Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi doniesienie wstępne

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca oryginalna Original Article Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi doniesienie wstępne Measurement of glycated hemoglobin HbA1c in dried blood spot preliminary report Joanna Urbaniak, Mieczysław Woźniak Zakład Chemii Klinicznej, Katedra Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu, Wrocław, Wybrzeże Pasteura 2 Streszczenie Celem pracy była ocena możliwości wykorzystania, jako materiału badanego, krwi przechowywanej w postaci suchej kropli na bibule do oznaczania hemoglobiny glikowanej HbA1c metodą immunoturbidymetryczną oraz ocena stabilności analitu w suchej kropli krwi. Krew pełną uzyskaną od 47 pacjentów nanoszono na bibułę Whatman 3, suszono i przechowywano przez 24, 72 godziny lub 7 dni. Zawartość HbA1c we krwi pełnej i suchej kropli krwi oznaczano zestawem Horiba ABX Pentra HbA1c WB przy użyciu analizatora Pentra C200. Stwierdzono wysoką korelację i wysoką zgodność zawartości HbA1c we krwi pełnej i suchej kropli krwi przechowywanej w temperaturze pokojowej przez 24 godziny (r=0.993 i obciążenie <0,05% Hb) oraz 72 godziny (r=0,992 i obciążenie <0,27% Hb). Pobieranie krwi na bibułę może być alternatywnym sposobem uzyskiwania materiału badanego do oznaczania HbA1c metodą immunoturbidymetryczną. Summary The aim of the study was the evaluation of the possibility of using dried blood spot for measurement of HbA1c by immunoturbidimetric method and the assesment of HbA1c stability in dried blood spot. Whole blood was collected from 47 patients and applied to Whatman 3 filter paper. Blood spots were dried and stored at room temperature for 24, 72 hours and 7 days. Hemoglobin A1c was measured in whole blood and dried blood using Horiba ABX Pentra HbA1c WB kit and Pentra C200 analyzer. There was a high correlation and good agreement between whole blood and dried blood spot HbA1c results after 24 hours (r=0.993 and bias <0.05% Hb) and 72 hours (r=0.992 and bias <0.27% Hb). Dried blood samples can be used for A1c measurement by immunoturbidimetric method. Słowa kluczowe: HbA1c, metoda immunoturbidymetryczna, sucha kropla krwi Key words: Dried blood spot, HbA1c, immunoturbidimetric method Wstęp Zgodnie z aktualnymi wytycznymi praktyki klinicznej oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c wykorzystuje się nie tylko do kontroli wyrównania metabolicznego w cukrzycy i oceny ryzyka powstawania przewlekłych powikłań choroby, ale także do jej wykrywania oraz oceny ryzyka rozwoju cukrzycy u osób z upośledzoną tolerancją glukozy [1]. Jeśli dostępność oznaczania HbA1c będzie odpowiednio wysoka, rola HbA1c w wykrywaniu cukrzycy będzie rosła, gdyż wskaźnik ten wykazuje znacznie mniejszą zmienność biologiczną w porównaniu do glikemii. Ponadto badanie można wykonać w materiale pobranym o dowolnej porze dnia, niezależnie od przyjętego posiłku czy aktywności fizycznej. Nie bez znaczenia jest również wyższa stabilność tego analitu in vitro w porównaniu z glukozą [2]. Jednym ze sposobów zwiększenia dostępności oznaczania HbA1c było opracowanie wielu metod typu Point-of-Care, które pozwalają oznaczyć zawartość HbA1c we krwi włośniczkowej w miejscu lub czasie o ograniczonej możliwości wykorzystania usług laboratorium. W chwili obecnej jednak zdecydowana większość z opracowanych dotąd systemów nie spełnia wymagań jakości analitycznej [3]. Dlatego w ostatnich latach powraca pomysł oznaczania HbA1c we krwi włośniczkowej pobranej na bibułę, który już w latach 90 XX wieku miał swoich zwolenników [4, 5]. Suchą kroplę krwi (dried blood spot, DBS) można bowiem przesłać w wygodny sposób do laboratorium, gdzie oznaczenie może być wykonane metodą o sprawdzonej jakości analitycznej. DBS wykorzystuje się od wielu lat w badaniach przesiewowych noworodków, więc odpowiednio wystandaryzowane zestawy do pobierania krwi są powszechnie dostępne [6]. Udowodniono, że DBS są odpowiednim materiałem do oznaczania 51

