Enzymatyczna metoda otrzymywania D-glukozy ze skrobi

Transkrypt

1 Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi Prwadzący: dr inż. Gabriela PASTUCH-GAWŁEK Miejsce ćwiczenia: sala 102 Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

2 CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest trzymanie D-glukzy ze skrbi z wykrzystaniem hydrlizy enzymatycznej. PDSTAWY TERETYCZNE Skrbia jest plisacharydem zbudwanym z cząsteczek D-glukzy, które są płączne wiązaniami -glikzydwymi. Jest na becna w rślinach, gdzie pełni rlę nśnika energii niezbędneg w większści prcesów metablicznych. Skrbia jest zbudwana z dwóch składników strukturalnych amylzy i amylpektyny. Amylza twrzy prste, długie łańcuchy masie cząsteczkwej d 4000 d Da. Reszty glukzylwe są przyłączane w niej wyłącznie wiązaniami glikzydwymi. H H H H H H H n H H H H Natmiast amylpektyna jest twrem rzgałęzinym zbudwanym z krótkich, prstych łańcuchów, złżnych z kł 30 jednstek glukzy płącznych wiązaniami glikzydwymi, a między sbą pwiązanych wiązaniami glikzydwymi. Dzięki becnści tych wiązań jednym z prduktów hydrlizy amylpektyny jest izmaltza. Masa cząsteczkwa amylpektyny jest znacznie większa niż amylzy i przekracza 500 kda, a sięga nawet d kda. H H gdzie = H H... H H Skrbia jest typwym plisacharydem zapaswym rślinnym i występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i nasinach wielu innych rślin. Twrzy różneg rdzaju granulki różniące się w zależnści d źródła pchdzenia raz spsbu wydzielania. Większść granulek składa się z klejnych warstw, które ulegają ascjacji mając pstać ziarenek widcznych pd mikrskpem. Stsunek amylzy i amylpektyny jest zasadniczą cechą pszczególnych gatunków skrbi. W tablicy pdan niektóre własnści skrbi. Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

3 Źródł Kształt Wielkść [ m] Amylza [%] Algi kulisty 15 1 wies kulisty Kukurydza kulisty Jęczmień kulisty Pszenica kulisty Ziemniaki walny Grch walny Z przytczneg zestawienia widać, że jedynie dla pewnych dmian kukurydzy i grchu wartść amylzy przekracza 50%. Ma t isttny wpływ na zdlnść hydrlizy skrbi przez enzymy i w knsekwencji na zdlnść przyswajania skrbi przez rganizmy. W prcesie metablizmu skrbi pierwszym stadium jest rzkład enzymatyczny na mniejsze fragmenty. Typwymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgwców są amylazy, które katalizują rzkład skrbi i glikgenu d maltzy lub glukzy. Są ne również becne w rślinach, zwłaszcza w zardkach ziarna zbóż, gdzie w prcesie kiełkwania następuje ich gwałtwna synteza, mająca na celu szybkie uruchmienie energetyczneg materiału zapasweg; znalazł t zastswanie przy trzymywaniu słdu. Znane są różne rdzaje amylaz, spśród nich głównymi są: -amylaza zaliczana d endamylaz raz -amylaza i glukamylaza zaliczane d grupy egzamylaz. Wszystkie rdzaje amylaz katalizują hydrlizę wiązań glikzydwych, a zgdnie z nazwą endamylazy, -amylaza atakuje wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha, natmiast -amylaza i glukamylaza, jak egzamylazy, rzrywają dpwiedni c drugie lub klejne wiązania glikzydwe, pczynając d nieredukująceg kńca łańcucha. degradacja amylzy i amylpektyny przez -amylazę H H gdzie = H H... degradacja amylpektyny przez -amylazę H H Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

4 Skrbia zawiera bk frakcji amylzy, również frakcję amylpektyny, złżną z łańcuchów rzgałęzinych. Pnieważ wiązania glikzydwe, występujące przy rzgałęzieniach w amylpektynie, stanwią barierę dla działania -amylazy, rzkład tej frakcji skrbi jest inny: bczne łańcuchy są rzkładane przez -amylazę d maltzy, pdbnie jak prsty łańcuch amylzy, p czym reakcja zatrzymuje się na rzgałęzinych wiązaniach 1 6. Pwstaje więc nierzłżna, wielkcząsteczkwa dekstryna graniczna, która stanwi kł 40-45% masy amylpektyny i wykazuje znaczną lepkść w rztwrze i filetwą barwę kmpleksu z jdem. Rzkładwi ulega na dpier przy łącznym działaniu bu enzymów, gdyż -amylaza przeskakuje przez wiązania , twrząc nwe, prste łańcuchy, które mgą już być rzkładane przez -amylazę. Tak więc, w wyniku łączneg działania - i -amylaz skrbia ulega hydrlizie d maltzy i izmaltzy, czyli -D-glukzyl-1 6-glukzy, raz niewielkiej ilści wlnej glukzy. Zarówn sk jelitwy, jak i ziarna zbóż zawierają również glukzydazę i glukzydazę (izmaltazę), enzymy te rzkładają wytwrzne disacharydy d cząsteczek glukzy, która jest kńcwym prduktem rzkładu enzymatyczneg skrbi. Najlepiej radzi sbie z amylpektyną (i glikgenem) glukamylaza występująca w grzybach raz u zwierząt. Rzkłada na zarówn wiązania , jak i glikzydwe i dlateg przy jej udziale amylpektyna i glikgen ulegają rzkładwi d glukzy. Liczne grzyby nitkwate, bytujące w śrdwiskach bgatych w plisacharydy, są zdlne d syntezy i wydzielania znacznych ilści amylaz; jest t wykrzystywane przy technicznym ich trzymywaniu. Inną drgą pzwalającą uzyskać glukzę z częściw zhydrlizwanej przez enzymy skrbi jest hydrliza kwaśna ligsacharydów. Szczególnie dgdne jak katalizatry są tzw. katinity mcn kwaśne. Są t zwykle kplimery styrenu i dwuwinylbenzenu, zawierające grupy sulfnwe. Fragment żywicy mżna przedstawić wzrem: CH CH 2 CH CH 2 H 3 S S 3 H Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

5 WYKNANIE ĆWICZENIA Zadanie 1. znaczanie aktywnści amylazy. Sprzęt: statyw z prbówkami, pipety, lejki, sączki karbwane, spektrftmetr, łaźnia wdna, waga analityczna. Materiał i dczynniki: preparat enzymatyczny substrat skrbiwy. 0.5g skrbi rzpuszczalnej, 1 g NaCl i 2 g cytrynianu sdu rzpuścić w 100 ml wdy grzewając d wrzenia. Ddać 1g benzesanu sdu dla knserwacji, 0.9% rztwór NaCl, 20% rztwór kwasu sulfsalicylweg, rztwór jdu. 2g KI rzpuścić w 5 ml wdy i w tym rztwrze rzpuścić 1g jdu, p czym uzupełnić wdą d 300ml. Rzcieńczyć r-r macierzysty 150 razy, 1% rztwór skrbi. 1g skrbi rzpuścić w 80 ml wrzącej wdy. P rzpuszczeniu studzić i uzupełnić wdą d 100 ml. Rztwry wzrcwe zawierające 2,4,6 i 8 mg skrbi w 1 ml. Rzcieńczyć 1% rztwór skrbi (10 mg/ml) birąc 2,4,6 i 8 ml i uzupełniając wdą d 10 ml. Wyknanie ćwiczenia: Zasada znaczenia: znacza się ilść rzłżneg substratu (skrbi) na pdstawie stpnia zmniejszenia się zabarwienia z jdem. Wynik pdaje się w jednstkach Whlgemutha, znaczających taką aktywnść amylazy w 1 ml badaneg preparatu, która rzkłada 1 mg skrbi d prduktów nie dających zabarwienia z jdem, w ciągu 30 minut, w temperaturze 37 C, w becnści jnów chlrkwych. Wyknanie: 2.4 ml substratu skrbiweg grzać d 37 C przez wstawienie d łaźni na 10 minut i wprwadzić następnie 0.1 ml preparatu enzymatyczneg. Inkubwać w łaźni wdnej temperaturze 37 C przez 30 minut. Ddać 2.5 ml rztwru kwasu sulfsalicylweg. P kilku minutach przesączyć rztwór d prbówki. Równlegle wyknać próbę kntrlną birąc 2.4 ml substratu, 0.1 ml preparatu enzymatyczneg i ddając natychmiast (bez inkubacji) 2.5 ml rztwru kwasu sulfsalicylweg. Przesączyć analgicznie jak pprzednia próbkę. D 0.5 ml przesączu próby badanej i kntrlnej wprwadzić (rztwór dmierzny d prbówki) 9.5 ml rzcieńczneg 150-krtnie rztwru jdu. znaczyć wartść absrbancji przy długści fali 560 nm wbec wdy. djąć wartść absrbancji próby badanej d wartści absrbancji próby kntrlnej i z krzywej kalibracyjnej dczytać wynik w jednstkach Whlgemutha. Wykreślenie krzywej kalibracyjnej. Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

6 D 0.1 ml rztwrów wzrcwych zawierających 2, 4, 6, 8 i 10 mg skrbi/ml wprwadzić p 0.15 ml 0.9% rztwru NaCl, 0.25 ml rztwru kwasu sulfsalicylweg i 9.5 ml rzcieńczneg 150-krtnie rztwru jdu. znaczyć wartść absrbancji wbec wdy i wykreślić krzywą, dkładając na si dciętych jednstki Whlgemutha. W pszczególnych prbówkach znajdwał się 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 i 1 mg skrbi, a pnieważ d wywłania barwy wychdzi się z 0.5 ml przesączu, c dpwiada 0.01 ml preparatu enzymatyczneg, wyniki w jednstkach Whlgemutha wynisą: 20,40, 60, 80 i 100. Wartści fizjlgiczne: d 30 j. W. W surwicy, d 40 j. W. W mczu, a w sku trzustkwym j. W. Zadanie 2. Enzymatyczna degradacja skrbi. Sprzęt: klby stżkwe, pipety, wata, sączki karbwane, lejki, cieplarka, klba krągłdenna, chłdnica zwrtna, mieszadł, papierki wskaźnikwe, waga analityczna. Materiał i dczynniki: preparat enzymatyczny skrbia kukurydziana lub ziemniaczana Wyknanie ćwiczenia: Hydrliza skrbi: W klbie stżkwej pjemnści ml, umieścić 5g skrbi kukurydzianej lub ziemniaczanej, ddać 50 ml wdy destylwanej i 0.5 ml preparatu enzymatyczneg. Zawartść klby grzewać d zżelwania w łaźni temperaturze 80ºC. Następnie całść chłdzić i ddać 1 ml preparatu enzymatyczneg. Klbkę zatkać krkiem z waty i mieszać jej zawartść przez 3 h w temperaturze pkjwej. P tym czasie wstawić klbkę d cieplarki ustawinej na 37 C i pzstawić na 24-72h. Następnie zawartść klbki grzać d wrzenia w celu zdenaturwania enzymu, a p chłdzeniu przesączyć zawartść klbki, a bjętść uzyskaneg przesączu dkładnie zmierzyć (będzie t ptrzebne d bliczenia sumarycznej ilści cukrów redukujących), pbrać próbki d znaczenia cukrów redukujących (dwie próbki p 0.5 ml). Pzstałą ilść przesączu zatężyć w zważnej klbie krągłdennej na wyparce rtacyjnej i kreślić masę pzstałści. Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

7 Zadanie 3. znaczanie cukrów redukujących metdą Smgyi. Sprzęt: klby stżkwe, pipety, lejki, biureta, łaźnia wdna, waga analityczna. Materiał i dczynniki: dczynnik Smgyi: Rztwór A- 15 g winianu sdw-ptasweg i 15 g bezwdneg węglanu sdu rzpuścić w 100 ml grącej wdy i ddać 40 ml 1 N NaH. Rztwór B- 4 g pięciwdneg siarczanu miedzi rzpuścić w 40 ml wdy i grzać d wrzenia Rztwór C- 90 g bezwdneg siarczanu sdu rzpuścić w 250 ml wdy Rztwry A, B i C płączyć ze sbą, ddać 4 g jdku ptasu raz 0.6 g jdanu ptasu w 10 ml wdy. Wymieszać i uzupełnić wdą d 500 ml N tisiarczan sdu. Przygtwać bezpśredni przed użyciem przez dziesięcikrtne rzcieńczenie 0.1 N mianwaneg rztwru tisiarczanu. 1 M kwas siarkwy wskaźnik skrbiwy. 500 mg skrbi rzpuszczalnej rzpuścić w 50 ml wdy grzewając całść d wrzenia. P chłdzeniu ddać 15 g chlrku sdweg. glukza. 100 mg glukzy rzpuścić w 100 ml wdy destylwanej (w klbie miarwej). D wyknania krzywej wzrcwej pbierać dpwiedni: 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 i 2.0 ml teg rztwru. Wyknanie ćwiczenia: D klby stżkwej pjemnści 50 ml zawierającej badany rztwór (0.5 ml) ddać 5 ml dczynnika Smgyi i p dkładnym wymieszaniu zawartść grzewać we wrzącej łaźni wdnej przez 15 minut. P wyjęciu z łaźni próbkę chłdzić pd bieżącą wdą. Następnie ddać 2 ml 1M kwasu siarkweg i wstrząsnąć energicznie aż d rzpuszczenia sadu. P upływie 5 minut zawartść prbówek zmiareczkwać 0.01 N tisiarczanem sdu wbec wskaźnika skrbiweg. Równlegle wyknać dwie próby kntrlne (zawierające wdę destylwaną zamiast badaneg rztwru). Zawartść cukrów redukujących w próbach badanych dczytać z krzywej wzrcwej. Aby sprządzić taką krzywą, należy wyknać w pisany pwyżej spsób serię znaczeń dla prób wzrcwych zawierających 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 i 2.0 mg glukzy w próbce. Wykreślić zależnść pmiędzy ilścią cukru w próbie badanej (w mg) a różnicą zużycia rztwru tisiarczanu na zmiareczkwanie próby kntrlnej i badanej (w ml). P dczytaniu z krzywej wzrcwej ilści cukrów redukujących w pbranej próbce przeliczyć, jaka jest ich zawartść w całej bjętści rztwru. Wynik uzyskany z znaczania ilści cukrów redukujących prównać z masą uzyskaną p zatężeniu przesączy. Przeanalizwać uzyskane wyniki i wyjaśnić ewentualne różnice pmiędzy masą uzyskaną z bliczeń i masą uzyskaną w wyniku zatężania. Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi

8 Literatura źródłwa: J. Berg, J. Tymczk, L. Stryer, Bichemia, Wyd. Naukwe PWN, W-wa 2005 L. Kłyszejk-Stefanwicz, Ćwiczenia z Bichemii, Wyd. Naukwe PWN, W-wa 1982 R. L. Whistler, M. L. Wlfrm, Methds in Carbhydrate Chemistry, Vl. I, Academic Press Inc. NY and Lndn, 1963 Enzymatyczna metda trzymywania D-glukzy ze skrbi