Technologia bioprocesów. procesy up-stream

Transkrypt

1 Technologia bioprocesów procesy up-stream

2 1. Metody statyczne (okresowe, ang. batch fermentation) polegające na tym, że w czasie rozwoju mikroorganizmów nie doprowadza się świeżych substancji odżywczych i nie odprowadza się końcowych produktów metabolizmu.

3 Wśród metod statycznych wyróżnia się metody powierzchniowe realizowane w cienkiej warstwie, This image is a work of the National Institutes of Health, part of the United States Department of Health and Human Services. As a work of the U.S. federal government, the image is in the public domain.

4 metody wgłębne które mogą przebiegać w warunkach tlenowych lub beztlenowych (najczęściej w obecności gazów obojętnych CO 2, N 2 ). l

5 Fazy wzrostu drobnoustrojów w hodowlach okresowych: 1 - faza inkubacyjna (przystosowawcza, lagfaza), 2 faza zapoczątkowanego wzrostu, 3 - faza logarytmicznego wzrostu (trofofaza), 4 - faza zahamowanego wzrostu, 5 - faza stacjonarna (idiofaza), 6 - faza letalna

6 2. Metody okresowe z zasilaniem (ang. fed batch fermentation), tzn. z okresowym lub ciągłym dozowaniem sterylnej pożywki do fermentora, dzięki czemu uzyskuje się zmniejszenie hamującego wpływu produktów metabolizmu na rozwój drobnoustrojów i zwiększony przyrost biomasy.

7 3. Metody okresowe z powtórnym zasilaniem (ang. repeated-fed batch fermentation), charakteryzujące się tym, że co pewien czas odbiera się część pożywki wraz z nagromadzoną biomasą drobnoustrojów i uzupełnia świeżą porcją pożywki, utrzymując w fermentorze stałą jej objętość.

8 4. Półciągłe metody fermentacji (ang. semicontinuous fermentation) polegają na długotrwałym wykorzystaniu potencjału biosyntetycznego drobnoustrojów przez okresowe odbieranie części środowiska znajdującego się w fermentorze i wprowadzenie równoważnej ilościowo porcji świeżej pożywki

9 5. Metoda fermentacji ciągłej (ang. continuous fermentation) polegająca na stałym odbieraniu podłoża z fermentora i stałym uzupełnianiu (w równoważnej ilości, stała objętość) świeżą pożywką

10 Schemat ideowy realizacji procesów fermentacyjnych: a) bioreaktor pracujący okresowo, b) bioreaktor pracujący okresowo z okresowym zasilaniem c) bioreaktor pracujący okresowo z okresowo powtarzalnym zasilaniem d) układ do fermentacji półciągłej - wypływ podłoża po osiągnięciu odpowiedniego stężenia biomasy lub osiągnięcia odp. poziomu cieczy, e) układ do fermentacji metodą ciągłą - wypływ ciągły

11 Zalety procesów ciągłych wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek, możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach, możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoża zasilającego hodowlę,

12 stosunkowo duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli, możliwość automatyzacji procesu, większa szybkość i wydajność wielu procesów, możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury przy jednoczesnym równomiernym jej obciążaniu przez cały czas trwania procesu.

13 Wady procesów ciągłych degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych, trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas, niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów, tworzących układy wielokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, a także tendencja do obrastania przewodów i innych elementów bioreaktora,

14 niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące, niedostateczna znajomość dynamicznych właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej.

15 Parametry procesu biosyntezy i ich kontrola

16 Parametry procesu mikrobiologicznego Charakterystyka materiału mikrobiologicznego 1. Ilość biomasy stężenie suchej masy, gęstość komórek (ogółem lub żywych), wilgotna biomasa lub jej objętość. gęstość optyczna: pomiar nefelometryczny 2. Morfologia komórek 3. Wiek komórek, struktura wieku komórek w populacji 4. Potencjał metaboliczny (maksymalna aktywność metaboliczna)

17 5. Stan fizjologiczny komórek: szybkość wzrostu, szybkość przyswajania substratu, szybkość tworzenia produktu, szybkość oddychania 6. Parametry molekularne komórek: - DNA/ RNA. białko ogółem, - poziom określonych enzymów, - stosunek NAD + /NADH, - potencjał energetyczny 7. Mutacje i zakażenia

