REDUKTAZY ZELAZA U ENTEROKOKÓW'

Transkrypt

1 MED. DOSW. MIKROBIOL., 2005, 57, Pawel Lisiecki, Jerzy Mikucki ASYMILACYJNE REDUKTAZY ZELAZA U ENTEROKOKÓW' Katedra Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Medycznego w Lodzi Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej Kierownik Zakladu: prof. dr hab. E. M Szewczyk Enterol{Old wytwarzaja asymilacyjne reduktazy zelaza, które sa enzymami scisle zwiazanymi z IJowierzchnh\ I{omórld.Aktywnosc redukujaca jest zróznicowana w obrebie gatunku i wsród szczepów IJOdobnego oraz róznego pochodzenia a taicie miedzy gatunkami. Niedobór i nadmiar zelaza Fe(Ill) oraz obecnosc hemoglobiny i hemu nie mialy wplywu na aktywnosc redukujaca. Swoistosc substratowa enterokokowych reduldaz zelaza jest szeroka. Redukuja one zelazo Fe(Dl) zwh\zkóworganicznych i nicorganicznych, komplel<sówz naturalnymi i syntetycznymi chelatorami oraz zwh\zanc z bialkowymi ustrojowymi nosnilcami. Reduktazy zelaza katalizaja redukcje jonu zelazowego Fe(III) do jonu zelazawego Fe (II). Redukcja skompleksowanego zelaza Fe(III) tworzy slabiej wiazacy pierwiastek kompleks, latwo ulegajacy rozszczepieniu i uwalniajacy zelazo dla jego transportu do komórki. Redukcja Fe(III) dla wbudowania go do bialek hemowych i niehemowychjest asymilacy.jna redukq,jazelaza zas redukcja dysylnilacyjnadostarcza energii dla rozmnazania komórki. Redukowanie przez bakterie zelaza w srodowisku moze byc w procesiejego przyswajania powiazane z dzialaniem sideroforów: zelazo pobranego do komórki kompleksu Fe(III)-siderofor ulega redukcji za pomoca cytoplazmatycznychreduktaz zelaza i jest uwalniane z kompleksu (17). O wystepowaniu reduktaz zelaza donoszono u wielu bakterii: Bacillus megaterium (1), Escherichia coli (4), Legionella pneumophila (11), Listeria monocytogenes (2, 7), Neisseria gonorrhoeae (13), Pseudomonas aeruginosa ( 6, 9), Staphy/ococcus aureus (12) i Vibrio anguillarum (15). Enterokoki wytwarzaja siderofory. Powszec1miewystepuje u nich siderofor klasy hydroksamowej (14). Brak natomiast danych o ich asymilacyjnych reduktazach zelaza, które samodzielnie lub we wspóldzialaniu z sideroforami uczestniczylyby w pobieraniu zelaza z jego zródel dla przyswojenia przez komórke. Praca ta przynosi pierwsze dane o wystepowaniu reduktaz zelaza u enterokoków i opisuje niektóre wlasciwosci tych enzymów. 'Praca wykonana w ramach grantu wewnetrznego UM Nr 502/13/224

2 360 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr4 MATERIAL I METODY s z c z e p y b a k t e ryj n e. W badaniach uzyto 122 szczepów rodzaju Enterococcus: 83 szczepygatunkue.faecalis, 29 szczepówgatunkue.faecium oraz po jednym szczepie gatunków: E. casseliflavus. E. dispar,e. durans. E. gallinarum. E. mundtii. E. sulfureus. E. solitarius. E. saccharolyticus i dwa szczepy o nieokreslonej przynaleznosci gatunkowej. Szczepy te pochodzily z materialu klinicznego (117 szczepów), od zwierzat (2 szczepy), ze srodowiska (2 szczepy) i z zywnosci(1 szczep). Czesc zbioru szczepów nalezala do kolek~ji wlasnej ZMF, a reszte otrzymano z Zakladu Mikrobiologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego w Warszawie,Zakladu Mikrobiologii CollegiumMedicum Uniwersytetuw Bydgoszczy, Czeskiej Kolekcji Drobnoustr~jów(CCM), Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów (DSM) i Amerykanskiej Kolekcji Drobnoustrojów(ATCC). Szczepyprzechowywanow 3,7% pozywce Brain Heart Infusion (Difco) zawierajacej 50% glicerolu w temperaturze -70 C. Standaryzacja zawiesin bakteryjnych i ocena wzrostu. Pomiary gestosci optycznej zawiesin i plynnych hodowli przeprowadzano w kolorymetrze spektralnym Spekol (Zeiss) przy dhlgosci fali swietlnej 11.=580nm wyrazajacja w niektórych doswiadczeniach w postaci jednostki ODU (optical density unit) odpowiadajacej wartosci absorbancji AS8oluu=1,0. Korzystano równiez ze skali McFarlanda (Difco) i kalibrowanych ez (0,01 ml). P o z Yw k i i war u n k i h o d o w l i. PlYlll1apozywka do namnazania enterokoków zawierala w 1000 mi: Casamino Acids, Vitamin Free (Difco) - 3 g, Yeast Extract (Difco) -1,5 g, Tris - (hydroksymetylo)aminometan-12,1 g, ~P04-3 g, NaCI- 5 g, NH4CI-l g, 1 M MgCl2 - lml, 100 mm CaCl2- l ml, 20% glukoza - 10 ml. ph pozywki 7,2. W niektórych doswiadczeniach hodowle prowadzono w dwóch wersjach pozywki: Fe. (Chelex) ze zmniejszona za pomoca zywicy Chelex 100 ( mesh)(biorad) zawartoscia zelaza do stezenia w granicach 1,2xlO'6-3,5xlO''M i Fe+ zawierajacej zelazo w stezeniu IO-4M.W razie potrzeby pozywke zestalano za pomoca 1,5% agaru Nobel Agar (Difco). Pozywki zakazano 5% (v/v) inokulum w buforowanymfosforanami izotonicznym roztworze NaCI (PBS)(Biomed) zlozonym z bakterii glodzonych dla uszczuplenia rezerw zelaza przez 24 godziny na pozywce Muellera-Hintona 2 z o-fenantrolina w stezeniu 50 ~IM.Gestosc inokulum odpowiadala wzorcowi N" 2 skali McFarlanda (6x108komórek bakteryjnych/mi). Hodowle prowadzono w temperaturze 37 C (takze w 25 C i 45 C) przez 24 godziny przy stalym wstrzasaniu 100 cykli/min. i wirowano (10000 x g, 15 min., 4 C). Po trzykrotnym przemyciu osadu roztworem PBS komórki i zebrany wczesniej plyn z nad osadu hodowli przechowywano w temp. -70 C. O z n a c z a n i e r e d u k t a z z e l a z a. Zdolnosc redukowania zelaza Fe(III) oceniano za pomocatestu z ferrozyna(3-(2-piiydylo)-5,6-difenylo-l,2,4-triazyna)(sigma).tworzy ona tylko z jonami Fe(II) kompleks o barwie fioletowej wykazujacy maksimum absorbcji przy dlugosci fali swietlnej 11.=562nm (18). Wy kry w a n i e r e d u k t a z z e l a z a. Standaryzowana zawiesine bakterii posiewano kalibrowanymi ezami (0,01 mi) na powierzchni plytki z pozywka. Po 24 godzinach inkubacji w temp. 37 C plytke zalewano 15 mi roztworu 0,8% agarozy zawierajacego 2 mm ferrozyny (Sigma), 50 ~IMNADH (Sigma), 50 ~IMFMN (Sigma) i 100 ~lg/mlsubstratu redukcji - cytrynianu zelazowo-amonowego (Sigma). Po zastygnieciu agarozy plytki inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37 C przy ograniczonym dostepie swiatla. Barwa fio-

3 Nr4 Reduktazy zelaza enterokoków 361 letowa strefy wzrostu dowodzila obecnoscikompleksu Fe(II)-ferrozyna i posrednio reduktaz zelaza (7). p o m i a rak t Yw n o s c i r e d u k t a z z e l a z a. Spoczynkowekomórki zawieszano w 6 ml pozywki nie zawierajacej MgCI2,CaCl2i glukozy.mierzono gestosc optyczna l ml zawiesiny wyznaczajac absorbancje przy dlugosci fali swietlnej 1.=580um. Do reszty zawiesiny dodawano kol~jno 10!lI roztwoni NADH (Sigma) w stezeniu 29,15 mg/mi, 10!lI roztwonifmn (Sigma) w stezeniu l mg/mi i l mi roztwoni ferrozyny (Sigma) \v stezeniu 6,9 mg/mi. Po dodaniu 100 ~Llsubstratu redukcji próbówki wstrzasano i umieszczano w lazni wodnej o temperaturze 37 C. Koncowe.stezenie substratu redukcjiw mieszaninie reagujacej wynosilo 100 ~Lg/ml.Po 10,20 i 30 minutach pobierano po l mi mieszaniny reagujacej, wirowano (10000 x g, 10 min., 4 C) i mierzono absorbancje plynu znad osadu w spektrofotometrze Cary 1uviVIs (Varian)przy dlugosci fali swietlnej1.=562nm. Kontrole stanowily skladniki mieszaniny reagujacej bez zródla enzymu. Ilosc powstajacego kompleksu Fe(II)-ferrozyna wyliczono z róznicy wartosci absorbancji próby wlasciwej i kontroli. Aktywnosc wlasciwa reduktaz zelaza wyrazano w mikromolach powstajacego kompleksu Fe(II)-ferrozynyw ciagu lninuty w przeliczeniu najednostke gestoscioptycznej(odu): ~L1nol Fe(II)-ferrozyny x minolx ODUI (7,11). Z ród la z e l a z a (s u b s t r a t y r e d u k c j i ). W badaniach wykorzystano nastepujace zródla zelaza: siarczan zelazowo-amonowy(sigma), azotan zelaza (POCH), cytryluan zelazowo-amonowy (Sigma), wersenian zelazowy (POCH), pirogronian zelazowy (Sigma), transferyne (Sigma), laktoferyne(sigma), hemoglobine (Sigma), ferrytyne (Sigma) i ferrioksarnine B (Sigma). S p r z e t l a b o r a t o ryj n y. Dla wyeliminowanianieenzymatycznejredukcji zelaza korzystano wylacznie zjednorazowych polietylenowych i polipropylenowych naczylllaboratoryjnych i sprzetu. O b l i c z e n i a s t a t y s t Yc Zn e. Analize statystycznaprzeprowadzonoza pomoca programu Statistica for Windows wersja 5.1 (Statsoft). Poniewaz rozklad badanych cech nie byl zgodny z rozkladem normalnym stosowano testy nieparametryczne KnIskala-Wallisa i U Matma-Whitneya (8). WYNIKI Przegladowe badanie popula~ji szczepówna pozywcestalej z ferrozyna wykazywalo, ze 111szczepów badanej popula~ji, a wiec 91 % redukowalo zelazo Fe(III) cytrynianu zelazowo-amonowego,któryjest dla enterokokówlatwo dostepnymzródlem tego pierwiastka. Standaryza~ja posiewanych zawiesin pozwalala porównac aktywnosc reduktaz zelaza. Na podstawie róznic w intensywnosci barwy wyrózniono trzy grupy szczepów: 21 szczepówbardzo aktywnych (17,2%) (intensywnosc zabarwielua oceniono na +++), 40 (32,8 %) szczepów o sredniej aktywnosci (intensywnosc zabarwienia oceniono na ++) i najliczluejsza grupe 50 (41%) szczepów o najslabszej aktywnosci (intensywnosc zabarwienia oceniono na +) (Ryc. l). Do dalszych badan wyselekcjonowano27 szczepów pochodzacych z grupy o najwyzszej i sredluej aktywnosci: 8 szczepów gatunku E. faecalis, 13 szczepów E. faecium i 6 szczepów gatunków E. dispar DSM 6630, E. durans CCM 4051, E. gallinarum CCM 4054, E. mundtii CCM 4059, E. sulfureus DSM 6905 i E. saccharolyticus DSM Poslugujac sie ta grupa szczepów ustalono, ze reduktazy zelaza sa scisle zwiazane

4 362 P.Lisiecki,J. Mikucki Nr Ryc. 1. Wykrywanie reduktaz zelaza u enterokoków na podlozu stalym z komórka i spoczynkowe komórki powinny byc wykorzystywane jako zródlo enzymu. W zadnym z plynów znad osadu hodowli tych szczepów,plynów niezageszczanych i zageszczanych nie wykryto reduktaz zelaza, poslugujac sie jako substratem redukc:jicytrynianem zelazowo-amonowym. Mimo wybom szczepów o najwyzszej aktywnosci redukajacej w tesciejakosciowym ich aktywnosc mierzona mikromolami Fe(II)-ferrozynyx min'lx ODU.Ibyla silnie zróznicowana. Najnizszajaka wykazano lnial szczep z materialu klinicznego E.faecium BY 10-0,065 f.lmola Fe(II)-ferrozyny x min'lx ODU.I, a najwyzsza izolowany ze srodowiska szczep E. sulfureus DSM ,7 f.lmolafe(ii)-ferrozyllyx min'lx ODU.I.Wsród szczepów izolowanych z materialu klinicznego wystepowaly szczepy o bardzo niskiej aktywnosci jak E. faecium BY 10 - i znacznie wyzszej jak E. faecium BY 9, odpowiednio 0,065 i 0,58 mikromola Fe (II)-ferrozyny x min'lx ODU.I. Znaczne róznice w aktywnosci wykazywaly równiez szczepy pochodzace ze srodowiska, z zywnosci i od zwierzat, a takze nalezace do gatunków E.faecalis i E.faecium. Najaktywni~jszeszczepy uzyto do dalszych doswiadczen: cztery szczepypochodzily z materialu klinicznego - E.faecalis BY 56 i BD 123 o aktywnosci 0,45 i 0,46 mikromola Fe(II)-ferrozyny x min'lx ODUl oraz E. faecium 97-0 i BY 9 o aktywnosci 0,43 i 0,58 mikromola Fe(II)-ferrozyny x lnin'lx ODUl a dwa szczepy byly izolowane ze srodowiska E. saccharolyticus DSM i E. sulfureus DSM 6905 o aktywnosci 0,3 i 1,7 mikromola Fe(II)-ferrozynyx min:lx ODU.I. Temperatura inkubacji hodowli enterokoków miala wplyw na aktywnosc reduktaz zelaza. W temperaturze 45 C bakterie te slabo sie mnozyly, nie wykazujac aktywnosci redukujac~j.komórki zbierane z hodowliw temperaturze 25 C mialy wyzsza aktywnosc niz hodowane w optymalnej dla enterokoków temperaturze 37 C. Dotyczylo to czterech szczepów: E. saccharolyticus DSM o aktywnosci 0,353 (25 C) i 0,085(37 C) mikromola Fe (II)-ferrozyny x min'lx ODU'I, E. sulfureus DSM 6905 odpowiednio 0,125 i 0,1 f.lmola Fe(II)-ferrozyny x min:lx ODU'I,E.faecalis BD 123-0,162 i 0,11 mikromola Fe(II)-ferrozyny x min.'ixodu.i oraz E. faecium BY 9-0,028 i 0,008 mikromola Fe(II)-ferrozyny x min:lx ODU.I (Tabela I). Analiza statystyczna wykazala znamiennosc wyzsz~j aktywnosci redukc:jizelaza komórek zbieranych z hodowli inkubowanej w temperaturze 25 C (p<0,05). Spoczynkowe komórki hodowane w wamnkach tlenowych i beztlenowych redukowaly zelazo Fe(III)jednak sklad gazowej atmosfery hodowli nie mial wplywu na poziom redukcji. Aktywnosc ta byla wyzsza u hodowanego w wamnkach beztlenowych pochodzacego ze srodowiska szczepu E. saccharolyticus DSM ,329 wobec 0,067, izolowanych z mate-

5 Nr4 Reduktazy zelaza enterokoków 363 Tabela I. Wplyw temperatury hodowli enterokoków na aktywnosc reduktaz zelaza Aktywnosc Szczepbakterii Fe(ll)-fenuzynyxmin.-lxODUI*) 25 C 37 C 45 C E.faecalis BD 123 0,162 0,110 O E.faecalis BY 56 0,D10 0,010 O E.faecillm BY 9 0,018 0,008 O E.faecillm 97-D 0,058 0,064 O E. sliljurellsdsm ,125 0,100 O E. saccharo/yticiisdsm ,353 0,085 O * ODU (optical density unit), jednostka gestosci optycznej Tabela II. Wplyw atmosfery gazowej hodowli enterokoków na aktywnosc reduktaz zelaza Aktywnosc Szczepbakterii Fe(ll)-ferrozynyxmin. -lxodu1*) wanmkibeztleno\\e wanmkitlenowe E.faecalis BD 123 0,418 0,163 E.faecalis BY 56 0,100 0,050 E.faecillm BY 9 0,054 0,113 E.faecillm 97-D 0,011 0,D10 E. saccllaro/yticlisdsm ,329 0,067 E.sll!fllrells DSM6905 0,289 0,271 * ODU (optical density unit), jednostka gestosci optycznej rialu klinicznego szczepów E. faeca/is BD 123-0,4 l 8 wobec 0,163 oraz E. faeca/is BY ,1 wobec 0,05 f.im Fe(II)-ferrozyny x min:lx ODU-I. Natomiast u szczepu E. faecium BY 9 aktywnosc byla wyzsza u komórek hodowanych w warunkach tlenowych: 0,113 wobec 0,054 f!mfe(ii)-ferrozyny x min:lx ODU-l. Nie róznily sie aktywnoscia szczepy E. sulfureus DSM 6905 i E. faecium 97-0 (Tabela II). Róznice w aktywnosci reduktaz zelaza u komórek hodowanych w warunkach beztlenowych i tlenowych nie byly jednak znainiemue statystycznie (p<0,05). Hodowla w warunkach niedoboru zelaza w pozywce Fe- (Chelex) nie miala wp1ywu na aktywnosc reduktaz zelaza, natomiast u dwóch szczepów E. faecium BY 9 i E. saccharolyticus DSM byla wyzsza w warunkach nadmiaru zelaza wynoszac odpowiednio 0,25 wobec 0,11 i 0,28 wobec 0,18 f.imfe(ii)-ferrozyny x nun. -lxodu-i (Tabela III). Statystyczne opracowanie wyników wykazalo jednak, ze zarówno niedobór jak i nadn1iar zelaza w czasie hodowli nie maja istotnego wplywu (p>0,05) na aktywnosc reduktaz. Równiez obecnosc w pozywce ustrojowych zródel zelaza w postaci helniny w stezeniu 3,26 f!glmllub hemoglobiny w stezeniu 5 f!glml nie Iniala istotnego wplywu na aktywnosc reduktaz zelaza (p>0,05) (Tabela IV).

6 364 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr4 Tabela m. Wplyw stezenia zelaza w podlozu wzrostowym na aktywnosc reduktaz zelaza u enterokoków Szczepbakterii Aktywnosc J.IMFe(II}ferrozynyxnnn.-1 xodt.ji*) +Fe poz)'\\ka - Fe (Chelex) E.faecalis BD 123 0,350 0,370 E.faecalis BY 56 0,140 0,120 E.faecium BY 9 0,250 0,110 E.faecium ,150 0,120 E. su!fureusdsm ,780 1,700 E. saccharolyticusdsm ,280 0,180 ODU (optical density unit), jednostka gestosci optycznej Tabela IV. Wplyw heminy i hemoglobiny w podlozu wzrostowym na aktywnosc reduktaz zelaza u enterokoków Aktywnosc Szczep bakterii J.IMFe(II}ferrozynyxrnill'l xodt.j1*) - + hemina + hemoglobina E.faecalisBD 123 0,082 0,010 0,073 E.faecalisBY56 0,080 0,004 0,098 E.faeciumBY9 0,025 0,033 0,019 E.faecium97-0 0,065 0,053 0,135 E. su!fureusdsm ,055 0,004 0,058 E. sacchamlyticusdsm ,153 0,078 0,072 ODU (optical density unit), jednostka gestosci optycznej Szczepy redukowaly zelazo Fe(III) wszystkich uzytych substratów ale z rózna aktywnoscia, nieistotnajednak statystycznie (p>o,os). Redukowane byly nieorganiczne i organiczne polaczenia zelaza, ustrojowe zródla zelaza i kompleksy zelaza Fe(III) z sideroforami. Nie udalo sie wyróznic jednego substratu, do którego enterokoki wykazuja szczególne preferencje ale mozna bylo ustalic gmpy takich substrató,v, miedzy którymi ujawnily sie znamienne statystycznie róznice. Pierwsza gmpe tworzyly substraty w stosunku do których enterokoki wykazywaly najwyzsza aktywnosc: cytrynian zelazowo-amonowy, laktoferyna i ferrioksami-. na B. Dmga gmpa obejmowalasiarczan zelazowo-amonowy,azotan zelaza i wersenian zelazowy. Trzecia gmpe stanowily substraty redukowane z najnizsza aktywnoscia: transferyna, hemoglobina, ferrytyna i pirogronian zelazowy. Biorac pod uwage te preferencje substratowe i aktywnosc wlasciwa reduktaz zelazajako srednia z trzech oznaczen i wyrazona w mikromolach Fe(II)-ferrozyny x min'lx ODU-Imozna ulozyc ciag substratów ukazujacy malejaca ich dostepnosc dla redukcji zelaza Fe(III): ferrioksamina B (xsr=0,26), cytrynian zelazowo-amo-

7 Nr4 Reduktazy zelaza enterokoków 365 nowy (xsr=0,17), laktoferyna (xsr=o,175) > azotan zelaza (xsr=0,08), siarczan zelazowo-amonowy (xsr=o,l1), wersenian zelazo\vy (xsr=0,125) > pirogronian zelazo\vy (xsr=o,oi), transferyna (xsr=0,02), hemoglobina (xsr=0,016), ferrytyna (xsr=0,015). DYSKUSJA Reduktazy zelaza sa szeroko rozpowszechnionewsród bakteni przezywajacych w tleno- \vych srodowiskach w obojetnym ph. Wystepujau bakterii Gram-dodatnich i Gram-lyemnych (1-15). Wytwarzaniereduktaz zelaza przez enterokokijest cecha powszeclmie\vystepujaca, gdyz ponad 90% szczepów redukowalo cytrynian zelazowo-amono\vy. Swoistoscsubstratowabakteryjnychreduktaz zelazajest szeroka. Redukuja zelazofe(iii) w zwiazkach organicznych i nieorganicznych, kompleksach z naturalnymi i syntetycznymi chelatorami oraz Z\viazanez ustrojo\vyminosnikami, a nawet wolnyjon Fe(III) (17). Reduktazy zelaza enterokoków maia równiez szeroka swoistosc substratowa. Podkreslenia jednak \vymaga niska aktywnosc redukcji naiwazniejszych poza laktoferyna ustrojo\vychnosników zelaza: transferyny, hemoglobiny i ferrytyny. Powszeclma u enterokoków zdolnosc redukowania femoksaminy B, heterogennego dla niclisideroforu, ulatwia przezywanie w ustroju w przestrzeniach z wlasna mikroflora.asymilacyjne reduktazy zelaza \vykorzystuja donory elektronów w postaci zredukowanego dinukleotydu nikotynamido- adeninowego (NADH) lub fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego(nadph) oraz kofaktorów mononukleotyduflawinowego(f1v1n), dinukleotyduflawinoadeninowego(fad)lub ryboflawiny(17). Koenzym NADH oraz kofaktor FMN zawierala mieszanina reagujaca w pomiarach aktywnosci reduktazowej gdyz wiekszosc bakteni \vymaga ich obecnosci dla redukcji (1-15). Uniwersalnosc funkcji asymilacyjnychreduktaz zelaza i niezaleznosc ich \vystepowania od dostepnosci zelaza wskazlliena konstytutywny charakter tych enzymów. Dowiedziono tego na modelub. megaterium (1), L. monocytogenes (2,7), L. pneumophila (11) i V.anguillarum (15). Szerokie spektmm substratowe i brak zaleznosci redukcji zelaza Fe(III) cytrynianu zelazowo-amonowego od niedoboru zelaza w srodowisku wskazuje, ze enterokokowe reduktazy zelaza sa równiez enzymami konstytutywnymi.takze obecnosc w podlozu wzrostowym bialka hemowego - hemoglobiny i heminy nie powodowala zmian w aktywnosci. Enterokoki jako wzgledne beztlenowce sa przystosowane do zycia w ubogim w tlen jelicie grubym i do srodowiska zmieniajacego sie od kwasnego do alkalicznego ph. Tylko u B. megaterium (1) beztlenowosc jest wamnkiem aktywnosci reduktaz zelaza. Obecnosc tlenu podczas hodowli jest konieczna dla aktywnosci reduktaz zelaza P. aeruginosa (6) i L. pneumophila (11) podczas gdy reduktazy zelaza L. monocytogenes (2) traca w wamnkach tlenowych80% sw~i~iaktywnosci.enterokokizachowalyaktywnoscreduktazowa w beztlenowychjak i tleno\vychwamnkach. Podkreslic trzeba, ze trzy z badanych szczepów \vykazywaly\vyzsza aktywnoscpo hodowli w wamnkach beztleno\vych ale obliczenia statystyczne \vykazalyna nieznamielulosctych róznic. Niektóre z bakteryjnych reduktaz zelaza Fe(III) sa czynnie \vydzielanymienzymami zewnatrzkomórkowymi lub uwalnianymi do srodowiska w \vyniku luznego powiazania z powierzchnia komórki, wzglednie wystepowaniaw przestrzeni periplazlnatycznej (17, 19). Zewnatrzkomórkowe reduktazy zelaza \vykrywanou E. coli i P. aeruginosa (19) oraz M paratuberculosis (10). U enterokoków enzymy te sa trwale Z\viazane z komórka, bowiem nie \vykrywano ich w niezgeszczonych ani zageszczonych plynach znad osadu hodowli w po-

8 366 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr4 zywkac11z niedoborem, czy nadmiarem zelaza. Umniejsza to nieco strategiczna role i efektywnosc reduktaz zelaza w pozyskiwaniu zelaza. Z drugiej stronyjednak najczesciej wystepujacym u bakterii mechanizmem prowadzacym do redukcji zelaza jest bezposredni kontakt z nim lub z jego nosnikiem. Test z ferrozyna pozwala wykrywacjony Fe(II) tylko zwiazane z powierzchnia komórki i uwalniane do srodowiskabowiem zwiazek ten nie przenika przez blone cytoplazmatyczna. Takwiec uzywaiacjako zródla enzymu pelnych komórek enterokoków oznaczano aktywnoscreduktaz zelaza zwiazanych z powierzchnia komórki, najprawdopodobniej z blona cytoplazmatyczna. Strategiczne rozmieszczenie na powierzchni komórki, wykorzystywanie reduktantów w postaci NADH i woln~i flawiny FMN oraz brak indukcji niedoborem zelaza dowodza konstytytutywnego charakteru tych asymilacyjnych reduktaz zelaza. Pojawiajace sie ostatnio doniesienia dotyczace wspóldzialania sideroforów i reduktaz zelaza moga zmienic nasz poglad na znaczenie jednych i drugich w przyswajaniu zelaza przez bakterie (15, 5). Siderofory sa chelatorami indukowanymi zas reduktazy enzymami konstytutywnymi, których synteza w odróznieniu od sideroforów zachodzi niezaleznie od dostepnosci zelaza. Sideroforyzaliczono ostatnio do metabolitów wtórnych gdyz wytwarzanie ich nastepuje w póznych fazach wzrostu- fazie sta~ionarnej i zamierania hodowli. Reduktazy zelaza sa wytwarzane w przebiegu wszystkich faz hodowli. Te ich cechy sprawiaja, ze moga one odgrywacznacznie wieksza niz sideroforyrole w l1nlchamianiuzasobów zelaza Fe(llI) w otoczeniubakterii. Dlategomozna zaproponowacwystepowanieprzynajmniejdwóch oddzielnych dróg pozyskiwania zelaza przez bakterie, które wytwarzaja siderofory i reduktazy zelaza. Naleza do nich równiez enterokoki. W warunkach dostepnosci zelaza w otoczeniu reduktazy zelaza przeksztalcaia zelazo Fe(III) w zelazo Fe(II), które moze byc przenoszone do komórki przez transporter NraIt1p(natural resistance-associated macrophages proteins) lub/i droga swobodn~idyfuzji, sciezki asymila~ii zelaza o niskim do niego powinowactwie (16). Przy ograniczon~i dostepnosci zelaza Fe(III) i malejacego wskutek tego stezenia w komórce zelaza Fe(II) nastep1liederepresja systemu sideroforów i przy udziale tych chelatorów otwiera sie druga droga pozyskiwania zelaza (3). Sideroforywiaza wolne i skompleksowane zelazo Fe(III) ale takze wolne, po redukcji jony Fe (II). Zwiazanie tych ostatnich z sideroforem powodqie natych111iastoweich utlenienie do zelaza Fe (III) tak, aby kompleks Fe(III)-siderofor mógl byc przeniesiony do cytoplazmy. Dzialanie obu tych dróg wymaga obecnosci konstytutywnych reduktaz zelaza. U enterokoków ograniczeniem w przypisywanym reduktazom dzialaniu moze byc ich scisly zwiazek z komórka. Nie moga zatem uruchamiac przez redukcje zasobów zelaza Fe (III) w otoczeniu komórki. Redukuja substraty.tylko stykajace sie z powierzchnia komórki a przeniesienie jonu Fe(lI) do cytoplazmy moglo by sie odbywac droga swobodnej dyfuzji. Taki111i indywidualnymi droga111ipoborujony Fe(II), oddzielnymi od dróg transportu kompleksów Fe(III)-siderofor posluguja sie Gram-dodatnie paleczki L. monocytogenes (2) oraz Gram-ujemne- E. coli(19)i P.aeruginosa(19).

9 Nr4 Reduktazy zelaza enterokoków 367 P. Lisiecki, J. Mikucki ASSIMILATORY FERRIC REDUCTASES IN"ENTEROCOCCI Summary Enterococci produced assimilatoryferric reductaseswhich are surface-associatedenzymes. This is the first report of the intracellular enzymic reduction of iron by enterococci. A correlation between ferric reductases activity and species affiliationand originofstrains was found. The expression offerric reductases has not affected by the presence or absence of iron, hemin and hemoglobin in the growth medium. Enterococcal ferric reductases exhibit a very broad specificity.a number of different ferric organic and inorganic compounds, natural and synthetic iron chelators and iron body sources including lactoferrin, transferin, ferritin, haemoglobin, could be reduced. A surface-associated ferric reductases may be one component of a general iron scavenging mechanism which can be used by enterococci growing in a variety of environments. PISMIENNICTWO l. Arceneaux JE, Byers BR. Ferrisiderophore reductase activity in Baci//us megaterium. J Bacteriol 1980; 141: Barchini E, Cowart RE. Extracellular iron reduetase aetivity produeed by Listeria monocytogenes. Areh Mierobiol1996; 166: Clarke TE, TariLW, Vogel HJ. Structural biology of baeterial iron uptake systems. Curr Top Med Chem 2001;1: Coves J. Fontecave M. Reduetion and mobilization of iron by a NAD(P)H: llavin oxidoreductase from Escherichia coli. Eur J Biochem. 1993;211: Cowart RE. Reduetion of iron by extraceliular iron reductases: implieations for microbial iron acquisition. Areh Bioehem Biophys 2002; 400: Cox CD. Iron reduetases from Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 1980;141: Deneer HG. Healey r.;boychuk l. Reduction of exogenous ferrie iron by a surface-assoeiated ferrie reductase oflisteria spp. Microbiology 1995;141: Dixon W J. MasseyJ. Introduction to statistical analysismc Graw-Hil1Book Co., New York Halle F. Meyer JM. Ferrisiderophore reductases of Pseudomonas. Purification, properties and eellular loeation of the Pseudomonas aeruginosa ferripyoverdine reductase. Eur J Bioehem1992; 209: Homuth M. falentin-weigand P. Rohde M. Gerlach GR Identification and charaeterization of a novel extracellular ferrie reductase from Mycobacterium paratuberculosis. Infeet Immun 1998;66: Johnson W, farner L, Poch M. Acquisition of iron by Legionella pneumophila: role of iron reduetase. Infectlmmun 1991; 59: Lascelles J. Burke KA. Reduetion of ferric iron by L-laetate and DL-glyeerol-3-phosphate in membrane preparations from Staphylococcus aureus and interactions with the nitrate reductase system. J Bacteriol 1978;134: Le Faou AE. Morse SA. Charaeterization of a soluble ferric reduetase from Neisseria gonorrhoeae. Biol Met 1991; 4: Lisiecki P. JJYsockiP. MikucJ,;J. Occurrenee of siderophores in enterococci. Zentraibl Bakteriol. 2000; 289: Mazoy R, Lemos ML. Ferric-reduetase sctivites in whole cells and celi fractions off7brio(listonella) angui//arum. Microbiology 1996; 141:

10 368 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr4 16. Ratledge C, Dover LG. Iron metabolism in pathogenic bacteria. Annu Rev MicrobioI2000;54: Schroder l, Johnson E, de Tries S. Microbial ferric iron reductases. FEMS Microbiol Rev 2003; 27: Stookey L. L. Ferrozine - a new Spectrophotometric reagent for iron. Anal Biochem 1970; 42: Vartivarian SE, Cowart RE. Extracellular iron reductases: identification of a new class of enzym es by siderophore-producing microorganisms. Arch Biochem Biophys 1999; 364: Otrzymano: 9 XI 2005 r. Adres Autora: Lódz, ul. Pomorska 137, Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej UM w Lodzi. lisiecki@toya.net.pl