Profesor Cebrat: Z punktu widzenia biologicznego in vitro powinno być zabronione

Transkrypt

1 Profesor Cebrat: Z punktu widzenia biologicznego in vitro powinno być zabronione 22 lipca 2015 prezydent Bronisław Komorowski podpisał ustawę o in vitro. Wcześniej ustawa została przyjęta przez Sejm oraz Senat. Wejdzie w życie po trzech miesiącach od podpisu prezydenta. Tymczasem eksperci od genetyki człowieka od lat podnoszą racjonalne argumenty, z którymi trudno się jest nie zgodzić. Są to między innymi: koszty ciągnione procedury, częstsze wady rozwojowe u poczętych tą metodą dzieci, powikłania w czasie ciąży i porodu, wcześniactwo oraz pojawianie się nowych mutacji. Przeczytajcie ciekawe wywiady z ekspertem od genomiki prof. Stanisławem Cebratem z Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego. 1. Czy metoda in vitro jest bezpieczna dla dzieci poczętych w ten sposób? Czy państwo powinno ją refundować?czy powinniśmy eksperymentować z genomem człowieka? Dlaczego z punktu widzenia biologicznego in vitro powinno być zabronione? Z prof. Stanisławem Cebratem, kierownikiem Zakładu Genomiki Uniwersytetu Wrocławskiego rozmawia w Gazecie Wrocławskiej Maciej Sas: -biznes-a-nie-nauka,3,id,t,sa.html 2. Narażamy życie całej populacji:

2 Metody wykrywania białka M w gammapatiach monoklonalnych (I) W diagnostyce chorób układu krwiotwórczego przebiegających ze zwiększoną liczbą komórek plazmatycznych, niezwykle ważne są badania laboratoryjne stężenia immunoglobulin, wydzielanych przez te komórki. Do dyspozycji lekarza i diagnosty pozostaje kilka metod wykrywania patologicznego białka, takich jak immunoelektroforeza białek surowicy krwi oraz immunofiksacja. Jednakże obecnie jednym z najbardziej przydatnych, zarówno przy ustalaniu rozpoznania, doborze leczenia, jak i w jego monitorowaniu jest badanie wolnych łańcuchów lekkich w surowicy (ang. serum Free Light Chains, sflc). Charakterystyka gammapatii monoklonalnych Do tzw. gammapatii monoklonalnych zalicza się m.in. zespoły MGUS, szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Walderstroema, chorobę łańcuchów ciężkich (HCD), oraz amyloidozę z łańcuchów lekkich. We wszystkich tych schorzeniach mamy do czynienia z rozrostem klonalnym komórek plazmatycznych lub limfoplazmatycznych, które produkują kompletne bądź niekompletne (łańcuchy lekkie/ciężkie) cząsteczki tego samego wariantu immunoglobuliny. Zgodnie z typem struktury wydzielanej immunoglobuliny możemy mówić o monoklonalnym

3 białku IgG, IgA, IgM (wyjątkowo rzadko IgD, IgE), oraz o łańcuchach lekkich kappa i lambda. Do diagnostyki podtypów Ig jeszcze wrócimy, zwróćmy jednak uwagę na wysoce zmienny charakter cząsteczek immunoglobulin. Ze względu na swoją rolę w wykrywaniu obcych antygenów, poliklonalne immunoglobuliny fizjologicznie występujące w ustroju są bardzo różnorodne. Dlatego struktura monoklonalnej immunoglobuliny w gammapatiach jest w zasadzie unikalna dla każdego chorego. Wynika stąd wiele problemów diagnostycznych, o czym za chwilę. Najnowszy podział gammapatii monoklonalnych jest oparty o odsetek plazmocytów w szpiku chorego, stężenie produkowanej immunoglobuliny (zwanej także białkiem M), stosunek stężeń łańcuchów lekkich kappa i lambda, oraz o objawy konstytucjonalne u chorego. Tetrada objawów klinicznych, określana akronimem CRAB dotyczy zwiększonego poziomu wapnia, uszkodzenia nerek, anemii i ubytków kostnych. W zależności od powyższych kryteriów wyróżniono: zespoły MGUS gammapatie monoklonalne o niezidentyfikowanym znaczeniu (najniższe ryzyko konwersji do pełnoobjawowego szpiczaka); szpiczak tlący się (ang. smouldering myeloma)- bez objawów konstytucjonalnych, ale istnieje wyraźne ryzyko progresji do pełnoobjawowego szpiczaka; szpiczak plazmocytowy forma objawowa; białaczka plazmocytowa agresywna, uogólniona postać szpiczaka mnogiego o przebiegu ostrej białaczki; szpiczak niewydzielający forma szpiczaka produkująca bardzo niewielkie ilości białka M lub cechujące się bardzo szybką jego degradacją w ustroju; makroglobulinemia Walderstroema typ chłoniaka nieziarniczego z komórek limfoplazmatycznych, wydzielających immunoglobulinę monoklonalną klasy IgM; -choroba łańcuchów ciężkich (choroba Franklina, choroba Seligmanna) bardzo rzadki rozrost monoklonalny z komórek limfoplazmatycznych, wydzielający jedynie fragmenty łańcucha ciężkiego, bez łańcuchów lekkich; amyloidoza AL (z łańcuchów lekkich) choroba spichrzeniowa powodowana odkładaniem się w tkankach nieprawidłowego białka monoklonalnego,