2 Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi doniesienie wstępne wielu substancji, m.in. aminokwasów, hormonów i ich metabolitów, witaminy D3 oraz wielu leków, a łatwość transportu materiału w takiej formie ułatwia centralizację badań [7]. Opublikowane dotychczas prace wskazują, że DBS może być alternatywnym materiałem badanym w przypadku oznaczania HbA1c metodą HPLC [4, 8], Tina-quant II na analizatorze Modular P firmy Roche [8, 9, 10, 11] lub Aggape Diagnostics (Indie) na analizatorze CX9 firmy Beckman [12]. Co ważne, ponad 80% pacjentów uczestniczących we wstępnych badaniach uznało, że samodzielne pobieranie DBS w domu w celu oznaczania HbA1c powinno zostać wprowadzone do praktyki klinicznej. Pozwala bowiem wykluczyć konieczność dodatkowej wizyty w ośrodku zdrowia, gdyż pacjent może odebrać wynik badania w dniu wizyty kontrolnej u lekarza, co stanowi ułatwienie dla osób o ograniczonej sprawności lub mieszkających w małych miejscowościach [10]. W piśmiennictwie brak informacji na temat zastosowania innej niż Tina-quant II metody immunoturbidymetrycznej, stosowanej w polskich laboratoriach, do oznaczania hemoglobiny glikowanej w DBS. Istnieją również rozbieżności w ocenie stabilności HbA1c w czasie przechowywania materiału. Dlatego podjęliśmy próbę oceny możliwości wykorzystania suchej kropli krwi do oznaczania HbA1c zestawem odczynników firmy Horiba ABX oraz ocenę stabilności HbA1c w DBS w temperaturze pokojowej. Materiał i metody W badaniach wykorzystano 47 losowo wybranych próbek krwi żylnej wersenianowej pochodzących od 47 pacjentów, u których oznaczano stężenie HbA1c w ramach badań kontrolnych w Centralnym Laboratorium Analitycznym Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego nr 1 we Wrocławiu. Pełną krew przechowywano przed badaniem do 6 godzin w temperaturze pokojowej. HbA1c oznaczano z wykorzystaniem zestawu odczynników Horiba ABX Pentra HbA1c WB oraz analizatora Pentra C200. Zgodnie z instrukcją producenta oznaczenie wykonywano w hemolizacie krwi przygotowanym przez zmieszanie 10 µl krwi pełnej i 500 µl odczynnika lizującego (ABX Pentra WB Hemolysis Reagent). Po wymieszaniu i 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej hemolizat umieszczano w rotorze próbkowym aparatu i przeprowadzano analizę. Równolegle nanoszono 20 µl każdej próbki krwi pełnej (po 3 krople) na paski bibuły chromatograficznej Whatman 3MM i po wysuszeniu przechowywano przez 24, 72 godziny lub 7 dni w temperaturze pokojowej w papierowych kopertach. W odpowiednim czasie suchą kroplę wycinano z bibuły przy użyciu nożyczek do papieru, cięto ją na 3 części, umieszczano w probówce Eppendorfa i dodawano 500 µl odczynnika lizującego (ABX Pentra WB Hemolysis Reagent). Po 15 minutach delikatnie mieszano próbkę i przenoszono hemolizat do naczynka próbkowego analizatora i przeprowadzano analizę. Zestaw ABX Pentra HbA1c WB zawiera odczynniki do wykonania dwu niezależnych oznaczeń: hemoglobiny całkowitej metodą kolorymetryczną i frakcji HbA1c metodą immunoturbidymetryczną. Oznaczenie hemoglobiny całkowitej opiera się na konwersji wszystkich form hemoglobiny w hematynę zasadową w zasadowym roztworze detergentu niejonowego. Natężenie barwy roztworu jest wprost proporcjonalne do stężenia hemoglobiny. W metodzie immunoturbidymetrycznej oznaczania HbA1c wykorzystuje się agregację cząstek lateksu opłaszczonych monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko HbA1c po dodaniu syntetycznego polimeru zawierającego wiele kopii immunoreaktywnej HbA1c. Tworzenie kompleksów powoduje wzrost absorbancji zawiesiny. Pod dodaniu próbki badanej aglutynacja odczynników testowych jest hamowana w stopniu zależnym od stężenia HbA1c w badanym materiale. Odsetkowa zawartość HbA1c jest obliczana jako stosunek HbA1c do hemoglobiny całkowitej. Oznaczenie HbA1c we krwi pełnej i w BDS przechowywanej przez 24 godziny wykonano we wszystkich 47 próbkach. Część próbek BDS badano dodatkowo po 72 godzinach (24) lub po 7 dniach (20). Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu statystycznego MedCalc wersja Do oceny zgodności wyników pomiarów w dwu materiałach wykorzystano analizę regresji Passinga i Babloka, współczynnik korelacji liniowej obliczono metodą Pearsona, do porównania wyników wykorzystano test t dla prób powiązanych. Przyjęto poziom istotności różnic 0,05. Wyniki Wyniki porównania zawartości HbA1c w hemolizacie krwi pełnej i w hemolizacie z suchej kropli krwi przedstawiono w tabeli I i na rycinie 1. W tabeli II zestawiono średnie różnice wyników w dwóch materiałach badanych obliczone z równania regresji dla 3 istotnych klinicznie punktów decyzyjnych: 5,7%, 6,5% i 7,0%. Zawartość HbA1c z przedziału 5,7-6,4% uważana jest za czynnik ryzyka rozwoju cukrzycy u pacjentów bez objawów choroby, wartość 6,5% upoważnia do rozpoznania cukrzycy, wartość 7,0% uważana jest Tabela I. Analiza zależności pomiędzy zawartością HbA1c we krwi pełnej (metoda odniesienia) i suchej kropli krwi przechowywanej przez 24 godziny, 72 godziny i 7 dni. Czas przechowywania Liczba próbek Równanie regresji Passinga i Babloka r Pearsona Średnie obciążenie 24 godziny 47 y = 0, ,9966 x 0, ,06 + 1,1% 72 godziny 24 y = 0, ,9934 x 0, ,28 + 4,3% 7 dni 20 y = -0, ,1061 x 0, ,48 + 7,9% 52

3 Rycina 1. Graficzne przedstawienie zależności pomiędzy zawartością HbA1c (%) oznaczoną we krwi pełnej (metoda odniesienia) i w kropli krwi suszonej przez 24 godziny (47 próbek), 72 godziny (24 próbki) i 7 dni (20 próbek). Wykresy A, C, E - prosta regresji (linia ciągła) wraz z 95% przedziałem ufności (linia przerywana). Wykresy B, D, F - analiza różnic Blanda i Altmana, zaznaczono średnią (mean) różnicę wyników dwóch metod (linia ciągła) wraz z 95% przedziałem ufności (linie przerywane). za optymalny poziom HbA1c w kontroli metabolicznej cukrzycy [1]. Przyjęto całkowity błąd dopuszczalny oznaczania HbA1c 7%. Wartość ta, proponowana przez College of American Pathologists (CAP) w sprawdzianach biegłości w roku 2011, odpowiada różnicy około 0,5% Hb, którą wielu lekarzy uważa za istotną klinicznie ( dostęp ). Zawartość hemoglobiny glikowanej oznaczona w hemolizacie z suchej kropli krwi po 24 godzinach nie różniła się istotnie (p=0,1180) od zawartości w hemolizacie świeżej krwi pełnej. Średnia różnica wyników oznaczeń w dwóch materiałach była niższa od całkowitego błędu dopuszczalnego w całym zakresie wartości oznaczanych. Przechowywanie suchej kropli krwi w temperaturze pokojowej przez 72 godziny lub dłużej powodowało istotne zwiększenie poziomu HbA1c 53

4 Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi doniesienie wstępne (p<0,0001), a zależność ta występowała w całym zakresie oznaczanych wartości. Różnice obserwowane po 72 godzinach można uznać za nieistotne klinicznie, natomiast różnice wyników uzyskiwane po 7 dniach przechowywania BDS są wyższe od przyjętego błędu dopuszczalnego (tabela II). Tabela II. Różnica zawartości HbA1c we krwi pełnej i suchej kropli krwi w punktach istotnych decyzyjnie w odniesieniu do całkowitego błędu dopuszczalnego. Czas 5,7% 6,5% 7,0% 24 godziny 0,05 0,05 0,04 72 godziny 0,27 0,27 0,26 7 dni 0,44 0,52 0,57 TE A (7%) 0,40 0,46 0,49 Dyskusja Materiałem do oznaczania hemoglobiny glikowanej jest krew pełna żylna pobierana na EDTA lub heparynę (materiał trwały do 7 dni w temperaturze +4 o C) lub krew włośniczkowa pobierana do specjalnych heparynizowanych kapilar i probówek, zawierających odczynnik hemolizujący/stabilizujący (materiał trwały do 14 dni) [2]. Na podstawie opublikowanych dotychczas badań wydaje się, że materiałem alternatywnym może być kropla krwi wysuszona na bibule (DBS), którą pacjent może samodzielnie pobrać w domu i przesłać do badania np. listownie [4, 5, 8, 9, 10, 11, 12]. W przedstawionej pracy ocenialiśmy możliwość wykonywania oznaczeń HbA1c w DBS z wykorzystaniem zestawu odczynnikowego ABX Pentra HbA1c WB i analizatora Pentra C200, a także stabilność analitu w DBS przechowywanej w warunkach zbliżonych do transportu przesyłką pocztową. W dostępnych pracach do pobierania krwi włośniczkowej wykorzystywano bibułę Whatman 1 [9], Whatman 3 [12], Whatman 903 [10], Ahlstrom 226 [11] lub zestaw HbA1c via Post [4]. W niektórych pracach nie podano zastosowanego nośnika [8], więc uznaliśmy, że rodzaj bibuły ma znaczenie drugorzędne i wykorzystaliśmy bibułę Whatman 3, ciętą z rolki na paski (rycina 2). W praktyce klinicznej zdecydowanie lepsze byłyby standaryzowane zestawy wykorzystywane w badaniach przesiewowych noworodków (Whatman 903), w których zaznaczony jest obszar, na który należy nanieść krew. Ważna jest natomiast wielkość kropli krwi, czas elucji i stosunek krwi do objętości odczynnika lizującego. Przedłużanie Rycina 2. Sucha kropla krwi na bibule Whatman 3. Średnica kropli około 10 mm. Kropla nr 58 wycięta do analizy. elucji powoduje zaniżanie HbA1c z powodu jej degradacji [10]. Do elucji w metodach immunoturbidymetrycznych używa się obecnie tego samego odczynnika, który służy do hemolizy krwi pełnej. W metodzie HPLC konieczne może być dodanie do hemolizatu cysteiny, aby zapobiec tworzeniu HbA3, która interferuje w oznaczeniu glikohemogobiny tą metodą [4]. W dotychczasowych badaniach wykorzystywano fragmenty bibuły o średnicy 3-12 mm, objętość odczynnika lizującego µl, a elucję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 minut [12], 1 godzinę [10] lub 3 godziny [11] lub w temperaturze 4 o C przez 24 godziny [4]. W naszych badaniach zwiększyliśmy objętość krwi (lizie poddawana była cała sucha kropla 20 µl) i skróciliśmy czas elucji do 15 minut, dzięki czemu przygotowanie hemolizatu odbywało się porównywalnie do krwi pełnej. Gdy zawartość HbA1c była wyższa od liniowości metody eluat rozcieńczano odczynnikiem do lizy i oznaczenie powtarzano. Z przeprowadzonych przez nas doświadczeń wstępnych wynika, że oznaczenie można wykonać z kropli krwi o mniejszej objętości zmniejszając proporcjonalnie objętość buforu do lizy lub przedłużając czas elucji. Największą uwagę przywiązuje się do stabilności HbA1c w DBS, która ma decydujące znaczenie dla przydatności tego materiału w codziennej praktyce. Wszyscy autorzy wskazują na wzrost HbA1c w czasie przechowywania DBS, co również obserwowaliśmy w naszych badaniach. Na maksymalny dopuszczalny czas przechowywania/transportu mają wpływ m.in. temperatura, dostęp powietrza i światła słonecznego. Zalecany czas przechowywania wynosi według różnych autorów: w temperaturze pokojowej 5-7dni [4], do 9 dni [11], do 10 dni [9]; w temperaturze +4 o C co najmniej 9 dni [11], 10 dni [4] lub 15 dni [12], w temperaturze -70 o C kilkanaście miesięcy [4]. Czas przechowywania można przedłużyć umieszczając DBS w torebkach foliowych z pochłaniaczem wilgoci ograniczających dopływ powietrza Tabela III. Przegląd wyników badań zależności pomiędzy zawartością HbA1c oznaczoną we krwi pełnej i suchej kropli krwi metodami immunoturbidymetrycznymi. Metoda Liczba próbek Równanie regresji Współczynnik korelacji Średnie obciążenie Lit. Tina-quant II Roche 115 y = 0,81 + 0,85 x 0,985 8 Tina-quant II Roche 58 y = 1,4 + 0,95 x 0,889 9 Tina-quant II Roche 93 y = -0, ,006 x 0,980-0, Tina-quant II Roche 73 y = 0, ,984 x 0, , Agappe Diagnostics 30 y = 0, ,9886 x 0,986-0,

5 (do 1 miesiąca) i dodatkowo w niższej temperaturze (do 3 miesięcy) [8]. Nasze badania przeprowadzaliśmy w okresie letnim, temperatura w ciągu dnia przekraczała w niektóre dni 30 o C, w nocy nie spadała poniżej 20 o C. Próbki były przechowywane w papierowej kopercie i nie były zabezpieczane w żaden dodatkowy sposób. W takich warunkach HbA1c była stabilna co najmniej 3 doby. Obserwowany przez nas krótszy czas stabilności HbA1c w DBS wynika jednak nie tyle z niedostatecznego zabezpieczenia próbki, co z przyjęcia, za CAP, ostrzejszego niż inni autorzy kryterium jakości. Gdybyśmy bowiem przyjęli, akceptowane powszechnie, kryteria NGSP (różnica bezwzględna 0,75% Hb, przy 6,5% Hb błąd całkowity bliski 12%) moglibyśmy uznać, że BDS można przechowywać nawet 7 dni. W naszym odczuciu kryteria formułowane przez CAP (błąd całkowity 7%, różnica bezwględna przy 6,5% Hb 0,45% Hb) lepiej spełniają oczekiwania klinicystów. Ocena korelacji i zgodności wyników HbA1c uzyskanych we krwi pełnej i suchej kropli krwi zestawem ABX Pentra HbA1c WB w pełni potwierdza obserwacje autorów, którzy oznaczali HbA1c metodą Tina-quant II lub metodą HPLC (tabela III). Uzyskane przez nas wyniki wskazują, że w przypadku oznaczania HbA1c metodą immunoturbidymetryczną sucha kropla krwi przechowywana do 3 dni w temperaturze pokojowej może być materiałem alternatywnym do krwi pełnej w sytuacjach ograniczonego dostępu do usług laboratorium lub trudności w pobraniu krwi żylnej. 9. Anjali, Geethanjali FS, Kumar RS, et al. Accuracy of filter paper method for measuring glycated hemoglobin. J Assoc Physicians India 2007; 55: Fokkema MR, Bakker AJ, de Boer F, et al. HbA1c measurements from dried blood spots: validation and patient satisfaction. Clin Chem Lab Med 2009; 47: Jones TG, Warber KD, Roberts BD. Analysis of hemoglobin A1c from dried blood spot samples with the Tina-quant II immunoturbidimetric method. J Diabetes Sci Technol 2010; 4: Lakshmy R, Gupta R. Measurement of glycated hemoglobin A1c from dried blood by turbidimetric immunoassay. J Diabetes Sci Technol 2009; 3: Zaakceptowano do publikacji Adres do korespondencji: dr n. farm. Joanna Urbaniak Zakład Chemii Klinicznej Katedra Analityki Medycznej Akademia Medyczna we Wrocławiu Wrocław, Wybrzeże Pasteura 2 Tel. (71) , faks (71) joanna.urbaniak@am.wroc.pl Podziękowania Autorzy pracy składają podziękowania firmie Horiba ABX Sp. z o.o. za nieodpłatne udostępnienie analizatora Pentra C200 oraz odczynników i materiałów niezbędnych do przeprowadzenia badań. Piśmiennictwo 1. Executive Summary: Standards of medical care in diabetes Current criteria for the diagnosis of diabetes. Diabetes Care 2011; 34 Suppl 1: S4-S Bryśkiewicz ME, Majkowska L. Czy hemoglobina glikowana (HbA1c) stanie się standardem w diagnostyce cukrzycy? Pol Merk Lek 2011; XXX: Lenters-Westra E, Slingerland RJ. Six of eight hemoglobin A1c point-of-care instruments do not meet the general accepted analytical performance criteria. Clin Chem 2010; 56: Jeppsson JO, Jerntorp P, Almër LO, et al. Capillary blood on filter paper for determination of HbA1c by ion exchange chromatography. Diabetes Care 1996;19: Voss EM, Cembrowski GS, Clasen BL, et al. Evaluation of capillary collection system for HbA1c specimens. Diabetes Care 1992; 15: UK Newborn Screening Programme Center. Revised guideline for newborn blood spot sampling. September (dostęp 26 września 2011). 7. Li W, Tse FLS. Dried blood spot sampling in combination with LC-MS/MS for quantitative analysis of small molecules. Biomed Chromatogr 2010; 24: Buxton OM, Malarick K, Wang W, et al. Changes in dried blood spot Hb A1c with varied postcollection conditions. Clin Chem 2009; 55: