(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) IntCl6: C12P 19/62 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób biosyntetycznego wytwarzania erytromycyny A (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 04/93 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/95 (73) Uprawniony z patentu: Tarchomińskie Zakłady Farmaceutyczne "POLFA", Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Janina Błońska, Warszawa, PL Wanda Brześkiewicz, Warszawa, PL Andrzej Dalewski, Warszawa, PL Leonard Karabin, Warszawa, PL Ludomir Kotala, Warszawa, PL Barbara Ostrowska-Krysiak, Warszawa, PL Marian Tryc, Warszawa, PL (57) 1. Sposób biosyntetycznego wytwarzania erytromycyny A, znamienny tym, że proces biosyntezy prowadzi się przy użyciu nowego fagoopornego mutanta szczepu Streptomyces erythreus o symbolu TZF 274 F, uzyskanego na drodze przemiennej selekcji z wykorzystaniem przez mutanta nieprzyswajalności pieciowęglowych cukrów, zwłaszcza arabinozy, przy zastosowaniu hodowli na ziarnach ryżu jako materiału szczepiennego. PL B1

2 Sposób biosyntetycznego wytwarzania erytromycyny A Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób biosyntetycznego wytwarzania erytromycyny A, znamienny tym, że proces biosyntezy prowadzi się przy użyciu nowego fagoopornego mutanta szczepu Streptomyces erythreus o symbolu TZF 274 F, uzyskanego na drodze przemiennej selekcji z wykorzystaniem przez mutanta nieprzyswajalności pięciowęglowych cukrów, zwłaszcza arabinozy, przy zastosowaniu hodowli na ziarnach ryżu jako materiału szczepiennego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biosyntezę prowadzi się z wykorzystaniem pomiarów lepkości hodowli, umożliwiających niezbędne sterowanie efektywnością procesu. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób biosyntetycznego wytwarzania erytromycyny A z zastosowaniem nowego, fagoopornego mutanta szczepu Streptomyces erythreus. Mutant ten o symbolu TZF 274 F został wyizolowany na drodze przemiennej selekcji. Pożądanym jest, aby wyizolowany drobnoustrój lub jego mutant był uodporniony na działanie aktynofagów, co ma zasadnicze znaczenie w produkcji każdego antybiotyku. Sposoby uodporniania szczepów Streptomyces erythreus są znane z polskich opisów patentowych, takich jak opis nr , według którego szczep jest uodporniany przez lizogenizację i opis nr , w którym uodpornia się szczep przez rekombinację protoplastów, istotą nowej metody przemiennej selekcji, według której otrzymano nowy fagooporny mutant TZF 274 F szczepu Streptomyces erythreus, zdolny do efektywnej i ekonomicznej biosyntezy erytromycyny A, jest sposób izolowania mutanta po dokonanej mutacji szczepu, który to mutant jest jednocześnie niezdolny do pobierania ze środowiska pięciowęglowego cukru, takiego jak arabinoza. Zaobserwowano, że frakcje mutantów, które nie przyswajają arabinozy, są również niezdolne do adsorbowania aktynofaga na swoich komórkach, co oznacza oporność na te właśnie wirusy. Arabinoza wchodzi w skład ściany komórkowej szczepu Streptomyces erythreus, a także cukier ten jest przyswajany przez wzorcowe szczepy tego gatunku (A Ricicova Taxonomical Study of the Reference Strain of Streptomyces erythreus. Folia Microbiol 27,93-101, 1982). Niezdolność przyswajania arabinozy przez szczepy Streptomyces erythreus może być w pewien sposób skorelowana z ich zdolnością lub brakiem zdolności adsorbowania aktynofagów. Wśród mutantów niezdolnych do przyswajania arabinozy i opornych na aktynofagi dokonano selekcji i wybrano tylko te mutanty, które spełniają warunki celowości ich użycia w procesie biosyntezy. W nowej metodzie selekcji fagoopornych mutantów szczepu Streptomyces erythreus połączono takie operacje, jak: - protoplastyzacja komórek ułatwiająca efekty mutagenne przy użyciu powszechnie znanych mutagenów, - rewersja zmutowanych prostoplastów do komórek o normalnych właściwościach fizjologicznych, - selekcja zmutowanych klonów z zastosowaniem repliki na podłoża różnicujące w celu wybrania klonów niezdolnych podłoża różnicujące w celu wybrania klonów niezdolnych do przyswajania arabinozy i równocześnie opornych na aktynofagi, - wybór wśród wyselekcjonowanych mutanów wysokoaktywnych producentów erytromycyny A, w których najbardziej aktywnym okazał się mutant szczepu Streptomyces erythreus, oznaczony symbolem TZF 274 F. Powierzchniowa hodowla nowego mutanta TZF 274 F jest ukierunkowana na optymalny wzrost drobnoustroju w środowisku dobranych składników pożywki i na optymalną aktywność metaboliczną tego mutanta dla ukierunkowanej biosyntezy erytromycyny A, z zastosowaniem jednostopniowej metody przygotowania materiału szczepiennego.