4 produkowanego przez nowotworowy klon plazmocytów [1]. 2. Zmienność białka M Kłopoty diagnostyczne związane z wykrywaniem białka monoklonalnego są spowodowane fizjologiczną heterogennością cząsteczek przeciwciał i różną charakterystyką nowotworowego klonu komórek plazmatycznych/limfoplazmatycznych. Wykazano że w część przypadków gammapatii produkowane jest tylko białko w postaci kompletnych przeciwciał, w innych są to tylko łańcuchy lekkie lub jednocześnie występują łańcuchy lekkie i kompletne Ig. Dodatkowo szpiczaki niewydzielające mogą produkować na tyle mało białka M, że jest ono niewidoczne w badaniach laboratoryjnych. Zmienność Ig prowadzi także do problemów z wynikami fałszywie ujemnymi, gdy stosowane testy oparte są o przeciwciała monoklonalne anty-ig. W przeciwieństwie do poliklonalnych, wykrywają one pojedyncze epitopy na cząsteczkach Ig, które mogą być nieobecne w niektórych wariantach tak zmiennych białek. Osobnym problemem jest ko-migracja immunoglobuliny monoklonalnej (szczególnie IgA) z frakcją białek beta w obrazie elektroforetycznym. W rzadkich przypadkach w szpiczaku obserwujemy białko biklonalne, produkowane równolegle przez 2 odrębne klony szpiczakowe [2]. W części drugiej niniejszego opracowania przedstawimy metody laboratoryjne wykorzystywane w rutynowej diagnostyce gammapatii i wskażemy, jak radzić sobie z powyższymi problemami, aby uniknąć wyników fałszywie negatywnych. Piśmiennictwo: 1. Dmoszyńska A. Dyskrazje plazmocytowe [W:] Dmoszyńska A. (red.) Wielka Interna Hematologia, wyd. I, Warszawa, Medical Tribune Polska 2011., str Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and Identifying Monoclonal Gammopathies. Clinical Chemistry 2000, 46(8)

5 Była sobie otyłość. Część 2: Wstęp do genetyki otyłości. Jak już pisaliśmy w poprzednim odcinku przyczyną otyłości oprócz dodatniego bilansu energetycznego są uwarunkowana genetyczne, zaburzenia wewnątrzwydzielnicze czynności gruczołów, uszkodzenie podwzgórza oraz wpływ niektórych leków. Otyłość może również wystąpić po urodzeniu z powodu lepszej przyswajalności pokarmu oraz wzrostu łaknienia. Pojawia się wtedy jako rekompensata niedożywienia płodu. Przekarmianie sprzyja rozwojowi otyłości, jednakże istnieje uwarunkowana genetycznie otyłość tzw. hiperplastyczna (rozrostowa), związana ze zwiększeniem liczby adipocytów. Ten typ otyłości może również być wynikiem przekarmiania w dzieciństwie i nie jest zbytnio podatny na odchudzanie. Intensywne badania nad otyłością wykazały, iż kluczową rolę w patogenezie otyłości odgrywają czynniki genetyczne. Wyodrębniono 5 genów, które zaliczane są do tzw. genów otyłości: -gen ob (obese) gen leptyny; -gen db (diabetes) gen receptora leptyny; -gen fat gen karboksypeptydazy E; -gen agouti gen peptydu agouti, antagonisty receptora melanotropowego; -gen tub gen białka tubby. Z praktycznego punktu widzenia genetyczne przyczyny otyłości podzielono na:

6 -Mutacje pojedynczego genu skojarzone z otyłością; -Mutacje wielogenowe. Do mutacji pojedynczego genu zalicza się przede wszystkim: -polimorfizm genu receptora melanokortyny- 4; -mutacje w genie POMC i agouti; -mutacje genu receptora dopaminy D4; -mutacje genów kodujących czynniki stymulujące termogenezę; -mutacje genów leptyny i receptora leptyny. W następnej części.: polimorfizm genu MC4R oraz mutacje w genie POMC i agouti jako jedne z przyczyn zaburzeń gospodarki lipidowej. Biotechnologia medyczna niezaspokojona pasja życia Biotechnologię medyczną definiuje się jako wykorzystanie układów żywych do procesów technologicznych znajdujących zastosowanie w przemyśle zdrowotnym. Dla mnie termin ten określa sztukę zgłębienia największej znanej człowiekowi tajemnicy życia, dlatego nie tak znowu dawno temu zdecydowałam się zasilić szeregi studentów Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, pełna podziwu dla czekających na mnie możliwości. Studia organizują dwie jednostki akademickie, w tym jedna medyczna, ale nie oznacza to, że program jest ukierunkowany jednotorowo. Choć rzeczywiście

7 kładzie się duży nacisk na takie obszary, jak histologia, immunologia, czy biologia komórki nowotworowej, przedmioty są dobrane tak, by nie zawężać horyzontów i dać jednocześnie dość obszerne pojęcie o tematyce niezwiązanej bezpośrednio z medycyną, dotyczącej na przykład biotechnologii roślin albo mikrobiologii. Student decyduje o pogłębianiu wiadomości w danej dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej, wirusologii molekularnej, czy wspomnianej już biotechnologii medycznej i roślin w związku z wyborem tematyki oraz miejsca wykonywania projektu licencjackiego i pracy magisterskiej. Nasi wykładowcy nie są technikami, którzy mechanicznie dystrybuują informacje. Starają się rozniecać naukową wyobraźnię i żądzę wiedzy. Dbają też o to co jest moim zdaniem jedną z największych zalet tego kierunku byśmy szybko nauczyli się odnajdywać w środowisku naukowym, dzięki czemu czytanie publikacji, przygotowanie i wygłoszenie prezentacji wyników badań w języku angielskim nie stanowi dla absolwenta najmniejszego problemu. Uczelnia ma do zaoferowania bogaty system stypendialny. Studenci studiów licencjackich mogą otrzymywać stypendium w ramach tak zwanego kierunku zamawianego. Inne propozycje wiążą się z możliwością wyjazdów. Zanim jeszcze otrzymaliśmy legitymacje, zaproponowano nam udział w rekrutacji na trzyletnie studia zagraniczne, realizowane we współpracy z konsorcjum dziesięciu europejskich uniwersytetów ( Job Creation Oriented Biotechnology Diploma ). Z kolei w trakcie studiów drugiego stopnia mogliśmy ubiegać się o stypendium na wykonywanie pracy magisterskiej na Uniwersytetach w Chicago i Wirginii. Prężnie działa również system programu Erasmus umożliwiający wymiany na rok akademicki i wakacyjne praktyki. Wydział pozostawia dużą swobodę w wyborze jednostki prowadzącej. Koledzy najczęściej wyjeżdżają do ośrodków naukowych z Europy i Stanów Zjednoczonych, chociaż niektórzy wolą rodzime instytuty (ja swoje pierwsze praktyki odbywałam w PAN). Dodatkowo, co roku Park Naukowo-Technologiczny w Gdyni ogłasza rekrutację na niebanalne praktyki dla studentów z całej Polski. Studenci rozwijają swoje biotechnologiczne zainteresowania, prowadząc badania w projektach koła naukowego BIO-MED. Aktualnie realizowane są między innymi doświadczenia mające na celu określenie zależności między wrażliwością komórek nowotworowych jelita grubego na witaminę D, a ekspresją genów związanych z jej aktywnością.

