrukcję stosowania, dyskusję o badaniach klinicznych, listę skutków ubocznych i tym podobne. Zestawy takie mogą także zawierać informacje, takie jak odesłania do literatury naukowej, materiały w postaci ulotek informacyjnych, wyniki badań klinicznych i/lub ich streszczenia i tym podobne, które wskazują lub przedstawiają zakres działania i/lub zalety kompozycji, i/lub które opisują dawkowanie, podawanie, efekty uboczne, interakcje z innymi lekami lub inne informacje użyteczne dla służby zdrowia. Takie informacje mogą być oparte na wynikach różnych badań, na przykład badań z udziałem zwierząt doświadczalnych obejmujących modele in vivo i badań opartych na badaniach klinicznych na ludziach. Zestaw może ponadto zawierać inny środek. W niektórych przykładach wykonania, związek według niniejszego

62 61 wynalazku i środek są dostarczane jako oddzielne kompozycje w oddzielnych pojemnikach w zestawie. W niektórych przykładach wykonania, związek według niniejszego wynalazku i środek są dostarczane jako pojedyncza kompozycja w pojemniku w zestawie. Odpowiednie opakowanie i inne artykuły do stosowania (np. miarka do preparatów ciekłych, folia do owijania, aby zminimalizować ekspozycję na powietrze i tym podobne) są znane w dziedzinie i mogą być zawarte w zestawie. Opisane tu zestawy mogą być dostarczane, sprzedawane i/lub reklamowane służbie zdrowia, w tym lekarzom, pielęgniarkom, farmaceutom, urzędnikom instytucji sporządzających listę leków refundowanych i tym podobnym. Zestawy mogą także w niektórych przykładach wykonania być sprzedawane bezpośrednio konsumentom. [0166] Wynalazek dostarcza także związek lub kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku do stosowania w sposobie leczenia stanów chorobowych, w tym, ale bez ograniczenia, stanów w których występuje nieprawidłowe działanie mtorc1, mtorc2 i/lub kinaz PI3. [0167] Wynalazek dotyczy także związku do zastosowania w sposobie leczenia zaburzeń hiperproliferacyjnych u ssaka, polegającym na podawaniu wspomnianemu ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości związku według niniejszego wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, proleku, solwatu, hydratu lub pochodnej. W niektórych przykładach wykonania, wspomniany sposób dotyczy leczenia nowotworu, takiego jak ostra białaczka szpikowa, nowotwór grasicy, mózgu, płuc, nowotwór płaskonabłonkowy, nowotwór skóry, nowotwór oka, siatkówczak, czerniak wewnątrzgałkowy, nowotwór jamy ustnej i części ustnej gardła, nowotwór pęcherza, nowotwór gastryczny, nowotwór żołądka, nowotwór trzustki, nowotwór pęcherza, nowotwór piersi, nowotwór szyjki macicy, nowotwór głowy, nowotwór szyi, nowotwór nerkowy, nowotwór nerki, nowotwór wątroby, nowotwór jajnika, nowotwór prostaty, nowotwór jelita grubego, nowotwór przełyku, nowotwór jądrowy, nowotwór ginekologiczny, nowotwór tarczycy, nowotwór CNS, nowotwór PNS, nowotwór związany z AIDS (np. chłoniak i mięsak Kaposiego) oraz nowotwór wywołany wirusowo. [0168] Sposoby leczenia tu dostarczane obejmują podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości związku według wynalazku. [0169] Wynalazek dotyczy także związku do zastosowania w sposobie leczenia chorób związanych z waskulogenezą lub angiogenezą u ssaka, polegającym na podawaniu wspomnianemu ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości związku według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, proleku, solwatu, hydratu lub pochodnej.

63 62 W niektórych przykładach wykonania, wspomniany sposób przeznaczony jest do leczenia choroby wybranej z grupy składającej się z angiogenezy nowotworowej, naczyniaka, glejaka, czerniaka, mięsaka Kaposiego oraz nowotworu jajnika, piersi, płuca, trzustki, prostaty, okrężnicy oraz epidermoidalnego. [0170] Pacjenci, którzy mogą być leczeni związkami według wynalazku lub farmaceutycznie dopuszczalną solą, estrem, solwatem, hydratem lub pochodną wspomnianych związków, według sposobów według tego wynalazku obejmują, na przykład, pacjentów, których zdiagnozowano jako mających BPH; nowotwór piersi, taki jak nowotwór przewodowy w tkance kanału w gruczole sutkowym, nowotwory rdzeniaste, nowotwory koloidowe, nowotwory cewkowe, oraz zapalny nowotwór piersi; nowotwór jajnika, w tym nowotwory nabłonkowe jajnika, takie jak gruczolakorak w jajniku i gruczolakorak, który migrował z jajnika do jamy brzusznej; nowotwór macicy; nowotwór szyjki macicy, taki jak gruczolakorak w nabłonku szyjki macicy, w tym rak płaskonabłonkowy i gruczolakorak; nowotwór prostaty, taki jak nowotwór prostaty wybrany spośród następujących: gruczolakorak lub gruczolakorak, który migrował do kości; nowotwór trzustki, taki jak rak epitelioidalny w tkance przewodu trzustkowego i gruczolakorak w przewodzie trzustkowym; nowotwór pęcherza, taki jak rak przejściowokomórkowy w pęcherzu moczowym, nowotwory nabłonka dróg moczowych (raki przejściowokomórkowe), nowotwory w komórkach nabłonka dróg moczowych, które wyściełają pęcherz, raki płaskonabłonkowe, gruczolakoraki oraz nowotwory drobnokomórkowe; białaczkę taką jak ostra białaczka szpikowa (AML), ostra białaczka limfocytowa, przewlekła białaczka limfocytowa, przewlekła białaczka szpikowa, białaczka włochatokomórkowa, mielodysplazja, zaburzenia mieloproliferacyjne, ostra białaczka szpikowa (AML), przewlekła białaczka szpikowa (CML), mastocytoza, przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), szpiczak mnogi (MM) i zespól mielodysplastyczny (MDS); nowotwór kości; nowotwór płuc, taki jak niedrobnokomórkowy nowotwór płuca (NSCLC), który jest podzielony na raki płaskonabłonkowe, gruczolakoraki oraz raki z dużych komórek niezróżnicowanych i drobnokomórkowy nowotwór płuca; nowotwór skóry, taki jak rak podstawnokomórkowy, czerniak, rak płaskonabłonkowy i rogowacenie słoneczne, które jest stanem skóry, który czasami rozwija się w raka płaskonabłonkowego; siatkówczaka oka; czerniaka skóry lub wewnątrzgałkowego (oka); pierwotny nowotwór wątroby (nowotwór, który zaczyna się w wątrobie); nowotwór nerek; nowotwór tarczycy, taki jak brodawkowaty, pęcherzykowy, rdzeniasty i anaplastyczny; chłoniaka związanego z AIDS, takiego jak rozlany chłoniak z

64 63 dużych komórek B, chłoniak immunoblastyczny z komórek B oraz chłoniak z małych nierozszczepionych komórek; mięsaka Kaposiego; wywołane wirusowo nowotwory w tym wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) oraz rak wątrobowokomórkowy; limfotropowy ludzki wirus typu 1 (HTLV-1) i białaczkę/chłoniaka z komórek T dorosłych; oraz wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) oraz nowotwór szyjki macicy; nowotwory centralnego układu nerwowego (CNS), takie jak pierwotny nowotwór mózgu, który obejmuje glejaki (gwiaździaka, gwiaździaka anaplastycznego lub glejaka wielopostaciowego), skąpodrzewiaka, oponiaka, wyściółczaka, chłoniaka, nerwiaka osłonkowego oraz rdzeniaka; nowotwory obwodowego układu nerwowego (PNS), takie jak nerwiaki akustyczne i nowotwór złośliwy osłonek nerwów obwodowych (MPNST), w tym nerwiakowłókniaki i nerwiaki osłonkowe, złośliwy nowotwór włóknistokomórkowy, złośliwy włóknisty mięsak histiocytarny, złośliwy oponiak, złośliwy międzybłoniak i złośliwy guz mieszany Müllera; nowotwór jamy ustnej i części ustnej gardła, taki jak nowotwór gardłowo-przełykowy (hipogardłowy), nowotwór krtani, nowotwór części nosowej gardła oraz nowotwór części ustnej gardła; nowotwór żołądka, taki jak chłoniaki, guzy podścieliskowe żołądka i rakowiaki; nowotwór jądra, taki jak nowotwory zarodkowe (germinalne) (GCT), które obejmują nasieniaki i nienasieniaki, oraz guzy podścieliskowe gonad, które obejmują guzy z komórek Leydiga i guzy z komórek Sertoliego; nowotwór grasicy, taki jak grasiczaki, nowotwory grasicy, choroba Hodgkina (ziarnica złośliwa), chłoniaki nie-hodgkinowe (ziarnica niezłośliwa), rakowiaki lub guzy rakowiakowe; nowotwór odbytu; oraz nowotwór okrężnicy. [0171] Wynalazek dotyczy także związku do zastosowania w sposobie leczenia cukrzycy u ssaka, który obejmuje podawanie wspomnianemu ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości związku według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, solwatu, hydratu lub pochodnej. [0172] W innym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się związek do zastosowania w sposobie leczenia choroby oczu, przez podawanie pacjentowi jednego lub więcej związków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych do oka. [0173] Ponadto dostarczane są sposoby podawania związków według niniejszego wynalazku za pomocą kropli do oczu, dogałkowego zastrzyku, zastrzyku do ciała szklistego, miejscowo albo poprzez zastosowanie urządzenia do elucji leku, mikrokapsułki, implantu lub urządzenia mikrostrumieniowego. W niektórych przypadkach, związki według niniejszego wynalazku są podawane z nośnikiem lub

65 64 zaróbką, która zwiększa wewnątrzgałkową penetrację związku, tak jak emulsja oleju i wody z koloidalnymi cząstkami o oleistym rdzeniu otoczonym przez film międzypowierzchniowy. Uważa się, że mogą być stosowane wszystkie miejscowe drogi do oczu w tym podawanie miejscowe, podspojówkowe, okołoczne, pozagałkowe, pod torebką Tenona, dokomorowe, do ciała szklistego, dogałkowe, podsiatkówkowe, okołotwardówkowe i do przestrzeni pomiędzy naczyniówką a twardówką. Może być możliwe podawanie układowe lub pozajelitowe, w tym, ale bez ograniczenia, dostarczanie dożylne, podskórne i doustne. Przykładowym sposobem podawania będzie iniekcja do ciała szklistego lub pod torebkę Tenona roztworów lub zawiesin, lub umieszczenie w ciele szklistym lub pod torebką Tenona bioerodowalnych lub niebioerodowalnych urządzeń, lub podawanie miejscowe do oka roztworów lub zawiesin, lub okołotwardówkowe podawanie preparatu w postaci żelu lub kremu. [0174] W niektórych przypadkach, koloidalne cząstki zawierają co najmniej jeden środek kationowy i co najmniej jeden niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak poloksamer, tyloksapol, polisorbat, pochodne polioksyetylenowane oleju rycynowego, ester sorbitanu, lub stearynian polioksylu. W niektórych przypadkach, środek kationowy to alkiloamina, trzeciorzędowa alkiloamina, czwartorzędowe związki amoniowe, kationowy lipid, alkohol aminowy, sól biguanidynowa, kationowy związek lub ich mieszanina. W niektórych przypadkach, środek kationowy to sól biguanidynowa, taka jak chlorheksydyna, poliaminopropylobiguanidyna, fenformina, alkilobiguanidyna lub ich mieszaniny. W niektórych przypadkach, czwartorzędowy związek amoniowy to halogenek benzalkoniowy, halogenek lauralkoniowy, cetrymid, halogenek heksadecylotrimetyloamoniowy, halogenek tetradecylotrimetyloamoniowy, halogenek dodecylotrimetyloamoniowy, halogenek cetrymoniowy, halogenek benzetoniowy, halogenek behenalkoniowy, halogenek cetalkoniowy, halogenek cetetylodimoniowy, halogenek cetylopirydyniowy, halogenek benzododecyniowy, halogenek chlorallilometenaminy, halogenek myristyloalkoniowy, halogenek stearalkoniowy lub mieszaniny dwóch lub więcej z nich. W niektórych przypadkach, środek kationowy to chlorek benzalkoniowy, chlorek lauralkoniowy, bromek benzododecyniowy, chlorek benzeteniowy, bromek heksadecylotrimetyloamoniowy, bromek tetradecylotrimetyloamoniowy, bromek dodecylotrimetyloamoniowy lub mieszanina dwóch lub więcej z nich. W niektórych przypadkach, faza olejowa to olej mineralny i lekki olej mineralny, triglicerydy o średnim łańcuchu (MCT), olej kokosowy; oleje utwardzone obejmujące utwardzony olej bawełniany, utwardzony olej palmowy,