18 Charakterystyka podłoża (chemiczna i fizykochemiczna) źródło węgla i energii źródło azotu źródło fosforu inne związki mineralne i organiczne prekursory produkty ph potencjał redox po 2

19 Warunki operacyjne (fizyczne) temperatura ciśnienie, lepkość, piana, pobór mocy, objętość cieczy, szybkość mieszania, szybkość napowietrzania, szybkość dozowania roztworów,

20 Parametry sterowane Warunki procesowe Wyniki Relacje pomiędzy grupami parametrów procesu biosyntezy

21 Parametry sterowane Warunki procesowe Wyniki Relacje pomiędzy grupami parametrów procesu biosyntezy

22 Schemat podstawowych układów pomiarowo-regulacyjnych w bioreaktorze

23 Jak to wygląda w praktyce? Bioreactor line (30, 100, 1000 liters) for production of substances Industrial process automation

24

25 Problemy do rozwiązania W której fazie rozwoju hodowli biosyntezowany jest idiolit? Czy w związku z tym opłacalne jest dodawanie do podłoża hodowlanego stymulatorów wzrostu szczepu? Czy opłacalne jest stosowanie prekursora biosyntezy idiolitu? Czy warto zmodyfikować metodę hodowli np. hodowlę okresową zastąpić hodowlą z dożywianiem lub półciągłą? Czy zastosowano właściwe źródło węgla? Jaki jest optymalny czas hodowli? Jaka jest szybkość (wydajność) wzrostu szczepu na zastosowanym podłożu?

26 Specyficzna szybkość wzrostu

27

28 N 2 lnn 2 /N 1 K= t2 -t 1 N 1 t 1 t 2

29 Optymalizacja procesu biotechnologicznego Optymalizacja szczepu mutageneza (?) fuzja i odnawianie protoplastów metody i strategie inżynierii genetycznej Optymalizacja warunków procesu składu podłoża hodowlanego składniki odżywcze, promotory wzrostu, prekursory biosyntezy, substancje pomocnicze i inne warunków fizycznych procesu czas, temperatura, napowietrzanie i inne

30 Optymalizacja procesu biotechnologicznego - metody Metoda OFAT (one factor at time) Cobalamine in mycelium (ug g-1) Cobalamine in mycelium (ug g-1) Cobalamine in mycelium (ug g-1) Co 2+ in medium (ug ml -1 ) Wpływ stężenia kobaltu (II) na biosyntezę witaminy B betain in medium (mg ml -1 ) Wpływ stężenia betainy na biosyntezę witaminy B choline in medium (mg ml -1 ) Wpływ stężenia betainy na biosyntezę witaminy B12 Co się stanie, jeżeli do podłoża wprowadzimy 30mg Co(II), 4 mg betainy oraz 2 mg choliny? Czy uzyskamy lepszy efekt? Brak odpowiedzi!!!

31 Metody Powierzchni Odpowiedzi (RSM - Response Surface Methodology) uwzględniają interakcje pomiędzy czynnikami Metoda macierzy ortogonalnej, Centralny plan kompozycyjny (CCRD) Metoda sieci neuronowych, inne Dane zamieszczone w tab oraz kształt krzywych na wykresach konturowych sugerują, że zarówno na wzrost grzybni, jak i na produkcję EPS znaczący wpływ miały silne interakcje występujące pomiędzy wyciągiem słodowym i WNK. Wzrost grzybni był w znacznym stopniu uzależniony od wzajemnych interakcji pomiędzy WNK i CaCl2, natomiast dla biosyntezy IPS najbardziej znaczący był łączny efekt oddziaływania WNK i CaCl2, WNK i MgSO4 7H2O, a także CaCl2 i MgSO4 7H2O. Wykresy powierzchni odpowiedzi i odpowiadające im wykresy warstwicowe. Na każdym wykresie uwidoczniony jest łączny wpływ dwóch zmiennych niezależnych na wydajność grzybni H. erinaceum; pozostałe dwie zmienne niezależne przyjmują wartości odpowiadające ich punktom centralnym