8 Jeśli w wakacje ktoś zatęskni za studiami, może wziąć udział w cyklu wykładów prowadzonych przez polskich i zagranicznych naukowców w trakcie corocznej Letniej Szkoły Biotechnologii. Władze obu uniwersytetów podejmują także konkretne działania w celu zapewnienia studentom miejsca pracy. Wspólnie z Politechniką Gdańską Wydział powołuje ośrodek badawczo-wdrożeniowy Bałtyckie Centrum Biotechnologii i Diagnostyki Innowacyjnej, w którym prowadzone będą badania z zakresu diagnostyki innowacyjnej, użyteczne w powiązanych z biotechnologią gałęziach przemysłu. Takie studia na pewno świetnie przygotowują do pracy naukowej. Wydział jest bardzo elastyczny i ciągle się zmienia, aby doskonalić swój i tak wysoki poziom kształcenia w rankingu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego znajduje się w najwyższej, pierwszej kategorii. Nasi studenci i absolwenci są mile widziani i dobrze odbierani na uczelniach z całego świata. Nauka na MWB otwiera perspektywy uczestniczenia w projektach nad badaniami podstawowymi biologii nowotworów, komórek eukariotycznych i prokariotycznych, a także poszukiwaniem nowych leków, tworzeniem nowatorskich szczepionek i systemów diagnostycznych. Można oczywiście też próbować swoich sił jako diagnosta (po ukończeniu kursu podyplomowego), technik kryminalistyki (po szkoleniu policyjnym), w koncernach farmaceutycznych, czy kosmetycznych. Młody człowiek, który ma głowę pełną pomysłów, jest odrobinę szalonym fascynatem, a zadowolenie z tego, co robi, najzupełniej wynagradza mu skromne życie, na pewno odnajdzie tutaj swoje miejsce. Martyna Franczuk

9 Gravity flow krok naprzód w dziedzinie izolacji DNA Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem. Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA. Jak to działa? Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA.

10 Metoda Gravity flow. Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo prosta, szybka i płynna. Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających. Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow

11 Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza. Gravity flow na żywo Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow. Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej

12 epmotion. Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow. 1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie, niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla oso b zabezpieczaja cych pro bki poza laboratorium np.pro bki s rodowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość plastikowych odpadów. 2. Elastyczność Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy. 3. Większa wydajność W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału. 4. Łatwość automatyzacji Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96. Właściwy czas, żeby się przekonać Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy

13 darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na Zapraszamy! Przechowywanie próbek w biotechnologii: jak, gdzie i jak długo? (III) Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. W poprzednich częściach ( I oraz II) zostało opisane postępowanie z materiałem biologicznym. Ostatnia część cyklu będzie koncentrowała się wokół produktów syntetycznych używanych w biotechnologii. Syntetyczne oligo i polinukleotydy Syntetyczne cząsteczki DNA, LNA czy PNA można potraktować tak samo jak plazmidy (część II niniejszego opracowania). Są one dostarczane do klienta na ogół w formie liofilizatu, który przechowuje się najczęściej po rozpuszczeniu w odpowiedniej objętości wody lub buforu w temperaturze -20 lub <-70 stopni. Jeżeli często używamy ich do przygotowywania reakcji- korzystajmy z mniejszych alikwot i stężeń roboczych. Sondy i barwniki fluorescencyjne W przypadku sond i barwników sytuacja jest zbliżona do oligonukleotydów. Bezwzględnym warunkiem przechowywania jest ciemność, gdyż wszelkie związki absorbujące i emitujące światło są wrażliwe na zbyt długą i silną ekspozycję. Najlepiej

14 przechowywać jest je w próbówkach nieprzezroczystych, lub w specjalnych próbówkach typu amber (bursztynowych), które częściowo pochłaniają promieniowanie świetlne nie pozbawiając nas wglądu w próbkę. Niektóre barwniki sproszkowane lub w roztworach stabilizujących można przechowywać nawet latami w lodówce lub w temperaturze pokojowej- wszystko zależy od specyfiki barwnika. Taka informacja musi znaleźć się na opakowaniu. W przypadku sond i znakowanych starterów należy przyjąć strategię taką jak z przechowywaniem innych syntetycznych oligo, mając na uwadze to, że znaczniki fluorescencyjne są bardziej podatne na degradację, w związku z czym przechowujemy je w ciemności i hołdujemy zasadzie, że im mniej cykli zamrażania-rozmrażania tym lepiej. Zamawiając znakowane oligo mierzmy siły na zamiary- nie zamawiajmy największej możliwej skali syntezy tylko po to, by barwnik po kilku latach się wyświecił, lepiej zamawiać częściej w mniejszych ilościach. Natywne białka enzymatyczne i przeciwciała Białka są bardzo heterogenną pod względem podatności na degradację grupą związków. Niektóre spośród nich są odporne na działanie czynników zewnętrznych (np. niektóre białka strukturalne), większość jednak jest uzależniona od warunków ph, temperatury, siły jonowej, statusu RED-OX czy też obecności stabilizujących ligandów. Dlatego oczyszczone białka należy dobrze poznać by móc stworzyć im dogodne warunki przechowywania. Zwykle roztwory wodne niemrożone mają trwałość do ok. miesiąca czasu, białka przechowywane w glicerolu lub glikolu w -20 C około roku (aczkolwiek utrata aktywności nie następuje szybko, ale stopniowo, więc pewną zdolnośc katalizy np. enzymy mogą zachować nawet ponad 10 lat!). Mrożone w <-70 C lub liofilizowane białka często można przechowywać latami. Z reguły liofilizaty wykazują po renaturacji mniejszą wyjściową aktywność niż roztwory po jednym cyklu mrożenie-rozmrożenie, są jednak od tej zasady odstępstwa. Jeżeli szukamy sposobu na przechowanie otrzymanego właśnie przez nas latach prób białka, możemy skorzystać z gotowych roztworów krioprotekcyjnych, zawierających stabilizatory (jak glikol, dekstrany, glicerol, mannitol), reduktory (np. DTT), inhibitory proteaz (chelatory, PMSF, białka). Materiały radioaktywne W kwestii preparatów znakowanych pierwiastkami promieniotwórczymi istnieje cały szereg odrębnych przepisów, regulujących ich przewóz, składowanie i utylizację. Każdy pracownik przed rozpoczęciem pracy z radioizotopami musi zapoznać się z tymi regulacjami, a niniejszy artykuł to tylko bardzo ogólna ściąga. W laboratoriach naukowych najczęściej wykorzystywane są związki trytu, siarki, fosforu i węgla, emitujące promieniowanie beta- o stosunkowo długim okresie

