Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3

Transkrypt

1 Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3 Metoda PCR została opracowana w 1987 r. przez grupę Naukowców z Cetus Corporation w USA. Firma Roche odkupiła od Cetus Corp. prawa do PCR za 300 mln $ Autor K. Mullis otrzymał w 1993r. nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. 1

2 Początkowo stosowano fragment Klenowa polimerazy DNA I z E. coli, który wykazuje aktywność 5 3 polimerazy oraz 3 5 egzonukleazy, brakuje natomiast aktywności 5 3 egzonukleazy, dzięki czemu nie występuje niebezpieczeństwo degradacji primerów podczas reakcji. Polimeraza ta była niestabilna w wyższych temperaturach, dlatego konieczne było dodawanie jej kolejnej porcji w każdym kolejnym cyklu. Niekorzystne cechy tej polimerazy zostały wyeliminowane przez użycie polimerazy Taq z termofilnych bakterii Thermus aquaticus temperatura denaturacji matrycy nie pozbawia enzymu aktywności. 1. Matryca DNA (RNA) 2. Startery 3. dntp 4. MgCl 2 5. Polimeraza 6. Bufor 2

3 najlepiej dodać najpierw wodę, a następnie kolejno pozostałe składniki mieszaninę reakcyjną przetrzymujemy w lodzie podczas pracy gdy matrycą jest powszechnie używane DNA w laboratorium lub gdy są jej śladowe ilości, to praca powinna odbywać się w laminarnym przepływie sterylnego powietrza, a tipsy i pipety powinny być zabezpieczone korkami podczas pracy z małymi objętościami komponentów (1-2 μl) trzeba uważać, aby do wszystkich prób dodana została jednakowa ilość (szczególnie ważne przy ilościowym PCR) Niekorzystna zbyt duża/zbyt niska liczba matryc - Ilość DNA 1ng-1μg - Wyjściowa liczba matryc: DNA człowieka 3*10-5 DNA drożdży 1μg DNA E. Coli 1ng Odpowiedni stopień czystości (UV, elektroforeza ) - Zanieczyszczenia matrycy: SDS, EDTA, DMSO, heparyna, fenol, sole Metoda izolacji - usunięcie inhibitorów reakcji 3

4 Efekt zbyt dużej liczby matryc Degradacja DNA Polimeraza Taq: Wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus Aktywność polimerazy 5-3 Aktywność egzonukleazy 5-3 Brak aktywności egzonukleazy 3-5 Aktywność polimerazy Taq około 2000 nt/min (60 nt/s) w optym. temperaturze C Po reakcji na końcach 3' kilka nukleotydów adeninowych, właściwość wykorzystywana jest przy klonowaniu produktów PCR. Do swej aktywności wymaga jonów Mg 2+ Procesywność, wierność, szybkość 4

5 Cechy: - odpowiednia długość (18-28 nt) - zawartość GC % Tm [2n 1 (A+T)+4n 2 (G+C)] C T a C -wyznaczana doświadczalnie -wpływ na specyficzność Dobór stężenia roboczego 10 pmol/ μl -zbyt duże stężenie- niespecyficzność produktów Dimery starterów - komplementarność końców 3 metoda oparta o %GC: Tm[ o C] = 81,5 + 16,6 x log[na] + 0,41 x (%GC) - 675/długość - 0,65 x (%formamidu) - (%niekomplementarnych) metoda uproszczona: Tm = [2 o x (A + T) + 4 o x (G + C)] metoda w oparciu o zasady sąsiadujące 5

6 startery - najczęściej to ich sekwencja i stężenie decyduje o powodzeniu reakcji: nie powinny tworzyć wewnętrznych struktur 2-rzędowych Powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T nie mogą komplementować między sobą na 3 końcu nie mogą zbyt silnie wiązać na 3 końcu do 5 można dodawać: miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych, tzw. lepkie końce stężenie 0,1-0,5 M (za dużo - pomyłki, za mało - mniej produktu) startery zdegenerowane, modyfikacje: biotynowanie, zabezpieczanie przed 3 degradacją - wiązania fosfotiolowe, fosforylacja Źle zaprojektowane startery 6

7 Wpływ temperatury wiązania starterów - termocykler z gradientem temp. - wyznaczanie optymalnej T m dntp-trifosforany deoksyrybonukleotydów niezrównoważony skład obniża dokładność polimerazy, stężenie wyjściowe: 5-10 mm stężenie reakcji: µm jednakowe stężenie wszystkich dntp ph 7, 7

