(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 38/16 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/12 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja terapeutyków chrząstki i sposób jej zastosowania () Pierwszeństwo: KR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/40 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/09 (73) Uprawniony z patentu: Sewon Cellontech Co., Ltd., Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 CHEONG-HO CHANG, Seoul, KR CHANG-KWON KO, Seoul, KR JAE-DEOG JANG, Seoul, KR EUN-YOUNG LEE, Seoul, KR JEONG-YONG CHOI, Seoul, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. SKR. POCZT WARSZAWA Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [Dziedzina wynalazku] [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy terapeutycznej kompozycji chrząstki, która może być przeszczepiana klinicznie do stawu kolanowego (articulatio genus) lub stawów skokowych, w szczególności istotne klinicznie, symptomatycznych regionów uszkodzeń chrząstki kłykcia kości udowej (środkowego, bocznego lub bloczkowego) i regionów uszkodzenia kości skokowej (talus) pochodzenia chrzęstnego, u ludzi lub gospodarzy zwierzęcych oraz sposobu stosowania tejże kompozycji. [Stan techniki] [0002] Generalnie, tkanki chrzęstne stanowiące połączenia kręgosłupa, raz uszkodzone, nie mogą regenerować do ich pierwotnego stanu in vivo. [0003] Gdy stawowe tkanki chrzęstne są uszkodzone, zwykłą codzienną aktywność ogranicza ciężki ból. Początkowe uszkodzenie stawowej tkanki chrzęstnej rozwija się w stan przewlekły nazywany postępującą chorobą zwyrodnieniową stawu, która zakłóca normalne życie. [0004] Tymczasem, w celu leczenia uszkodzenia chrząstki stawowej, obecnie, jedną z metod leczenia jest szlifowanie uszkodzonej powierzchni stawowej, w ten sposób czyniąc ją miękką, lub inną metodą jest wywoływanie mikrozłamań lub robienia małego otworu przy powierzchni stawowej. [000] Jednak, takie metody mają wady takie jak nawrót objawów w ciągu kilku tygodni co czyni niemożliwym powrót do normalnego trybu życia. Ponadto, tkanki włókniste wytworzone poprzez takie leczenie całkowicie jakościowo różnią się od normalnych tkanek chrzęstnych. [0006] Ponadto, tam gdzie stawowe tkanki chrzęstne są znacząco uszkodzone, regeneracja tkanek chrzęstnych staje się niemożliwa. Zatem, kiedy tkanki chrzęstne nie są w stanie regenerować ze względu na stan ich ciężkiego uszkodzenia, biorąc pod uwagę konwencjonalne metody leczenia, uszkodzona chrząstka stawowa musi być całkowicie usunięta i zastąpiona sztucznym stawem metalowym lub ze sztucznego tworzywa. [0007] Do tej pory, taka metoda zastąpienia sztucznym stawem jest znana jako jedyna metoda leczenia uszkodzenia chrząstki, które jest zbyt ciężkie by być leczone z zastosowaniem metod regeneracyjnych. [0008] W samych USA, przeprowadza się rocznie 0000 wymian wspomnianych wyżej sztucznych stawów kolanowych. [0009] Jednak, sztuczna chrząstka stawowa nie może być stale używana, jej żywotność, jako urządzenia, wynosi około lat. Ponadto, cena urządzenia przekracza 4000 dolarów, nakładając zatem na pacjentów ciężkie obciążenie ekonomiczne. [00] Dodatkowo częstotliwość nawracania powikłań dla takiej sztucznej chrząstki stawowej jest zbyt wysoka, tak więc sztuczna chrząstka jest nieodpowiednia do zastosowania u aktywnych młodych ludzi. [0011] Ostatnio, w celu leczenia uszkodzonej chrząstki stawowej, wiele uwagi skierowano na autologiczny przeszczep chondrocytów jako nową metodę leczenia opartą na inżynierii tkanek. [0012] Metodę tą zbadano po raz pierwszy w Hospital for Joint Disease w Nowym Jorku w USA i dalej rozwinięto na University of Gothenburg i Sahlgrenska University Hospital w Szwecji. [0013] Autologiczny przeszczep chondrocytów jest metodą leczenia uszkodzonej chrząstki stawu pacjenta, związaną z pobraniem chrząstki z powierzchni przenoszącej mniejszy ciężar u pacjenta cierpiącego z powodu uszkodzonej chrząstki stawów kolanowych, następnie separacją chondrocytów, hodowlą izolowanych chondrocytów w celu otrzymania ilości chondrocytów wystarczającej do leczenia regionów 1

3 uszkodzenia chrząstki, a następnie przeszczepieniem pacjentom hodowanych chondrocytów w region uszkodzenia chrząstki w celu przywrócenia uszkodzonej chrząstki stawowej. [0014] Wydajność tego autologicznego przeszczepu chondrocytów zweryfikowano jako podstawowe leczenie stawu w oparciu o różne wyniki kliniczne, ale koniecznie wiąże się z pobraniem okostnej przy przeszczepianiu terapeutycznego czynnika chondrocytarnego i po przeszczepieniu do uszkodzonej części, wstrzyknięciem terapeutycznego czynnika chondrocytarnego. [00] W dodatku autologiczny przeszczep chondrocytów ma różne wady, takie jak duże cięcie w okolicy kolana związane z pobraniem okostnej, możliwość przeciekania terapeutycznego czynnika chondrocytarnego spowodowana niekompletnym szwem pomiędzy miejscem zabiegu chirurgicznego a okostną, zbyt długim czasem, jaki upływa na zszyciu okostnej z regionem uszkodzenia stawowego i tym podobne. [Ujawnienie] [Problem techniczny] [0016] Zatem, niniejszy wynalazek został wykonany z uwagi na powyższe problemy, a aspektem niniejszego wynalazku jest dostarczenie terapeutycznej kompozycji chrząstki, która pozwoli na rozwiązanie trudności spowodowanych pobieraniem okostnej, szwem, niekompletnym szwem pomiędzy okostną a miejscem przeszczepu oraz dużym cięciem i czasem potrzebnym do operacji przy przeszczepianiu terapeutycznego czynnika chrząstki oraz sposobu jej stosowania. [0017] Innym aspektem niniejszego wynalazku jest dostarczenie terapeutycznej kompozycji chrząstki powodującej minimalne straty terapeutycznego czynnika chrząstki z powodu łącznego stosowania i zestalenia składników chondrocytarnych, trombiny i fibrynogenowego składnika macierzy, pełniejsze efekty regeneracji chrząstki poprzez interakcję pomiędzy fibrynogenową macierzą a komórkami, skrócenie czasu zabiegu operacyjnego i wykorzystanie artroskopu oraz sposobu jego stosowania. [Rozwiązanie techniczne] [0018] Zgodnie z aspektem niniejszego wynalazku powyższe oraz inne cele mogą być osiągnięte przez dostarczenie terapeutycznej kompozycji chrząstki obejmującej mieszaninę składników chondrocytarnych izolowanych i namnażanych lub różnicowanych od gospodarza, trombiny i fibrynogenowej macierzy. [0019] Zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, dostarczono sposobu stosowania terapeutycznej kompozycji chrząstki obejmującego: przygotowanie składników chondrocytarnych izolowanych i namnażanych lub różnicowanych od gospodarza; przygotowanie trombiny; przygotowanie fibrynogenowej macierzy leczenie uszkodzonego regionu chrząstki; i mieszanie składników chondrocytarnych, trombiny i fibrynogenowej macierzy oraz wstrzykiwanie otrzymanej mieszaniny do uszkodzonego regionu chrząstki. [Opis Figur] [00] Powyższe i inne aspekty, właściwości oraz inne korzyści niniejszego wynalazku będą bardziej zrozumiałe z poniższego szczegółowego opisu w powiązaniu z załączonymi figurami, w których: Fig. 1 jest wykresem przedstawiającym siłę macierzy do przeszczepienia chondrocytów zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w odniesieniu do stężenia wstrzykiwanego fibrynogenu i trombiny; 2

4 Fig. 2 jest zdjęciem macierzy gdy fibrynogen wstrzyknięto odpowiednio w ilości 0 mg/ml (A), 160 mg/ml (B) i mg/ml na Fig. 1; Fig. 3 jest zdjęciem przedstawiającym przycięty region uszkodzonej chrząstki, do którego zgodnie z niniejszym wynalazkiem będzie przeszczepiona macierz; Fig. 4 jest zdjęciem przedstawiającym przeszczepione miejsce, do którego, zgodnie z niniejszym wynalazkiem przeszczepiono macierz; Fig. jest zdjęciem przedstawiającym wstrzyknięcia terapeutycznej kompozycji chrząstki po uprzednim zeszyciu okostnej zgodnie z innym przykładem niniejszego wynalazku; Fig. 6 jest zdjęciem przedstawiającym wstrzyknięcie terapeutycznej kompozycji chrząstki po wcześniejszym wytworzeniu otworu łączącego w regionie uszkodzenia chrząstki zgodnie z innym przykładem według niniejszego wynalazku; Fig. 7 jest zdjęciem przedstawiającym wzorce różnicowania chondrocytów w fibrynogenowej macierzy zgodnie z niniejszym wynalazkiem; i Fig. 8 jest zdjęciem przedstawiającym wzorce różnicowania chondrocytów w fibrynogenowej macierzy zawierającej % kolagenu i % kwasu hialuronowego zgodnie z innym przykładem niniejszego wynalazku. [Najlepsza postać realizacji wynalazku] [0021] Teraz, niniejszy wynalazek będzie opisany bardziej szczegółowo. [0022] Niniejszy wynalazek może poprawiać, utrzymywać i przywracać funkcje tkanek przez stosowanie inżynierii tkankowej związanej z wymianą tkanek i narządów. [0023] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stosując inżynierię tkankową, dostarczono terapeutyczną kompozycję chrząstki wytworzoną przez mieszanie składników chondrocytarnych izolowanych i namnażanych lub zróżnicowanych od