66 65 utwardzony olej rycynowy lub utwardzony olej sojowy; pochodne polioksyetylenowe utwardzonego oleju rycynowego obejmujące polioksyl-40 utwardzony olej rycynowy, polioksyl-60 utwardzony olej rycynowy lub polioksyl-100 utwardzony olej rycynowy. [0175] Ujawnione są także sposoby modulowania aktywności kinazy PI3K i / lub mtor przez kontaktowanie kinazy ze skuteczną ilością związku według wynalazku. Modulacja może być inhibitująca lub aktywująca aktywność kinazy. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności kinazy przez kontaktowanie kinazy ze skuteczną ilością związku według wynalazku w roztworze. W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza sposoby inhibicji aktywności kinazy przez kontaktowanie komórki, tkanki, narządu, które eksprymują rozważaną kinazę. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności kinazy u pacjenta, w tym, ale bez ograniczenia, gryzoni i ssaków (np. ludzi), przez podawanie pacjentowi skutecznej ilości związku według wynalazku. W niektórych przykładach wykonania, procentowa inhibicja przekracza 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90%. [0176] W niektórych przykładach wykonania, kinaza jest wybrana z grupy obejmującej mtor, w tym różne izoformy, takie jak mtorc1 i mtorc2; kinazy PI3, w tym różne izoformy, takie jak kinaza PI3 α, kinaza PI3 β, kinazy PI3 γ, kinaza PI3 δ; DNA-PK; Abl, VEGFR, receptor ephrin B4 (EphB4); receptorową kinazę tyrozynową TEK (Tie2); tyrozynową kinazę 3 podobną do FMS (FLT-3); receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFR); RET; ATM; ATR; hsmg-1; HCK; Src; receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR); KIT; receptor insuliny (IR) i IGFR. [0177] Ujawniono także sposoby modulowania aktywności mtor przez kontaktowanie mtor z ilością związku według wynalazku wystarczającą do modulowania aktywności kinazy mtor. Modulowanie może być inhibitujące lub aktywujące aktywność mtor. Ujawnione są również sposoby inhibicji mtor przez kontaktowanie mtor z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor. [0178] Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w roztworze przez kontaktowanie wspomnianego roztworu z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianym roztworze. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w komórce przez kontaktowanie wspomnianej komórki z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianej komórce. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w tkance przez kontaktowanie wspomnianej tkanki z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianej tkance.

67 66 Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w organizmie przez kontaktowanie wspomnianego organizmu z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianym organizmie. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w zwierzęciu przez kontaktowanie wspomnianego zwierzęcia z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianym zwierzęciu. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w ssaku przez kontaktowanie wspomnianego ssaka z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianym ssaku. Ujawnione są również sposoby inhibicji aktywności mtor w człowieku przez kontaktowanie wspomnianego człowieka z ilością związku według wynalazku wystarczającą do inhibicji aktywności mtor we wspomnianym człowieku. Niniejszy wynalazek dostarcza związek do zastosowania w sposobach leczenia choroby, w której pośredniczy aktywność mtor, u pacjenta wymagającego takiego leczenia. [0179] Ujawnione są również sposoby terapii kombinowanych, w których środek znany z modulowania innych szlaków lub innych składników tego samego szlaku, a nawet nakładających się zbiorów enzymów docelowych, jest stosowany w połączeniu ze związkiem według niniejszego wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą, estrem, solwatem, hydratem lub pochodną. W jednym aspekcie, taka terapia obejmuje, ale bez ograniczenia, kombinację jednego lub więcej związków według wynalazku ze środkami chemioterapeutycznymi, przeciwciałami terapeutycznymi i leczeniem radioterapią, w celu dostarczenia synergistycznego lub addytywnego działania terapeutycznego. [0180] W jednym aspekcie, związki lub kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą wykazywać synergistyczne lub addytywne działanie przy podawaniu w kombinacji ze środkami, które inhibitują wytwarzanie lub aktywność IgE. Taka kombinacja może zmniejszyć niepożądany skutek wysokiego poziomu IgE związanego z zastosowaniem jednego lub więcej inhibitorów PI3Kδ, w razie wystąpienia takiego efektu. Może to być szczególnie użyteczne w leczeniu chorób autoimmunologicznych i zapalnych (AIID), takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. Dodatkowo, podawanie inhibitorów PI3Kδ lub PI3Kδ/γ według wynalazku, w połączeniu z inhibitorami mtor może również wykazywać synergię poprzez zwiększenie inhibicji szlaku PI3K. [0181] Związek według wynalazku może być formułowany lub podawany w połączeniu z innymi środkami, które działają w celu łagodzenia objawów stanów zapalnych, takich jak zapalenie mózgu i rdzenia, astma i inne opisane tu choroby. Środki te obejmują

68 67 niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAID), np. kwas acetylosalicylowy; ibuprofen; naproksen; indometacynę; nabumeton; tolmetynę; itp. Kortykosterydy są stosowane do zmniejszenia zapalenia i tłumią aktywność układu immunologicznego. Najpowszechniej przepisywanym lekiem tego rodzaju jest Prednizon. Chlorochina (Aralen) lub hydroksychlorochina (Plaquenil) może być również bardzo przydatna u niektórych osobników z toczniem. Najczęściej są one przewidziane dla objawów skórnych i stawowych tocznia. Azatiopryna (Imuran) i cyklofosfamid (Cytoxan) tłumią stan zapalny i mają tendencję do tłumienia układu odpornościowego. Inne środki, np. metotreksat i cyklosporyna są używane do kontrolowania objawów tocznia. Leki przeciwzakrzepowe są stosowane, aby zapobiec szybkiemu krzepnięciu krwi. Obejmują one zakres od aspiryny w bardzo małej dawce, która zapobiega przywieraniu płytek krwi, do heparyny/kumadyny. [0182] W innym aspekcie, wynalazek ten odnosi się również do związku i kompozycji farmaceutycznych do zastosowania w sposobach inhibicji nieprawidłowego wzrostu komórek u ssaka, co obejmuje pewną ilość związku według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, solwat lub hydrat w kombinacji z pewną ilością środka przeciwnowotworowego (np. środka chemioterapeutycznego). Wiele środków chemioterapeutycznych jest obecnie znanych w dziedzinie i mogą być one stosowane w kombinacji ze związkiem według wynalazku. [0183] W niektórych przykładach wykonania, środek chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy obejmującej inhibitory mitotyczne, środki alkilujące, antymetabolity, antybiotyki interkalujące, inhibitory czynnika wzrostu, inhibitory cyklu komórkowego, enzymy, inhibitory topoizomerazy, modyfikatory odpowiedzi biologicznej, anty-hormony, inhibitory angiogenezy i antyandrogeny. [0184] Nieograniczające przykłady to środki chemioterapeutyczne, środki cytotoksyczne i niepeptydowe małe cząsteczki, takie jak Gleevec (mesylan imatynibu), VELCADE (bortezomib), Casodex (bikalutamid), Iressa (gefitynib) i adriamycyna, jak również wiele środków chemioterapeutycznych. Nieograniczające przykłady środków chemioterapeutycznych obejmują środki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN ); sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metylomelaminy, włączając altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; iperyty azotowe, takie jak chlorambucyl, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, nowembichyna, fenesteryna, prednimustyna,

69 68 trofosfamid, iperyt uracylu; nitrozomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; antybiotyki, takie jak aklacynomyzyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktynomycyna, kalicheamycyna, karabicyna, karminomycyna, karzynofilina, Casodex, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, ezorubicyna, idarubicyna, marcelomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zinostatyna, zorubicyna; anty-metabolity, takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi purynowe, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidyny, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksyurydyna, androgeny, takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; środki hamujące działanie nadnerczy (anti-adrenals), takie jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; środki uzupełniające działanie kwasu foliowego, taki jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidowy; kwas aminolewulinowy; amsakryna; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofaminę; demekolcynę; diazychon; elfomitynę; octan eliptynium; etoglucyd; azotan galu; hydroksymocznik; lentinan; lonidaminę; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrynę; pentostatynę; fenamet; pirarubicynę; kwas podofillinowy; 2-etylohydrazyd; prokarbazynę; PSK.R ; razoksan; sizofiran; spirogermanium; kwas tenuazonowy; triazychon; 2,2',2"-trichlorotrietyloaminę; uretan; windezynę; dakarbazynę; mannomustynę; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozynę; arabinozyd ("Ara-C"); cyklofosfamid; tiotepę; taksany, np. paklitaksel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i docetaksel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja); kwas retinowy; esperamicyny; kapecytabinę; oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne dowolnego z powyższych. Również włączone jako odpowiednie chemioterapeutyczne środki do kondycjonowania komórkowego są środki anty-hormonalne, których działanie polega na regulacji lub inhibicji działania hormonu na nowotwory, takie jak antyestrogeny, obejmujące na przykład tamoksyfen (NolvadexTM), raloksyfen, 4(5)-imidazole inhibitujące aromatazę, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY , onapriston i toremifen (Fareston); oraz anty-androgeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina; chlorambucyl; gemcytabina; 6-tioguanina;

70 69 merkaptopuryna; metotreksat; analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna; winblastynę; platynę; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycynę C; mitoksantron; winkrystynę; winorelbinę; nawelbinę; nowantron; tenipozyd; daunomycynę; aminopterynę; kseloda; ibandronian; kamptotecynę-11 (CPT-11); inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO). W razie potrzeby, związki lub kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w kombinacji z powszechnie przepisywanymi lekami przeciwnowotworowymi, takimi jak Herceptin, Avastin, Erbitux, Rituxan, Taxol, Arimidex, Taxotere, ABVD, AVICINE, abagowomab, karboksamid akrydyny, adekatumumab, 17-N-alliloamino-17- demetoksygeldanamycyna, alfaradin, alwocydyb, tiosemikarbazon 3-aminopirydyno-2- karboksyaldehydu, amonafid, antracenodion, immunotoksyny anty-cd22, środki przeciwnowotworowe, przeciwnowotworowe zioła, apazychon, atiprimod, azatiopryna, belotekan, bendamustyna, BIBW 2992, birikodar, brostalicyna, briostatyna, sulfoksyimina butioniny, CBV (chemioterapia), kalikulina, niespecyficzne wobec cyklu komórkowego leki przeciwnowotworowe, kwas dichlorooctowy, diskodermolid, elsamitrucyna, enocytabina, epotilon, eribulina, ewerolimus, eksatekan, eksisulind, feruginol, forodezyna, fosfestrol, schemat chemioterapii ICE, IT-101, imekson, imikwimod, indolokarbazol, irofulwen, lanikwidar, larotaksel, lenalidomid, lukanton, lurtotekan, mafosfamid, mitozolomid, nafoksydyna, nedaplatyna, olaparib, ortataksel, PAC-1, pawpaw, piksantron, inhibitor proteasomu, rebekamycyna, rezykwimod, rubitekan, SN-38, salinosporamid A, sapacytabina, Stanford V, swainsonina, talaporfin, tarikwidar, tegafur-uracyl, temodar, tesetaksel, tetraazotan triplatyny, tris (2-chloroetylo)amina, troksacytabina, uramustyna, wadimezan, winflunina, ZD6126 i zosukwidar. [0185] Opisany jest również sposób stosowania związków lub kompozycji farmaceutycznych tu dostarczanych w kombinacji z radioterapią do inhibicji nieprawidłowego wzrostu komórek lub leczenia zaburzenia hiperproliferacyjnego u ssaka. Techniki podawania radioterapii są znane w dziedzinie i techniki te można stosować w terapii kombinowanej tutaj opisanej. Podawanie związku według wynalazku w tej terapii kombinowanej można ustalić w sposób tutaj opisany. [0186] Radioterapia może być podawana za pomocą jednego z kilku sposobów lub kombinacji sposobów, w tym, bez ograniczenia, terapii zewnętrzną wiązką, wewnętrznej radioterapii, promieniowania implantu, radiochirurgii stereotaktycznej, układowej radioterapii, radioterapii i stałej lub czasowej śródmiąższowej brachyterapii. Termin "brachyterapia", tak jak stosowany jest tutaj, odnosi się do radioterapii dostarczonej przez

71 70 przestrzennie ograniczony materiał radioaktywny umieszczony w ciele na nowotworze lub w jego pobliżu lub innym miejscu objętym proliferacyjną chorobą tkanek. Termin ma bez ograniczenia obejmować ekspozycję na izotopy promieniotwórcze (np. At-211, I-131, I- 125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 i izotopy promieniotwórcze Lu). Odpowiednie źródła promieniowania do stosowania jako środek do kondycjonowania komórkowego według niniejszego wynalazku obejmują zarówno ciała stałe jak i ciecze. Tytułem nieograniczającego przykładu, źródłem promieniowania może być radionuklid, taki jak I-125, I-131, Yb-169, Ir-192 jako stałe źródło, I-125 jako stałe źródło lub inne radionuklidy, które emitują fotony, cząstki beta, promieniowanie gamma lub inne promieniowanie terapeutyczne. Materiałem radioaktywnym może być również płyn wykonany z dowolnego roztworu radionuklidu(ów), np. roztwór I-125 i I-131 lub płyn radioaktywny może być wytwarzany z zastosowaniem zawiesiny odpowiedniego płynu zawierającego małe cząstki stałych radionuklidów, takich jak Au-198, Y-90. Ponadto radionuklid(y) może(mogą) być włączony(e) do żelu lub radioaktywnych mikrokuleczek. [0187] Bez ograniczenia się do żadnej teorii, związek według niniejszego wynalazku może uczynić nieprawidłowe komórki bardziej wrażliwymi na leczenie promieniowaniem w celu zabicia i / lub inhibicji wzrostu takich komórek. Zgodnie z tym, również ujawniono sposób uwrażliwiania nieprawidłowych komórek u ssaka na leczenie promieniowaniem, który obejmuje podawanie ssakowi pewnej ilości związku według niniejszego wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, solwatu, hydratu lub pochodnej, która to ilość jest skuteczna w uwrażliwianiu nieprawidłowych komórek na leczenie promieniowaniem. Ilość związku, soli lub solwatu w tym sposobie można ustalić za pomocą tutaj opisanych środków służących do ustalania skutecznych ilości takich związków. [0188] Związek lub farmaceutyczne kompozycje według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z pewną ilością jednej lub więcej substancji wybranych spośród środków przeciw angiogenezie, inhibitorów transdukcji sygnału, środków antyproliferacyjnych, inhibitorów glikolizy lub inhibitorów autofagii. [0189] Środki przeciw angiogenezie, takie jak inhibitory MMP-2 (metaloproteinazy macierzy 2), inhibitory MMP-9 (metaloproteinazy macierzy 9) oraz inhibitory COX-11 (cyklooksygenazy 11) mogą być stosowane w połączeniu ze związkiem według wynalazku i kompozycjami farmaceutycznymi opisanymi tutaj. Środki przeciw angiogenezie obejmują, na przykład, rapamycyną, temsyrolimus (CCI-779), ewerolimus (RAD001), sorafenib, sunitynib i bewacyzumab. Przykłady przydatnych inhibitorów

72 71 COX-II obejmują CELEBREX (alekoksyb), waldekoksyb i rofekoksyb. Przykłady przydatnych inhibitorów metaloproteinazy macierzy opisano w WO 96/33172 (opublikowanym 24 października 1996), WO 96/27583 (opublikowanym 7 marca 1996), Europejskim Zgłoszeniu Patentowym nr (złożonym 8 lipca 1997), Europejskim Zgłoszeniu Patentowym nr ,2 (złożonym 29 października 1999), WO 98/07697 (opublikowanym 26 lutego 1998), WO 98/03516 (opublikowanym 29 stycznia 1998), WO 98/34918 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/34915 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/33768 (opublikowanym 6 sierpnia 1998), WO 98/30566 (opublikowanym 16 lipca 1998), Europejskiej Publikacji Patentowej 606,046 (opublikowanej 13 lipca 1994), Europejskiej Publikacji Patentowej 931, 788 (opublikowanej 28 lipca 1999), WO 90/05719 (opublikowanym 31 maja 1990), WO 99/52910 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/52889 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/29667 (opublikowanym 17 czerwca 1999), Międzynarodowym Zgłoszeniu PCT Nr PCT/IB98 /01113 (złożonym 21 lipca 1998), Europejskim Zgłoszeniu Patentowym nr (złożonym 25 marca 1999), Zgłoszeniu Patentowym Wielkiej Brytanii nr (złożonym 3 czerwca 1999), Zgłoszeniu Tymczasowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej nr 60/ (złożonym 12 sierpnia 1999), Patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej (udzielonym 26 stycznia 1999), Patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej (udzielonym 19 stycznia 1999) oraz Europejskiej Publikacji Patentowej 780,386 (opublikowanej 25 czerwca 1997). Korzystnymi inhibitorami MMP-2 i MMP-9 są te, które mają niewielką lub nie mają aktywności inhibitującej MMP-1. Bardziej korzystne są te, które selektywnie inhibitują MMP-2 i/lub AMP-9 w stosunku do innych metaloproteinaz macierzy (tj. MAP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP- 7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13). Niektóre konkretne przykłady inhibitorów MMP przydatnych w wynalazku to AG-3340, RO i RS [0190] Inhibitory autofagii obejmują, ale nie są ograniczone do nich, chlorochinę, 3- metyloadeniną, hydroksychlorochinę (Plaquenil ), bafilomycynę A1, rybozyd 5-amino- 4-imidazolokarboksyamidu (AICAR), kwas okadaikowy, glonowe toksyny tłumiące autofagię, które inhibitują fosfatazy białkowe typu 2A lub typu 1, analogi camp oraz leki, które podnoszą poziomy camp, takie jak adenozyny, LY204002, rybozyd N6- merkaptopuryny i winblastyna. Ponadto, antysensowne lub sirna, które inhibituje ekspresję białek, w tym, ale bez ograniczenia, ATG5 (które są zaangażowane w autofagię), może być również stosowane.

73 72 [0191] Związki opisane tutaj mogą być formułowane lub podawane w połączeniu z ciekłymi lub stałymi barierami tkankowymi znanymi także jako środki smarujące. Przykłady barier tkankowych obejmują, ale bez ograniczenia, polisacharydy, polyglikany, seprafilm, INTERCEED i kwas hialuronowy. [0192] Leki, które mogą być podawane w połączeniu ze związkami opisanymi tutaj obejmują dowolne odpowiednie leki skutecznie dostarczane poprzez inhalację, na przykład, środki przeciwbólowe, takie jak: kodeina, dihydromorfina, ergotamina, fentanyl lub morfina; Preparaty stosowane w dusznicy, np. diltiazem; środki przeciwalergiczne, np. kromoglikan, ketotifen lub nedokromil; środki przeciwinfekcyjne, np. cefalosporyny, penicyliny, streptomycyna, sulfonamidy, tetracykliny lub pentamidyna; środki przeciwhistaminowe, np metapirylen; środki przeciwzapalne, na przykład beklometazon, flunizolid, budezonid, tipredan, acetonid triamcynolonu lub flutykazon; środki przeciwkaszlowe, np. noskapina; środki rozszerzające oskrzela, np. efedryna, adrenalina, fenoterol, formoterol, izoprenalina, metaproterenol, fenylefryna, fenylopropanoloamina, pirbuterol, reproterol, rimiterol, salbutamol, salmeterol, terbutalina, izoetaryna, tulobuterol, orcyprenalina lub (-)-4-amino-3,5-dichloro-α-[[[6-[2-(2-pirydynylo)etoksy]- heksylo]amino]metylo]benzenometanol; Leki moczopędne, np. amiloryd; leki antycholinergiczne np. ipratropium, atropina lub oksytropium; hormony, np. kortyzon, hydrokortyzon lub prednizolon; ksantyny np. aminofilina, teofilinian choliny, teofilinian lizyny lub teofilina; oraz białka i peptydy terapeutyczne, np. insulina lub glukagon. Tam, gdzie to stosowane, będzie oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie, że leki można stosować w postaci soli (np. jako sole metali alkalicznych lub amin lub jako sole addycyjne z kwasami) lub jako estry (np. niższe estry alkilowe) lub jako solwaty (np. hydraty) dla optymalizacji aktywności i/lub stabilności leku. [0193] Inne przykładowe środki terapeutyczne użyteczne w terapii kombinowanej, obejmują, ale nie ograniczają się do nich, środki opisane powyżej, radioterapię, antagonistów hormonów, hormony i ich czynniki uwalniające, leki tarczycowe i przeciwtarczycowe, estrogeny i progestyny, androgeny, hormon adrenokortykotropowy; steroidy kory nadnerczy i ich syntetyczne analogi; inhibitory syntezy i działania hormonów kory nadnerczy, insulinę, doustne środki hipoglikemiczne, i farmakologię czynności endokrynnej trzustki, środki wpływające na zwapnienie i obrót kostny: wapń, fosforany, parathormon, witamina D, kalcytonina, witaminy, takie jak witaminy rozpuszczalne w wodzie, kompleks witaminy B, kwas askorbinowy, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, witaminy A, K i E, czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny,

74 73 agonistów i antagonistów receptora muskarynowego; środki antycholinesterazowe; środki działające na połączenia nerwowo-mięśniowe i/lub zwoje układu autonomicznego; katecholaminy, leki sympatomimetyczne i agonistów lub antagonistów receptora adrenergicznego; i agonistów i antagonistów receptora 5-hydroksytryptaminy (5-HT, serotonina). [0194] Środki lecznicze mogą także obejmować środki do zwalczania bólu i zapalenia, takie jak histamina i antagoniści histaminy, bradykinina i antagoniści bradykininy, 5- hydroksytryptamina (serotonina), substancje lipidowe, które są generowane przez biotransformację produktów selektywnej hydrolizy fosfolipidów błonowych, eikozanoidy, prostaglandyny, tromboksany, leukotrieny, aspiryna, niesteroidowe leki przeciwzapalne, środki przeciwbólowe- przeciwgorączkowe, środki, które hamują syntezę prostaglandyn i tromboksanów, selektywne inhibitory indukowalnej cyklooksygenazy, selektywne inhibitory indukowalnej cyklooksygenazy-2, autakoidy, hormony parakrynne, somatostatyna, gastryna, cytokiny, które pośredniczą w oddziaływaniach zangażowanych w humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną, autakoidy lipidowe, eikozanoidy, agoniści β-adrenergiczni, ipratropium, glikokortykoidy, metyloksantyny, blokery kanału sodowego, agonistów receptorów opioidowych, blokery kanału wapniowego, stabilizatory błon i inhibitory leukotrienów. [0195] Dodatkowe środki terapeutyczne rozważane tutaj obejmują diuretyki, wazopresynę, środki wpływające na zachowanie wody przez nerki, reninę, angiotensynę, środki użyteczne w leczeniu niedokrwienia mięśnia sercowego, środki przeciwnadciśnieniowe, inhibitory konwertazy angiotensyny, antagonistów receptora β- adrenergicznego, środki do leczenia hipercholesterolemii i środki do leczenia dyslipidemii. [0196] Inne rozważane środki terapeutyczne obejmują leki stosowane do kontroli kwasowości żołądka, środki do leczenia wrzodów trawiennych, środki do leczenia choroby refluksowej przełyku, środki prokinetyczne, środki przeciwwymiotne, leki stosowane w zespole jelita wrażliwego, środki stosowane w biegunce, środki stosowane w leczeniu zaparć, środki stosowane w chorobie zapalnej jelita, środki stosowane w chorobie dróg żółciowych, środki stosowane w chorobie trzustki. Środki terapeutyczne stosowane w leczeniu zakażeń pierwotniakami, leki stosowane w leczeniu malarii, amebozy, giardiozy, rzęsistkowicy, trypanosomozy i/lub leiszmaniozy i/lub leki stosowane w chemioterapii robaczycy. Inne środki terapeutyczne obejmują środki przeciwdrobnoustrojowe, sulfonamidy, trimetoprim-sulfametoksazol, chinolony i środki

75 74 do leczenia zakażeń dróg moczowych, penicyliny, cefalosporyny i inne, antybiotyki β- laktamowe, środek zawierający aminoglikozyd, inhibitory syntezy białek, leki stosowane w chemioterapii gruźlicy, chorobie wywołanej przez kompleks mycobacterium avium i trądu, środki przeciwgrzybicze, środki przeciwwirusowe obejmujące środki nieretrowirusowe i środki antyretrowirusowe. [0197] Przykłady przeciwciał terapeutycznych, które mogą być połączone ze związkiem według wynalazku obejmują, ale bez ograniczenia, przeciwciała przeciwko receptorowym kinazom tyrozynowym (cetuksymab, panitumumab, trastuzumab), przeciwciała anty CD20 (rytuksymab, tositumomab) oraz inne przeciwciała, takie jak alemtuzumab, bewacyzumab i gemtuzumab. [0198] Ponadto, środki terapeutyczne stosowane do immunomodulacji, takie jak immunomodulatory, środki immunosupresyjne, tolerogeny i immunostymulanty są przewidywane tutaj w sposobach. Ponadto, środki terapeutyczne działające na krew i narządy krwiotwórcze, środki krwiotwórcze, czynniki wzrostu, minerały i witaminy, antykoagulanty, leki trombolityczne i przeciwpłytkowe. [0199] W leczeniu raka nerek można łączyć związek według niniejszego wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 z Tabeli 1 z sorafenibem i/lub Avastin. Do leczenia zaburzeń śluzówki macicy, można połączyć związek według niniejszego wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 z Tabeli 1, z doksorubicyną, taksotere (taksol) i/lub cisplatyną (karboplatyna). W leczeniu nowotworu jajnika, można połączyć związek według niniejszego wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 z Tabeli 1, z cisplatyną (karboplatyna), taksotere, doksorubicyną, topotekanem i/lub tamoksyfenem. Do leczenia raka piersi, można połączyć związek według niniejszego wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 z Tabeli 1, z taksotere (taksol), gemcytabiną (kapecytabina), tamoksyfenem, letrozolem, Tarceva, lapatynibem, PD , Avastin, herceptyną, OSI- 906 i/lub OSI-930. Do leczenia raka płuc, można połączyć związek według niniejszego wynalazku, w tym, ale bez ograniczenia, związek 1 z Tabeli 1, z taksotere (taksol), gemcytabiną, cisplatyną, pemetreksedem, Tarceva, PD i/lub Avastin. [0200] Inne środki terapeutyczne, które mogą być stosowane w kombinacji ze związkiem według wynalazku można znaleźć w: Goodman, Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", dziesiąta edycja, pod redakcją Hardmana, Limbirda i Gilmana lub Physician's Desk Reference, z których oba są tu włączone przez odniesienie w całości. [0201] Związki opisane tutaj mogą być stosowane w kombinacji z opisanymi tutaj środkami lub innymi odpowiednimi środkami, w zależności od leczonego stanu. Stąd też,

76 75 w niektórych przykładach wykonania jeden lub więcej związków według wynalazku będzie podawany wspólnie z innymi środkami, jak to opisano powyżej. W przypadku zastosowania terapii kombinowanej, związki tutaj opisane mogą być podawane wraz z drugim środkiem jednocześnie lub oddzielnie. Podawanie w kombinacji może obejmować jednoczesne podawanie dwóch środków w tej samej postaci dawkowania, jednoczesne podawanie w oddzielnych postaciach dawkowania, jak również oddzielne podawanie. Oznacza to, że opisany tu związek i dowolne środki opisane powyżej mogą być formułowane razem w tej samej postaci dawkowania i podawane jednocześnie. Alternatywnie, związek według wynalazku i dowolny ze środków opisanych powyżej, można podawać jednocześnie, przy czym oba środki występują w oddzielnych preparatach. W innym alternatywnym wykonaniu, związek według niniejszego wynalazku może być podawany zaraz po dowolnym ze środków opisanych powyżej, lub vice versa. W protokole podawania oddzielnego, związek według wynalazku i dowolny ze środków opisanych powyżej, można podawać w odstępie kilku minut, lub w odstępie kilku godzin, lub w odstępie kilku dni. [0202] Podawanie związku według niniejszego wynalazku można przeprowadzić dowolnym sposobem, który umożliwia dostarczanie związków do miejsca działania. Skuteczna ilość związku według wynalazku może być podawana albo w dawkach pojedynczych albo wielokrotnych dowolnym z przyjętych sposobów podawania środków o podobnym zastosowaniu, w tym drogą doodbytniczą, dopoliczkową, donosową i przezskórną, przez wstrzykiwanie dotętnicze, dożylnie, dootrzewnowo, pozajelitowo, domięśniowo, podskórnie, doustnie, miejscowo, jako środek wziewny lub poprzez impregnowane lub powlekane urządzenie, takie jak na przykład stent lub wprowadzony do tętnicy cylindryczny polimer. [0203] Ilość podawanego związku będzie zależeć od leczonego ssaka, ciężkości zaburzenia lub stanu, szybkości podawania, dyspozycji związku i uznania lekarza przepisującego lek. Jednakże, skuteczna dawka jest w zakresie od około 0,001 do około 100 mg na kg masy ciała na dzień, korzystnie od około 1 do około 35 mg/kg/dzień w dawkach pojedynczych lub podzielonych. Dla człowieka ważącego 70 kg ilość ta wynosiłaby od około 0,05 do 7 g/dzień, korzystnie od około 0,05 do około 2,5 g/dzień. W pewnych przypadkach, poziomy dawkowania poniżej dolnej granicy wspomnianego zakresu mogą być bardziej niż odpowiednie, natomiast w innych przypadkach można stosować jeszcze większe dawki bez powodowania żadnych szkodliwych skutków ubocznych, np. przez dzielenie takich większych dawek na kilka małych dawek do

77 76 podawania przez cały dzień. [0204] W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest podawany w pojedynczej dawce. Typowo, takie podawanie będzie przez wstrzyknięcie, np. wstrzyknięcie dożylne, w celu wprowadzenia środka szybko. Jednakże, inne drogi mogą być stosowane w razie potrzeby. Pojedyncza dawka związku według wynalazku może być również stosowana w leczeniu ostrego stanu. [0205] W niektórych przykładach wykonania, związek według wynalazku jest podawany w dawkach wielokrotnych. Dawkowanie może wynosić około raz, dwa razy, trzy razy, cztery razy, pięć razy, sześć razy lub ponad sześć razy dziennie. Dawkowanie może wystąpić około raz na miesiąc, raz na dwa tygodnie, raz na tydzień lub raz na dwa dni. W innym przykładzie wykonania, związek według wynalazku i inny środek podaje się razem około jednego razu dziennie do około 6 razy dziennie. W innym przykładzie wykonania, podawanie związku według wynalazku i środka trwa mniej niż około 7 dni. W jeszcze innym przykładzie wykonania, podawanie trwa dłużej niż około 6, 10, 14, 28 dni, dwa miesiące, sześć miesięcy lub jeden rok. W niektórych przypadkach ciągłe dawkowanie osiąga się i utrzymuje tak długo, jak jest to konieczne. [0206] Podawanie środków według wynalazku może trwać tak długo, jak jest to konieczne. W niektórych przykładach wykonania, środek według wynalazku podaje się więcej niż 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 lub 28 dni. W niektórych przykładach wykonania, środek według wynalazku podaje się mniej niż 28, 14, 7, 6, 5, 4, 3, 2 lub 1 dzień. W niektórych przykładach wykonania, środek według wynalazku jest podawany przewlekle w sposób ciągły, np. do leczenia objawów przewlekłych. [0207] Gdy związek według wynalazku jest podawany w kompozycji zawierającej jeden lub więcej środków, a środek ma krótszy okres półtrwania niż związek według wynalazku, postacie dawki jednostkowej środka oraz związku według wynalazku mogą być odpowiednio dostosowane. [0208] Przykłady i preparaty dostarczone poniżej dalej ilustrują i stanowią przykład związku według niniejszego wynalazku i sposobów otrzymywania tego i podobnych związków. Należy rozumieć, że zakres niniejszego wynalazku nie jest w żaden sposób ograniczony przez zakres poniższych przykładów i preparatów. W poniższych przykładach cząsteczki z pojedynczym centrum chiralności, o ile nie zaznaczono inaczej, występują jako mieszanina racemiczna. Cząsteczki z dwoma lub większą liczbą centrów chiralności, o ile nie zaznaczono inaczej, występują jako mieszanina racemiczna diastereomerów. Pojedyncze enancjomery/diastereoizomery można otrzymać sposobami

78 77 znanymi specjalistom w dziedzinie. [0209] Poniższe przykłady, które nie są objęte zakresem zastrzeżeń patentowych, są przykładami odniesienia. PRZYKŁADY Przykład 1: Oznaczanie ekspresji i inhibicji p110α / p85α, p110β / p85α, p110δ / p85α i p110γ: [0210] PI3-K klasy I mogą być albo zakupione (p110α / p85α, p110β / p85α, p110δ / p85α z Upstate, a p110γ z Sigmy) lub eksprymowane w sposób opisany uprzednio (Knight i in., 2004). Wartości IC50 mierzy się przy użyciu standardowego oznaczenia TLC aktywności kinazy lipidowej (opisane poniżej) lub oznaczenia przez wychwytywanie membraną o dużej wydajności. Reakcje kinazy przeprowadza się przez wytworzenie mieszaniny reakcyjnej zawierającej kinazę, inhibitor (końcowe stężenie DMSO 2%), bufor (25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgC12) i świeżo sonikowany fosfatydyloinozytol (100 µg / ml). Reakcje inicjuje się przez dodanie ATP zawierającego 10 µci γ-32p-atp do końcowego stężenia 10 lub 100 µm i pozostawienie na 5 minut w temperaturze pokojowej. Do analizy TLC, reakcje następnie kończy się przez dodanie 105 µl 1N HCl, a następnie 160 µl CHCl3:MeOH (1:1). Dwufazową mieszaninę miesza się mieszadłem wibracyjnym, krótko wiruje, a warstwę organiczną przenosi się do nowej probówki przy użyciu końcówki pipety do nakładania na żel wstępnie pokrytej CHCI3. Ekstrakt ten nanosi się na płytki TLC i rozwija w ciągu 3-4 godzin w roztworze 65:35 n-propanol:1 M kwas octowy. Płytki TLC następnie się suszy, wystawia na ekran urządzenia fosfoobrazującego (Storm, Amersham) i ocenia ilościowo. Dla każdego związku, aktywność kinazy mierzy się przy stężeniach inhibitora reprezentujących dwukrotne rozcieńczenia od najwyższego badanego stężenia (typowo 200 µm). W przypadku związków wykazujących znaczącą aktywność, oznaczenia IC50 są powtarzane dwa do czterech razy, a wartość podana jest średnią z tych niezależnych pomiarów. [0211] Inne komercyjne zestawy lub systemy do oznaczania aktywności PI3-K są dostępne. Dostępne w handlu zestawy lub systemy mogą być wykorzystywane w celu badania inhibitorów i/lub agonistów PI3-K, w tym, ale bez ograniczenia, kinaz PI3 α, β, δ i γ. Przykładowym systemem jest test kinazy PI3 (ludzkiej) HTRF (ang. PI3-Kinase (human) Assay) z Upstate. Oznaczanie można prowadzić zgodnie z procedurami

79 78 sugerowanymi przez producenta. W skrócie, oznaczanie to oznaczanie FRET rozdzielcze w czasie, które pośrednio mierzy produkt PIP3 utworzony przez aktywność PI3-K. Reakcję kinazy prowadzi się na płytce do mikromiareczkowania (np. 384 dołkowa płytka do mikromiareczkowania). Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi około 20 μl na dołek. W pierwszym etapie każdy dołek otrzymuje 2 μl badanego związku w 20% dimetylosulfotlenku, co daje 2% końcowe stężenie DMSO. Następnie około 14,5 μl mieszaniny kinaza/pip2 (rozcieńczone w buforze reakcyjnym 1X) dodaje się do każdego dołka do końcowego stężenia 0,25-0,3 μg/ml kinazy i 10 μm PIP2. Płytkę zamyka się szczelnie i inkubuje przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć reakcję, 3,5 μl ATP (rozcieńczonego w buforze reakcyjnym 1X) dodaje się do każdego dołka do końcowego stężenia 10 μm ATP. Płytkę zamyka się szczelnie i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymuje się dodając 5 μl roztworu zatrzymującego do każdego dołka, a następnie dodaje się 5 μl mieszaniny detekcyjnej do każdego dołka. Płytkę zamyka się szczelnie, inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie odczytuje na odpowiednim czytniku płytek. Dane są analizowane i generowane są wartości IC50 przy użyciu GraphPad Prism 5. Przykład 2: Oznaczanie ekspresji i inhibicji Abl [0212] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy Abl może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Na przykład, związki tutaj opisane mogą być oznaczane potrójnie wobec rekombinowanej Abl pełnej długości lub Abl (T3151) (Upstate) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgC12, 200 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 0,5 mg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy Abl EAIYAAPFAKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 3: Oznaczanie ekspresji i inhibicji Hck [0213] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy Hck może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w

80 79 dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być oznaczane potrójnie wobec rekombinowanej Hck pełnej długości w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 200 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 0,5 mg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy kinazy rodziny Src EIYGEFKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 4: Oznaczanie ekspresji i inhibicji receptora insuliny (IR) [0214] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy receptora IR może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być oznaczane potrójnie wobec rekombinowanej domeny kinazy receptora insulinowego (Upstate) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgC12, 10 mm MnC12, 200 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 0,5 mg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje kończy się przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 5: Oznaczanie ekspresji i inhibicji Src [0215] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy Src może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być oznaczane potrójnie wobec rekombinowanej Src pełnej długości lub Src (T338I) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgC12, 200 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 0,5 mg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy kinazy rodziny Src EIYGEFKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie.

81 80 Przykład 6: Oznaczanie ekspresji i inhibicji DNA-PK (DNAK) [0216] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy DNAK może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie. DNA-PK można zakupić z Promega i oznaczyć przy użyciu układu testowego DNA-PK (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Przykład 7: Oznaczanie ekspresji i inhibicji mtor [0217] Zdolność jednego lub więcej związków według wynalazku do inhibicji aktywności mtor może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej mtor (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 50 mm HEPES, ph 7,5, 1 mm EGTA, 10 mm MgCl2, 2,5 mm, 0,01% Tween, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Szczurzy rekombinowany PHAS-1/4EBP1 (Calbiochem; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje kończy się przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. [0218] Inne zestawy lub systemy do oznaczania aktywności mtor są komercyjnie dostępne. Na przykład, można zastosować oznaczanie kinaz Invitrogenu LanthaScreen w celu zbadania inhibitorów mtor tutaj ujawnionych. Oznaczanie to jest platformą FRET rozdzielczą w czasie, która mierzy fosforylację GFP oznaczonego 4EBP1 przez kinazę mtor. Reakcję kinazy prowadzi się na białej 384-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20 µl na dołek, a skład buforu reakcyjnego to 50 mm HEPES ph 7,5, 0,01% Polisorbat 20, 1 mm EGTA, 10 mm MnCl2 i 2 mm DTT. W pierwszym etapie, każdy dołek otrzymuje 2 μl badanego związku w 20% dimetylosulfotlenku, co daje 2% końcowe stężenie DMSO. Następnie 8 µl mtor rozcieńczonego w buforze reakcyjnym dodaje się do każdego dołka do końcowego stężenia 60 ng/ml. Aby rozpocząć reakcję, 10 µl mieszaniny ATP/GFP 4EBP1 (rozcieńczonej w buforze reakcyjnym) dodaje się do każdego dołka do końcowego stężenia 10 µm ATP i 0,5 µm GFP-4EBP1. Płytkę zamyka się szczelnie i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie do każdego dołka 10 µl mieszaniny przeciwciało Tb-anty-pT46 4EBP1/EDTA (rozcieńczonej w

82 81 buforze TR-FRET) do końcowego stężenia przeciwciała 1,3 nm i EDTA 6,7 mm. Płytkę zamyka się szczelnie, inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie odczytuje na czytniku płytek ustawionym do LanthaScreen TR-FRET. Dane są analizowane i generowane są wartości IC50 przy użyciu GraphPad Prism 5. Przykład 8: Oznaczanie ekspresji i inhibicji receptora wzrostu śródbłonka naczyniowego [0219] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec receptora VEGF może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być badane wobec rekombinowanej domeny kinazy receptora KDR (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 0,1% BME, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje zakończono przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 9: Oznaczanie ekspresji i inhibicji receptora efryny B4 (EphB4) [0220] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec EphB4 może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy receptora efryny B4 (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 0,1% BME, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje zakończono przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 10: Oznaczanie ekspresji i inhibicji receptora czynnika wzrostu naskórka (EGFR) [0221] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku

83 82 wobec kinazy EGFR może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy receptora EGF (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 0,1% BME, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje kończy się przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 11: Oznaczanie ekspresji i inhibicji oznaczenia KIT [0222] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy KIT może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy KIT (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 1mM DTT, 10 mm MnCl2, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje kończy się przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 12: Oznaczanie ekspresji i inhibicji RET [0223] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy RET może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy RET (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 2,5 mm DTT, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy Abl EAIYAAPFAKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie.

84 83 Przykład 13: Oznaczanie ekspresji i inhibicji receptora płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFR) [0224] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy PDGFR może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy receptora PDG (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 2,5 mm DTT, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy Abl EAIYAAPFAKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 14: Oznaczanie ekspresji i inhibicji tyrozynowej kinazy 3 podobnej do FMS (FLT-3) [0225] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy FLT-3 może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy FLT-3 (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 2,5 mm DTT, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Zoptymalizowany substrat peptydowy Abl EAIYAAPFAKKK jest stosowany jako fosfoakceptor (200 μm). Reakcje kończy się przez nakrapianie na arkusze fosfocelulozowe, które przemywa się 0,5% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 15: Oznaczanie ekspresji i inhibicji kinazy tyrozynowej receptora TEK (TIE2) [0226] Aktywność krzyżowa lub jej brak jednego lub więcej związków według wynalazku wobec kinazy TIE2 może być mierzona zgodnie z dowolnymi procedurami znanymi w dziedzinie albo sposobami ujawnionymi poniżej. Związki tutaj opisane mogą być

85 84 testowane wobec rekombinowanej domeny kinazy TIE2 (Invitrogen) w oznaczeniu zawierającym 25 mm HEPES, ph 7,4, 10 mm MgCl2, 2 mm DTT, 10 mm MnCl2, 10 μm ATP (2,5 μci γ-32p-atp) i 3 µg/ml BSA. Poly E-Y (Sigma; 2 mg/ml) jest stosowany jako substrat. Reakcje kończy się przez nakrapianie na nitrocelulozę, którą przemywa się 1M NaCl/1% kwasem fosforowym (około 6 razy, 5-10 minut każdy). Arkusze suszy się, a przeniesiona radioaktywność jest określana ilościowo przez fosfoobrazowanie. Przykład 16: Oznaczanie aktywacji i proliferacji komórek B [0227] Zdolność jednego lub więcej związków według wynalazku do inhibicji aktywności i proliferacji komórek B może być mierzona zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie. Na przykład, znane jest oznaczanie proliferacji komórkowej in vitro, które mierzy aktywność metaboliczną żywych komórek. Oznaczanie przeprowadza się na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania stosując redukcję Alamar Blue. Śledzionowe komórki B Balb/c oczyszcza się na gradiencie Ficoll-Paque PLUS, a następnie poddaje magnetycznemu rozdzielaniu komórek przy użyciu zestawu do izolowania komórek B MACS (ang. B cell Isolation Kit) (Miletenyi). Komórki wysiewa się w 90 µl przy komórek/dołek w pożywce dla komórek B (ang. B Cell Media) (RPMI + 10% FBS + Penn/Strep + 50 µm bme + 5 mm HEPES). Związek tutaj ujawniony jest rozcieńczany w pożywce dla komórek B i dodawany w objętości 10 µl. Płytki inkubuje się przez 30 minut w 37 C i 5% CO 2, (końcowe stężenie DMSO 0,2%). Dodaje się następnie 50 µl koktajlu stymulującego komórki B zawierającego albo 10 µg/ml LPS albo 5 µg/ml oślego antymysiego IgM F(ab')2 oraz 2 ng/ml rekombinowanego mysiego IL4 w pożywce dla komórek B. Płytki inkubuje się przez 72 godziny w 37 C i 5% CO 2. Objętość 15 µl reagenta Alamar Blue dodaje się do każdego dołka i płytki inkubuje się przez 5 godzin w 37 C i 5% CO 2. Fluorescencje Alamar Blue odczytuje się przy 560 Wzb./590 Em., a wartości IC50 i EC50 oblicza się stosując oprogramowanie GraphPad Prism 5. Przykład 17: Oznaczanie proliferacji linii komórek nowotworowych [0228] Zdolność jednego lub więcej związków według wynalazku do inhibicji proliferacji linii komórek nowotworowych może być mierzona zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie. Na przykład, oznaczanie proliferacji komórkowej in

86 85 vitro może być przeprowadzane w celu pomiaru aktywności metabolicznej żywych komórek. Oznaczanie przeprowadza się na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania stosując redukcję Alamar Blue. Ludzkie nowotworowe linie komórkowe uzyskano z ATCC (np. MCF7, U-87 MG, MDA-MB-468, PC-3 i dowolne inne linie komórkowe wymienione na Figurze 1A-B), hodowano do konfluencji w kolbach T75, trypsynizowano 0,25% trypsyną, przemyto jeden raz pożywką dla komórek nowotworowych (ang. Tumor Cell Media) (DMEM + 10% FBS) i wysiano w 90 µl przy 5000 komórek/dołek w pożywce dla komórek nowotworowych. Związek tutaj ujawniony jest rozcieńczany w pożywce dla komórek nowotworowych i dodawany w objętości 10 µl. Płytki inkubuje się przez 72 godziny w 37C i 5% CO 2. Objętość 10 µl reagenta Alamar Blue dodaje się do każdego dołka i płytki inkubuje się przez 3 godziny w 37C i 5% CO 2. Fluorescencję Alamar Blue odczytuje się przy 560Wzb./590 Em., a wartości IC50 oblicza się stosując oprogramowanie GraphPad Prism 5. Wyniki przedstawione na Figurze 1A, Figurze 1B i Figurze 7A wskazują, że związek według niniejszego wynalazku skutecznie hamuje proliferację wielu komórek nowotworowych. W pewnych przypadkach, związek według wynalazku daje 50% inhibicję proliferacji komórek przy stężeniu, które jest jeden lub dwa rzędy wielkości mniejsze niż w przypadku konwencjonalnych leków przeciwnowotworowych, przy badaniu w tych samych warunkach. Przykład 18: Aktywność przeciwnowotworowa in vivo [0229] Związki tutaj opisane mogą być oceniane w panelu ludzkich i mysich modeli nowotworów. Modele nowotworu opornego na paklitaksel 1. Model nowotworu jajnika pochodzenia klinicznego [0230] Ten model nowotworu jest tworzony z biopsji nowotworu pacjenta z nowotworem jajnika. Biopsja nowotworu jest brana od pacjenta. [0231] Związki tutaj opisane są podawane nagim myszom z wywołanymi nowotworami z wykorzystaniem schematu co 2 dni x 5.

87 86 2. Ksenoprzeszczep ludzkiego nowotworu jajnika A2780Tax (zmutowana tubulina). [0232] A2780Tax to oporny na paklitaksel ludzki model nowotworu jajnika. Uzyskuje się go z wrażliwej linii macierzystej A2780 przez jednoczesną inkubację komórek z paklitakselem i werapamilem, środkiem cofającym MDR. Wykazano, że jego mechanizm oporności nie jest związany z MDR i przypisuje się go mutacji w genie kodującym białko beta-tubuliny. [0233] Związki tutaj opisane mogą być podawane nagim myszom z wywołanymi nowotworami z wykorzystaniem schematu co 2 dni x Ksenoprzeszczep ludzkie nowotworu okrężnicy HCT116 / VM46 (oporny na wiele leków). [0234] HCT116/VM46 to nowotwór okrężnicy z opornością MDR opracowany z wrażliwej linii macierzystej HCT116. In vivo, hodowany w nagich myszach, HCT116/VM46 konsekwentnie wykazał wysoką odporność na paklitaksel. [0235] Związki tutaj opisane mogą być podawane nagim myszom z wywołanymi nowotworami z wykorzystaniem schematu co 2 dni x Mysi model mięsaka M5076 [0236] M5076 to włókniakomięsak mysi, który jest z natury oporny na paklitaksel in vivo. [0237] Związki tutaj opisane mogą być podawane nagim myszom z wywołanymi nowotworami z wykorzystaniem schematu co 2 dni x 5. [0238] Jeden lub więcej związków według wynalazku może być stosowanych w kombinacji z innymi środkami terapeutycznymi in vivo w ksenoprzeszczepach ludzkiego opornego na wiele leków raka okrężnicy HCT / VM46 lub dowolnym innym modelu znanym w dziedzinie, włączając tutaj opisane. [0239] Oczekuje się, że jeden lub więcej związków według niniejszego wynalazku jest silnymi inhibitorami wzrostu nowotworów in vivo w badanych warunkach. Przykład 19: Oznaczenie stabilności mikrosomalnej [0240] Stabilność jednego lub więcej związków według wynalazku jest określana zgodnie

88 87 ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie. Na przykład, stabilność jednego lub więcej związków według wynalazku ustala się przez oznaczenie in vitro. W szczególności znane jest oznaczenie in vitro stabilności mikrosomalnej, które mierzy stabilność jednego lub więcej związków według wynalazku w reakcji z mikrosomami z wątroby myszy, szczura lub człowieka. Reakcję mikrosomową ze związkami przeprowadza się w 1,5 ml probówce Eppendorfa. Każda probówka zawiera 0,1 µl 10,0 mg/ml NADPH; 75 µl 20,0 mg/ml mikrosomów wątroby myszy, szczura lub człowieka; 0,4 µl 0,2 M buforu fosforanowego i 425 µl ddh 2 O. Probówka kontroli negatywnej (bez NADPH) zawiera 75 µl 20,0 mg/ml mikrosomów wątroby myszy, szczura lub człowieka; 0,4 µl 0,2 M buforu fosforanowego i 525 µl ddh 2 O. Reakcję rozpoczyna się dodając 1,0 µl 10,0 mm badanego związku. Probówki reakcyjne inkubuje się w 37 C. 100 µl próbka zbierana jest do nowej probówki Eppendorfa zawierającej 300 µl zimnego metanolu w 0, 5, 10, 15, 30 i 60 minucie reakcji. Próbki odwirowuje się przy obrotach na minutę w celu usunięcia białka. Supernatant odwirowanej próbki przenosi się do nowej probówki. Stężenie stabilnego związku po reakcji z mikrosomem w supernatancie mierzy się przy użyciu chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC-MS). Stabilność mikrosomalna jednego lub więcej związków według niniejszego wynalazku, gdy jest oznaczana w tych warunkach, ma T1/2 (min) w zakresie wymaganym dla badań klinicznych. Przykład 20: Oznaczanie stabilności w osoczu [0241] Stabilność jednego lub więcej związków według wynalazku w osoczu jest określana zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie. Patrz np. Rapid Comunn. Mass Spectrom., 10: Następująca procedura jest oznaczaniem HPLC- MS/MS przy użyciu ludzkiego osocza; inne gatunki w tym małpa, pies, szczur i mysz są również dostępne. Zamrożone heparynizowane ludzkie osocze rozmraża się w łaźni z zimną wodą i wiruje przez 10 minut przy 2000 obrotów na minutę w 4 C przed użyciem. Związek według wynalazku jest dodawany z 400 µm roztworu podstawowego do porcji wstępnie ogrzanego osocza z otrzymaniem końcowej objętości testowej równej 400 µl (lub 800 µl do określenia czasu półtrwania), zawierającej 5 µm badanego związku i 0,5% DMSO. Mieszaniny reakcyjne inkubuje się, wytrząsając, przez 0 minut do 60 minut w 37 C, albo przez 0, 15, 30, 45 i 60 minut w 37 C do określenia czasu półtrwania. Reakcje zatrzymuje się przez przeniesienie 50 µl mieszaniny inkubacyjnej do 200 µl lodowatego

89 88 acetonitrylu i miesza się je przez wytrząsanie przez 5 minut. Próbki odwirowuje się przy 6000 x g przez 15 minut w 4 C i 120 µl supernatantu usuwa się do czystych probówek. Próbki następnie odparowuje się do sucha i poddaje analizie za pomocą HPLC-MS / MS. [0242] W razie potrzeby, jedną lub więcej kontroli i związków odniesienia (5 µm) testuje się równocześnie z badanymi związkami: jeden związek, propoksykainę, o małej stabilności w osoczu i inny związek, propantelinę, o pośredniej stabilności w osoczu. [0243] Próbki roztwarza się w mieszaninie acetonitryl/metanol/woda (1/1/2, obj./obj./obj.) i analizuje za pomocą (RP)HPLC-MS/MS za pomocą selektywnego monitorowania reakcji (SRM).Na warunki HPLC składa się pompa binarna LC z urządzeniem do automatycznego pobierania próbek, tryb mieszany, kolumna C12 2x20 mm oraz program gradientowy. Pola powierzchni pików odpowiadających analitom są rejestrowane za pomocą HPLC-MS / MS. Stosunek związku macierzystego pozostającego po 60 minutach w stosunku do ilości pozostającej w czasie zero, wyrażony jako procent, jest rejestrowany jako stabilność chemiczna. W przypadku określenia okresu półtrwania, okres półtrwania jest określony na podstawie nachylenia początkowego liniowego zakresu krzywej logarytmicznej pozostającego związku (%) w funkcji czasu, przy założeniu kinetyki pierwszego rzędu. Przykład 21: Stabilność chemiczna [0244] Stabilność chemiczna jednego lub więcej związków według wynalazku jest określana zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie. Następujące dane opisują przykładową procedurę ustalenia stabilności chemicznej przedmiotowego związku. Domyślny bufor stosowany do oznaczenia stabilności chemicznej to buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) o ph 7,4; inne odpowiednie bufory mogą być stosowane. Związek według wynalazku jest dodawany z 100 µm roztworu podstawowego do porcji PBS (podwójnie) z otrzymaniem końcowej objętości testowej równej 400 µl, zawierającej 5 µm badanego związku i 1% DMSO (do określenia czasu półtrwania sporządzana jest całkowita objętość próbki 700 µl). Mieszaniny reakcyjne inkubuje się, wytrząsając, przez 0 minut do 24 godzin w 37 C; do określenia czasu półtrwania próbki są inkubowane przez 0, 2, 4, 6 i 24 godziny. Reakcje zatrzymuje się przez dodanie natychmiast 100 µl mieszaniny inkubacyjnej do 100 µl acetonitrylu i wirowanie przez 5 minut. Następnie próbki przechowuje się w -20 C aż do analizy metodą HPLC-MS/MS. W przypadku, gdy jest to pożądane, związek kontrolny lub

90 89 związek odniesienia, taki jak chlorambucyl (5 µm) jest testowany równolegle z badanym związkiem według wynalazku, ponieważ związek ten jest w dużej mierze hydrolizowany w ciągu 24 godzin. Próbki analizuje się za pomocą (RP)HPLC-MS/MS za pomocą selektywnego monitorowania reakcji (SRM). Na warunki HPLC składa się pompa binarna LC z urządzeniem do automatycznego pobierania próbek, tryb mieszany, kolumna C12 2x20 mm oraz program gradientowym. Pola powierzchni pików odpowiadających analitom są rejestrowane za pomocą HPLC-MS/MS. Stosunek związku macierzystego pozostającego po 24 godzinach w stosunku do ilości pozostającej w czasie zero, wyrażony jako procent, jest rejestrowany jako stabilność chemiczna. W przypadku określania okresu półtrwania, okres półtrwania jest określany na podstawie nachylenia początkowego liniowego zakresu krzywej logarytmicznej pozostającego związku (%) w funkcji czasu, przy założeniu kinetyki pierwszego rzędu. Przykład 22: Oznaczanie kinazy Akt [0245] Komórki zawierające składniki szlaku Akt/mTOR, włączając, ale bez ograniczenia, mioblasty L6, komórki B-ALL, komorki B, komórki T, komórki białaczkowe, komórki szpiku kostnego, komórki transdukowane p190, komórki pozytywne pod względem chromosomów philladelphia (ph+) i mysie embrionalne fibroblasty są zwykle hodowane w pożywce do hodowli komórek, takiej jak pożywka DMEM suplementowana bydlęcą surowicą płodową i / lub antybiotykami, i hodowane do konfluencji. [0246] W celu porównania wpływu jednego lub więcej związków tutaj ujawnionych na aktywację Akt, wybrane komórki pozbawia się surowicy przez noc i inkubuje z jednym lub więcej związków tu ujawnionych lub 0,1% DMSO przez około 1 minutę do około 1 godziny przed stymulacją insuliną (np. 100 nm) na około 1 minutę do około 1 godziny. Komórki poddaje się lizie przez zdrapywanie do lodowatego buforu do lizy zawierającego detergenty takie jak dodecylosiarczan sodu oraz inhibitory proteazy (np. PMSF). Po skontaktowaniu komórek z buforem do lizy, roztwór poddaje się krótko działaniu ultradźwięków, klaruje przez wirowanie, rozdziela za pomocą SDS-PAGE, przenosi na nitrocelulozę lub PVDF i bada za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciał na fosfo-akt S473, fosfo-akt T308, Akt oraz β-aktynę (Cell Signaling Technologies). [0247] Wyniki pokazują, że jeden lub więcej związków według wynalazku inhibituje stymulowaną insuliną fosforylację AKT na S473. Alternatywnie, pewne związki według wynalazku inhibitują ponadto stymulowaną insuliną fosforylację Akt na T308. Klasa

91 90 związków, które mogą inhibitować sygnalizację Akt skuteczniej niż rapamycyna, jak pokazano tutaj, obejmuje te (np. związki przedstawione w Tabeli 1), które inhibitują mtorc2 i mtorc1. Przykład 23: Sygnalizacja kinaz we krwi [0248] Sygnalizacja PI3K/Akt/mTOR jest mierzona w komórkach krwi, z wykorzystaniem metody Phosflow (Methods Enzymol.2007; 434:131-54). Zaletą tego sposobu jest to, że z natury jest to oznaczanie pojedynczej komórki, tak że można raczej wykryć różnorodność komórek niż średnie populacji. Pozwala to na jednoczesne rozróżnienie stanów sygnalizacji w różnych populacjach zdefiniowanych przez inne markery. Phosflow jest również bardzo ilościowa. Aby zbadać działanie jednego lub więcej związków według wynalazku, niefrakcjonowane splenocyty lub jednojądrzaste komórki krwi obwodowej stymulowane są anty-cd3 w celu zainicjowania sygnalizacji receptora komórek T. Komórki następnie utrwala się i wybarwia pod kątem markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych fosfoprotein. Oczekuje się, że inhibitory tutaj ujawnione inhibitują fosforylację Akt-S473 i S6 w której pośredniczy anty-cd3, podczas gdy rapamycyna inhibituje fosforylację S6 i zwiększa fosforylację Akt w testowanych warunkach. [0249] Podobnie, porcje pełnej krwi inkubuje się przez 15 minut z nośnikiem (np. 0,1% DMSO), albo inhibitorami kinazy w różnych stężeniach, przed dodaniem środków stymulujących do sieciowania receptora komórek T (TCR) (anty-cd3 z drugorzędowym przeciwciałem) lub receptora komórek B (BCR) przy użyciu przeciwciała anty-łańcuchy lekkie kappa (fragmenty Fab'2). Po około 5 do 15 minut, próbki są utrwalane (na przykład zimnym 4% paraformaldehydem) i używane do Phosflow. Barwienie powierzchniowe jest stosowane w celu rozróżnienia komórek T i B, za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchni komórek, które są znane w stanie techniki. Poziom fosforylacji substratów kinazy, takich jak Akt i S6, jest następnie mierzony przez inkubację utrwalonych komórek z oznaczonymi przeciwciałami specyficznymi względem fosforylowanych izoform tych białek. Populacja komórek jest następnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. Oczekuje się, że wyniki wskażą, że jeden lub więcej związków według wynalazku może selektywnie inhibować sygnalizację jednego lub więcej członków PI3K, mtor i Akt w komórkach krwi w testowanych warunkach.

92 91 Przykład 24: Oznaczanie tworzenia kolonii [0250] Mysie komórki szpiku kostnego świeżo transformowane retrowirusem p190 BCR- Abl (tutaj określane jako komórki transdukowane p190) wysiewa się w obecności kombinacji różnych leków w pożywce z metylocelulozy M3630 na około 7 dni z rekombinowaną ludzką IL-7 w około 30% surowicy i liczbę utworzonych kolonii zlicza się za pomocą oględzin wizualnych pod mikroskopem. Oczekuje się, że związki według wynalazku nasilą skuteczność stężenia dającego połowę maksymalnej odpowiedzi znanych środków chemioterapeutycznych, takich jak, ale bez ograniczeń, imatynib, rapamycyna i dazatynib w badanych stężeniach. [0251] Alternatywnie, ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej otrzymuje się z podmiotów dodatnich (Ph+) i ujemnych (Ph-) pod względem chromosomu Philladelphia w czasie wstępnej diagnozy lub nawrotu. Żywe komórki są izolowane i wzbogacane w komórki progenitorowe CD19+ CD34+ B. Po całonocnej hodowli ciekłej, komórki wysiewa się w pożywce Methocult GF+ H4435, Stem Cell Tehcnologies), suplementowanej cytokinami (IL-3, IL-6, IL-7, G-CSF, GM-CSF, CF, ligandem Flt3 i erytropoetyną) i różnymi stężeniami znanych środków chemioterapeutycznych w kombinacji ze związkami według wynalazku. Kolonie zlicza się za pomocą mikroskopu dni później. Ta metoda może być stosowana do badania addytywnej lub synergicznej aktywności różnych terapii kombinowanych wykorzystujących przedmiotową kompozycję. Oczekuje się, że jeden lub więcej związków według niniejszego wynalazku jest silnymi i selektywnymi inhibitorami tworzenia kolonii komórek transdukowanych p190 w badanych warunkach. Przykład 25: Wpływ in vivo inhibitorów kinazy na komórki białaczkowe [0252] Samice myszy biorców są śmiertelnie napromieniowywane ze źródła γ w dwóch dawkach około 4 h od siebie, około 5Gy każda. Około 1 godzinę po podaniu drugiej dawki promieniowania, myszom wstrzykuje się dożylnie około 1x10 6 komórek białaczkowych (np. ludzkich lub mysich komórek Ph+ lub komórek szpiku kostnego transdukowanych p190). Komórki te są podawane wraz z radioprotekcyjną dawką około 5x10 6 normalnych komórek szpiku kostnego od 3-5 tygodniowych myszy dawców. Biorcom podaje się antybiotyki w wodzie i monitoruje codziennie. Myszy, które stają się chore po około 14 dniach, uśmierca się i narządy limfoidalne zbiera się do analizy.

93 92 Leczenie inhibitorem kinazy zaczyna się około 10 dni po wstrzyknięciu komórek białaczkowych i trwa codziennie aż myszy zachorują lub maksymalnie około 35 dni po przeszczepie. Inhibitory są podawane przez płukanie jamy ustnej. [0253] Obwodowe komórki krwi pobiera się w przybliżeniu w dniu 10 (przed leczeiem) i po uśmierceniu (po leczeniu), kontaktuje się ze znakowanymi przeciwciałami anty-hcd4 i zlicza za pomocą cytometrii przepływowej. Sposób ten może być użyty do wykazania, że synergiczne działanie jednego lub więcej związków według wynalazku samodzielnie lub w kombinacji ze znanymi środkami chemioterapeutycznymi znacznie zmniejsza liczbę białaczkowych komórek krwi, w porównaniu z leczeniem samymi znanymi środkami chemioterapeutycznymi (np. Gleevec'iem) w testowanych warunkach. Przykład 26: Inhibicja proliferacji komórek nowotworowych z niedoborem aktywności PTEN ale eksprymujących kinazy PI3 [0254] Zdolność jednego lub więcej związków według wynalazku do inhibitowania proliferacji komórek nowotworowych z niedoborem aktywności PTEN, ale eksprymujących kinazy PI3 jest badana zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 17. Jak to przedstawiono na Figurze 7A, związek według niniejszego wynalazku (np. związek z Tabeli 1) daje 50% inhibicję proliferacji komórek PC-3 w stężeniu, które jest co najmniej o dwa rzędy wielkości mniejsze w porównaniu z rapamycyną. [0255] Analiza Western blot wykazała, że związek według wynalazku jest zdolny do inhibitowania fosforylacji AKT (S473) i Akt (T308), jak również innych dalszych celów szlaku sygnałowego mtor w stopniu większym niż rapamycyna. Patrz Figura 7b. W szczególności, komórki PC-3 wysiano przy około 1x10 5 komórek/dołek na 24-dołkowych płytkach w pożywce hodowlanej zawierającej 10% FBS. Komórki pozostawiono do wzrostu do około 80% konfluencji. Komórki traktowano przez 2 godziny w 37 C w inkubatorze CO 2 ze świeżą pożywką do hodowli komórkowych (10% FBS), ze związkiem według niniejszego wynalazku lub rapamycyną we wskazanych stężeniach. Po inkubacji komórki poddano lizie przez dodanie 1X buforu do lizy komórek (200 µl na dołek 24- dołkowej płytki konfluentnych komórek). Białka rozdzielano za pomocą SDS-PAGE na 4-20% żelu gradientowym i zastosowano standardowe techniki blottingu półsuchego do przeniesienia białka na błony nitrocelulozowe. p-akt (473), p-s6k i p-4ebp1 wykryto stosując królicze pierwotne przeciwciało anty-ludzkie (Celi Signaling, Danvers, MA), a następnie wtórne sprzężone z HRP przeciwciało anty-królicze (Celi Signaling, Danvers

94 93 MA). Substrat LumiGLO (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) jest wykorzystywany do wykrywania fosfoprotein na Western blot. Przykład 27: Leczenie mysiego modelu choroby tocznia [0256] U myszy pozbawionych receptora inhibitującego FcγRIIb, który przeciwdziała sygnalizacji PI3K w komórkach B, rozwija się toczeń z wysoką penetracją. Myszy pozbawione FcγRIIb (R2KO, Jackson Labs) są uważane za uzasadniony model ludzkiej choroby, ponieważ niektóre podmioty z toczniem wykazują zmniejszoną ekspresję lub funkcję FcyRIIb (S. Bolland i J.V. Ravtech 2000.Immunity 12: ). [0257] U myszy R2KO rozwija się choroba podobna do tocznia z przeciwciałami przeciwjądrowymi, kłębuszkowe zapalenie nerek i proteinuria w ciągu około 4-6 miesiąca życia. Dla tych eksperymentów, analog rapamycyny RAD001 (dostępny z LC Laboratories) stosuje się jako związek odniesienia i podaje doustnie. Pokazano, że związek ten łagodzi objawy tocznia w modelu B6. Sle1z.Sle3z ( T. Wu i in..j. Clin Invest. 117: ). [0258] Mysie modele choroby tocznia, takie jak R2KO, BXSB lub MLR/lpr leczy się w wieku około 2 miesięcy, w przybliżeniu przez około dwa miesiące. Myszom podaje się dawki: nośnika, około 10 mg/kg RAD001 lub związków tutaj ujawnionych w dawce w przybliżeniu 10 mg/kg do około 50 mg/kg. Próbki krwi i moczu uzyskuje się w przybliżeniu przez cały okres badania i bada się je pod kątem przeciwciał przeciwjądrowych (w rozcieńczeniu surowicy) i stężenia białka (w moczu). Surowica jest również badana w kierunku przeciwciał anty-ssdna i anty-dsdna metodą ELISA. Zwierzęta są uśmiercane w 60 dniu i tkanki zbiera się do pomiaru masy śledziony i choroby nerek. Kłębuszkowe zapalenie nerek ocenia się w sekcjach nerek barwionych za pomocą H & E. Pozostałe zwierzęta bada się przez około dwa miesiące po przerwaniu leczenia przy użyciu tych samych punktów końcowych. [0259] Model ten znany w dziedzinie można wykorzystać w celu zbadania, czy inhibitory kinazy tutaj ujawnione mogą tłumić lub opóźnić wystąpienie objawów tocznia w mysiym modelu choroby tocznia. Przykład 28: Oznaczanie mysiego przeszczepu szpiku kostnego [0260] Samice myszy biorcy są śmiertelnie napromieniowywane ze źródła

95 94 promieniowania γ. Około 1 godzinę po dawce promieniowania, myszom wstrzykuje się około 1x10 6 komórek białaczkowych z transdukowanej hodowli p190 z wczesnego pasażu (np. jak opisano w Cancer Genet Cytogenet Sierpień; 161 (1): 51-6). Komórki te są podawane wraz z radioprotekcyjną dawką około 5x10 6 normalnych komórek szpiku kostnego od 3-5 tygodniowych myszy dawców. Biorcom podaje się antybiotyki w wodzie i monitoruje codziennie. Myszy, które zachorują po około 14 dniach uśmierca się i narządy limfoidalne zbiera się do cytometrii przepływowej i/lub wzbogacenia magnetycznego. Leczenie rozpoczyna się około 10 dnia i trwa codziennie, aż myszy zachorują lub do maksymalnie około 35 dni po transplantacji. Leki podaje się przez wgłębnik doustny (p.o.). W pilotażowym eksperymencie identyfikuje się dawkę chemioterapeutyku, która nie jest lecznicza, ale opóźnia wystąpienie białaczki o około jeden tydzień lub mniej; kontrole są traktowane nośnikiem lub traktowane środkiem chemioterapeutycznym, co do którego wykazano wcześniej, że opóźnia, lecz nie leczy leukemogenezy w tym modelu (np. imatynib w dawce około 70 mg/kg dwa razy dziennie). Dla pierwszego etapu, używane są komórki P 190, które eksprymują egfp, a analiza pośmiertna jest ograniczona do zliczenia odsetka komórek białaczkowych w szpiku kostnym, śledzionie i węzłach chłonnych (LN) za pomocą cytometrii przepływowej. W drugim etapie, używane są komórki p190, które eksprymują postać bezogonowa ludzkiego CD4, a analiza pośmiertna obejmuje magnetyczne sortowanie komórek hcd4+ ze śledziony, a następnie analizę immunoblot kluczowych punktów końcowych sygnalizacji: p Akt-T308 i S473; ps6 i p4ebp-1. Jako kontrole do detekcji immunoblot, posortowane komórki inkubuje się w obecności lub nieobecności inhibitorów kinazy spośród inhibitorów niniejszego ujawnienia przed lizą. Ewentualnie, "phosflow" jest stosowany do detekcji p Akt - S473 i ps6-s235/s236 w komórkach bramkowanych hcd4 bez uprzedniego sortowania. Te badania nad sygnalizacją są szczególnie przydatne, gdy na przykład, u myszy leczonych lekiem nie rozwinęła się białaczka kliniczna w punkcie czasowym 35 dni. Krzywe Kaplana-Meiera przeżycia są generowane i analizowane statystycznie zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie. Wyniki z komórek P 190 są analizowane oddzielnie jak również kumulacyjnie. [0261] Próbki krwi obwodowej ( μl) uzyskuje się od wszystkich myszy co tydzień, począwszy od dnia 10 bezpośrednio przed rozpoczęciem leczenia. Osocze stosuje się do pomiaru stężeń leku, a komórki analizuje się pod kątem markerów białaczki (egfp lub hcd4) i biomarkerów sygnalizacji, jak tu opisano. Oczekuje się, że wyniki analizy wykażą skuteczne dawki terapeutyczne związków tutaj ujawnianych do inhibicji

96 95 proliferacji komórek białaczkowych. Ponadto oczekuje się, że terapia kombinowana inhibitorów tutaj ujawnionych z innymi środkami chemioterapeutycznymi, w tym, ale bez ograniczenia, związkami tutaj ujawnianymi (np. Gleevec i dazatynib) wykaże wyższy stopień skuteczności lub zmniejszenie toksyczności w porównaniu z zastosowaniem pojedynczego środka chemioterapeutycznego. Przykład 29: Oznaczanie farmakokinetyczne u gryzoni [0262] W celu zbadania farmakokinetyki związków według wynalazku grupę tygodniowych myszy dzieli się zgodnie z następującą tabelą: Nr grupy Myszy/grupa Podawanie związku od dnia 1 do dnia 7 (mg/kg) Droga Schemat Po BID przez 7 dni [0263] Alternatywnie, związki podaje się intensywnie (na przykład raz) i po pewnym czasie (na przykład około 0, 30 s, 1 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h, 8 h, 10 h, 12 h, 1 d, 2 d, itd.) pobiera się krew i analizuje jak opisano poniżej. [0264] Związki według wynalazku rozpuszcza się w odpowiednim nośniku (np. 5% 1- metylo-2-pirolidynon, 85% glikol polietylenowy 400, 10% Solutor) i podaje doustnie codziennie co 12 godzin. Wszystkie zwierzęta uśmierca się w CO 2, 2 godziny po ostatnim podaniu związku. Krew zbiera się natychmiast i przechowuje na lodzie w celu izolacji osocza. Osocze izoluje się przez odwirowanie przy 5000 obrotach na minutę przez 10 minut. Zebrane osocze jest zamrażane do detekcji farmakokinetycznej. [0265] Oczekuje się, że wyniki przedstawią parametry farmakokinetyczne, takie jak absorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie i toksyczność dla związków według wynalazku.

97 96 Przykład 30: Kombinowane zastosowanie inhibitorów PI3Kδ i środków, które inhibitują wytwarzanie lub aktywność IgE [0266] Związki według wynalazku mogą wykazywać synergistyczną lub addytywną skuteczność przy podawaniu w kombinacji z inhibitorami selektywnymi dla jednej lub więcej kinaz PI3, np. PI3Kδ. [0267] Inhibitory PI3Kδ mogą być skuteczne w leczeniu zaburzeń autoimmunologicznych i zapalnych (AIID), na przykład reumatoidalnego zapalenia stawów. Jeśli inhibitor PI3Kδ spowoduje niepożądany poziom wytwarzania IgE, można zdecydować o podaniu go w kombinacji ze środkiem, który inhibituje wytwarzanie IgE lub aktywność IgE, takim jak ujawniony tutaj inhibitor mtorc1 i / lub mtorc2. Dodatkowo, podawanie inhibitorów PI3Kδ lub PI3Kδ/γ w kombinacji z inhibitorami mtor może również wykazywać synergię poprzez zwiększenie inhibicji szlaku PI3K. Różne modele in vivo i in vitro mogą być stosowane w celu ustalenia wpływu takiego leczenia kombinowanego na AIID w tym, ale bez ograniczenia: (a) oznaczanie in vitro wytwarzania przeciwciał komórek B, (b) oznaczanie TNP in vivo, oraz (c) gryzoniowy model zapalenia stawów indukowanego kolagenem. (A) Oznaczanie komórek B [0268] Myszy uśmierca się, a śledziony usuwa się i dysperguje przez sito nylonowe w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Splenocyty przemywa się (po usunięciu erytrocytów przez szok osmotyczny) i inkubuje z mikrokulkami sprzężonymi z przeciwciałami anty-cd43 i anty-mac-1 (Miltenyi Biotec). Komórki związane z kulkami są oddzielane od niezwiązanych komórek z użyciem magnetycznego sortera komórek. Namagnesowana kolumna zatrzymuje niepożądane komórki i spoczynkowe komórki B są zbierane w przepływie. Oczyszczone komórki B są stymulowane lipopolisacharydem lub przeciwciałem anty-cd40 oraz interleukiną 4. Stymulowane komórki B traktuje się za pomocą samego nośnika lub inhibitora PI3Kδ z i bez inhibitorów mtor, takich jak rapamycyna, rapalogs lub inhibitorów mtorc1/c2 tutaj ujawnianych. Oczekuje się, że wyniki pokażą, że w obecności samych inhibitorów mtor (np. rapamycyny, jak również przedmiotowych inhibitorów zdolnych do inhibitowania zarówno mtorc1 jak i mtorc2), jest niewielki lub nie ma znaczącego wpływu na odpowiedź IgG i IgE. Jednakże, w obecności inhibitorów PI3Kδ i mtor, oczekuje się, że komórki B wykażą

98 97 zmniejszoną odpowiedź IgG, w porównaniu z komórkami B traktowanymi samym nośnikiem, i oczekuje się, że komórki B wykażą zmniejszoną odpowiedź IgE w porównaniu do odpowiedzi z komórek B traktowanych samymi inhibitorami PI3Kδ. (B) Oznaczanie TNP [0269] Myszy immunizuje się za pomocą TNF-Ficoll lub TNF-KHL i traktuje: nośnikiem, inhibitorem PI3Kδ, inhibitorem mtor, na przykład rapamycyną, lub inhibitorem PI3Kδ w kombinacji z inhibitorem mtor, takim jak rapamycyna. Surowicze IgE specyficzne wobec antygenu jest mierzone w teście ELISA przy użyciu płytek powleczonych TNP- BSA i przeciwciał znakowanych specyficznie dla izotypu. To oznaczenie może być użyte do sprawdzenia, że myszy traktowane samym inhibitorem mtor wykazują niewielki lub nie wykazują istotnego wpływu na specyficzną dla antygenu odpowiedź IgG3 i nie ma statystycznie znaczącego podwyższenia w odpowiedzi IgE w porównaniu z kontrolą traktowaną nośnikiem. Oznaczenie to może być również stosowane do testowania, że myszy traktowane zarówno inhibitorem PI3Kδ jak i inhibitorem mtor wykazują redukcję specyficznej dla antygenu odpowiedzi IgG3, w porównaniu do myszy traktowanych samym nośnikiem. Ponadto, oznaczenie to można zastosować do sprawdzenia, że myszy traktowane zarówno inhibitorem PI3Kδ jak i inhibitorem mtor wykazują zmniejszenie odpowiedzi IgE w porównaniu z myszami traktowanymi samym inhibitorem PI3Kδ. (C) Szczurzy model zapalenia stawów wywołanego kolagenem [0270] Samice szczurów Lewis'a znieczula się i podaje się im zastrzyki z kolagenu wytworzone i podane, jak opisano wcześniej, w dniu 0. 6 dnia, zwierzęta są znieczulane i podaje się im drugi zastrzyk z kolagenu. Pomiary suwmiarką normalnych (przedchorobowych) prawych i lewych stawów skokowych są wykonywane w dniu 9. W dniach 10-11, występuje zazwyczaj zapalenie stawów i szczury są randomizowane do grup terapeutycznych. Randomizacja odbywa się po tym, jak obrzęk stawów skokowych jest ustalony w sposób oczywisty i istnieje dobry dowód choroby dwustronnej. [0271] Zwierzę jest wybierane do udziału w badaniu i następnie rozpoczyna się leczenie. Zwierzętom podaje się nośnik, inhibitor PI3Kδ lub inhibitor PI3Kδ w kombinacji z inhibitorem mtor. Dawkowanie podawane jest w dniach 1-6. Szczury są ważone w

99 98 dniach 1-7 po ustaleniu się zapalenia stawów i pomiary kostek za pomocą suwmiarki pobierane są codziennie. Końcowe masy ciała są pobierane w dniu 7 i zwierzęta są uśmiercane. [0272] To oznaczenie można stosować, aby sprawdzić, czy terapia kombinowana z użyciem inhibitora PI3Kδ i inhibitora mtor dostarczy większą skuteczność niż leczenie samym inhibitorem PI3Kδ. Przykład 31: Inhibicja wzrostu guza in vivo [0273] Linie komórkowe: nowotworowe linie komórkowe, takie jak A549, U87, ZR-75-1 i 786-O uzyskano z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Komórki poddaje się proliferacji i konserwuje kriogenicznie przy wczesnym pasażu (np. pasażu 3). Jedną porcję stosuje się do dalszej proliferacji, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do jednego badania TGI (około pasażu 9). Zwierzęta [0274] Samice atymicznych nagich myszy są dostarczane z Harlan. Myszy są odbierane w wieku 4 do 6 tygodni. Wszystkie myszy aklimatyzują się przez około jeden dzień do dwóch tygodni przed procedurami. Myszy umieszcza się w klatkach typu microisolator i utrzymuje w specyficznych warunkach wolnych od patogenów. Myszy karmi się napromieniowaną karmą dla myszy i dostarcza się swobodnie dostępną wodę w autoklawie. [0275] Model ksenoprzeszczepu nowotworu: Myszy inokuluje się podskórnie w prawy bok za pomocą 0,01 do 0,5 ml komórek nowotworowych, takich jak wymienione powyżej (około 1,0 x 10 5 do 1,0 x 10 8 komórek/mysz). Pięć do 10 dni po inokulacji, guzy mierzy się za pomocą suwmiarek i oblicza się masę guzów, na przykład za pomocą oprogramowania do prowadzenia badań nad zwierzętach, takiego jak Study Director V (Study Log). Myszy z rozmiarami guzów około 120 mg są parami dopasowywane do pożądanych grup, z zastosowaniem Study Director (dzień 1). Masy ciała są rejestrowane, kiedy myszy są dopasowane w pary. Pomiary objętości guzów i mas ciała pobierane są od jednego do czterech razy w tygodniu, a zgrubne obserwacje dokonywane są co najmniej raz dziennie. W dniu 1, związki według niniejszego wynalazku i związki odniesienia, jak również kontrolę w postaci nośnika podaje się przez wgłębnik doustny lub dożylnie, jak wskazano. W ostatnim dniu eksperymentu, myszy uśmierca się, a ich guzy zbiera się 1-4 godziny po podaniu ostatniej dawki. Guzy wycina

100 99 się i tnie na dwie sekcje. Jedna trzecia guza jest utrwalana w formalinie i zatapiana w parafinowych blokach, zaś pozostałe dwie trzecie guza jest natychmiast zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 C. [0276] Dane i analiza statystyczna: średnia inhibicja wzrostu guza (TGI) obliczana jest z wykorzystaniem następującego wzoru: [0277] Guzy, które cofają się od początkowego rozmiaru dnia 1 są usuwane z obliczeń. Indywidualne kurczenie się guzów (TS) jest obliczane na podstawie poniższego wzoru do guzów, które wykazują cofanie się w stosunku do masy guza dnia 1. Średnie kurczenie się guza każdej grupy jest obliczone i przedstawione. [0278] Model może być stosowany do wykazania, czy związki według wynalazku mogą inhibitować wzrost komórek nowotworowych, w tym, ale bez ograniczenia, wzrost komórek nowotworu nerek, wzrost komórek nowotworu piersi, wzrost komórek nowotworu płuc lub wzrost komórek glejaka w testowanych warunkach. [0279] Jak pokazano na Figurach 3A-3B, związek według wynalazku o wzorze I'-A' zmniejsza rozmiar guza w modelu ksenoprzeszczepu ludzkiego glejaka U87 w sposób zależny od dawki w okresie 14 dni leczenia. [0280] Figura 3C pokazuje, że związek nie wykazuje znaczącego działania toksycznego u zwierzęcia, ponieważ nie było znaczącej utraty masy ciała podczas leczenia. Wycięte guzy (Figura 3C) poddano dalszej analizie metodą Western blot, która ujawniła inhibicję sygnalizacji mtor/akt przez związek według wynalazku (Figury 4B oraz 10). W szczególności, o inhibicji sygnalizacji mtor/akt świadczy zmniejszenie ilości fosforylowanej Akt na resztach S473 i T308, PS6, p4ebp-1 i cykliny D1. Związek według wynalazku jest bardziej skuteczny w inhibicji sygnalizacji mtor/akt w porównaniu z inhibitorem, który nie jest selektywny wobec mtor, takim jak powszechnie określany jako inhibitor PanPI3K/mTOR. Wycięte guzy były również poddane barwieniu TUNEL (Figura 12), co pokazuje śmierć komórek nowotworowych po leczeniu. [0281] Ten sam eksperyment przeprowadzono w kilku innych modelach nowotworów, w tym indukowanym komórkami nowotworowymi A549 NSCLC (niedrobnokomórkowy nowotwór płuc), indukowany komórkami nowotworowymi ZR-75-1 nowotwór piersi oraz indukowany komórkami nowotworowymi 786-O RCC (rak nerkowokomórkowy). Figury 11B-11D pokazują, że skuteczność związku według wynalazku w leczeniu tych

101 100 wszystkich nowotworów stała się wykrywalna już po tygodniu leczenia. Efekt zmniejszenia wielkości guza we wszystkich przypadkach trwa co najmniej 1 miesiąc. 1. Związek o następującej strukturze: Zastrzeżenia patentowe lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. 2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość związku lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli według zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 3. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól według zastrz. 1 do zastosowania w leczeniu nowotworu. 4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2 do zastosowania w leczeniu nowotworu. 5. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym nowotworem jest włókniakomięsak, nowotwór trzustki, nowotwór nerki, nowotwór wątroby, czerniak, nowotwór nosowej części gardła, nowotwór żołądka, nowotwór jajnika, białaczka, szpiczak, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, nowotwór jelita grubego, nowotwór płuc, glejak, nowotwór macicy, nowotwór pęcherza, międzybłoniak, nowotwór głowy, nowotwór szyi i nowotwór szyjki macicy. 6. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór nerki. 7. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest rak nerkowokomórkowy. 8. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym

102 101 wspomnianym nowotworem jest nowotwór piersi. 9. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór macicy. 10. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór pęcherza. 11. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór jelita grubego. 12. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór płuca. 13. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest niedrobnokomórkowy nowotwór płuca. 14. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest drobnokomórkowy nowotwór płuca. 15. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest glejak. 16. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór ginekologiczny. 17. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór szyjki macicy. 18. Związek lub farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania według zastrz. 3, lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym wspomnianym nowotworem jest nowotwór żołądka. Intellikine, LLC Pełnomocnik:

103 102

104 103

105 104

106 105

107 106

108 107

109 108

110 109

111 110

112 111

113 112

114 113

115 114

116 115

117 116

118 117

119 118