3 Nowy fagooporny szczep Streptomyces erythreus jako mutant TZF 274 F, uzyskany z wysokowydajnego, wrażliwego na aktynofagi Streptomyces erythreus TZF - Y, charakteryzuje się następująco: - opornością na wszystkie aktynofagi działające na szczep Streptomyces erythreus, - brakiem nosicielstwa aktynofaga, - brakiem wydzielania aktynofaga do środowiska, -jednorodnością populacji pod względem oporności na aktynofagi (w 100% klonów), - stabilnością populacji w kolejnych 5 pasażach w różnych warunkach przechowywania, - zdolnością do biosyntezy erytromycyny A mcg/cm3 po 6 dniach hodowli. Badania taksonomiczne przeprowadzono zgodnie z metodą Shirlinga i Gottlieba, opublikowaną w International Journal of Systematic Bacteriology 1966, vol 16, nr 3, pp T a b e la 1 Typ sporoforów wytwarzanych przez kontrolowane szczepy Streptomyces erythreus na podstawie obserwacji w mikroskopie optycznym Podłoże nr 2 nr 3 nr 5 (CM) Nazwa szczepu Drożdżowo-słodowe Owsiane Glicerolo-asparaginowe S.erythreus TZF - Y RAx/ RA nie wytwarza grzybni powietrznej S.erythreus TZF-274 F RA RA -"- x/ RA oznacza typ sporoforów prostych z tendencją do tworzenia otwartych spirali. Kompletne RA RA T a b e la 2 Zabarwienie grzybni podstawowej u kontrolowanych szczepów Streptomyces erythreus (ich mutantów)x/ Podłoże: nr 2 nr 3 CM Symbol szczepu-jego mutanta Drożdżowo-słodowe Owsiane Kompletne S.erythreus TZF - Y YB + red. YB + red. YB + red. S.erythreus TZF F Y Y Y x/ określenie symboli w tabeli: Y - barwa żółta YB + red - barwa żółto-brunatna z odcieniem czerwonym T a b e la 3 Zabarwienie grzybni powietrznej u kontrolowanych szczepów Streptomyces erythreus (ich mutantów) według wzorców Tresnera-Backusa (Appl. Microbiol.11,335,1963) Podłoże: nr 2 nr 3 CM Nazwa szczepu Drożdżowo-słodowe Owsiane Kompletne S.erythreus TZF - Y Y Y Y S. erythreus TZF F Y Y Y x/ określenie symbolu w tabeli: Y - oznacza barwę żółtą (Yellow)

4 T a b e la 4 Porównanie mutantów szczepu Streptomyces erythreus S. erythreus TZF - Y (macierzysty) i S. erythreus TZF F (nowy mutant) Nazwa szczepu Wrażliwość na aktynofagi Przyswajanie pentoz arabinoza ksyloza Wytwarzanie erytromycyny A S.erythreus TZF - Y S. erythreus TZF F wrażliwy przyswaja przyswaja wysoka aktywność oporny nie przyswaja nie przyswaja wysoka aktywność T a b e la 5 Wrażliwość kontrolowanych szczepów Streptomyces erythreus (mutantów) na aktynofagi z kolekcji TZF-x) Nazwa faga: F-1 F-2 F-3 F-5 F-6 F-7 F-10 F-11 F-13 F-15 F-16 F-17 Nazwa szczepu: S.erythreus TZF- Y S.erythreus TZF- 274 F Objaśnienia oznaczeń: + - aktynofag powoduje lizę szczepu - - brak działania litycznego Analogiczne wyniki daje F-121 z kolekcji Rautensteina T a b e la 6 Wykorzystanie węglowodanów przez kontrolowane szczepy Streptomyces erythreus (mutanty) x/ Celuloza ± S.erythreus TZF-Y S.erythreus TZF- 274 F ± Nazwa szczepu Podłoże bez cukru Glukoza Dekstryna Skrobia Sacharoza Fruktoza Inozytol Arabinoza Ksyloza Ramnoza ± ± x/ Na podłożu nr 9 według Shirlinga i Gottlieba

5 Objaśnienia znaków w tabeli: wzrost bardzo dobry wzrost dobry + - wzrost słaby + - wzrost śladowy - brak wzrostu Sposób wytwarzania erytromycyny A na drodze biosyntezy z udziałem nowego, fagoopornego mutanta szczepu Streptomyces erythreus, jako TZF 274 F, przebiega w sposób typowy, ale oprócz zasadniczej cechy wynalazczej zastosowania nowego mutanta TZF 274 F, uzyskanego na drodze przemiennej selekcji, zawiera dodatkowe elementy nowości, takie jak wykorzystanie pomiarów lepkości hodowli w procesie oraz wykorzystanie przez mutanta nieprzyswajalności pięciowęglowych cukrów, zwłaszcza arabinozy. Ponadto nowość stanowi również zastosowanie jako materiału szczepiennego hodowli prowadzonej na ziarnach ryżu. Pomiar lepkości hodowli, którego regulacji dokonuje się przez zmiany parametrów fizyko-chemicznych w trakcie procesu i przez dobór składników odżywczych pożywki wsadowej, jak również uzupełnianie niektórych z nich podczas biosyntezy w celu maksymalnej konwersji substratów, okazał się szczególnie przydatnym i szybko dającym wyniki parametrem w procesie. Ten właśnie parametr umożliwia bezpośrednie sterowanie wysokowydajną biosyntezą erytromycyny A, co wpływa poważnie na ekonomizację metody. T a b e la 7 Typowy przebieg biosyntezy erytromycyny A Okres hodowli (godziny) Lepkość (wartość pomiaru) Biosynteza antybiotyku mcg/cm3/godz. Uwagi do do kluczowy okres biosyntezy powyżej Lepkość pożywki od 3-5 jednostek po rozpoczęciu hodowli wzrasta w okresie logarytmicznego rozwoju hodowli do kilkudziesięciu a nawet do 100 jednostek. Wraz ze wzrostem lepkości tempo wytwarzania antybiotyku wyrażone w mcg/cm3/godz wzrasta od kilku do około 30 mcg/cm3/godz. Podstawowa efektywna biosynteza od 30 do 50 mcg/cm3/ godz. występuje w fazie równowagi, w której lepkość wynosi jednostek. Przedłużenie fazy równowagi może być regulowane przez zmiany; takie jak temperatura hodowli, tempo napowietrzania i dozowanie stymulatorów biosyntezy, ale bez stymulowania rozwoju nowych generacji drobnoustroju. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, nie ograniczając jego zakresu. Przykład I. a/ Otrzymywanie prostoplastów mutanta TZF - Y (macierzystego) szczepu Streptomyces erythreus. Do 8 kolb stożkowych o pojemności 500 cm3 z zawartością pożywki po 50 cm3 w każdej z nich o składzie procentowym: dekstryna 1,5; glukoza 1,5; wyciąg namokowy kukurydzy - WNK (50% suchej masy) 2,0; K2HPO4 0,05; glicyna 0,5; dodano zawiesinę zarodników mutanta szczepu Streptomyces erythreus TZF - Y w ilości 107 j.t.k. (jednostek tworzących kolonie) na 1 cm3 pożywki. Zawiesinę przygotowano z dwutygodniowej, dobrze wykształconej hodowli, którą prowadzono w temperaturze 30 C na pożywce agarowej o składzie procentowym: wyciąg mięsny 0,1; wyciąg drożdżowy 0,1; pankreatynowy wyciąg kazeiny 0,2; dekstryna 0,2;. Zaszczepione kolby inkubowano na trzęsawce obrotowej 220 rpm przez 40 godzin, obserwując w mikroskopie świetlnym obecność rozgałęzionych pojedynczych zawiązków grzybni.

6 Po czterodziestogodzinnej hodowli mutanta szczepu TZF - Y zawartość wybranych 5 kolb odwirowano trzykrotnie po 15 minut przy obrotach wirówki 2000 na minutę i uzyskane komórki mutanta szczepu przemywano dwukrotnie pożywką o symbolu P, składającej się z surowców o składzie procentowym: sacharoza 10,3; K2SO4 0,025; MgCl26H2-0,203; mikroelementy 2 cm3 na litr; KH2PO4 0,005; CaCl2H2O 0,368; i 0,25 M buforu (TRIS) o ph 7,2-100 cm3 na litr. Po trzecim odwirowaniu zawieszono 1,5 g komórek mutanta szczepu w 10 cm3 pożywki o symbolu P, wzbogaconej dodatkiem 3 g polietylenoglikolu (PEG) 6000, następnie dodano 10 mg = j lizozymu i prowadzono inkubację przez 2 godziny w temperaturze 32 C lekko mieszając. Po kontroli efektywności protoplastyzacji w mikroskopie świetlnym, mieszaninę przesączono wstępnie przez warstwę waty, a potem przez filtr membranowy o wielkości porów 5 µm. Otrzymaną mieszaninę przesączonych protoplastów odwirowano trzykrotnie w ciągu 15 minut, przemywając następnie pożywką P oziębioną do temperatury + 4 C. Tak uzyskana zawiesina zawierała 5 x 108 w 1 cm3 protoplastów mutanta szczepu TZF - Y, co stwierdzono w komorze Thoma w mikroskopie fazowo-kontrastowym. b/ Mutagenizacja protoplastów przy użyciu N-metylo-N -nitroi-n-nitro-zoguanidyny (NTG). 1,0 cm3 zawiesiny protoplastów mutanta szczepu S. erythreus TZF - Y uzyskanej według punktu a) (zmieszano z 5 cm 0,05 M buforu TM) roztwór zawierający 0,05 TRIS i 0,05 M kwasu maleinowego (o wartości ph 8,0 i dodano odpowiednią ilość NTG tak, aby uzyskać końcową koncetrację 200 mcg) cm3 i natychmiast dokładnie wymieszano. Tak uzyskaną zawiesinę inkubowano w temperaturze 33 C w ciągu 30 minut w szafce z wyciągiem, następnie odwirowano odrzucając supernatant. Otrzymany osad protoplastów po mutagenizacji rozprowadzono w 1,0 cm3 jałowej wody i natychmiast przygotowano seryjne rozcieńczenia, c/ Regeneracja zmutowanej populacji na podłożu "R2" Seryjne rozcieńczenia protoplastów mutanta TZF - Y szczepu S.erythreus po mutagenizacji rozsiano w ilości po 0,2 cm3 na płytki o średnicy 10 cm zawierające 20 cm podłoża R2 (Okanishi M.J.Microbiol, 80, , 1974). Na płytkach tych prowadzono inkubacją rozsianego materiału w temperaturze 32 C przez 12 dni z jednoczesną inkubacją płytek kontrolnych z analogiczną zawiesiną protoplastów, nie poddaną mutagenizacji. Po inkubacji wybrano kilka płytek, na których wyrosło kolonii rewertantów (z rozcieńczenia 10-1), podczas gdy na płytkach kontrolnych wyrosło 1000 kolonii. d/ Przygotowanie matryc ze zmutowanymi, regenerowanymi klonami. Z odpowiednich, wybranych kolonii rewertantów przygotowano 10 płytek matrycowych do replikacji, przez przeniesienie zarodników tych kolonii na płytki (po 25 kolonii na płytkę) z podłożem kompletnym odżywczym (CM) o składzie procentowym: wyciąg drożdżowy 0,1; wyciąg mięsny 0,1; pankreatynowy wyciąg kazeiny 0,2; glukoza 1,0; agar 2,0. Płytki inkubowano w temperaturze 32 C przez 12 dni, a następnie używano do replikacji. e/ Replika matryc na podłoża selekcjonujące z glukozą, arabinozą, glukozą i fagiem. Przygotowane według punktu d/ płytki matrycowe z rewertantami mutanta TZF - Y szczepu S.erythreus po mutacji NTG, replikowano metodą odciskową na welwecie, kolejno - na podłoże CM zawierające 1,0% glukozy, następnie - na podłoże CM z dodatkiem arabinozy i na końcu - na podłoże CM zawierające jednocześnie glukozę i faga F-17 w ilości 106 pfu/na płytkę. Płytki po replikacji inkubowano w temperaturze 32 C w ciągu 12 dni. f/ Wybór mutantów ara=fag rx) Z płytek po replikacji z podłożem CM i zawierających glukozę izolowano te zlokalizowane kolonie, które wyrosły na płytkach zawierających glukozę i faga F-17, a nie wyrosły na płytkach zawierających arabinozę. W ten sposób uzyskano 6 klonów ara-fagr, które po przeszczepieniu na podłoże kompletne poddano kilkustopniowej selekcji, prowadząc kontrolę ich przydatności do produkcji erytromycyny A. W testach kolbowych, prowadzonych na trzęsawce, wybrano klon oznakowany 274 F, który okazał się korzystny dla produkcji erytromycyny A w skali przemysłowej. x/ ara- - nie przyswajających arabinozy fagr - oporny na faga