gospodarza takiego jak człowiek lub zwierzę oraz trombiny i fibrynogenowej macierzy. [0024] W dodatku niniejszy wynalazek wymaga macierzy, jako tkanki zastępczej, do której mogą być włączone swoiste komórki i czynniki wzrostu i stosuje in vivo składniki macierzy, takie jak składniki zewnątrzkomórkowej macierzy (ang. extracellular matrix, ECM) i naturalny polimer jako macierz zastępcza. [002] Interakcja pomiędzy chondrocytem a macierzą bezpośrednio wspiera adhezję komórek, migrację, wzrost, różnicowanie i apoptozę. [0026] Ponadto, taka interakcja reguluje aktywność cytokin i czynników wzrostu oraz aktywuje proces wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnałowej, powodując szybki wzrost i odbudowę interesujących nas tkanek. [0027] Tymczasem, sposób stosowania terapeutycznej kompozycji chrząstki zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmuje przygotowanie składników chondrocytarnych izolowanych i namnażanych lub zróżnicowanych od ludzi lub zwierząt oraz przygotowanie trombiny, która jest stosowana jako czynnik krzepnięcia. [0028] Potem następuje przygotowanie fibrynogenowej macierzy, która musi być mieszana ze składnikami chondrocytarnymi i trombiną, to jest składnikami takimi jak fibrynogen, kolagen, kwas hialuronowy, glikozaminoglikan (zwany GAG ) i aprotynina. [0029] W związku z tym, w macierzy fibrynogenowej koniecznie zawierającej fibrynogen, fibrynogen może być stosowany sam w odpowiednim stężeniu lub macierz fibrynogenowa może być tworzona przez 3

5 mieszanie fibrynogenu i innych składników macierzy takich jak kolagen, kwas hialuronowy, GAG i aprotynina w odpowiednim stosunku. [00] Aprotynina służy do hamowania degradacji fibrynogenu przez plazminę, umożliwiając zatem utrzymanie kształtu terapeutycznego czynnika chrząstki (mieszanina trombiny, składników chondrocytarnych i fibrynogenu) w ustalonej formie, przez długi okres czasu, gdy składniki terapeutycznego czynnika chrząstki są mieszane i zestalane. [0031] W tym czasie region uszkodzenia chrząstki, do którego terapeutyczny czynnik chrząstki będzie przeszczepiony, jest najpierw przycinany, a następnie wykonywany jest otwór o średnicy 2 do 3 mm i głębokości 3 do mm wewnątrz miejsca dla przeszczepu, a dalej rozpylana trombina. [0032] Wówczas terapeutyczny czynnik chrząstki złożony z mieszaniny składników chondrocytarnych, trombiny i fibrynogenowej macierzy jest wstrzykiwany do regionu uszkodzenia chrząstki, do którego rozpylono trombinę. [0033] Następnie, wysokie stężenie trombiny jest rozpylane w celu zaszczepienia i utrzymania kształtu terapeutycznego czynnika chrząstki od góry w miejscu uszkodzenia chrząstki, do którego wstrzyknięto terapeutyczny czynnik chrząstki. [0034] W niniejszym wynalazku, składniki chondrocytarne są przygotowywane i stosowane przez izolowanie chondrocytów z normalnej tkanki chrzęstnej, stosując odpowiedni enzym, i inkubowanie izolowanych komórek w podłożu hodowlanym w celu otrzymania hodowli zawierającej więcej niż 6 komórek/ml. [003] W dodatku, fibrynogen jest przywracany do swojego pierwotnego stanu z liofilizowanego fibrynogenu przy zastosowaniu konwencjonalnego komórkowego podłoża hodowlanego takiego jak DMEM (ang. Dulbecco s Modified Eagle s Medium, podłoże Eagle a w modyfikacji Dulbecco), podłoże F-12 Hama, DMEM/F-12, IMDM (ang. Iscove s Modified Dulbecco s Medium, podłoże Dulbecco w modyfikacji Iscove a), podłoże A McCoy a, MEM (ang. Minimum Essential Medium, podłoże minimalne), α-mem, podłoże RPMI 1640, podłoże L-Leibovitz a i podstawowe podłoże Eagle a. [0036] Trombina jest również przywracana do swojego pierwotnego stanu z liofilizowanej trombiny przy zastosowaniu wspomnianych wyżej podłoży hodowlanych włączając podłoże DMEM. [0037] Dalej, fibrynogenowa macierza jest wytwarzana przez mieszanie fibrynogenu z co najmniej jednym z następujących kolagenem, kwasem hialuronowym i GAG oraz aprotyniną w określonym stężeniu. [0038] W związku z tym, że fibrynogen jest substancją obecną we krwi, odgrywającą rolę w krzepnięciu ponieważ reaguje z trombiną i jest wtedy przekształcana do fibryny, która krzepnie przy CaCl 2 i czynniku XIII dodanym do trombiny, wypełnia zatem funkcję hemostatyczną. [0039] W dodatku, podłoże hodowlane do rekonstytucji liofilizowanego fibrynogenu może zawierać mniej niż % FBS (płodowej surowicy bydlęcej, ang. fetal bovine serum), FCS (płodowej surowicy cielęcej ang. fetal calf serum), surowicy cielęcej, końskiej surowicy lub ludzkiej surowicy oraz w celu zapobiegania infekcji wywołanych mikroorganizmami, antybiotyki takie jak penicylina G, kanamycyna, gentamycyna i streptomycyna lub czynniki przeciwgrzybicze takie jak amfoterycyna B i nystatyna mogą być dodane do niego w odpowiedniej ilości. [0040] Dodatkowo jako podłoże hodowlane rekonstytucji liofilizowanego fibrynogenu, mogą być zastosowane wszystkie konwencjonalne podłoża do hodowli komórkowych, włączając podłoże A McCoy a, podstawowe podłoże Eagle a, minimalne podłoże Glasgow, podłoże F-12 Ham a, podłoże Dulbecco w modyfikacji Iscove a, podłoże L- Liebovitz a i podłoże RPMI

