Pawel Lisiecki, Maria Sobis-Glinkowska, Piotr JJysocki, Jerzy Mikucki WZROST ENTEROKOKÓW W NORMALNEJ I WYSYCONEJ ZELAZEM SUROWICY*

Transkrypt

1 MED. DOSW. MIKROBIOL, 2001, 53, Pawel Lisiecki, Maria Sobis-Glinkowska, Piotr JJysocki, Jerzy Mikucki WZROST ENTEROKOKÓW W NORMALNEJ I WYSYCONEJ ZELAZEM SUROWICY* Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Katedra Mikrobiologii AM w Lodzi Kierownik: dr hab. E.M. Szewczyk Wsród zbioru 20 wytwarz~acych siderofory szczepów rodzaju Enterococcus izolowanych z róznych zródel badano. zdolnosc wzrostu w normalnej surowicy ludzkiej i surowicy ludzkiej wzbogaconej zelazem. W organizmie zwierzecym Fe(III) wystepuje w zelazoproteidach hemowych i niehemowych, polaczeniach o znacznej trwalosci. Ogranicza to stezenie wolnych, dostepnych dla bakte.rii jonów Fe(III) do okolo lo-18m(8). Nie pokrywa ono, podtrzymujacego wzrost bakterii, zapotrzebowania na ten pierwiastek (11). Zelazoproteidy niehemowe - transferyna osoczowa i laktoferyna, wystepujaca w osoczu tylko w sladowych ilosciach, tworza pule zelaza transportowanego. Wydobycie go z tych polaczen wymaga rozerwania wiazania o wysokiej stalej powinowactwa K= 1-6 x lo-22m(12). Mimo to, te dwa glikoproteidowe nosniki zelaza moga byc jego zródlem dla wielu bakterii umozliwiajac w ten sposób kolonizacje ustroju (13). Celem badan bylo sprawdzenie zdolnosci enterokoków do wzrostu w normalnej surowicy ludzkiej w aspekcie ich zapotrzebowania na zelazo i mechanizmów jego pozyskiwania. MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. W badaniach wykorzystano 20 szczepów z rodzaju Enterococcus izolowanych z materialu klinicznego, od zwierzat, z zywnosci i srodowiska. Do identyfikacji szczepów z kolekcji wlasnej uzyto systemu API - STREP (biome-. rieux). Szczepy przechowywano w temperaturze -70 C w 3,7% Brain Heart Infusion (Difco) zawierajacym 50% glicerolu.(tabela I). p o z y w k i i war u n k i h o d o w l i. Do oceny wzrostu enterokoków w surowicy bakterie hodowano na stalej pozywce Mueller - Hintona 2 (biomerieux) z niedoborem Fe(III). Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C mase bakteryjna zbierano, trzykrotnie przeplukiwano 0,85.%NaCI, wirowano (9500 x g, 4 C, 15 min.) i zawieszano w buforowanym 0,85% NaCI o ph 7,2 (Biomed). * Praca finansowana w ramach grantu wewnetrznegoakademii Medycznej w Lodzi AM (55).

2 112 P. Lisieckii inni Nr 2 Do oznaczania aktywnosci sideroforowej (glodzenia i namnazania bakterii) uzywano pozywkizawierajacej(w 1 litrze): 3 g Casamino Acids Vitamin Free (Difco); 3 g Yeast Extract (Difco); 2 g glukozy; 3 g KH2P04; 5 g NaCI; 1 g NH4Cl; 0,09 g MgCh; 0,01 g CaCh; 12,1 g Tris -(hydroxymetylo)aminometan (Serva), ph pozywki doprowadzano do 7,2. Zawartosc zelaza w pozywce obnizano do stezenia ok. 1 x 10'6M za pomoca jonowymiennej zywicy poliaminokarboksylowej Chelex 100 ( mesh) (Bio Rad). Pozywke zakazano 18 godzinna hodowla badanego szczepu na agarze z krwia doprowadzajac gestosc optyczna wyzej wymienionej pozywki do A580 = O,l. Drobnoustroje glodzono przez 18 godzin w temperaturze 37 C ze stalym wstrzasaniem (75 cykli/minute). Stanowily one inokulum (5% v/v) dla posiewów na nowa porcje pozywki. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C przy stalym wstrzasaniu (120 cykli/minute) hodowle wirowano (9500 x g, przy 4 C, przez 15 minut), osad odrzucano, plyn znad osadu saczono przez filtr membranowy 0,22 JlM (Millipore). Liczenie bakterii i standaryzowanie zawiesin. Zawiesiny bakteryjne standaryzowano w kolorymetrze spektralnym Spekol (Zeiss) przy dlugosci fali swietlnej 580 nm. Liczbe zywych komórek oceniano za pomoca seryjnych rozcienczen w buforowanym 0,85% roztworze NaCI (Biomed) o ph 7,2 i standardowych posiewów na plytki z 4% Trypticase Soy Agar (Difco). O z n a cz an i e wz ros t u w s u r ow i cy. Ludzka normalna surowice otrzymywano z krwi pobranej od zdrowych ochotników. Do 0,5 mi inaktywowanej surowicy (56 C przez 30 minut) nie zawierajacej egzogennego Fe(III) (OFe) i uzupelnionej Fe(III) za pomoca nitrylotrioctanu zelaza (1) do stezenia 0,2 mm (+ Fe) dodawano inokulum w postaci 0,5 mi standaryzowanej zawiesiny badanego szczepu o znanej liczbie komórek i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37 C. Po inkubacji oznaczano koncowa liczbe zywych komórek w zawiesinie. O zn acz a n i e ak tywn o s c i si d e ro fo row ej. Aktywnosc sideroforowa oznaczono w niezageszczonych i pieciokrotnie zageszczonych plynach nadosadowych hodowli metoda Schwyna i Neilandsa (9) z Chrom Azurolem S (test CAS). Aktywnosc wyrazano jako mg metanosulfonianu desferrioksaminy B (Desferal, Ciba - Geigy) na mi hodowli. M e t o d y a n a l i t Yc z n e. Zawartosc zelaza oznaczano za pomoca ferrozyny (Sigma) metoda Gadia i Mehra (3). Statystyczna znamiennosc róznic oceniano testem nieparametrycznym U wg Manna-Whitney'a przy poziomie znamiennosci p::; 0,005 (2). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W surowicy ludzkiej Fe(III), które mogloby byc wykorzystywane przez enterokoki, wystepuje w postaci wolnej i skompleksowanej. Stezenie wolnego Fe(III) nie przekracza z powodu jego niskiej rozpuszczalnosci 1O.18Mi moze byc niewystarczajace dla podtrzymania wzrostu enterokoków. Najwazniejsza czesc skompleksowanego Fe (III) jest zwiazana z jego zewnatrzkomórkowymi zasobami - transferyna i laktoferyna (12). Wewnatrzkomórkowym zródlem Fe(III) pojawiajacym sie w surowicy moze byc ferrytyna (12). Uwalniana z rozpadlych erytrocytów hemoglobina jest w surowicy wiazana przez haptoglobine, a wolny hem powstajacy w wyniku dysocjacji hemoglobiny - przez hemopeksyne i albuminy (12). Fe (III) zawarte we wszystkich tych zródlach jest uzytkowane przez liczne bakterie (13) i mozna bylo oczekiwac, ze korzystac z nich moga

3 Nr2 Siderofory enterokoków 113 równiez enterokoki. Wiadomo, ze bakterie te moga wykorzystywac Fe(III) bydlecej transferyny, laktoferyny i mioglobiny oraz konskiej ferrytyny (10). "Wlasne dane doswiadczalne wskazuja, ze enterokoki pobieraja 59Fez ludzkiej transferyny i Jaktoferyny (niepublikowana praca). Szczepy uzyte w badaniach nalezaly do pieciu gatunków: E. faecalis, E. faecium, E. mundtii, E. sulfureus i E. durans. Siedemnascie z nich (E. faecalis i E. faecium) wyizolowano z materialu klinicznego od ludzi, jeden (E. mundtii), pochodzil. od zwierzecia, jeden (E. durans) z zywnosci i jeden (E. sulfureus) ze srodowiska. Badania mechanizmów asymilacji Fe(III) przez enterokoki zostaly dopiero zapoczatkowane. Niedawno udowodniono, ze bakterie te wytwarzaja siderofory nalezace do klasy chelatorów hydroksamowych (4, 5). Wszystkie badane szczepy enterokoków wytwarzaly siderofory, których aktywnosc chelatujaca oznaczano za pomoca testu CAS (Tabela I). Najnizsza aktywnosc wynosila 19,73 JLg/mla najwyzsza 36,23 JLg/ml.Szczepy te mialy wiec potencjalna zdolnosc pobierania Fe(III) z jego ustrojowych zródel. W innych badaniach wykazano, ze enterokoki pobierajace Fe(III) ze zwierzecych jego zródel poslugiwaly sie sideroforami (10). Brak jest danych o innych, wystepujacych u bakterii mechanizmach asymilacji Fe(III), które moglyby byc wykorzystywane przez enterokoki w surowicy: proteolitycznym rozkladzie nosnika, redukcji Fe(III) do Fe(II) i uwalniania jonu czy przenoszenia Fe (III) z nosnika na receptor powierzchni komórki (6). Nie wiadomo wiec, który( e) z tych mechanizmów mógl dzialac podczas wzrostu enterokok6w w surowicy. Namnazanie sie enterokoków w surowicy oceniano na podstawie odzyskiwania wiecej niz 100% liczby komórek stanowiacych inokulum po 24 godzinach inkubacji (7). Sposród 22 badanych szczepów enterokoków, 12 (63,6%) namnazalo sie w surowicy OFe i byly to wylacznie szczepy izolowane z materialu klinicznego (E. faecalis, E. faecium). Intensywnosc ich wzrostu byla rózna. Mierzona wielokrotnoscia wprowadzanego inokulum, u 5 szczepów wynosila od 1,2 do 2,0, u kolejnych 5 szczepów od 3,0 do 4,0 a u 2 szczepów byla wieksza od 4,0 (Tabela I). Statystyczna analiza wyników ujawnila, ze róznice w liczbie komórek wprowadzanych do surowicy (inokulum) i po 24 godzinach inkubacji w normalnej surowicy nie wysyconej zelazem (OFe) byly statystycznie znamienne (p=0,005). Dwa glówne zródla Fe (III) w surowicy - transferyna i laktoferyna sa nie w pelni wysycone zelazem. Transferyna jest nim wysycona w 30% zas laktoferyna tylko w 9% (12). Dodanie do normalnej surowicy nitrylotrioctanu zelaza do stezenia 0,2 mm powoduje pelne wysycenie tych nosników (1). Szczepy rosnace w surowicy OFe rosly równiez w wzbogaconej w ten sposób zelazem surowicy + Fe (Tabela I). Róznice w liczbie komórek wprowadzonych do surowicy (inokulum) i po 24 godzinach inkubacji w surowicy + Fe byly znamienne statystycznie (p=0,003). Analizujac intensywnosc wzrostu stwierdzono, ze nie rózni sie on u wiekszosci szczepów (u 10 z 12) od wzrostu w surowicy OFe. Wielokrotnosci liczby komórek inokulum byly w surowicy + Fe takie same lub bardzo zblizone. Obserwacje,te zostaly potwierdzone statystycznie, gdyz brak bylo istotnych róznic miedzy wzrostem w surowicy OFe i +Fe gdyz p=0,767. Dwa szczepy - E. faecalisbd 36 i E. faecium 99 H+, oba pochodzace z materialu klinicznego, wylamywaly sie z tej reguly. Wzrost szczepu E. faecalis BD 36 byl hamowany w surowicy +Fe i odpowiadal 54,7% wartosci liczbo-

4 r 114 P. Lisieckii inni Nr 2 Tabela I. Aktywnosc sideroforowa i wzrost w surowicy szczepów z rodzaju Enterococcus Szczep Aktywnosc Wzrost w surowicy(cfu/ml)* Pochodzenie sideroforowa Inokulum OFe +Fe szczepu (g/ml) x 106 x 106 X 106 E. JaecalisBD26 material 22,20 2,5 4,1 4,1 E. JaecalisBD36 material 30,46 1,0 4,2 2,3 E. JaecalisBD122 material 21,38 1,9 3,8 3,0 E. JaecalisBD123 material 19,73 1,0 1,7 2,4 E. Jaecalis BD156 material 23,85 5,5 5,0 3,6 E. JaecalisBD160 material 25,09 3,8 3,3 3,4 E. Jaecalis BD181 material 23,40 2,1 9,7 2,3 E. sulfureusdsm 6905 srodowisko 25,09 7,0 0,6 1,3 -B.Jaecalis ATCC material 21,20 9,4 5,6 5,1 E. mundtii CCM 4059 zwierzeta 31,28 1,6 0,3 1,6 E. durans CCM 4051 zywnosc 24,26 3,7 1,2 2,1 E. Jaecalis 62-1 material 24,26 0,5 2,4 2,6 E. Jaecalis 22-1 material 24,68 0,2 0,4 0,5 E. Jaecalis 97-0 material 22,61 0,1 3,8 3,8 E. Jaecalis 39-2 material 23,04 2,1 8,0 7,4 E. Jaecalis99H+ material 23,03 1,9 2,3 10,4 E. Jaecalis.113 material 24.,26 2,3 7,3 6,6 E. Jaecalis material 23,85 4,8 3,9 3,3 E. Jaecalis 13-5 material 23,44 2,3 9,1 11,8 E. Jaecalis 8-1 material 36,23 3,8 12,6 11,7 ') cfu - colony forming units, jednostki tworzace kolonie

5 Nr 2 Siderofory enterokoków i15 - wej inokulum zas wzrost szczepu E. faecium 99 H + byl silnie styiimlowany, do 4,5 wielokrotnosci wartosci inokulum. Pozostale 8 (36,4%) z 22 szczepów enterokoków nie roslo w surowicy OFe. Piec z nich bylo izolowanych z materialu klinicznego (E. faecalis), 1 od zwierzat (E. mun-. dtii), 1 z zywnosci (E. durans) i 1 ze srodowiska (E. sulfureus).u trzech szczepów odsetek odzyskiwanego inokulum wynosil 81,2%, 86,8% i 90,1%. Biorac pod uwage blad metody w liczeniu zywych komórek bakteryjnych mozna zalozyc, ze drobnoustroje te nie mnozyly sie w surowicy OFe ale w niej przezywaly. Dla pozostalych szczepów natomiast odsetek odzyskiwanego inokulum byl duzo nizszy, od 8,6% do 58,5%. Mozna wiec twierdzic, ze wzrost tych drobnoustrojów w surowicy OFe byl hamowany. Podkreslic tu nalezy, ze drobnoustroje nie mnozace sie w surowicy wytwarzaly siderofory i nie mialo to wplywu na ich wzrost. Jedna tylko publikacja w dostepnym nam pismiennictwie dotyczy wzrostu jednego szczepu enterokoków w normalnej surowicy (1). Szczep S. faecalis mnozyl sie w normalnej surowicy ale nadmiar Fe(III) nie mial wplywu na jego wzrost. Wyniki naszych badan obejmujace 20 szczepów trudno konfrontowac z danymi odnoszacymi sie do jednego tylko szczepu. Nie potwierdzaja one jednak w pelni tych obserwacji. Wiekszosc szczepów badanych rzeczywiscie mnazala sie w normalnej surowicy ale reszta albo przezywala w niej albo wzrost byl hamowany. Wysycenie surowicy Fe(III), co inni autorzy okreslaja nadmiarem Fe(III) w stosunku do warunków fizjologicznych, nie mialo wplywu na wzrost. Widocznie enterokoki pokrywaly calkowicie swoje zapotrzebowanie na Fe(III) jego naturalnymi zasobami w surowicy. Wzrost wiekszosci bakterii, które maja zdolnosc wyrastania w normalnej surowicy byl zawsze stymulowany nadmiarem Fe(III) (1). Mozna wobec tego sadzic, ze zapotrzebowanie enterokoków na Fe (III) jest minimalne, o czym zreszta wspominaja inni autorzy (8). Wyniki naszych wczesniejszych badan równiez tego dowodza ale w posredni sposób: wiekszosc enterokoków charakteryzowala sie znaczna opornoscia na silny chelator zelaza jakim jest kwas etylenodiamino-diorto-hydroksyfenylooctowy (EDDA) i wiazaca sie z tym mala wrazliwoscia na niedobór tego pierwiastka (10). Enterokoki zasiedlaja w ustroju przestrzenie obfitujace w pokarm ale ubogie w tlen. Ich oddychanie i wydajnosc energetyczna moze w mniejszym stopniu zalezec od ukladu oksydacyjno-redukcyjnego, którego wiekszosc skladników zawiera w czasteczce zelazo. P. Lisiecki, M. Sobis-Glinkowska, P. Wysocki, J. Mikucki GROWTH OF ENTEROCOCCI IN NORMAL AND IRON SATURA'IED HUMAN SERUM Summary Among 20 strains of genusenterococcusisolatedfrom differentsources 12 strains multiplied in iron unsupplemented normal human serum. The excessof iron did not increase the rate of multiplication. Three strains sulvivedin serum and growth of five strains was inhibited. The si~erophores production had no effect on the multiplicationof enterococciin serum unsupplemented with iron.

6 116 P. Lisieckii inni Nr 2 PISMIENNICIWO - 1. Brock JH, Ng J. The effect of desferrioxamine on growth of Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica and Streptococcus faecalis in human serum: uptake of desferrioxamine~bound iron. FEMS Microbiol Lett 1983; 20: Dixon WJ, Massey FJ. Introduction to statistical analysis. McGrow-Hill Book Co., New York Gadia MK, Mehra Me. Rapid speetrophotometric analysis of total and ionie iron in the p,g range. Mierochim Acta 1977; II: Lisiecki P, Wysocki P, Mikucki J. Siderofory klasy hydroksamowej u enterokoków. Med Dosw Mikrobiol 1999; 51: Lisiecki P, Wysocki P, Mikucki J. Occurrence of siderophores in enterococci. Zent Bl Bakteriol1999; 298: ' 6. Mikucki J, Lisiecki P. Siderofory agresyny bakteni. Post Mikrobio11998; XXXVII: Montgomerie JZ, Bindereif A, Neilands JB i inni. Association of hydroxamate siderophore (aerobactin) with Escherichia coli isolated from patients with bacteremia. Infeet Immun 1984; 46: Neilands JB, Konopka K, Schwyn B i inni. Comparative biochemistry of microbial iron assimilation. W: Iron transport in microbes, plants and animals. Red. G. Winkelman, D. van der Helm, J. B. Neilands, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987, Schwyn B, Neilands JB. Universal chemical assay for detection and determination of siderophores. Anal Biochem 1987; 160: Sobis-Glinkowska M, Mikucki J, Lisiecki P. Zwierzece ustrojowe zródla zelaza wykorzystywane in vitro przez enterokoki. Med Dosw Mikrobiol 2001; 53: Weinberg ED. Iron witholding: a defense against infection and neoplasia. Physiol Rev 1984; 64: Williams P, Griffiths E. Bactenal transferrin receptors - structure, funetion and contnlmtion to virulence. Med Microbiol Immunol 1992; 181: Wooldridge KG, Williams PH. Iron uptake mechanisms of pathogenie bacteria. FEMS Mierobiol Rev 1993; 12: Otrzymano:8 XII 2000 r. Adres Autora: Lódz, ul. Pomorska 137, Zaklad MikrobiologiiFarmaceutycznejAM w Lodzi.