15 półtrwania (trytu i węgla liczony w latach, siarki ok. 3 miesięcy, fosforu 2 tygodnie). W pracowniach radioizotopowych laboratoriów klinicznych repertuar związków jest o wiele większy, warto wspomnieć np. o radionuklidach chromu, żelaza czy jodu. Miejsce przechowywania związków zawierających radioizotopy musi być oznaczone specjalną tablicą (wzór określony odpowiednim rozporządzeniem ministerialnym). W takim pomieszczeniu zabrania się składowania substancji łatwopalnych, wybuchowych, wydzielających opary żrące i powodujących korozję, a także gazów sprężonych. Źródła i odpady promieniotwórcze przechowuje się w sposób uniemożliwiający rozprzestrzenianie się skażeń promieniotwórczych, najczęściej w ołowianych pojemniczkach odpowiednich do rodzaju promieniowania.dostęp do materiałów promieniotwórczych powinny mieć tylko osoby do tego uprawnione i przeszkolone. Korzystając z wyznakowanych radioaktywnie substancji pamiętajmy o okresie półtrwania: jeżeli przechowujemy je dłuższy czas, przed użyciem przeliczmy, czy aktywność związku dalej jest wystarczająca do przeprowadzenia eksperymentu (bardzo rzadko się o tym pamięta a czasami ma to istotne znaczenie na powodzenie np. hodowli komórkowej w pożywce z radionuklidem). Oczywiście w diagnostyce medycznej producent zestawu określa datę przydatności do użycia (w przypadku jodu ok. 3 miesiące) i nie musimy kłopotać się oznaczaniem aktywności. Temat przechowywania w biotechnologii jest bardzo obszerny, w codziennej pracy możemy spotkać się z różnymi odczynnikami i materiałami które przyjdzie nam składować przez dłuższy czas. Żeby móc zachować ich właściwości, często musimy dobrze poznać każdą substancję. Jeżeli nie dysponujemy instrukcją przechowywaniapytajmy znajomych w innych laboratoriach, szukajmy w książkach i protokołach firm. Wbrew pozorom w dzisiejszych czasach producenci odczynników zachęcają konsumentów do kupna swoich odczynników bardzo profesjonalnymi opracowaniami na temat użytkowania tych produktów. Piśmiennictwo: 1. Protein stability and storage. Pierce, 2005, Materiały dydaktyczne z zakresu diagnostyki izotopowej (podziękowania dla kadry prof. Rybczyńskiej!) 3. Doświadczenia własne

16 Technika MLPA: między cytogenetyką a biologią molekularną Nazywana potocznie małpą technika MLPA (ang. Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) nie jest ani tak znana jak SSCP, ani tak popularna jak RFLP, ani tak sławna jak FISH. Jest za to równie elastyczna jak wszystkie wymienione metody razem wzięte i pozwala na detekcję małych i większych mutacji, jak również rearanżację chromosomowych naraz. Ani rutynowa cytogenetyka ani tradycyjna diagnostyka molekularna nie oferuje tak szybkiego i zgrabnego screeningu jak MLPA, a mimo to nie jest to powszechnie stosowana w diagnostyce metoda. Może jednak warto przyjrzeć się jej bliżej? MLPA powstała jako odpowiedź na pytanie: czy da się podczas jednej reakcji PCR zamplifikować więcej niż 10 amplikonów? Każdy, kto choć raz łączył PCR y w multipleks wie, że przy tradycyjnym podejściu do zagadnienia jest to praktycznie niewykonalne. Ale jest sposób, który eliminuje konieczność mieszania >20 oligonukleotydowych starterów, by zamplifikować interesujące nas geny. Wystarczy użyć uniwersalnych adaptorów przed właściwą reakcją PCR. Dzięki temu jeden komplet starterów komplementarnych do sekwencji adaptorów zamplifikuje co nam się żywnie podoba! Mechanizm reakcji W MLPA wykorzystano dwie znane od dawna techniki, należące do kanonu biologii molekularnej: PCR oraz ligację DNA. Pierwszy etap reakcji polega na hy6brydyzacji sond połówkowych, częściowo komplementarnych do sekwencji

17 docelowych naszego DNA, częściowo zaś niekomplementarnych. Obie połówki sond hybrydyzują dokładnie obok siebie na DNA, pozwalając na późniejszą ligację, natomiast sekwencje niekomplementarne zawierająna końcu tag wspólny dla wszystkich połówek (który stanie się po ligacji sekwencją przyłączającą starter) oraz tak zwany stuffer, niekomplementarny ciąg zasad DNA, którego jedyną funkcją jest wydłużenie sekwencji amplifikowanej później przez wspólne startery. Celem jest to, żeby każda sonda różniła się znacząco wielkością. Pozwoli to na rozdział elektroforetyczny zaplifikowanych sond. Po przyłączeniu sond połówkowych następuje ligacja obu połówek każdej z sond. Produktem ligacji jest zestaw sond o różnej sekwencji środka, różnej długości, ale o wspólnych sekwencjach końców. Nasz zestaw sond jest później poddawany amplifikacji w reakcji PCR, wykorzystującej pojedynczą parę starterów, komplementarną do sekwencji brzeżnych sond. Produkty amplifikacji rozdziela się z reguły kapilarnie, chociaż niektóre metodyki dopuszczają rozdział agarozowy (na przykład w screeningu mutacji dystrofiny, tak zwanym low-resolution MLPA). Żeby pomóc wam zrozumieć nietypowy i dość zawiły mechanizm reakcji zamieszczam poniżej rycinę, obrazującą przebieg MLPA.

18 Niezbędne odczynniki i sprzęt MLPA nie wymaga bardzo zaawansowanego sprzętu, a odczynniki niezbędne do przeprowadzenia analizy (ligaza, bufor, sondy i startery, polimeraza i dntp) są sprzedawane w zestawie przez laboratorium, w którym wynaleziono i udoskonalono technikę i to za stosunkowo niewielkie pieniądze. Do wszystkich analiz wymagany jest termocykler (nie ma chyba laboratorium molekularnego, które nie byłoby wyposażone w to urządzenie) a dodatkowo, do oznaczeń o wysokiej rozdzielczości, konieczny jest system do fluorescencyjnej elektroforezy

19 kapilarnej. Brak tego kosztownego sprzętu nie stanowi jednak problemu nie do przeskoczenia dla małych laboratoriów rozdział kapilarny wykonywany jest przez wiele firm i nie jest drogi (koszt poniżej 20 złotych za próbkę), więc technika MLPA jest osiągalna niemal dla każdego. Samodzielne przygotowanie testu w oparciu o MLPA? MRC Holland oferuje obecnie duży wybór zestawów do MLPA, które pokrywają większość zapotrzebowania dla diagnostyki i badań naukowych. Każdego naukowca kusi jednak perspektywa przygotowania własnego, skrojonego na miarę MLPA. Z jednej strony jest to bardzo atrakcyjna technika o wielkim potencjale, z drugiej jednak stanowi ogromne wyzwanie dla bioinformatyków i spory koszt poniesiony na przygotowanie sond połówkowych (amplifikacja w oparciu o wektory fagowe M13). W Polsce niewiele laboratoriów na to stać, a ryzyko, że metoda nie będzie chodzić, albo że połowa sond wypadnie z powodu konfliktów sterycznych i dimeryzacji jest znaczne. Nie oznacza to jednak, że nie warto podnieść rękawicy; należy jednak zastanowić się i przekalkulować, czy projektowanie własnego zestawu MLPA nam się opłaci. Nie tylko zalety Oprócz trudności w przygotowaniu własnej metodyki MLPA metoda ma inne wady, które zmniejszają jej użyteczność. Przede wszystkim MLPA rzadko wykrywa translokacje zrównoważone, nie nadaje się także do poszukiwania nieznanych mutacji. Wrażliwość na SNP w miejscu ligacji jest przydatna w analizie znanych mutacji, ale jest też piętą achillesową, bo obecność polimorfizmów pomiędzy sondami połówkowymi może być potraktowana jako (fałszywie) pozytywny wynik. Inny potencjalny problem to czystość DNA poddanego hybrydyzacji z sondami MLPA. Materiał musi być nienagannej jakości, by można było przeprowadzić reakcję. Dla cytogenetyków złą wiadomością będzie także ograniczenie możliwości identyfikacji rearanżacji chromosomowych do populacji komórek. Nie jesteśmy w stanie określić kariotypów poszczególnych komórek wynik jest wypadkową wszystkich rearanżacji w pewnej ich populacji, więc nie mamy możliwości opisu materiału z taką dokładnością, z jaką ma to miejsce w cytogenetyce klasycznej. Zastosowania metody

20 Gdzie MLPA ma zastosowanie? Metoda przeżywa swój renesans w diagnostyce prenatalnej i genetyce klinicznej, wspomagając analizę kariotypu i FISH w poszukiwaniu zespołów mikrodelecyjnych i insercji, które są nieuchwytne w badaniu chromosomów metafazalnych. Wiele metodyk jest także dedykowanych badaniom aberracji chromosomowych w onkologii i hematologii (istnieją panele dedykowane np. dla chłoniaków czy ostrych białaczek) oraz mutacji kojarzonych z wieloma zaburzeniami (EGFR w niedrobnokomórkowym raku płuca, BRCA1 i 2 w raku piersi). MLPA jest także w stanie zidentyfikować disomię jednorodzicielską (analiza profilu metylacji) jako przyczynę choroby oraz dać odpowiedź (w niektórych przypadkach) na pytanie o to dlaczego pary starające się o potomstwo nie mogą go począć. Wiele laboratoriów w Polsce ma już w swojej ofercie MLPA. Mimo pewnych słabości, ta metoda ma przyszłość ze względu na swoją prostotę i wyjątkową plastyczność. Na pewno warto rozważyć wypróbowanie jej w praktyce. Marzena Pieronkiewicz Źródło: MRC Holland. Postępy Biologii Komórki.

21 Diagnostyka laboratoryjna nasienia Żyjemy w czasach, w których coraz większa liczba par ma problemy z poczęciem potomstwa. Klinicyści są zgodni, że najszybsze i najskuteczniejsze diagnozowanie niepłodności opiera się na wszechstronnym badaniu niepłodności u obojga partnerów jednocześnie, z oceną gospodarki hormonalnej oraz prawidłowości wytwarzania gamet. Niestety w praktyce diagnostyka niepłodności trwa długo i zwykle rozpoczyna się od przebadania mężczyzny pod kątem występowania defektów w wytwarzanym nasieniu. Jest to materiał łatwy do pozyskania, a sama procedura badania jest relatywnie szybka i tania, ocenia się, że aż 40% problemów z płodnością par jest związana właśnie z obniżoną zdolnością plemników partnera do zapłodnienia. Jak pozyskuje się nasienie do badań? Niestety rutynowo nie praktykuje się pobierania spermy w warunkach domowego zacisza ze względu na konieczność szybkiego wykonania badań po pobraniu materiału. Mężczyzna pobiera nasienie samodzielnie w placówce wykonującej badanie ma do dyspozycji osobny pokój wyposażony podobnie jak gabinet dla dawców spermy i zapewnioną intymność. Pobranie nasienia w domu jest dopuszczalne, jeżeli pacjent jest wybitnie skrępowany i ma problem z wykonaniem tej czynności w obcym otoczeniu. Są to przypadki indywidualnie uzgadniane z laboratorium, w takich sytuacjach konieczne jest szybkie przetransportowanie ejakulatu w temperaturze 37 stopni do placówki wykonującej badanie (optymalnie w ciągu kilkunastu minut). Przygotowanie do badania obejmuje okres abstynencji płciowej od 2 do 7 dni. Ze względu na pewną zmienność analityczną badanie powinno zostać wykonane co najmniej dwukrotnie w odstępie czasu co najmniej tygodniowym, maksymalnie 3- miesięcznym. Jeżeli wyniki istotnie się między sobą różnią, wykonuje się trzecie oznaczenie. Bardzo istotne jest pobranie całej objętości ejakulatu, ponieważ plemniki rozmieszczone są w nim nierównomiernie, z tego względu ilościowa ocena może