6 [0041] W szczególnej postaci wykonania fibrynogenowej macierzy, fibrynogen jest stosowany sam w stężeniu mg/ml do 0 mg/ml, zależnie od warunków miejsca transplantacji i pacjenta. [0042] Obecny w dużym stężeniu fibrynogen jest stosunkowo twardy i tworzy gęstą macierz, co prowadzi do zwiększenia czasu degradacji, powodując uczucie ciała obcego w organizmie po jego zastosowaniu. Przeciwnie, gdy jest obecny w niskim stężeniu, degradacja fibrynogenu w tkance szybko postępuje, zatem tworzy się luźna macierz, powodując w ten sposób trudności z zastąpieniem chrząstki. [0043] Dodatkowo, oprócz mg/ml do 0 mg/ml fibrynogenu, fibrynogenowa macierz może zawierać 0,01 mg/ml do mg/ml kolagenu, 0,1 mg/ml do mg/ml kwasu hialuronowego i 0,1 mg/ml do mg/ml GAG (glikozaminoglikan) i 1 do 00 KIU/ml samej aprotyniny lub w jej dowolnej kombinacji. [0044] Wyżej wymieniony kolagen, kwas hialuronowy, GAG i aprotynina są substancjami obecnymi w organizmie zwierzęcego gospodarza i nawet jeśli są one podawane ponad określone stężenie, wpływ na komórki nie różni się znacznie, ale wydłuża czas utwardzania, prowadząc do opóźnienia czasu leczenia operacyjnego. [004] Dodatkowo, aprotynina jest substancją, która hamuje degradacje fibryny in vivo i przez co wspiera funkcję hemostatyczną i gdy dodana ilość aprotyniny zwiększa się, szybkość degradacji fibryny zmniejsza się. Zatem możliwa jest kontrola szybkości degradacji macierzy przez dostosowanie stężenia aprotyniny. [0046] Generalnie chrząstki kręgowców składają się z chondrocytów i macierzy. Macierz jest złożona głównie z GAG, zawiera kolagen i kwas hialuronowy i nie ma naczyń krwionośnych otrzymując zatem substancje odżywcze z płynu stawowego. [0047] Głównym składnikiem płynu stawowego jest kwas hialuronowy i dlatego stosowanie mieszaniny zawierającej taki składnik dostarcza doskonałe zdolności regeneracyjne chrząstki. [0048] 0,01 IU/ml do 0 IU/ml przygotowanej trombiny miesza się z terapeutycznym czynnikiem chrząstki według niniejszego wynalazku i dlatego, podczas mieszania składników chrząstki z fibrynogenową macierzą, trombina przekształca fibrinogen w fibrynę. [0049] Zatem, przez dostosowanie stężenia trombiny dodanej do mieszaniny terapeutycznego czynnika chrząstki, możliwa jest kontrola szybkości utwardzania terapeutycznego czynnika chrząstki, jak również kontrola fizycznych właściwości fibrynogenowej macierzy. [000] Gdy stężenie trombiny jest niskie, macierz składa się z grubych materiałów włóknistych i posiada pory o dużej wielkości. Dlatego korzystne jest włączenie komórek i fizjologicznie aktywnych materiałów, ale prowadzi to do opóźnienia czasu utwardzania, utrudniając zatem osiągnięcie pożądanych celów. [001] Odwrotnie gdy stężenie trombiny jest wysokie, macierz składa się z cienkich materiałów włóknistych i posiada pory o małej wielkości. Dlatego korzystne jest, aby umożliwić łatwy wzrost przy jednoczesnym blokowaniu penetracji komórkowej. Prowadzi to do przyspieszenia czasu utwardzania, powodując skrajnie niską funkcjonalność ze względu na utwardzanie macierzy w trakcie mieszania odpowiednich składników. [002] Zatem korzystne jest stężenie trombiny w zakresie 0,01 IU/ml do 0 IU/ml, a wstrzyknięta trombina twardnieje w 1 do min. W dodatku, korzystnie, trombina mieszana z macierzą według niniejszego wynalazku jest stosowana w niskim stężeniu, i trombina podawana przed lub po wstrzyknięciu kompozycji, jest stosowana w wysokim stężeniu. [003] W rezultacie, możliwe jest otrzymanie macierzy o mechanicznej wytrzymałości i elastyczności odpowiedniej dla regeneracji tkanek chrzęstnych. [004] Możliwa jest również łatwa zmiana kształtu macierzy taka, która jest dostosowana do różnych możliwych konfiguracji obecnych w regionie uszkodzonej chrząstki, zwiększając tym samym komfort

7 związany z operacją chirurgiczną, a również pozwala macierzy pozycjonowanie w sposób ciągły w uszkodzonym regionie przy jednoczesnym zachowaniu jej określonego kształtu po przeszczepie, prowadząc do wsparcia rozrastania się i różnicowania się przeszczepionych chondrocytów in vivo. [00] W regionie uszkodzonej chrząstki, w którym kompozycja do przeszczepiania chondrocytów według niniejszego wynalazku ma być przeszczepiona, uszkodzony region jest najpierw poddany obróbce, wykonuje się od zera do pięciu otworów o średnicy 2 do 3 mm i głębokości około 3 do mm wewnątrz miejsca przeszczepu, zależnie od wielkości uszkodzonej części, po zatamowaniu krwawienia rozpyla się 0 IU/ml do 00 IU/ml wysoko stężonej trombiny na powierzchni uszkodzonej części, aby zwiększyć przyczepność terapeutycznego czynnika chrząstki. [006] W tym czasie, trombina służy do wywoływania ścisłego wiązania pomiędzy terapeutycznym czynnikiem chrząstki i regionem uszkodzenia chrząstki, do którego terapeutyczny czynnik chrząstki ma być przeszczepiony, zwiększając tym samym gęstość regeneracji chrząstki, przy jednoczesnym zwiększeniu wytrzymałości na zewnętrzne działanie. [007] W dodatku, terapeutyczna kompozycja chrząstki jest wstrzykiwana do region uszkodzenia chrząstki u pacjenta będącego człowiekiem lub zwierzęciem. [008] Wstrzyknięcie terapeutycznej kompozycji chrząstki jest przeprowadzane poprzez wolną iniekcję do perforowanej części regionu uszkodzenia chrząstki po czy następuje wstrzyknięcie w celu wypełnienia wszystkich pozostałych uszkodzonych części. [009] Ponieważ czas wymagany do przekształcenia fibrynogenu w fibrynę w trakcie mieszania fibrynogenu i trombiny jest zależny od stężenia, terapeutyczny czynnik chrząstki jest wstrzykiwany do uszkodzonego regionu w odpowiednim okresie czasu pomiędzy około 1 a min. [0060] Dalej po transplantacji terapeutycznej kompozycji chrząstki do uszkodzonego regionu chrząstki, trombina w wysokim stężeniu 0 IU/ml do 00 IU/ml jest rozpylana na przeszczepioną terapeutyczną kompozycję chrząstki, złożoną ze składników chondrocytarnych, trombiny i fibrynogenu, w celu pomocy w jej wszczepieniu i utrzymania jej kształtu, w ten sposób tworząc film ochronny, aby chronić terapeutyczny czynnik regeneracji chrząstki. [0061] Miejsce transplantacji pozostawia się na około min do momentu całkowitego utwardzenia podczas przekształcenia fibrynogenu w fibrynę przez działanie trombiny. [Postać wykonania] [0062] Obecnie wynalazek będzie opisany bardziej szczegółowo poprzez odniesienie do następujących przykładów. Przykłady te dostarczono jedynie do zilustrowania niniejszego wynalazku i nie powinny być interpretowane jako ograniczające zakres i istotę niniejszego wynalazku. Przykłady Przykład doświadczalny 1 [0063] W celu określenia odpowiednich fizykochemicznych właściwości różnych macierzy stosowanych w przeszczepianiu terapeutycznego czynnika chrząstki, dostępna w handlu liofilizowana trombina była rekonstytuowana do stężenia 2 IU/ml do IU/ml. [0064] 2 IU/ml do IU/ml trombiny dodano aby przekształcić fibrynogen, główną macierz, w fibrynę. [006] Dodatkowo dodano kolagen, kwas hialuronowy i GAG w ilościach odpowiednio od 0,01 mg/ml do mg/ml; 0,1 mg/ml do mg/ml i 0,1 mg/ml do mg/ml aby wytworzyć odpowiednią macierz. [0066] Każdą tak przygotowaną macierz mieszano i mierzono uzyskaną twardość, wytrzymałość i wytrzymałość na zginanie. 6

8 2 [0067] Najpierw 1 ml fibrynogenu o stężeniu mg/ml do 0 mg/ml i 1 ml trombiny o stężeniu 2 IU/ml do IU/ml mieszano i mierzono twardość i wytrzymałość odpowiednio otrzymanej kompozycji. [0068] W dodatku stosowany terapeutyczny czynnik chrząstki i macierz o wyżej wspomnianym stężeniu były mieszane a następnie mierzono wytrzymałość otrzymanej kompozycji. [0069] W rezultacie, jak przedstawiono na Fig. 1, poprzez różne badania kliniczne, po transplantacji terapeutycznej kompozycji chrząstki, składającą się z mieszaniny składnika chondrocytarnego-trombinyfibrynogenu, odpowiednia jej wytrzymałość wynosiła około 160 do 170 g/cm 2. W oparciu o wyniki mierzone jak opisano powyżej otrzymano następujące wytrzymałości kompozycji: 166 g/cm 2 dla 2 IU/ml trombiny i mg/ml fibrynogenu; 170 g/cm 2 i 16 g/cm 2 dla 4 IU/ml trombiny i odpowiednio 160 mg/ml i 0 mg/ml fibrynogenu; 170 g/cm 2 i 166 g/cm 2 dla 8 IU/ml trombiny i odpowiednio 160 mg/ml i 0 mg/ml fibrynogenu i 171 g/cm 2 i 169 g/cm 2 dla IU/ml trombiny i odpowiednio 160 mg/ml i 0 mg/ml fibrynogenu. W rezultacie otrzymano odpowiednie dla przeszczepienia stężenia fibrynogenu i trombiny oraz właściwości, jak przedstawiono na Fig. 2. [0070] Różnice pomiędzy fizycznymi właściwościami kompozycji, ze względu na stężenia fibrynogenu, wykazują właściwości przedstawione na fotografii z Fig. 2 (A: 0 mg/ml, B: 160 mg/ml i C: mg/ml od lewej do prawej). [0071] Podczas pomiaru wytrzymałości każdej kompozycji, w której każda macierz, t.j., kolagen, kwas hialuronowy i GAG była mieszana z odpowiednimi stężeniami fibrynogenu i trombiny, mierzona wytrzymałość terapeutycznej kompozycji chrząstki, składającej się z mieszaniny chondrocytarnego składnika-trombiny-fibrynogenu, do której dodano kwas hialuronowy, kolagen i GAG, odpowiednio, wynosiła około 4 do 9 g/cm 2, przy spadku o około 1 do 6 g/cm 2 wytrzymałości, w porównaniu z wynikami mierzonymi powyżej. [0072] Taki spadek wytrzymałości może być kontrolowany przez dostosowanie stężeń składników macierzy takich jak kolagen, kwas hialuronowy i GAG lub stosując dowolną ich kombinację. [0073] W dodatku, ponieważ kompozycja macierzy różni się zależnie od warunków i cech pacjenta, wspomniany wyżej zakres stężeń fibrynogenu i trombiny jest stosowany w połączeniu ze składnikami macierzy, takimi jak kolagen, kwas hialuronowy i GAG. [0074] Ponadto, efekty wytwarzania chrząstki można otrzymać przez dodanie kolagenu lub kwasu hialuronowego w przypadku pacjentów w podeszłym wieku i przez stosowanie kompozycji w połączeniu z GAG lub kwasem hialuronowym w przypadku młodych pacjentów cierpiących z powodu poważnych urazów, n.p. z powodu wypadków komunikacyjnych. Przykład doświadczalny 2 [007] W Tabeli 1 przedstawiono czas polimeryzacji wymagany aby nadać wstrzykniętemu fibrynogenowi i trombinie wytrzymałość 160 do 170 g/cm 2 odpowiednią dla stosowania jako terapeutyczny czynnik chrząstki. 7

9 Tabela 1 Stężenie fibrynogenu (mg/ml) Stężenie trombiny (IU/ml) 2 [0076] Tak więc, niskie stężenie trombiny wykazywało wolny czas polimeryzacji i tworzenie cienkiej struktury włóknistej o wielkości porów większej niż około µm, podczas gdy wysokie stężenie trombiny wykazywało szybki czas polimeryzacji i tworzenie struktury o wielkości porów mniejszej niż około 1 µm. [0077] Dodatkowo, można zauważyć, że kompozycji złożonej z trombiny i fibrynogenu zajmuje 2 do 7 minut aby wykazać wytrzymałość 0 do 180 g/cm 2, odpowiednią dla stosowania w terapeutycznym czynniku chrząstki. Przykład 1 Wstrzyknięcie terapeutycznej kompozycji chrząstki przez artroskop [0078] Najpierw pobrano tkankę chrzęstną od gospodarza zwierzęcego lub ludzkiego i z tkanki izolowano chondrocyty. Następnie izolowane komórki hodowano, aby przygotować terapeutyczny czynnik chrząstki, składający się z 0,3 do 0, ml DMEM i 9x 6 do 1,x 7 chondrocytów. [0079] Następnie, jako dostępny w handlu produkt medyczny, przygotowano uszczelniacz fibrynowy i dodano DMEM do fiolki zawierającej liofilizowany fibrynogen tak, że fibrynogen rozpuszczono do stężenia 0 mg/ml do 0 mg/ml. [0080] Ponadto, liofilizowaną trombinę rozpuszczono do stężenia 00 IU/ml, a następnie otrzymany roztwór trombiny dodano do terapeutycznego czynnika chrząstki w stężeniu 1 IU/ml do IU/ml. [0081] Po zakończeniu wspomnianego wyżej procesu, region uszkodzenia chrząstki kolana pacjenta był gotowy do przeszczepu przez przycięcie regionu uszkodzenia chrząstki z zastosowaniem artroskopu. [0082] Następnie, region uszkodzonej chrząstki pacjenta został prawidłowo przycięty przy użyciu narzędzi chirurgicznych, a następnie wykonano trzy do pięciu otworów o średnicy 3 mm i głębokości mm w uszkodzonym regionie przy użyciu wiertła chirurgicznego, w zależności od wielkości uszkodzonego obszaru. [0083] Następnie, z uszkodzonego regionu usunięto gruz chrzęstny i kostny i wykonano hemostazę aby zakończyć konieczne dla transplantacji etapy. [0084] Po zakończeniu koniecznych dla transplantacji etapów, mieszano chondrocytarne składniki, trombinę i macierz, zawierającą co najmniej fibrynogen, aby przygotować terapeutyczny czynnik chrząstki. [008] W związku z tym, że fibrynogen reaguje z trombiną po przekształceniu w fibrynę, która z kolei daje skrzepy, terapeutyczny czynnik chrząstki powinien być przeszczepiony w ciągu minut do miejsca przeszczepienia. 8