8 MgCl 2-0,5-5,0 mm - wpływa na aktywność enzymu, zwiększa T m dsdna, tworzy kompleksy z dntp dając substrat dla polimerazy, Stężenie jonów Mg > stężenie dntp dntp Stężenie optymalne µM MgCl 2 Wiązanie przez: matrycę, startery, polimerazę Taq, dntp datp:dgtp: dctp: dttp Stosowanie jednakowych stężeń Dokładność reakcji Proporcjonalna do stężenia wolnych MgCl 2 Wrażliwość na degradację Rozkład- przyczyna braku produktu Wzrost dokładności polimerazy Stężenie MgCl 2 nieco wyższe od steżenia dntp 8

9 Należy zwrócić uwagę na: - Stężenie 0,5-5U na 100µl zbyt duże- niespecyficzne produkty zbyt małe- brak produktów - Przechowywanie -20 C - Okres półtrwania 92,5 C 2h 95,0 C 40 min 97,5 C 5 min (!) 9

10 DMSO Żelatyna BSA Tween 20 PEG Fenol SDS Proteinaza K Porfiryna EDTA Etanol 10

11 Zapewnia odpowiednie warunki dla działania polimerazy ph 8,3-8,8 Tris-HCl w zakresie mm Czynniki ujemnie wpływające na PCR: 1. Jakość i zanieczyszczenia matrycy 2. Startery - powstawanie dimerów starterów - niska specyficzność starterów 3. Niewłaściwy dobór stężeń dntp i MgCl 2 4. Błędy polimerazy 5. Zanieczyszczenia odczynników 6. Ilość cykli 11

12 ETAP CZAS C początkowa denaturacja 2-5 min 94 denaturacja 1-60 s 94 przyłączanie starterów s 54 wydłużanie starterów s 72 ostatnie wydłużanie 5-10 min 72 schładzanie b/o 4 x Aktywność polimerazy Taq około 2000 nt/min (60 nt/s) w optym. temperaturze C Denaturacja nie powinna być dłuższa niż 60 s, ponieważ wpływałoby to na aktywność enzymu Początkowo czas wydłużania ustalamy 1kb -1 min, 2kb 2 min itd., przy kolejnych reakcjach można skracać Przyłączanie starterów temp. zależy od temp. topnienia obu oligonukleotydów Liczba cykli 30, więcej cykli nie wpływa znacząco na ilość produktu OPTYMALIZACJA usunięcie niespecyficznych produktów 12

13 Specyficzność eliminowanie niespecyficznych produktów podwyższyć temperaturę annealingu (przyłączania starterów), obniżyć stężenie jonów Mg 2+ zmienić skład nukleotydowy primera obniżyć ilość cykli zmienić polimerazę Długość produktu amplifikacja długich fragmentów wydłużyć czas syntezy dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg 2+ zmienić polimerazę skrócić czas denaturacji podwyższyć stężenie matrycy zmienić ph buforu do PCR Wierność redukcja błędów syntezy obniżyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy obniżyć stężenie dntp zmienić polimerazę Ilość produktu zwiększenie ilości amplifikowanych fragmentów zwiększyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy zmienić polimerazę obniżyć temperaturę annilingu wydłużyć czas syntezy 13

14 Hot start - unikanie niespecyficznej amplifikacji podczas pierwszego cyklu (RT 94 o C): wkładać probówki do gorącego bloku dodawać polimerazę lub startery do gorącej mieszaniny odseparować startery od reszty reakcji parafiną korzystać z polimerazy zabezpieczonej przeciwciałem inne zabezpieczenia dysocjujące w wyższej temperaturze Touch-down PCR pierwsze kilka cykli wykonane przy dużo wyższej temp. przył. startera zwiększa specyficzność Kłopoty z subklonowaniem produktu PCR po Taq polimerazie zostaje ok. 70% końców tępych, a reszta ma 1 zasadę wystającą na końcu 3 (zwykle A) - można ligować na lepko (!) większość starterów zdefosforylowanych na końcu 5 (PNK). 14

15 Cechy PCR PCR w zastosowaniu analitycznym (diagnostycznym) Wykrywanie sekwencji o niewielu kopiach Analizy genetyczne Sądownictwo Synteza sond PCR jako metoda syntezy (zastosowanie laboratoryjne) Synteza insertów przeznaczonych do klonowania Czułość Synteza matryc do sekwencjonowania Specyficzność Wierność Ilość produktu - (+) _ +++, niezwykle istotna; ++, bardzo istotna; +, istotna; (+), może być istotna; -, nieistotna. Jedna zasada, wiele modyfikacji 15

16 nested - zagnieżdżony PCR, multiplex PCR - jednoczesna amplifikacja kilku fragmentów (dłuższe startery), long (expanded, extended) PCR - dla fragmentów > 5kb - mieszanki polimeraz, octany, dwie temp. (np.99/68), inverted PCR, asymetryczny PCR (zmiana proporcji starterów po cyklach), LCR - ligase chain reaction, RT-PCR, in situ PCR (genomowy i RT) w tkance, Real time PCR mutageneza kierowana - wprowadzanie zmian, AMV-RT - avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, zachowuje aktywność do 55 C, eliminuje problemy związane strukturą II-rzędową MMLV-RT - moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase, ma mniejszą aktywność RNAzy H niż AMV-RT i jest lepsza do syntezy pełnej długości cząsteczek cdna synteza cdna: hybrydyzacja ze specyficznym starterem hybrydyzacja z oligo (dt) hybrydyzacja z heksamerami AAAA TTTT AAAA AAAA 16

17 dwie lub więcej docelowych sekwencji jest namnażanych w jednej probówce jedna z tych sekwencji to najczęściej wewnętrzna kontrola poprawności warunków reakcji a druga jest sekwencją docelową zastosowanie diagnostyczne polimorfizmy analizy mikrobiologiczne SSCP- polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single strand conformation polymorphism) wykorzystywany w celu wykrywania punktowych mutacji w genomowym DNA w war.natywnych DNA przyjmuje określoną konformację zależną od sekwencji nukleotydowych szybkość zależna od wielkości i konformacji >95% wykrywalność dla DNA o wielkości pz Do detekcji reakcja srebrzenia, radioizotopy, rzadziej bromek etydyny 17

18 PCR-HD Wykrywanie mutacji metodą heterodupleksów 1. Do produktów PCR powyżej 400 pz 2. Układ heterozygotyczny( 2 allele zmutowany i prawidłowy) 3. Amplifikacja inkubacja w celu utworzenia heterodupleksów 4. Heterodupleks- hybrydyzacja nie w pełni komplementarna 5. Substytucja-obustronne wybrzuszenie 6. Insercja lub delecja- jednostronne wybrzuszenie lub ugięcie nici Polimorfizmy RFLP to dziedziczne warianty sekwencji DNA, które objawiają się utworzeniem bądź zanikiem miejsca rozpoznawalnego przez endonukleazy restrykcyjne lub zmianą liczby nukleotydów między takimi miejscami. Amplifikacja fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP a potem jego hydroliza enzymem restrykcyjnym. 18

19 pozwala na amplifikację długich fragmentów DNA, można w ten sposób uzyskiwać fragmenty nawet do 27 kb, rutynowo służy do otrzymywania fragmentów kb długie fragmenty uzyskuje się stosując mieszaninę termostabilnych polimeraz DNA, zwykle: polimerazę Taq zapewnia wysoką procesywność (aktywność 5-3 polimerazy) polimerazę Pwo zapewnia poprawność (aktywność 3-5 egzonukleazy) Nested PCR dwa zestawy primerów: zewnetrzne i wewnętrzne, ale dwie rundy amplifikacji. cel: zwiększenie czułości (pg) i specyficzności PCR 19

20 enz transgen enz trawienie restrykcyjne a następnie ligacja (to nie jest plazmid!) przecinamy w obszarze transgenu enz., który nie trawi transgenu projektujemy primery amplifikacja, klonowanie i sekwencjonowanie Koliste fragmenty DNA stają się matrycą produkty są w mieszaninach, w których formy koliste zawierają oba miejsca przyłączania starterów pozwala zamplifikować obszary wokół transgenu 20

21 niskie tło znakowanie po specyficznej hybrydyzacji, startery nie są znakowane szybkość hybrydyzacja i elongacja w 30 min., cała procedura 2h wydłużanie nie jest limitowane długością startera 21

22 Ocena ilościowa produktu Wysoka czułość i powtarzalność Szeroki zakres oznaczanych stężeń Budowa: - źródło światła wzbudzającego cząsteczkę reporterową - układ detekcji fluorescencji - termocyler 22

23 23

24 SYBR Green I interkaluje do dsdna podczas reakcji, związane z DNA ma silną fluorescencję (1000x silniej niż nie związane stąd (+) niskie tło) technika FRET - (fluorescence resonanse energy transfer) do detekcji specyficznych sekwencji. Przygotowuje się 2 sondy hybrydyzujące blisko na matrycy. Górna sonda jest wyznakowana fluoresceiną na końcu 3, która działa jako FRET. Koniec 5 dolnej sondy jest wyznakowany akceptorem. Jeżeli dojdzie do hybrydyzacji obu - jest fluorescencja technika Molecular Beacons podwójnie znakowany starter, gdy jest nie związany jest wygaszanie1 (struktura spinki do włosów), gdy się przyłączy jest fluorescencja TaqMan wykorzystanie aktywności egzonukleolitycznej 5-3. Starter jest podwójnie wyznakowany: fluoresceiną i wygaszaczem. Następuje wycięcie barwnika, co odblokowuje fluorescencję. SYBR Green I (metoda niespecyficznej detekcji fluorescencji) 24

25 TaqMan (metoda specyficznej detekcji fluorescencji) 25

26 26

27 Geny: mir482d mir6023 U6 Matryce: 3dpi K 3dpi Inf 27

28 Geny: β tubulina Lsd1 Matryce: Col0 Lsd1(Col0) 28

29 Gene expression level Gene Expression Std. Error 95% C.I. P(H1) Result ACT2 1 APX1 1,584 0,909 0,663-2,870 0,065 CAT2 0,687 0,586 0,560-0,885 0,008 DOWN EIN2 1,795 1,065 0,903-4,560 0,045 UP ERF1 195, , , ,734 0 UP GA3 0,474 0,4 0,357-0,629 0,007 DOWN LOX2 3,35 2,099 0,993-9,826 0,014 UP ORA47 1,01 0,477 0,423-2,022 0,963 OXI1 1,209 0,702 0,601-2,150 0,363 PDF ,04 198,096 48, ,125 0,001 UP PR1 8,044 2,83 2,589-42,579 0,002 UP RRTF 6,84 5,689 5,203-10,045 0,001 UP SAG2 2,486 1,398 0,453-8,868 0,058 UBQ 1,261 0,54 0,212-6,047 0,661 WRKY33 4,335 2,269 1,760-10,719 0 UP ,1 ROOT 29

30 Elektorforeza i metody elucji 30

31 rodzaj agarozy przezroczystość rozdział krótkich prążków cena czas (dla prążków krótszych niż 600pz) lepiej krócej tzn. 3-4 h dla żelu cm, przy dłuższym czasie 14-16h (niskie napięcie) prążki nie są ostre, rozdział gorszy Agaroza 0,3% 5-60 kpz 0,5% 1-30 kpz Wielkość rozdzielanych fragmentów DNA 0,7% 0,8-12 kpz 1,0% 0,5-10 kpz 1,2% 0,4-7 kpz 1,5% 0,2-3 kpz 2,0% 0,05-2 kpz rozdział wielu prążków (polimorficzne loci): lepsze żele poliakrylamidowe, jeżeli prążki różnią się kilkoma pz (np. markery mikrosatelitalne) 6-10% niedenaturujące dobry dla pojedynczych loci denaturujące 6%/7M mocznik - żele do sekwencjonowania multiplex PCR 2-3% żel agarozowy Elektroelucja konieczne przeprowadzenie kolejne elektroforezy, w specjalnie przygotowanym aparacie, pracochłonna Szkło kwarcowe sole chaotropowe odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, pracochłonna, zanieczyszczenia NaI, trudności przy agarozie opartej na TBE Modyfikowana celuloza DEAE nadaje się do oczyszczania długich odcinków DNA, skomplikowana i pracochłonna, konieczność wykonania kolejnej elektroforezy, możliwość nieodwracalnego związania się DNA z celulozą po wyschnięciu Zamrażanie, wyciskanie, wirowanie tania, styczność z BrEt podczas wyciskania Trawienie -agarazą odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, tylko do agarozy o niskiej temperaturze topnienia, trudności przy wykorzystaniu bufora TBE, konieczne utrzymywanie odpowiedniej temp. (42-45C) oraz ph 5-8 Metody z wykorzystaniem kolumienek wygodna, w kontrolowanych warunkach, powtarzalna, kosztowne, większe cząsteczki DNA mogą zahaczać się w kolumienkach 31

32 Dziękuję za uwagę! 32