22 być zaburzona przy źle zebranym materiale. W przypadku badania mikrobiologicznego nasienia, należy przed pobraniem materiału oddać mocz i umyć dokładnie okolice cewki moczowej (podobnie jak do badania mikrobiologicznego moczu). Badanie nasienia rutynowo obejmuje kilka etapów: -ocena makroskopowa: objętość, barwa, ciągliwość ( lepkość), ph, stopień upłynnienia, czasami podawany jest także zapach -ocena mikroskopowa morfologii komórek plemnikowych -ocena mikroskopowa ilości plemników w ml upłynnionego ejakulatu -ocena żywotności i ruchliwości plemników -identyfikacja innych elementów upostaciowanych obecnych w ejakulacie (pasma śluzu, agregaty i aglutynaty plemników, obecność komórek nabłonkowych, niedojrzałych komórek rozrodczych, leukocytów i erytrocytów) -dodatkowe badania biochemiczne: poziom fruktozy, LDH4, alfa-glukozydazy, kwaśnej fosfatazy, kwasu cytrynowego -uzupełniające badania bakteriologiczne, histologiczne (ocena zawartości DNA) -testy czynnościowe: badanie penetracji śluzu 1. Opis makroskopowy Wstępny opis ejakulatu powinien zostać wykonany jak najwcześniej po pobraniu materiału, by możliwa była ocena czasu upłynnienia. Płyn nasienny początkowo wykazuje dużą lepkość, co zabezpiecza plemniki przed uszkodzeniami podczas przechodzenia przez cewkę moczową. W warunkach prawidłowych powinien on ulec upłynnieniu w czasie od kilkunastu do ok. 30 minut, przyjmuje się jednak że patologią jest nieupłynnienie materiału w ciągu godziny. Ocena objętości możliwa jest albo poprzez zważenie (mniej dokładna), albo

23 poprzez faktyczne zmierzenie objętości po upłynnieniu w naczynku z podziałką lub w pipecie. Zwykle objętość nasienia pobranego po odpowiednim czasie abstynencji wynosi 2-6ml. Ocena wizualna materiału po upłynnieniu to opis koloru i przejrzystości prawidłowa sperma jest opalizująca, nieprzejrzysta, o kolorze białawym i jednolitej konsystencji. Zbyt duża przejrzystość świadczy o małej liczbie plemników z kolei wysoka leukocytoza może powodować mocniejsze zmętnienie. Sperma podbarwiona krwią ma brunatny odcień, niektóre leki i podwyższony poziom bilirubiny wolnej mogą dawać kolor żółty. Orientacyjna ocena lepkości nasienia wykonywana jest na bagietce szklanej lub w pipecie pasteurowskiej. Prawidłowy materiał nie powinien się ciągnąć w formie długich pasm po upłynnieniu, ale kapać dość dużymi kroplami Pomiar ph wykonuje się paskowo przy pomocy wskaźnika o zakresie odczynów od lekko kwaśnego do zasadowego (prawidłowo sperma jest alkaliczna, ph 7,2-7,8) 2. Opis mikroskopowy Wstępna ocena wykonywana jest po upłynnieniu (ok 60 min od pobrania), przyżyciowo, w mikroskopie z kontrastem fazowym (zalecany), lub w zwykłym mikroskopie świetlnym. Na powiększeniu 10x (obiektywu) obserwujemy występowanie aglutynatów i agregatów, pasm śluzu oraz innych elementów upostaciowanych. Następnie zmieniamy powiększenie na 20 lub 40x, by przyjrzeć się ruchliwości plemników. Plemniki mogą wykazywać ruch postępowy, ruch wirowy w miejscu lub być nieruchliwe. Wg zaleceń WHO powinno się podliczyć co najmniej 200 plemników w 5 polach widzenia w każdym z 2 wykonanych preparatów. Sposób wyliczenia odsetka plemników o danym typie ruchu jest opisany w polskim opracowaniu wytycznych WHO. W preparacie bezpośrednim określamy jeszcze rozcieńczenie, które musimy wykonać, by móc przeprowadzić ocenę ilościową w komorze. We wspomnianym opracowaniu doskonale opisano jak należy wykonać rozcieńczenia.

24 Zliczenie liczby plemników w całym preparacie i przeliczenie na ml preparatu wykonuje się w komorze zliczeniowej, przy czym rekomendowane jest wykonanie tego badania w udoskonalonej komorze Neubauera. Do wykonania badania można zastosować także komorę Maklera lub Burkera, należy mieć jednak świadomość, że wyniki uzyskane w tych 3 siatkach różnią się w przypadku oligospermii, stąd rekomendowana jest tylko komora Neubauera. Z upłynnionej spermy równolegle do preparatu przyżyciowego wykonuje się rozmaz barwiony metodą Papanicolau, lub Shorra. Kryteria WHO dopuszczają także barwienie Diff-Quick. Diff-Quick i Papanicolau mogą także posłużyć do opisu innych komórek (leukocyty, nabłonki), jeżeli w obserwacji przyżyciowej zauważono dużą ilość komórek okrągłych. Ocena morfologii Ocena mortologii dokonywana jest pod powiększeniem obiektywu 100x, po wybarwieniu preoparatu jedną ze wspomnianych powyżej metod (Diff-Quick, Papanicolau, lub Shorra). Wykonujemy ocenę w dwóch powtórzeniach po 200 plemników, najlepiej z dwóch różnych preparatów. Plemniki klasyfikujemy jako prawidłowe lub nieprawidłowe, w zależności od ukształtowania główki, wstawki i witki spermatocytu. Każdy element plemnika powinien być prawidłowo zbudowany, w przeciwnym razie uznajemy taką komórkę za nieprawidłową. Główka powinna być pojedyncza, kształtu owalnego, z dobrze zaznaczonym akrosomem (lizosomem), zajmującym powyżej 40% powierzchni z przodu główki. Akrosom tworzy charakterystyczne, łukowate przejaśnienie. O ile w obszarze akrosomu można stwierdzić obecność wakuoli (jasne owale), o tyle poniżej nie powinno się stwierdzać ich obecności. Wstawka znajduje się bezpośrednio za główką, powinna leżeć w długiej osi komórki i być długości porównywalnej z główką. Wić powinna być pojedyncza, mieć długość ok 10-krotnie większą niż główka o grubości mniejszej niż wstawka i jednolitej grubości. Nie powinna być patologicznie pozakrzywiana (połamana) ani ustawiona pod dużym kątem do wstawki.

25 Obecnie dostępne są narzędzia komputerowe, pomagające w zdigitalizowanej ocenie morfologii. 3. Badania uzupełniające Badania biochemiczne nie są rutynowo wykonywane podczas oceny nasienia, natomiast po stwierdzeniu nieprawidłowości można z ich pomocą dokonać oceny poszczególnych elementów męskiego układu płciowego: prostaty, pęcherzyka nasiennego i najądrza. Odpowiedni skład płynu nasiennego zapewnia odpowiednią żywotność plemników (kwas cytrynowy pełni funkcję osmotyczną), daje im energię do ruchu (fruktoza jako paliwo), zawartość enzymów wskazuje na prawidłowość funkcji nabłonka plemnikotwórczego. Szczególną rolę w diagnostyce biochemicznej ma poziom fosfatazy kwaśnej, który ulega obniżeniu podczas infekcji sterczu. Badania immunologiczne płynu nasiennego (tzw. test MAR) pozwalają na stwierdzenie obecności przeciwciał, skierowanych przeciwko elementom nasienia. Coraz częściej obserwuje się autoimmunologiczne przyczyny problemów z płodnością. Szczególnie narażeni na rozwinięcie się przeciwciał są mężczyźnie o stwierdzonej alergii oraz chorobach z autoagresji, oraz ci z przebytymi infekcjami lub urazami prostaty, jąder i nasieniowodów. Badanie penetracji śluzu to zaawansowane badanie, testujące zdolność plemnika do przebicia się przez śluz szyjkowy. Defekty enzymatyczne dotyczące białek akrosomalnych mogą powodować brak możliwości penetracji zarówno śluzu jak i otoczki komórki jajowej. Z drugiej strony, kobieta immunizowana przeciwko plemnikom wytwarza w śluzie immunoglobuliny, które podobnie jak w sytuacji męskiej niepłodności z autoagresji, także niszczą plemniki. Marzena Wojtaszewska Źródło: UHMC SEMEN ANALYSIS

26 Labowe know-how : ELISA Test immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) jest jedną z najpowszechniejszych metod stosowanych w badaniach diagnostycznych i naukowych. Jej zadaniem jest wykrycie i oszacowanie stężenia badanego białka poprzez użycie odpowiednich przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych. Podstawą metody jest tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało, których wykrycie umożliwia sprzężona reakcja enzymatyczna. Technika została po raz pierwszy opisana przez Petera Perlmana i Eve Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie w roku 1971 i doczekała się licznych modyfikacji.

27 Mechanizm działania krok po kroku 1. Do badania używa się płytek, najczęściej polistyrenowych lub pleksiglasowych (szkło akrylowe). Każda płyta składa się ze studzienek (dołków), do których nakładane są próbki antygenu (w testach pośrednich i bezpośrednich) bądź przeciwciała (w teście kanapkowym i bardziej złożonych wariantach ELISy). Proces ten nazywany jest opłaszczaniem fazy stałej i jest niezbędny na początkowym etapie reakcji. 2. Po opłaszczaniu musimy zablokować miejsca niezwiązane z opłaczającym antygenem/przeciwciałem, a niespecyficznie wiążące białka. W tym celu stosujemy czynniki blokujące takie jak na przykład roztwór owoalbuminy, kazeina (odtłuszczone mleko w proszku), albumina (najczęściej BSA) lub żelatyna. 3. Kolejnym etapem jest dodanie specyficznego dla antygenu przeciwciała lub antygenu (w teście kanapkowym). W tym momencie tworzy się kompleks immunologiczny. 4. By uniknąć niespecyficznego tła reakcji odpłukujemy pozostałe niezwiązane przeciwciała/antygeny. 5. W testach wymagających dodania przeciwciał drugorzędowych wykonujemy kolejną inkubację i odpłukiwanie. 6. Po dodaniu do każdej studzienki odpowiedniego substratu chromogennego dla enzymu, dochodzi do reakcji enzymatycznej, co charakteryzuje się powstaniem barwnego produktu. Intensywność koloru jest sczytywana spektrofotometrycznie przy odpowiedniej długości fali (obecnie stosuje się automatyczne czytniki) i porównywana z krzywą wzorcową, sporządzaną dla znanych stężeń antygenu. Znakowanie przeciwciał: do znakowania przeciwciał używa się najczęściej peroksydazy chrzanowej, rzadziej fosfatazy alkalicznej, oksydazy glukozowej czy beta-galaktozydazy. Każdy z tych enzymów katalizuje in vitro przekształcenie substratu w barwny produkt. Enzymy są koniugowane z przeciwciałem i w tej formie sprzedawane przez producentów. Sprzęganie może być kowalencyjne (mostki disiarczkowe), poprzez łączniki dekstranowe lub wiązanie streptawidynabiotyna. Rodzaje testów

28 Bezpośredni test ELISA jest to bardzo szybka metoda wykrycia obecności antygenu, aczkolwiek droga i dziś prawie już nie stosowana. Z fazą stałą wiązany jest antygen, natomiast specyficzne przeciwciało, skoniugowane z enzymem znajduje się w roztworze. Konieczność koniugowania z enzymem każdego przeciwciała z osobna spowodowała, że metoda została wyparta przez techniki pośrednie. Pośredni test ELISA -antygen opłaszczający płytkę wykrywany jest przez swoiste, nieznakowane przeciwciało i tworzy z nim kompleks immunologiczny. W kolejnym etapie do studzienek dodawane są skoniugowane z enzymem przeciwciała drugorzędowe, nacelowane na część stałą łańcucha przeciwciała pierwszorzędowego. Jest to genialne posunięcie, pozwala bowiem na dowolny dobór przeciwciał drugorzędowych, które są uniwersalne dla organizmu, z którego pochodzą przeciwciała pierwszorzędowe. Tak więc przeciwciało anty-królicze wykryje każde przeciwciało królicze, a anty-mysie, każde przeciwciało mysie. Jest to typowy test ELISA używany w badaniach naukowych oraz w badaniach jakościowych. Metoda nie grzeszy jednak czułością, dlatego została udoskonalona w postaci testu typu Sandwich.

29 Test kanapkowy (sandwich ELISA) -służy przede wszystkim do wykrywania i ilościowego oznaczania interesującego nas antygenu w diagnostyce medycznej. Tym razem w fazie stałej znajduje się przeciwciało monoklonalne zerowego rzędu. Z nim łączy się antygen, a następnie po jego odpłukaniu używa się przeciwciała pierwszorzędowego także monoklonalnego,ale nakierowanego na inny epitop badanego białka. Pozwala to na maksymalne zwiększenie specyficzności reakcji. Zwiększenie czułości zapewnia przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem. Zalety metody ELISA jest z pewnością jedną z najważniejszych technik immunoenzymatycznych. Jej zalety to wysoka czułość, duża przepustowość, możliwość półautomatyzacji, a przede wszystkim wynik ilościowy. ELISA w rutynowej diagnostyce znalazła zastosowanie głównie w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej (wykrywanie i monitoring leczenia patogenów), immunologii i serologii (wykrywanie przeciwciał i autoprzeciwciał), toksykologii, onkologii, a także w przemyśle (typowanie szczepów, wykrywanie zanieczyszczeń grzybowych

30 produktów spożywczych) i rolnictwie. Literatura 1. Lequin R (2005), Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Clin. Chem. 51 (12): doi: /clinchem S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October 2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): PMC PMID Paulina Kłos-Wojtczak, Marzena Pieronkiewicz Przechowywanie próbek w biotechnologii: jak, gdzie i jak długo? (II) Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. W części pierwszej opisałam postępowanie z tkankami i komórkami, w drugiej zaś zajmiemy się kwasami nukleinowymi. Plazmidy i wektory Produkty PCR i konstrukty DNA, takie jak standardy do qrt-pcr, wektory

31 plazmidowe, fagowe czy BAC-i przechowywane są w postaci zamrożonych roztworów wodnych- w czystej wodzie lub buforach (np. TE) nawet latami bez znaczącej utraty ich właściwości. Ważne jest przechowywanie konstruktów i bibliotek w alikwotach, a nie w pojedynczych próbówkach, które będą wielokrotnie zamrażane i rozmrażane. Każda runda rozmrożenia powoduje częściową degradację DNA i stopniową utratę właściwości. Najlepszy sposób na przechowywanie plazmidów to głębokie mrożenie w < -70 stopniach. W zasadzie nie obserwuje się utraty superhelikalnej struktury przy takim przechowywaniu. Wygodną, ale nie tak trwałą alternatywą jest liofilizacja materiału. Uzyskany pellet może być przechowywany nawet powyżej roku czasu w temperaturze pokojowej w ciemnym pojemniku, jednak po rozpuszczeniu i elektroforezie będziemy obserwować wraz z upływem czasu stopniową utratę formy superhelikalnej do otwartej a nawet liniowej. Jeżeli zależy nam na nietkniętym plazmidzie z liofilizatu do transformacji bakterii, wówczas prowadzimy elektroforezę, wycinamy z żelu tylko formę supercoil i oczyszczamy by otrzymać nietknięte cząsteczki. DNA genomowe DNA to bardzo odporny na degradację materiał. Można go ekstrahować nawet z kości datowanych na kilkadziesiąt tys. lat. Jednakże antyczne DNA to bardzo kiepskiej jakości materiał- z każdym rokiem dochodzi do utleniania i hydrolizy niewielkiej ilości połączeń między zasadami DNA (najczęściej pękają wiązania diestrowe, tworząc nick i na niciach). Dlatego z biegiem czasu uzyskujemy coraz mniejszy plon z długich odczytów- im dłuższy amplikon, tym większa szansa na napotkanie rozciętej nici, której nie jest w stanie odczytać polimeraza. Drugim niebezpieczeństwem jest mechaniczne, dwuniciowe pękanie nici DNA podczas cykli zamrażania-rozmrażania. Tworzenie kryształów lodu sprzyja fragmentacji łańcucha. Trzecim zagrożeniem dla DNA jest hydroliza enzymatyczna powodowana przez DNAzy- najczęściej wydzielane są one do próbki przez mikroby, które dostały się do niej dzięki niesterylnemu przechowywaniu naszego DNA. Żeby zapobiec niekorzystnym zjawiskom powodującym pogorszenie jakości

32 wyizolowanego DNA, przetrzymujmy je w stanie zamrożenia (optymalnie <-70 stopni, rutynowo stosowana jest jednak temperatura zamrażalnika, ~ -20 stopni). Z doświadczenia polecam trzymać każdą próbkę w dwóch próbówkach: stężony materiał i dodatkowo rozcieńczenie robocze, które służy do oznaczeń. Jeżeli skończy się ten materiał, dopiero rozmrażam materiał stężony by przygotować nową objętość rozcieńczonego. Jak stwierdzić częściową degradację? Elektroforetycznie (powiększenie się strefy smearu w zakresie małych fragmentów) lub za pomocą multiplex STR-PCR. W takim PCRze większe amplikony będą dużo gorzej niż zwykle amplifikowane w stosunku do mniejszych. RNA RNA w przeciwieństwie do DNA jest materiałem labilny. Jest on podatny zarówno na degradację chemiczną (np. w obecności jonów 2+, kwasów lub zasad), termiczną, a przede wszystkim- enzymatyczną. RNAzy wytwarza do środowiska w dużych ilościach każdy organizm, by bronić się przed dostępem cudzej informacji genetycznej. Człowiek wydziela je z potem, śliną, łzami, śluzami- nasza skóra jest więc niebezpiecznym dla próbek RNA źródłem kontaminacji. Ze względu na podatność RNA na degradację zaleca się przechowywanie tego materiału w <-70 C, krótkoterminowo w -20 C. Nie poleca się przetrzymywania tego materiału w lodówce. Temperatura pokojowa i wyższa przyspiesza hydrolizęjeżeli zapomnieliśmy przełożyć RNA z blatu do zamrażarki, sprawdźmy je wykonując elektroforezę (oceniając jakość prążków rrna) lub wykonajmy RT-PCR lub qrt-pcr jako kontrolę degradacji mrna. Piśmiennictwo: 1. Riggio B. A Beginner s Guide to Storing Biological Materials. Bitesize Bio, 30 July Ancient DNA Repair. MCMaster Ancient DNA Center, 2010.