10 [0086] Następnie 00 IU/ml przygotowanego wcześniej roztworu trombiny rozpylono w miejscu przeszczepienia terapeutycznej kompozycji chrząstki z użyciem dyszy do rozpylania, a następnie delikatnie wytarto gazą [0087] Wówczas terapeutyczną kompozycję chrząstki, złożoną z mieszaniny chondrocytarnych składników, trombiny i fibrynogenu, powoli wstrzyknięto przy użyciu strzykawki przez wcześniej perforowane otwory w uszkodzonej części kolejno do całego obszaru. [0088] Wstrzyknięcie kompozycji powinno być szybko przeprowadzone bez powstawania pęcherzyków, a bezpośrednio po zakończeniu wstrzyknięcia, rozpylono równo 00 IU/ml roztworu trombiny o wysokim stężeniu przy użyciu dyszy do rozpylania. Przykład 2 Przeszczepienie terapeutycznego czynnika chrząstki, w którym artroskopowo dodano kolagen do kompozycji mieszaniny chondrocytarnych składników, trombiny i fibrynogenu. [0089] Jak to opisano wyżej przygotowano chondrocytarne składniki, trombinę i fibrynogen. [0090] W celu zwiększenia elastyczności i w celu uzyskania efektów regeneracji chrząstki u pacjenta wykazującego zmniejszenie elastyczności stawów może być zastosowana do przeszczepu fibrynogenowa macierz zmieszana z kolagenem. [0091] Fibrynogenowa macierz składa się z fibrynogenu i kolagenu, kwasu hialuronowego i GAG do niej dodanych. Przy łącznym stosowaniu fibrynogenu i kolagenu, u 0-letniego mężczyzny, kolagen w stężeniu wynoszącym 1/ lub 1/ może być stosowany sam lub w mieszaninie, w stosunku do stężenia fibrynogenowej macierzy, mimo że stężenie kolagenu różni się zależnie od stanu pacjenta. [0092] Na przykład w przypadku macierzy do przeszczepienia u 2-letniego mężczyzny, przygotowano fibrynogen i kolagen odpowiednio w stężeniu od 80 mg/ml do 160 mg/ml i w stężeniu mg/ml do mg/ml. Następnie zmieszano 0,3 ml fibrynogenu i 0,1 ml kolagenu, aby przygotować fibrynogenową macierz do przeszczepienia. [0093] Następnie, wytworzono otwory do wprowadzenia artroskopu do uszkodzonej części, jak w Przykładzie 1, a następnie wprowadzono przez nie artroskop w celu dokładnego przygotowania miejsca przeszczepienia. Dalej, przeszczepienie przygotowano przez wytworzenie około 4 otworów o średnicy 3 mm i głębokości mm w uszkodzonej części (wielkość zmiany u chorego wynosi około 4 cm 2 ). [0094] Następnie do chondrocytarnych składników dodano 1 IU/ml do IU/ml trombiny, a następnie terapeutyczną kompozycję chrząstki, w której zmieszano fibrynogenową macierz, zawierającą mieszaninę chondrocytarnych składników i kolagenu, wstrzyknięto i wypełniono region uszkodzenia chrząstki. [009] Kolejne procesy są takie same jak w Przykładzie 1.. [0096] Tymczasem, przy przeszczepianiu fibrynogenowej macierzy utworzonej przez dodanie innych mieszanin do fibrynogenu, rodzaje mieszanin dodane do fibrynogenu mogą różnić się zależnie od stanu i wieku pacjenta. Dla starszych pacjentów składniki macierzy takie jak kolagen i kwas hialuronowy mogą być mieszane i stosowane z terapeutycznym czynnikiem chrząstki. [0097] Fig. 7 przedstawia wzorzec różnicowania chondrocytów w fibrynogenowej macierzy jak opisano powyżej. Wzorce różnicowania chondrocytów w fibrynogenowej macierzy zawierającej % kolagenu i % kwasu hialuronowego przedstawiono na Fig. 8. Przykład 3 Wstrzykiwanie terapeutycznej kompozycji chrząstki przy zastosowaniu okostnej 9

11 [0098] Najpierw pobrano tkankę chrzęstną od pacjenta, z tkanki wyizolowano chondrocyty i hodowano je. Następnie przygotowano terapeutyczny czynnik chrząstki składający się z ponad około 1,2 x 7 chondrocytów i 0,4 ml DMEM. [0099]. Następnie, jako dostępny w handlu produkt medyczny, przygotowano uszczelniacz fibrynowy i dodano DMEM do fiolki zawierającej liofilizowany fibrynogen tak, że fibrynogen rozpuszczono do stężenia 0 mg/ml do 80 mg/ml. [00] Ponadto do fiolki zawierającej liofilizowaną trombinę dodano DMEM tak, że trombinę rozpuszczono do stężenia 00 IU/ml. [01] Następnie miejsce do przeszczepienia terapeutycznej kompozycji chrząstki było gładko przycięte z użyciem narzędzia chirurgicznego. [02] Po zakończeniu wspomnianego wyżej procesu, pobrano okostną z kolana pacjenta, a następnie ostrożnie przyszyto do miejsca przeszczepienia. [03] Po zakończeniu szycia zastosowano w zszywanym miejscu uszczelniacz. [04] Następnie ustalono czy wodoszczelność zszytej okostnej była całkowita czy nie. [0] Dalej do przygotowanych uprzednio chondrocytarnych składników dodano roztwór rozpuszczonej trombiny w stężeniu 1 IU/ml do IU/m, następnie dobrze wymieszano. [06] Następnie 0,4 ml chondrocytarnych składników zmieszanych z trombiną wymieszano dobrze z 0,4 ml roztworu fibrynogenu w celu wytworzenia przeszczepianej kompozycji. Otrzymaną kompozycję wstrzyknięto do okostnej uszkodzonej części, stosując strzykawkę jak przedstawiono na Fig.. [07 W związku z tym, że fibrynogen reaguje z trombiną po przekształceniu w fibrynę, która z kolei daje skrzepy, wstrzyknięcie powinno być przeprowadzone szybko. Przykład 4 Wstrzyknięcie kompozycji złożonej z mieszaniny fibrynogenowej macierzy, w której do fibrynogenu dodano kwas hialuronowy i GAG, i składników komórkowych, do których dodano trombinę. [08] Fragment tkanki chrzęstnej pobrano od 27-letniego mężczyzny z uszkodzeniem chrząstki wskutek wypadku komunikacyjnego i hodowano aby przygotować około 3 x 7 komórek/ml. [09] Jako składniki fibrynogenowej macierzy przygotowano 0 mg/ml do 0 mg/ml fibrynogenu, mg/ml kwasu hialuronowego i mg/ml do mg/ml GAG. [01] Ponieważ obrażenia pacjenta w związku z uszkodzeniem chrząstki w wyniku wypadku komunikacyjnego były wielkości 4 do 8 cm 2, zmieszano 0, ml fibrynogenu o stężeniu 0 mg/ml do 0 mg/ml; 0,2 ml kwasu hialuronowego o stężeniu mg/ml i 0,2 ml GAG o stężeniu mg/ml do mg/ml. [0111] Miejsce do przeszczepienia terapeutycznego czynnika chrząstki było gładko przycięte i wykonano dwa do pięciu otworów o średnicy 3 mm i głębokości mm zależnie od wielkości uszkodzonego obszaru. [0112] Potem chondrocytarne składniki mieszano z IU/ml trombiny i przygotowano trzy składnikową mieszaną macierz fibrynogenową. [0113] Następnie trombinę w wysokim stężeniu 00 IU/ml równomiernie rozpylono na miejsce transplantacji z użyciem dyszy do rozpylania. Wówczas mieszano 0,9 ml chondrocytarnych składników i trzy-składnikową mieszaną macierz fibrynogenową. [0114] Kompozycję złożoną z mieszanych chondrocytarnych składników i fibrynogenowej macierzy (kwas hialuronowy+gag) podawano powoli poprzez otwory w miejscu przeszczepienia. [01] Ponownie trombinę w wysokim stężeniu 00 IU/ml rozpylono na miejsce transplantacji i pozostawiono na około min. Proces przeszczepiania dobiegł końca wraz z zakończeniem utwardzania.

12 2 [0116] W związku z tym, że młody pacjent wykazuje dobrą elastyczność tkanki chrzęstnej, ale posiada mniejszą gładkość części chrząstki z powodu urazu, stosowanie kwasu hialuronowego lub GAG może łagodzić taką niedogodność wspierając w ten sposób łatwą regenerację chrząstki. [Zastosowanie przemysłowe] [0117] Jak opisano powyżej zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczono korzyści takich jak zapobieganie wyciekaniu terapeutycznego czynnika chrząstki, uproszczony proces chirurgiczny dla utrzymania ustalonego kształtu i zdolność utrzymania doskonałego tworzenia się chrząstki wskutek połączenia in vivo przeszczepiania składników macierzy. [0118] Ponadto dostarczono działań takich jak skrócenie czasu operacji chirurgicznej, gdy okostna nie jest przyszywana, uproszczenie procesu chirurgicznego wskutek wykorzystania artroskopu, możliwość utrzymania doskonałej regeneracji chrząstki wskutek kombinowanego przeszczepienia ze składnikami macierzy in vivo i nie wymaga nacięcia kolana. [0119] Chociaż korzystne postaci wykonania niniejszego wynalazku ujawniono w celach zilustrowania, specjaliści w dziedzinie ocenią, że różne modyfikacje, dodatki i substytucje są możliwe. Zastrzeżenia patentowe 1. Terapeutyczna kompozycja chrząstki obejmująca mieszaninę składników chondrocytarnych, izolowanych i namnażanych lub różnicowanych od gospodarza, oraz trombiny i fibrynogenowej macierzy, zawierającej fibrynogen, przy czym trombina jest stosowana w ilości 0,01 do 0 IU/ml, przy czym fibrynogenowa macierz zawiera 0,01 mg/ml do mg/ml kolagenu i 0,1 mg/ml do mg/ml kwasu hialuronowego, przy czym fibrynogenowa macierz zawiera mg/ml do 0 mg/ml fibrynogenu. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że składniki komórkowe są wytwarzane przez oddzielenie komórek z normalnej tkanki chrzęstnej izolowanej od gospodarza z użyciem enzymu i inkubowanie komórek w podłożu hodowlanym w celu otrzymania hodowli zawierającej więcej niż 6 komórek/ml. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że fibrynogenowa macierz zawiera co najmniej jeden antybiotyk wybrany spośród antybiotyków takich jak penicylina G i streptomycyna oraz czynniki przeciwgrzybicze takie jak kanamycyna, amfoterycyna B, nystatyna i gentamycyna. 11

13 Wytrzymałość Trombina 2 IU/ml Trombina 4 IU/ml, Trombina 8 IU/ml, Trombina IU/ml Stężenie fibrynogenu 12

14 13

15 14

16