7 Przykład II. Jednostopniowa hodowla posiewowa z użyciem szczepu Streptomyces erythreus - mutant TZF F, inkubowanego na ziarnach ryżu. Do kolby stożkowej k 4 litry odważono 100 g ryżu, 5 g mąki sojowej i dodano 60 cm3 pożywki L-1 o składzie procentowym: wyciąg namokowy kukurydzy 0,5; dekstryna 1,0; chlorek sodu 0,3; siarczan amonu 0,3; węglan wapnia 0,3; agar "Difco" 2,5; przy wartości ph 7,2. Kolby sterylizowano dwukrotnie z przerwą 24 godzinną w temperaturze 120 C przez 20 minut. Tak przygotowaną pożywkę ryżową szczepiono (po schłodzeniu i rozbiciu ewentualnych grudek) zamrożoną zawiesiną zarodników szczepu S.erythreus - mutant TZF F w ilości 3 cm3 (1 kolbę); gęstość zawiesiny 108 j.t.k/cm3. Kolby inkubowano przez 12 dni w temperaturze 32 C z rozbiciem grudek po 24 i 48 godzinach. Dojrzała hodowla charakteryzowała się równomiernym pokryciem ziarn ryżu przez obficie zarodnikującą grzybnię o zabarwieniu beżowo-różowym. Do tak przygotowanej hodowli dodano w sposób sterylny 1000 cm3 pożywki L-2 o składzie procentowym: sacharoza 3,0; wyciąg namokowy kukurydzy 1,6; węglan wapnia 0,7; siarczan amonu 0,2; olej sojowy 0,1; wartości ph wynosiła 6,2. Kolbę z hodowlą mutanta na ryżu, którą zalano pożywką, umieszczono na trzęsawce obrotowej o 230 rpm i skoku 5 cm, w temperaturze 33 C na okres 17 godzin. Tak przygotowaną zawiesinę zarodników (1 litr o gęstości 109 j.t.k.) zaszczepiono w sposób standardowy posiewowy fermentor o pojemności 15 m3, zawierający 6 m3 pożywki składającej się z: mąki z wytłoków sojowych 200 kg, skrobi ziemniaczanej 160 kg; dekstryny 160 kg; siarczanu amonu 16 kg; węglanu wapnia 48 kg i oleju sojowego 75 kg. Przebieg hodowli mutanta TZF -274 F S.erythreus przedstawiono w tabeli 8. T a b e la 8 Hodowla posiewowa w fermentorze 15 m3 zaszczepiona zawiesiną zarodników mutanta TZF -274 F szczepu S.erythreus po inkubacji na ziarnach ryżu Godz.hodowli ph Lepkość Biomasa Jałowość Uwagi 0 6, ,0 1, ,0 2, ,85 2, ,7 3, ,75 14, ,8 23, ,95 26, użyto do szczepienia fermentora produkcyjnego Przykład III. Hodowla produkcyjna mutanta TZF F szczepu S.erythreus w fermentorze 150 m3. W fermentorze o pojemności 150 m3 przygotowano w sposób standardowy pożywkę o składzie: mąka z wytłoków sojowych 3920 kg, skrobia ziemniaczana 3640 kg, hydrolizat skrobi ziamniaczanej 3640 kg, siarczan amonu 200 kg, sól kuchenna 560 kg, węglan wapnia 900 kg, olej sojowy i smalec wieprzowy 1:1 400 kg. Po sterylizacji przez 60 minut w temperaturze 120 C wartość ph pożywki wynosiła 7,3. Po schłodzeniu do temperatury 32 C dodano do fermentora zawartość fermentora posiewowego przygotowanego jak w przykła-

8 dzie II. Proces prowadzono przez 170 godzin, dodając do hodowli propanol w 7 porcjach w całkowitej ilości 1,4 m3 oraz mieszankę tłuszczową w ilości średnio 15 kg/godzinę. Wskaźnikiem prawidłowości przebiegu hodowli produkcyjnej były wyniki pomiaru lepkości, w zależności od których regulowano zmienne parametry, takie jak temperatura procesu, przepływ powietrza i intensywność mieszania. Przebieg procesu produkcyjnego przedstawiono w tabeli 9. Tabela 9 Przebieg hodowli produkcyjnej mutanta TZF F szczepu S.erythreus w fermentorze 150 m Okres hodowli Wartość ph Lepkość (jednostki wzgl.) temp. C Zmienne parametry przepływ powietrza v/v/min. mieszanie rpm Biosynteza erytromycyny A mcg/cm3/godz ,3-6, ,7-6, , ,7-7, ,2-7, ,1-7, ,2-7, W wyniku procesu biosyntezy przedstawionego w tabeli 9, uzyskano 104 m3 hodowli o aktywności 4780 mcg/cm3, co stanowi 497,1 kg erytromycyny. Metodą chromatografii cienkowarstwowej stwierdzono, że 95% stanowiła erytromycyna A, a pozostałe 5% - to erytromycyny C i B. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł