PL B1. UNIWERSYTET WARMIŃSKO-MAZURSKI W OLSZTYNIE, Olsztyn, PL BUP 26/10

Transkrypt

1

2 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 35/52 ( ) A61K 31/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Preparat do konserwacji nasienia zwierząt, zwłaszcza knura (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/10 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET WARMIŃSKO-MAZURSKI W OLSZTYNIE, Olsztyn, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (72) Twórca(y) wynalazku: JERZY STRZEŻEK, Olsztyn, PL LEYLAND FRASER, Olsztyn, PL MAREK LECEWICZ, Olsztyn, PL RAFAŁ STRZEŻEK, Zezuty, PL ANNA DZIEKOŃSKA, Pluski, PL

3 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest preparat do konserwacji nasienia zwierząt, zwłaszcza knura. Preparat może znaleźć zastosowanie w stacjach unasieniania zwierząt, a także w fermach produkcyjnych i gospodarstwach indywidualnych. Znany jest z patentu nr rozcieńczalnik wykorzystywany w konserwacji nasienia knura w niskich temperaturach zawierający w 1 litrze wody destylowanej 27,66 g glukozy, cytrynianu sodu 8,16 g, uwodnionego wersenianu dwusodowego 2,45 g, kwaśnego węglanu sodowego 1,23 g, poliwinylopirolidonu 1,04 g, chlorku potasu 0,7 g i gentamycyny 0,20 g rozpuszczonych w wodzie destylowanej. Żółtko jaja kurzego od wielu lat uznawane było jako uniwersalny składnik rozcieńczalników nasienia ssaków, który przeciwdziała udarowi chłodowemu plemników podczas procedury zamrażania- -rozmrażania. Żółtko jaja kurzego zawiera 3 zasadnicze makrocząsteczkowe struktury: - granule (24% s.m.), które składają się z nierozpuszczalnych cząstek Iipowitelin i fosfityn, - Iiwetyny (16% s.m.), których źródłem jest surowica krwi, - Iipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), stanowiące główną strukturę żółtka jaja (60% s.m.). Mechanizm molekularny, poprzez który żółtko jaja osłania strukturę plazmolemy plemników związany jest z obecnością LDL. Jednak funkcja głównych komponentów LDL, to jest białek i lipidów, w interakcji z plazmolemą plemników nie została dokładnie poznana. Przypuszcza się, między innymi, że fosfolipidy obecne w LDL osłaniają plemniki poprzez uformowanie warstwy na ich powierzchni lub przez zastąpienie fosfolipidów plazmolemy, które ulegają wyciekowi lub uszkodzeniu podczas procesu kriokonserwacji. Ostatnio podkreśla się znaczenie mechanizmu interakcji LDL z białkami plazmy nasienia co wzmaga efektywność osłaniającą powstającego kompleksu. Generalnie LDL są zlokalizowane w rozpuszczalnej frakcji żółtka jaja. Obok triacylogliceroli i estrów cholesterolu zawierają fosfolipidy, które pełnią funkcję stabilizującą ich strukturę. LDL zawierają 83-89% lipidów i 11-17% białek. W składzie lipidów LDL około 69% zajmują triacyloglicerole, 26% fosfolipidy i 5% cholesterol. W ostatnim okresie zwrócono jednak uwagę na występowanie w żółtku jaja kurzego substancji inhibitorowych, które naruszają proces oddychania plemników i ich ruchliwość. Z drugiej strony, ponieważ pełne żółtko jaja stanowi oryginalny surowy materiał zwierzęcy może być potencjalnym źródłem zanieczyszczeń mikrobiologicznych lub nawet wirusowych. W żółtku jaja kurzego stwierdzono obecność bakterii Salmonella lub Staphylococcus. Z kolei wirus ptasiej grypy izolowano z żółtka jaja naturalnie infekowanych kur. Należy podkreślić, że sygnalizowane zanieczyszczenia bakteryjne i wirusowe mogą obniżać zdolności zapładniające nasienia stosowanego w inseminacji. W przypadku knura dodatkowym czynnikiem ograniczającym użycie pełnego żółtka jaja kurzego jest obecność specyficznych białek zależnych od jonów cynkowych w plazmie nasienia, które posiadają zdolność precypitacji komponentów żółtkowych. Zjawisko to osłabia protekcyjną rolę komponentów żółtka jaja wobec struktur plazmolemy plemników poddanych wpływowi temperatur poniżej 10 C. Według wynalazku preparat do konserwacji nasienia zwierząt, zwłaszcza knura składa się z rozcieńczalnika, który zawiera w jednym litrze destylowanej wody: 19 g cytrynianu sodowego (2xH 2 O), 12,5 g fruktozy, 3,0 g EDTA (wersenian disodowy), 1,4 g octanu potasu, 250 mg gentamycyny oraz 50 g liofilizowanego preparatu Iipoproteinowego LPFo wyekstrahowanego z pełnego żółtka jaja strusia. W pracy nad naszym wynalazkiem okazało się, że możliwe jest wykorzystanie jako źródła LDL żółtka jaja strusia afrykańskiego (Struthio camelus), które pozwala na uzyskanie frakcji lipoprotein (LPFo) charakteryzującej się zdecydowanie lepszymi parametrami biochemicznymi warunkującymi właściwości protekcyjne wobec ultrastruktur plemników knura. Przy wykorzystaniu specyficznych metod biochemicznych stwierdzono, że preparat LPFo zawiera 72,5% lipidów oraz 27,5% białek. Charakteryzuje się wysoką zawartością triacylogliceroli (47,62 ± 3,44 mg/cm 3 ), fosfolipidów (23,48 ± 1,54/cm 3 ) i cholesterolu (8,83 ± 0,53 mg/cm 3 ). W składzie zidentyfikowanych 5 frakcji fosfolipidów dominują fosfatydylocholina (79,4%) oraz fosfatydyloetanoloamina (17,33%). Obecna jest również fosfatydyloseryna (0,57%), która wykazuje dobre właściwości protekcyjne plemników knura przed udarem chłodowym. Wśród kwasów tłuszczowych dominują kwasy nasycone (54,2%). Natomiast w grupie kwasów nienasyconych zidentyfikowano kwasy monoenowe (31,54%), dienowe (9,89%), trienowe (3,39%) oraz tetraenowe (0,98%).

4 PL B1 3 W badaniach chromatograficznych i elektroforetycznych stwierdzono znaczną heterogenność substancji białkowych preparatu LPFo. Stwierdzono obecność białek o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (od 14,4 kda do 94 kda), co podkreśla Iipoproteinowy charakter preparatu LPFo. Odzyskanie podczas ekstrakcji żółtka jaja strusia rozpuszczalnej w wodzie frakcji lipoprotein charakteryzującej się oryginalnym składem biochemicznym warunkuje unikalne właściwości osłaniające LPFo wobec plazmolemy plemników poddawanych różnym technologiom konserwacji. Stworzyło to nowe możliwości wykorzystania liofilizowanego preparatu LPFo w składzie rozcieńczalników dla konserwacji nasienia knura w temperaturach 5 C i 16 C oraz kriokonserwacji w temperaturze ciekłego azotu (-196 C). Preparat LPFo może być użyty jako zamiennik pełnego żółtka jaja kurzego w składzie rozcieńczalnika dla nasienia ogiera i psa. Liofilizowany preparat LPFo daje szerokie możliwości konserwacji nasienia knura w różnych przedziałach temperaturowych przy ograniczonym zagrożeniu sanitarno-epidemiologicznym. Badania fluorescencyjne z zastosowaniem fluorochromu ANS (1-anilinonaphtalene-8-sulphonic acid) wskazały, że 5% dodatek LPFo do rozcieńczalnika zwiększa odsetek plemników wykazujących wiązanie lipoprotein w regionie główki i wstawki plemników knura. Zjawisko to koreluje z zachowaniem lepszej integralności plazmolemy i sprawności metabolicznej plemników podczas konserwacji nasienia. Stwierdza się ponadto, że LPFo posiada właściwości supresyjne wobec indukowanej L-askorbinianem i jonami Fe 2+ peroksydacji lipidów plazmolemy plemników knura. Zwłaszcza w przedziale temperaturowym +16 C do +5 C obserwuje się zdecydowany spadek tempa produkcji dialdehydu malonowego (MDA) - produktu peroksydacji lipidów. Omawiane zjawisko supresji peroksydacji wykazuje tendencję zwiększającą w obecności białek plazmy nasienia knura. W badaniach immunodyfuzyjnych z LPFo nie stwierdza się charakterystycznego dla plazmy nasienia knura zjawiska precypitacji komponentów pełnego żółtka jaja. Obecność LPFo w rozcieńczalniku korzystnie wpływa na metabolizm plemników przechowywanych w temperaturze +5 C i +16 C co przejawia się lepszą sprawnością aparatu mitochondrialnego, związanego z procesem oddychania plemników i syntezą ATP. Stwierdza się również ograniczony zakres zmian struktury DNA. Prezentowane zalety biologiczne preparatu LPFo stanowiły zasadniczą przesłankę do pilotowego wdrożenia do inseminacji loch nowego typu rozcieńczalnika, wzbogaconego odpowiednim dodatkiem liofilizowanej frakcji lipoprotein (forma sypka). Przedmiot wynalazku zostanie bliżej pokazany w przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1. Preparat do konserwacji nasienia knura składa się z: - cytrynian sodowy (2xH 2 O) - 19 g/l - fruktoza - 12,5 g/l - EDTA (wersenian disodowy) - 3,0 g/l - octan potasu - 1,4 g/l - antybiotyk - gentamycyna mg/l - Iiofilizat LPFo - 50 g/l Końcowe ph rozcieńczalnika wynosi 6,8 zaś osmomolarność 300 mosm. Zakwalifikowany do konserwacji ejakulat knura rozrzedza się rozcieńczalnikiem według wynalazku do końcowej koncentracji plemników 3x10 9 plemników/100 cm 3 przy jednoczesnym uwzględnieniu 5% stężenia końcowego LPFo w próbie. Następnie pozostawia się rozrzedzone nasienie na 2 godziny w temperaturze pokojowej a następnie przechowuje w termoboksie (16-18 C) lub w temperaturze 5 C (lodówka). Aplikacja konserwowanego nasienia w preparacie według wynalazku w inseminacji loch. Inseminację loch przeprowadzono dawkami rozrzedzonego nasienia konserwowanego 48 h w temperaturze 5 C lub 16 C zaś reinseminację loch po 72 h konserwacji nasienia w omawianych temperaturach. Wyniki prezentuje poniższa tabela; Temperatura konserwacji/ inseminowanych loch 5 C/10 16 C/10 Wskaźnik wyproszeń % Wielkość miotu 11,08 ± 1,73 10,93 ± 1,87 Liczb prosiąt żywych w miocie 10,57 ± 1,07 10,58 ± 1,62

5 4 PL B1 Uzyskane wyniki wskazały na możliwość stosowania obniżonej do 5 C temperatury konserwacji nasienia zakonserwowanego preparatem według wynalazku w stanie płynnym bez możliwości zakupu kosztownego termoboksu. Przeprowadzono również kontrolne zabiegi inseminacyjne loch nasieniem konserwowanym długookresowo w preparacie według wynalazku w temperaturze 5 C. Wyniki prezentuje tabela: Czas konserwacji nasienia/loch inseminowanych D1/D2/n = 16 (do 48 h) D2/D4 / n = 5 (do 72 h) Wskaźnik wyproszeń (%) 81,25 80,0 Wielkość miotu 9,8 ± 1,4 10,1 ± 1,9 Liczba urodzonych prosiąt żywych w miocie 9,5 ± 2,2 9,2 ± 1,5 Uwzględniając ekonomiczne aspekty inseminacji loch w gospodarstwie indywidualnym czyli bez koniecznego zakupu termoboksu lub kolejnej dawki dla reinseminacji, udostępniono laboratorium Stacji Unasienniania Loch porcje inseminacyjne preparatu według wynalazku z możliwością użycia zmiennych temperatur konserwacji nasienia knurów tj. w temperaturze 16 C - laboratorium SUL oraz w temperaturze 5 C - lodówka, gospodarstwo indywidualne. Rolnicy wykonywali zabiegi inseminacyjne i reinseminacyjne nasieniem konserwowanym w zmiennych temperaturach. Wyniki zabiegów inseminacyjnych prezentuje tabela: Gospodarstwo rolne Liczba inseminowanych i reinseminowanych loch Wskaźnik wyproszeń % Liczba prosiąt żywo urodzonych w miocie A 5 80,0 9,5 B 4 100,0 10,5 C 2 100,0 9,5 D 4 50,0 11,0 E 15 80,0 11,1 F 6 50,0 10,6 G 9 78,8 12, ,9 10,52 P r z y k ł a d 2 Preparat według wynalazku składa się z: - cytrynian sodowy (2xH 2 O) - 19 g/l - fruktoza - 12,5 g/l - EDTA (wersenian disodowy) - 3,0 g/l - octan potasu - 1,4 g/l - antybiotyk - gentamycyna mg/l - Iiofilizat LPFo - 50 g/l Zastosowanie preparatu według wynalazku do zamrażania nasienia knura. Wartość biologiczna kriokonserwowanego nasienia knura stanowi nadal aktualny problem do rozwiązania. Obok bowiem obserwowanych zmian kriogenicznych, krótkiej przeżywalności plemników w układzie płciowym lochy istotnym czynnikiem obniżającym płodność kriokonserwowanego nasienia knura jest zjawisko kriokapacytacji plemników powodowane niewłaściwą stabilizacją błon plazmatycznych przez komponenty rozcieńczalnika. Nasienie knura rozrzedza się w stosunku 1;1 (v/v) preparatem bez dodatku LPFo oraz schładza przez 3 godz. do temperatury 16 C. Po odwirowaniu próby (800 x g;10 min, temperatura 16 C) uzyskany osad plemników zawiesza się w oziębionym preparacie zawierającym końcowe 5% stężenie LPFo oraz 11% stężenie laktozy a następnie schładza się w temperaturze 5 C przez 3 godz. Oziębione próby rozrzedza się ponownie (2:1; v/v) rozcieńczalnikiem zawierającym; 89,5 ml preparatu według

6 PL B1 5 wynalazku z dodatkiem laktozy, 9 ml glicerolu (v/v) oraz 1,5 ml (v/v) środka dyspersyjnego Orvus Es Paste (OEP). W ten sposób uzyskuje się końcowe stężenie LPFo, glicerolu, OEP odpowiednio: 5%, 3% i 0,5%. Próby rozrzedza się do końcowej koncentracji plemników: 500 x 10 6 pl/ml i konfekcjonuje w 10 ml wysterylizowanych tubach aluminiowych i zamraża w kontrolowanej komputerowo zamrażarce z zastosowaniem specjalnego protokołu zamrażania. Tuby umieszcza się w kontenerze z ciekłym azotem i przechowuje do czasu użycia w inseminacji loch. W celu rozmrożenia tuby wyjmowane są z ciekłego azotu i inkubowane przez 60 sekund na łaźni wodnej o temperaturze 50 C. Rozmrożone próby nasienia są użyte do zabiegu inseminacyjnego z zastosowaniem specjalnej procedury postępowania. W rezultacie inseminacji 8 loch reprodukcyjnych (2-krotne unasienianie), użytkowanych w fermie produkcyjnej trzody chlewnej, uzyskano niżej prezentowane wyniki: Liczba loch inseminowanych - 8 Liczba loch niepowtarzających rui po 28 dniach - 6 (75%) Liczba loch prośnych - 6 (75%) Liczba prosiąt urodzonych/żywych - 70/63 Wielkość miotu - 10,5 ± 0,4 Uzyskane wyznaczniki biologiczne wskazują na przydatność praktyczną stosowania w kriokonserwacji nasienia knura preparatu według wynalazku. Zastrzeżenie patentowe Preparat do konserwacji nasienia zwierząt, zwłaszcza knura zawierający cytrynian sodowy, EDTA, gentamycynę, znamienny tym, że składa się z rozcieńczalnika, który zawiera w jednym litrze destylowanej wody; 19 g cytrynianu sodowego (2xH 2 O), 12,5 g fruktozy, 3,0 g EDTA (wersenian disodowy), 1,4 g octanu potasu, 250 mg gentamycyny oraz 50 g liofilizowanego preparatu Iipoproteinowego LPFo wyekstrahowanego z pełnego żółtka jaja strusia.

7 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)