(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) T3 (51) Int. Cl. A23L1/328 A23B4/027 ( ) ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2009/27 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób przygotowywania owulowanych jaj zwierząt wodnych jako spożywczego produktu jakościowego oraz owulowane jaja przygotowane przy użyciu tego sposobu (30) Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/35 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2010 (73) Uprawniony z patentu: Stiftung Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung, Bremerhaven, DE (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 KÖHLER-GÜNTHER Angela, Bremerhaven, DE (74) Pełnomocnik: Włodarczyk + Włodarczyk rzecznicy patentowi sp.p. rzecz. pat. Bełz Anna Lublin ul. Spokojna 17/11 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 - 1 - Opis [0001] Wynalazek dotyczy sposobu przygotowania owulowanych jaj zwierząt wodnych jako delikatesowego produktu spożywczego, zbioru owulowanych jaj bez wywierania negatywnego wpływu na zwierzęta wodne oraz konserwacji owulowanych jaj zwierząt wodnych przygotowanych w podany sposób, jako delikatesowy produkt spożywczy. [0002] Przetworzone, nie zapłodnione jaja różnych zwierząt wodnych w bogatych społeczeństwach od dawna stanowią uznany, coraz częściej spożywany produkt delikatesowy. Ikrą nazywane są nie wytarte w naturalny sposób i niedojrzałe jaja ryb (w różnych stadiach). Ikra teoretycznie może pochodzić od jakiejkolwiek samicy ryby (lub samicy innego zwierzęcia wodnego), której jaja nie są trujące. Należy do nich również takifugu, ryba silnie trująca, nawet przygotowana w odpowiedni sposób. Z ikry jesiotra przygotowywany jest tzw. kawior czarny albo kawior rosyjski. Rozróżniany jest kawior ossetra, bieługa i siewruga. Ponadto, oprócz jesiotrów żyjących w naturze, do pozyskiwania kawioru służą jesiotry hodowlane. Na przykład ikra taszy (zająca morskiego), ryb dorszowatych i śledziowatych, stosowana jest do produkcji namiastki kawioru ( kawior niemiecki/norweski ). Kawior islandzki produkowany jest z ikry gromadnika. Z ikry pstrąga powstaje kawior złocisty, z łososia kawior czerwony. Ikrę pozyskuje się również z jeżaka brzegowego. Do interesującej nas grupy zwierząt wodnych należy zaliczyć również płazy, na przykład ropuchy i kumaki, rozmnażające się poprzez składanie jaj. Ikra jest najczęściej solona, czasem również wędzona. Wędzoną ikrę produkuje się, wędząc na gorąco ikrę w nienaruszonej powłoce. Wędzona ikra pochodzi najczęściej z ryb dorszowatych, w tym dorsza atlantyckiego, oraz łososia morskiego. Ikra homarów, dużych raków rzecznych i innych skorupiaków oraz pomarańczowa ikra przegrzebka oznaczane są jako corail.

3 - 2 - [0003] Oprócz wysokiej wartości odżywczej kawior ma wiele innych cennych właściwości. Jest bogaty w białka (25 do 30 %) z wysokim udziałem aminokwasów egzogennych. Zawiera 16 % tłuszczu, nie jest więc pokarmem niskotłuszczowym. Kawior zawiera witaminy D, E, B12 oraz niacynę i minerały jod i sód. Ponadto ma wysoką zawartość dobrego cholesterolu. [0004] Dostępny obecnie na rynku kawior jest to kawior przetworzony (czyszczenie, solenie), pobierany z jajników samic ryb w stanie niedojrzałym, kiedy jaja wykazują wystarczającą trwałość i nadają się do dalszego przetwarzania. Aby uzyskać kawior najlepszej jakości, jaja zbierane są przed osiągnięciem maksymalnej dojrzałości (stadium owulacji). [0005] Zasadniczym problemem przy produkcji kawioru jest pozyskanie jaj. Problem zabijania samic ryb w celu pozyskania kawioru (np. jesiotrów) istnieje zarówno przy odłowie, jak i w akwakulturach (ogółem na świecie ok ton rocznie). Przy pozyskiwaniu kawioru i ikry różnych gatunków ryb od wielu wieków przyjęte jest zabijanie zwierząt przed pobraniem jaj. Głównym powodem zabijania samic, na przykład jesiotrów, jest to, że jaja w stanie niedojrzałym zbierane są przed osiągnięciem naturalnego stadium owulacji, ponieważ jaja maksymalnie dojrzałe do owulacji w ciele matki, a więc zdolne do zapłodnienia, są zbyt miękkie i w trakcie konserwacji solą (chlorkiem sodu) oraz w połączeniu z boraksem pękają i lepią się, tworząc kaszę, nienadającą się do konsumpcji. W trakcie owulacji, a więc wydostania się komórek jajowych z pęcherzyków Graafa, jaja zmieniają się w naturalny sposób (mięknie ścianka komórki, aby umożliwić zapłodnienie przez plemniki), co obniża możliwość wykorzystania ich jako kawioru. Dochodzą do tego również efekty osmotyczne, oddziałujące później, w trakcie solenia jaj. Znane ze stanu techniki eksperymenty, przeprowadzane z lekko zasolonym kawiorem jesiotra małego, wyprodukowanego na potrzeby eksperymentu z jaj owulowanych (dojrzałych) i nie owulowanych (niedojrzałych), pokazują, że dojrzałe jaja

4 - 3 - pękają już przy lekkim dotknięciu i rozlewają się, tworząc mazistą substancję. Nie stwierdzono wszakże wyraźnych różnic smakowych. [0006] Praktyka zabijania zwierząt, wraz z nadmiernym odłowem, doprowadziła do zagrożenia wyginięciem około trzydziestu różnych gatunków jesiotra, żyjących w naturalnym środowisku. W Rosji opracowano nową metodę pozyskania niedojrzałej ikry bez zabijania ryb. Po znieczuleniu przeprowadzana jest operacja na jajnikach, przypominająca cesarskie cięcie, niedojrzałe jaja są wyciskane a rany zaszywane. Po zagojeniu ran ryba może powrócić do swojego naturalnego środowiska lub pozostać w zbiornikach hodowlanych i zostać po raz kolejny wykorzystana do pobrania kawioru. Niemniej śmiertelność przy tej, kosztownej i stresującej dla ryb, metodzie oscyluje w granicach 40 %. Ponadto niemieckie przepisy dotyczące ochrony zwierząt zakazują jej stosowania. [0007] Zainicjowano w skali globalnej kosztowne programy ponownego zasiedlania jesiotra. Ryby te w naturalnym środowisku osiągają dojrzałość płciową dopiero w wieku 8-12 lat, w akwakulturach zaś w wieku od 2 do 4 lat, w zależności od gatunku. Różne gatunki jesiotrów z akwakultur są, z różnym powodzeniem, wypuszczane do wolnej przyrody w ramach programów regeneracyjnych, służących ochronie populacji, zagrożonej wyginięciem. Podczas gdy w celach hodowlanych samice pozostają żywe, a jaja pozyskiwane są poprzez sztuczne tarło, przy produkcji kawioru w akwakulturach powstaje również problem zabijania samic z wyżej w wymienionych powodów. [0008] Wysokie straty przemysłowe należy wziąć pod uwagę przy hodowli narybku i małych rybek w akwakulturach oraz przy procesach technologicznych zarybiania, ponieważ starsze samice mają znacząco lepsze zdolności reprodukcyjne. [0009] Przetworzenie kawioru po pobraniu służy podniesieniu jego jakości. Lekkie posolenie przedłuża okres przydatności do spożycia. Wysokiej jakości kawior jest solony na tyle,

5 - 4 - aby zapewnić ograniczony okres przydatności do spożycia. Kawior oznaczany jako małosolny może zawierać maksymalnie 2,8 % do 4,0 % soli. Kawior małosolny praktycznie zachowuje naturalny smak kawioru. Obok kawioru małosolnego istnieje kawior solony, o dłuższym okresie przydatności do spożycia, zmieszany z ok. 10 % do 12 % soli kuchennej. Świeży kawior jest bardzo wrażliwy na temperaturę, z tego względu jego magazynowanie i podawanie jest bardzo utrudnione. Tradycyjnym sposobem pakowania jest szczelna, powleczona od wewnątrz, konserwa przeznaczona dla solonego, ale nieogrzanego kawioru. Kawior pasteryzowany osiąga dłuższy okres przydatności do spożycia dzięki krótkiemu podgrzaniu do temperatury 60 C. Dostarczany jest w słoikach z nakrętką i zabezpieczeniem, gwarantującym roczny okres przydatności do spożycia przed otwarciem. [0010] Problemem przy magazynowaniu świeżego kawioru jest mnożenie się bakterii, powodujące szybkie psucie się produktu. Natomiast przy pasteryzacji, z uwagi na wysoką temperaturę, kawior traci ziarnistość i smak. Kolejnym problemem przy magazynowaniu kawioru oraz innych produktów z ikry jest krystalizacja molekuł tyrozyny, występujących w jajach jako aminokwasy endogenne. Z uwagi na krystalizację produkt nie nadaje się do sprzedaży. Kolejny problem związany jest z szybkością przetwarzania pozyskanej ikry. Pomiędzy zbiorem ikry od samic a zapakowaniem do puszek nie może upłynąć więcej niż 10 minut, aby jaja nie zepsuły się. [0011] Każdy etap w procesie przetwórstwa (konserwacja, pasteryzacja itd.) po zbiorze jaj stwarza ryzyko, że jaja popękają, co spowoduje nieodwracalną stratę jakości i niemożność wykorzystania produktu. Stan techniki [0012] Z JP A znany jest sposób produkcji pakowanej ikry śledzia, w trakcie którego ikra, pozyskana w stanie niedojrzałym od uprzednio uśmierconej samicy śledzia, po zakonserwowaniu solą i procesach antybakteryjnych

6 - 5 - wzmacniana jest roztworem nadtlenku wodoru i soli. Dzięki natychmiastowemu usunięciu krwi z pozyskanej ikry można zredukować stosowanie nadtlenku wodoru, co prowadzi do poprawy jakości ikry śledzia. Po zastosowaniu nadtlenku wodoru i soli należy przeprowadzić katalazę w celu usunięcia rodników nadtlenku wodoru. Natychmiastowe usunięcie jeszcze nie zakrzepłej krwi należy jednak przeprowadzić bezpośrednio po uśmierceniu ryby albo tuż przed końcem rozmrażania ryby, zamrożonej natychmiast po uśmierceniu. Z uwagi na wysoki koszt usunięcia krwi zaraz po uśmierceniu ryby, ryby są na ogół zamrażane, co z kolei prowadzi do straty jakości. [0013] Znaną i wypróbowaną techniką przy pozyskiwaniu narybku w akwakulturach jest zastosowanie kwasu taninowego. Zapłodnione jaja poddawane są działaniu roztworu kwasu taninowego celem usunięcia lepkiej warstwy żelu. Dzięki temu przy rozmnażaniu jaja mogą być lepiej dezynfekowane i zmniejszeniu ulega ilość grzybów i bakterii w trakcie inkubacji jaj. Procedura jest standardem w przypadku różnych rodzajów ryb, np. okonia morskiego oraz jesiotrów (patrz publikacja I Mizuny et al.: Elimination of adhesiveness in the eggs of shishamo smelt Spirinchus lanceolatus using kaolin treatment to achieve high hatching rate in environment with a high iron concentration, Aquaculture 242, 2004 pp ). Kwas taninowy, polifenol, to forma taniny o komercyjnym zastosowaniu. Jego struktura oparta jest na estrach glukozy kwasu galusowego. Kwas galusowy stosowany jest jako środek do barwienia drewna, w przyrodzie występuje w dębie, orzechach włoskich, mahoniu i sekwojach jako ochrona przed pożarem. Z publikacji I (patrz rys. 5) można wywnioskować, że zastosowanie kwasu taninowego może podnieść ciśnienie jaj, prowadzące nawet do ich pękania. Wiadomo wszakże, że zastosowanie kwasu taninowego powoduje twardnienie błony jaj, uniemożliwiając ich spożycie.

7 - 6 - [0014] Z RU C1 znany jest sposób barwienia, gdzie owulowana ikra barwiona jest słabym barwnikiem naturalnym, przede wszystkim u mniej wartościowych, w porównaniu z jesiotrem, gatunków ryb, w dwóch stopniach z odstępem minimalnie 0,5 h oraz zasolona. W pierwszym etapie do ikry dodawane są bezpośrednio dwie trzecie barwnika, a w drugim etapie jego pozostała część wraz z emulsją z zawartością tłuszczów i protein w ilości od 5 % do 10 % w zależności od ilości ikry. Zasolenie przeprowadzane jest przed drugim stopniem barwienia. Przy tej metodzie nie można wykluczyć, że owulowana ikra, po dodaniu barwnika w pierwszym etapie, nie pęknie przy zasoleniu. Dodanie emulsji tłuszczów i protein następuje po zasoleniu i służy bardziej stabilnemu zabarwieniu oraz poprawie właściwości organoleptycznych i ochronie ikry przed promieniowaniem. [0015] Z RU C2, stanowiącego, technicznie najbliższy, punkt wyjścia dla niniejszego wynalazku, pochodzi metoda produkcji ziarnistego kawioru z owulowanej ikry jesiotra. Pozyskane owulowane jaja poddawane są działaniu gorącego roztworu wodnego substancji konserwującej o stężeniu 1,5 % do 2,0 % w celu przygotowania do procesu pasteryzacji w temperaturze 65 oc do 70 oc. Pomijając fakt, że każde ogrzanie wyraźnie wpływa na smak ikry, przy wykorzystaniu owulowanych jaj, które, jak wiadomo, mają bardzo miękką ścianę komórkową, nie ma również pewności, że wytrzymają działanie środka konserwującego nie ulegając popękaniu. Nawet niewielki udział pękniętych jaj w istotny sposób pogarsza jakość kawioru, ze względu na trudności w ich usunięciu. Główną zaletą wykorzystania jaj owulowanych jest fakt, że w celu ich pobrania zwierzęta nie muszą zostać uśmiercone ani poddane stresującej operacji. [0016] Na podstawie wiedzy i technologii przetwarzania, zgodnej ze stanem techniki, obecnie punktem wyjścia jest to, że nie jest możliwe wyprodukowanie w pełni wartościowego kawioru z dojrzałych (owulowanych) jaj jesiotra, ponieważ w naturalny sposób dojrzałe jaja,

8 - 7 - wskutek przygotowania do zapłodnienia, są zbyt miękkie i w kontakcie z solą lub innymi środkami konserwującymi natychmiast pękają. Podane metody pozyskiwania kawioru z owulowanej ikry nie dają satysfakcjonujących wyników. Określenie celu [0017] Celem wynalazku jest sposób przygotowania pozyskanych z żywego zwierzęcia wodnego owulowanych jaj tak, aby bez straty jakości, nie ulegając pękaniu, mogły być przetworzone w wysokiej jakości produkt delikatesowy, konkurencyjny w sprzedaży w porównaniu z innymi podobnymi produktami. Dla osiągnięcia tego celu musi być uzyskana przede wszystkim niska wrażliwość jaj przy przetwarzaniu oraz znacząco przedłużony okres przydatności do spożycia, bez stosowania silnych metod konserwacji. Ponadto sposób ten ma być prosty i przystępny cenowo, a jego zastosowanie ma być możliwe do wykazania na gotowym produkcie. [0018] Rozwiązanie wynalazku, przedstawione w zastrzeżeniach dotyczących sposobu, składa się z następujących etapów:. Pozyskanie owulowanych jaj bez uszkodzenia zwierzęcia wodnego,. egzogenne przetwarzanie świeżych owulowanych jaj w roztworze wodnym z dodaniem co najmniej jednej molekuły transdukcyjno-sygnalnej (H 2 O 2 i (albo) CaCl 2 ), występującej naturalnie w komórce jaja w celu stabilizacji fizjologicznej ściany jaja dzięki aktywacji Ovoperoxidase, a następnie. konserwację. [0019] Kolejne korzystne warianty sposobu zostaną opisane w poszczególnych zastrzeżeniach oraz wyjaśnione w odniesieniu do wynalazku. W zastrzeżeniach produktu wykazano ponadto, że owulowane jaja, przygotowane według sposobu zgodnie z

9 - 8 - wynalazkiem, posiadają utwardzony płaszcz zewnętrzny z siatką nici proteinowych i nieodwracalnie wbudowanych molekuł tyrozyny. Wyżej wymieniona struktura molekuł nie występuje w naturze u nie zapłodnionych jaj. Niniejszy, sztucznie wytworzony produkt, nie jest znany w dotychczasowym stanie techniki. [0020] W sposobie według wynalazku, owulowane jaja, a więc jaja w pełni dojrzałe do zapłodnienia, pozyskiwane są od spokojnych zwierząt wodnych, przede wszystkim jesiotrów, w wyniku naturalnego wydalenia owulowanych jaj z otworów w ciele lub poprzez sztuczne tarło. Zwierzęta są dzięki temu tylko w minimalnym stopniu narażone na stres. Świeżo pozyskane owulowane jaja są przed konserwacją poddane działaniu molekuły transdukcyjno-sygnalnej, naturalnie występującej w komórce jajowej. Aktywowany jest w ten sposób enzym Ovoperoxidase, który tworzy i utwardza zewnętrzną powłokę, a co za tym idzie fizjologicznie stabilizuje ścianę komórki jajowej. Właściwym określeniem dla sposobu utwardzania według wynalazku może być więc oznaczenie OVOHARD. Opisana procedura, dotycząca owulowanych jaj z minimalnie jedną molekułą, występującą naturalnie w komórce jajowej, w normalnych warunkach powstającą w niewielkim stężeniu w procesach metabolicznych komórki, została uznana za całkowicie nieszkodliwą, zgodną z praktyką w przemyśle spożywczym, metodę utwardzenia jaj. Jednocześnie, w sposobie według wynalazku, poprzez zastosowanie naturalnej substancji, osiągnięte zostaje utwardzenie pozyskanych jaj, dzięki któremu owulowane jaja są o wiele mniej wrażliwe na kolejne zabiegi, zwłaszcza związane z konserwacją i puszkowaniem, ale również magazynowaniem i przepakowywaniem. Kolejną zaletą dodatkowego naturalnego utwardzenia jest wydłużenie okresu przydatności do spożycia, czyli też okresu sprzedaży jaj, dzięki zatrzymaniu procesu tworzenia się kryształów tyrozyny w trakcie magazynowania. Aktywacja owo-peroksydazy spowoduje powstanie sieci nitek proteinowych oraz

10 - 9 - nieodwracalne usunięcie tyrozyny z nieprzenikliwej błony, co uniemożliwi powstawanie kryształów. Proces ponadto wywołuje skutki antybakteryjne,także przedłużające okres przydatności produktu do spożycia. [0021] Sposób według wynalazku polega na zewnętrznym poddaniu świeżo pozyskanych owulowanych jaj działaniu minimalnie jednej molekuły, naturalnie występującej w komórce jajowej, odgrywającej kluczową rolę w transdukcyjnej kaskadzie sygnałowej, powodującej utwardzenie ściany komórkowej przy naturalnym zapłodnieniu. Chodzi tu przede wszystkim o jony wapnia (Ca++), które faliście przepływają przez jajo po impulsie egzogennym i prowadzą do aktywacji enzymów. Oprócz tego istnieje jeszcze co najmniej jedna kluczowa molekuła. Chodzi o molekułę nadtlenku wodoru H 2 O 2, utworzoną z oksydazy, zależnej od NADPH. Nadtlenek wodoru w niskich, mikromolarnych stężeniach, inicjuje naturalne, uwarunkowane endogennie tworzenie trwałej ścianki wokół jaja. Jony wapnia (Ca++) znajdują się w nie zapłodnionej komórce jajowej w tzw. zbiornikach wapnia, mitochondriach oraz retikulum endoplazmatycznym, mogą jednak dostać się do komórki również dzięki przepływowi jaj z zewnątrz, przez określone receptory. Dzięki fali wapnia zostaną uwolnione enzymy ze zbiorników wewnątrzkomórkowych, w których przechowywane są w formie nieaktywnej. Enzymy te (np. dehydrogenaza glukozo- 6-fosforanowa) produkują z kolei NADPH. NADPH oznacza fosforyzowaną formę NADH, powstałą w wyniku dodania anionu H- (hydridion) z NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy). Oksydaza NADPH produkuje nadtlenek wodoru, który jest z kolei substratem Ovoperoxidase, odpowiedzialnej za utwardzenie ściany komórkowej jaj. [0022] W naturze, nie zapłodnione owulowane jajo znajduje się w stanie spoczynku, dopóki nie jest przy naturalnym zapłodnieniu bombardowane plemnikami. Wszystkie plemniki, oprócz tych, które połączą się z komórką jajową, muszą pozostać na zewnątrz. Przy naturalnym zapłodnieniu, kilka

11 sekund po przeniknięciu plemnika błona komórki jajowej utwardza się, aby zapobiec zapłodnieniu przez kilka plemników, śmiertelnemu dla embriona (polispermia, wyjątkiem są nieliczne przypadki, prowadzące do porodu bliźniąt jednojajowych). Powstały embrion radzi sobie z tym, tworząc w ciągu kilku sekund zewnątrzkomórkową osłonę zewnętrzną, przez którą nie mogą przeniknąć inne plemniki. Chroni ona również embrion przed uszkodzeniami mechanicznymi i trującymi substancjami. Kluczowym dla tego procesu enzymem jest owo-peroksydaza, oczekująca w postaci granulek (cortical granules) przed błoną komórki jajowej. W momencie zapłodnienia zachodzi opisana powyżej reakcja. Wytworzenie Ovoperoxidase (peroksydaza) spowoduje powstanie sieci nitek proteinowych oraz nieodwracalne wprowadzenie kinazy tyrozynowej, stymulującej ten proces, do nieprzenikliwej błony zewnątrzkomórkowej, chroniącej embrion. Mechanizm ten dotyczy całego świata bezkręgowców (np. jeżaków brzegowych) oraz kręgowców (np. ryb, myszy i ludzi), pełniąc funkcję ochrony embrionów (por. np. publikację II autorstwa La Fleura etal.: Searching ovoperoxidase; oocyte specific member of a heme dependent peroxidase superfamily that function to stop polyspermy, Mechanisms of Developments 70 (1998), pp oraz publikację III autorstwa Wessela et al.: The Biology of Cortical Granules Int. Rev. Cytol. 209 (2001, pp ). [0023] W publikacji IV: Conformational Control of Ovoperoxidase Catalysis in ihe Sea Urchin fertilization Membrane autorstwa T L. Deitse et al. (Journal of Bilogical Chemistry, Vol. 261, No. 26, Issue of September 15, pp , 1966) oraz publikacji V: Release of ovoperoxidase from sea urchin eggs hardens the fertilization membrane with tyrosine crosslinks autorstwa Ch. A. Foerdera et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 74, No. 11, oo , October 1977, Biochemistry) po raz pierwszy metodą chromatograficzną stwierdzono, że i w jaki sposób dochodzi do utworzenia sieci tyrozyny oraz

12 utwardzenia błony. Następnie stwierdzono, że tyrozyna (reszty tyrozynowe) odgrywają ważną rolę w procesie utwardzania. Za pomocą odpowiednich inhibitorów peroksydaz stwierdzono, że peroksydaza (Ovoperoxidase) odgrywa ważną rolę biologiczną w procesie tworzenia siatki tyrozyny, a co za tym idzie w procesie utwardzania błony. [0024] Na podstawie opisanego powyżej zjawiska komórkowego, w sposobie według wynalazku, została opracowana egzogenna aplikacja co najmniej jednej molekuły transdukcyjnosygnalnej, w naturalny sposób występującej w komórce jajowej, celem utwardzenia błony komórkowej bez udziału plemników. Przy czym molekuła transdukcyjno-sygnalna jest rodnikiem tlenowym nadtlenku wodoru H 2 O 2, albo roztworem chlorku wapnia CaCl 2, dostarczającym jony wapnia. Jednoczesne zastosowanie obu molekuł transdukcyjnosygnalnych jest możliwe, ponieważ jest najbardziej zbliżone do naturalnego utwardzenia błony i pozwala osiągnąć założone wyniki, zwłaszcza jeżeli chodzi o stopień twardości jaj z uwagi na strategię sprzedaży. Egzogenna aplikacja i przeniknięcie, sztucznie wprowadzonych, molekuł transdukcyjno-sygnalnych do niezapłodnionego owulowanego jaja symuluje, według wynalazku, transdukcyjną kaskadę sygnałową zapłodnienia naturalnego, dzięki czemu dochodzi do uformowania twardej osłony zewnątrzkomórkowej niezapłodnionych owulowanych jaj. [0025] Równomierne utwardzenie wszystkich jaj, w sposobie według wynalazku, wzrasta wraz z przedłużaniem procesu w zakresie od 1 do 20 minut. Stopień twardości można osiągnąć indywidualnie, wydłużając lub skracając proces. Największy wpływ na stopień twardości ma jednak stężenie dodanych molekuł transdukcyjno-sygnalnych, naturalnie występujących w komórce jajowej w niskim stężeniu (por. rys. 5 C dla H 2 O 2 ). Jest to oczywiste, albowiem naturalne stężenie molekuł transdukcyjno-sygnalnych w komórce oddziałuje również w skali nano- i mikromolekularnej. Szczególnie korzystne jest, w sposobie według wynalazku poddanie świeżo pozyskanych jaj działaniu wody z dodatkiem 0,01 % do 0,02 %

13 nadtlenku wodoru i (albo) jonów wapnia w formie chlorku wapnia CaCl2, przez pięć minut. Obie molekuły transdukcyjno-sygnalne mogą być zastosowane oddzielnie lub w kombinacji. [0026] Nie zapłodnione owulowane jaja mogą być po pozyskaniu przetwarzane, po uprzednim przepłukaniu w roztworze fizjologicznym soli kuchennej przed kontaktem z wodą, tak aby zapobiec sklejaniu się i przedłużyć okres przetwarzania świeżych jaj. Przepłukiwanie powinno być przeprowadzane w sterylnych warunkach. Następnie sterylne, przepłukane jaja poddaje się kąpieli z odpowiednim stężeniem nadtlenku wodoru i (albo) chlorku wapnia, określonym w trakcie opracowywania metody, a następnie, po upływie ustalonego czasu oddziaływania, wyjmuje przy pomocy sita. Wynalazek jest więc bardzo łatwą, szybką i tanią metodą. Jego zaletą jest również nie duże, możliwe najniższe stężenie wykorzystanych chemikaliów, mające pozytywny wpływ na smak przetworzonych owulowanych jaj. Nadtlenek wodoru rozpada się na wodę i tlen, jest więc bezsmakowy. Wapń występuje we wszystkich komórkach roślinnych i zwierzęcych, a jego charakterystyczny smak jest odczuwalny tylko w bardzo wysokich stężeniach, nie występujących przy zastosowaniu wynalazku. [0027] Sposób według wynalazku stosowany jest wyłącznie na nie zapłodnione, owulowane jaja danego zwierzęcia wodnego. Oczywiście ważne jest aby pozyskiwać jaja od żywego zwierzęcia wodnego, tak by nie stwarzać zagrożenia dla przetrwania gatunku. Niemniej możliwe jest pozyskanie jaj od uśmierconego lub martwego zwierzęcia wodnego. Zaletą pozostaje to, że jaja z odłowu oraz akwakultur, nawet jeśli są już w stadium owulacji, mogą być jeszcze przetworzone. Obecnie w przemyśle przetwórczym ikry, jaja znajdujące się już w stadium owulacji, likwidowane są bez wykorzystania ich, co powoduje znaczące straty gospodarcze. Z jednej strony możliwe jest wykorzystanie jaj zwierząt wodnych uśmierconych w innych celach (np. konsumpcji), z drugiej strony zwierzę wodne nie zostanie uśmiercone niepotrzebnie,

14 kiedy okaże się, że jego jaja są już w stadium owulacji (dotychczas jaja te były likwidowane z powodu niemożności ich wykorzystania). Sposób według wynalazku, a dokładnie stworzenie siatki dzięki wprowadzeniu tyrozyny do utwardzonej błony komórki jajowej, zapobiega krystalizacji w trakcie magazynowania, co pozwala znacząco podnieść jakość wyrobu, lub wręcz ochronić go przed zniszczeniem. Ponadto sposób według wynalazku wykazuje właściwości antybakteryjne, prowadzące do uśmiercenia zarodków, co w znaczny sposób przedłuża okres przydatności do spożycia owulowanych jaj, a tym samym okres, przeznaczony na produkcję delikatesowego produktu spożywczego. [0028] Główną zaletą sposobu według wynalazku jest jednak to, że po raz pierwszy umożliwia przetwarzanie dojrzałych owulowanych jaj ryb i innych zwierząt wodnych w stadium owulacji na kawior. Jaja pozyskiwane są poprzez sztuczne tarło albo również mechanicznie, tudzież urządzeniem ssącym, dzięki czemu samice pozostają żywe. Ochrona zagrożonych gatunków, a przede wszystkim zachowanie samic w wieku rozrodczym, jest korzystne gospodarczo dla akwakultur. Wielokrotne osiągnięcie stadium rozrodu znacząco zwiększa ilość pozyskanej ikry i gwarantuje pomyślny rozród (dużą liczbę żywych embrionów). [0029] Sposób według wynalazku może być zastosowany wobec jaj wszystkich zwierząt, żyjących w wodzie i w jej pobliżu, wpływając przy tym na zachowanie zagrożonych gatunków. Główna korzyść gospodarcza dotyczy oczywiście produkcji kawioru z jaj jesiotrów oraz produkcji corail z jaj homarów. Utwardzenie pozyskanych owulowanych jaj, osiągnięte w sposób według wynalazku, umożliwia niezawodną konserwację jaj, na przykład chlorkiem sodu lub boraksem. Równie bezproblemowe jest wędzenie jaj. W żadnym wypadku nie występuje zagrożenie dotyczące pękania jaj, co w znacznym stopniu podnosi jakość produktu. Ponadto kawior można produkować o różnych stopniach twardości, w zależności od czasu oddziaływania ww. substancji /stężenia oraz kombinacji z solą i (albo) boraksem, co pozwala

15 dostosować właściwości smakowe i organoleptyczne do wymagań poszczególnych grup konsumentów. [0030] Zastosowanie sposobu według wynalazku spowoduje znaczące zmiany w pozyskanych owulowanych jajach z punktu widzenia morfologii utwardzonych błon komórek jajowych. Przede wszystkim, przy wykorzystaniu mikroskopu optycznego oraz dokładnego mikroskopu elektronowego, łatwo i jednoznacznie stwierdzić można utwardzoną powłokę zewnętrzną z siatką protein i nieodwracalnie wbudowanymi molekułami tyrozyny. Zjawisko to nie występuje przy konwencjonalnych metodach przetwórstwa jaj zwierząt wodnych. Utwardzona komórka jajowa pojawia się wyłącznie w wyniku zapłodnienia, a więc obecności co najmniej jednego plemnika w zapłodnionej komórce jajowej. Zastosowanie sposobu według wynalazku może więc zostać jednoznacznie udowodnione na gotowym nie zapłodnionym produkcie. Przykłady wykonania [0031] Realizacje sposobu przetwarzania jaj zwierząt wodnych w delikatesowy produkt spożywczy według wynalazku objaśnione są bliżej w dalszej części tekstu w oparciu o rysunki. Rysunki przedstawiają: Rysunek 1 naturalny sposób utwardzania jaj jeżaka brzegowego, Rysunek 2 ocenę przyspieszonej mikroskopii produkcji NADPH przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, Rysunek 3a nieprzetworzone owulowane jajo jeżaka brzegowego, Rysunek 3b przetworzone owulowane jajo jeżaka brzegowego, Rysunek 4a bardzo delikatne przekroje błony nieprzetworzonego owulowanego jaja jesiotra, Rysunek 4a bardzo delikatne przekroje błony nieprzetworzonego owulowanego jaja jesiotra, po zastosowaniu chlorku wapnia, Rysunek 4c bardzo delikatne przekroje błony nieprzetworzonego owulowanego jaja jesiotra, po zastosowaniu nadtlenku wodoru,

16 Rysunek 5a, 5b diagramy pomiaru udziału części błony w całkowitej grubości błony w % u niedojrzałych jaj jesiotra (kawior) po przetworzeniu według wynalazku, Rysunek 5c, 5d Rysunek 5a, 5b diagramy pomiaru udziału części błony w całkowitej grubości błony w % owulowanych jaj jesiotra (kawior) po przetworzeniu według wynalazku, [0032] Rysunek 1 przedstawia naturalne zapłodnienie jaj jeżowca oraz wytworzenie zewnątrzkomórkowej błony zapładniającej. Lewy rysunek przedstawia niezapłodnione jajo w dwustukrotnym powiększeniu. Prawy rysunek przedstawia, w tym samym powiększeniu, zapłodnione jajo z utwardzoną błoną zapładniającą (strzałka). Małe kreski oznaczają atakujące plemniki. [0033] Sposób według wynalazku został przetestowany na żywych jajach jeżaka brzegowego (Psammechinus miliaris) oraz na jajach jesiotra syberyjskiego (Acipenser baerii). Wyniki utwardzania owulowanych jaj zostały sprawdzone na podstawie pomiaru aktywności enzymów i morfologii jaj jeżowca oraz jesiotra syberyjskiego in vivo. [0034] Jak już wcześniej wspomniano, bardzo szybka aktywacja enzymu dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa ważna jest ze względu na produkcję redukcyjnie równoważnego NADPH do produkcji H 2 O 2 jako substratu Ovoperoxidase, rozpoczynającej proces utwardzania błony komórki jajowej. Rozpoczęcie aktywności G6PDH można sprawdzić w żywych jajach pod wpływem stymulacji egzogennej. Jako dowód na żywe komórki została przeniesiona metoda soli tetrazolowej wg Van Noordena i Fredericksa (1992). NADPH powstały przy aplikacji substratu redukuje ilościowo sól tetrazolową (TNBT) na brązowawy produkt reakcji, formazan. Tworzenie się produktu reakcji uchwycone jest w czasie przy pomocy pomiarów absorpcyjnych przy falach o długości 585 nm. [0035] Rysunek 2 przedstawia mikroskopię poklatkową (timelapse microskopy, Imaging s Zeiss Axiovert, Axiocam, KS300, Software, Axiovsion Software) produkcji NADPH w żywych jajach jeżowców. Strzałka wskazuje aplikację stymulanta egzogennego (H 2 O 2 1 % w wodzie morskiej). Obie górne krzywe

17 absorpcyjne w strefie kortykalnej (brzeg jaja) oraz w cytoplazmie (wnętrze jaja) wykazują po zastosowaniu wyraźny wzrost w czasie mierzonym co sekundę. Przeprowadzono kontrolę bez stymulacji egzogennej. Obie dolne krzywe absorpcyjne dla strefy kortykalnej i cytoplazmy nie wykazują wzrostu po zastosowaniu. Maski pomiarowe mikroskopii są na obu dolnych rysunkach przedstawione na rysunku 2. Lewy rysunek przedstawia kulistą maskę pomiarową strefy kortykalnej, prawy rysunek przedstawia okrągłą maskę pomiarową cytoplazmy. Aktywność enzymu jest najwyższa w strefie kortykalnej, ponieważ istnieje tu największe zapotrzebowanie NADPH na zużycie H 2 O 2. Identyczny przebieg aktywacji enzymu został zaobserwowany u owo-peroksydazy po zastosowaniu H 2 O 2. [0036] Rysunek 3a przedstawia nieprzetworzone owulowane jajo jeżaka brzegowego bez błony ochronnej (powiększenie 400 x). Kortykalne granulki są luźno porozrzucane na powierzchni jaja i pokryte jedynie cienką warstwą witeliny, nie do rozpoznania pod mikroskopem świetlnym. Rysunek 3b przedstawia jajo z wyraźnie wytworzoną membraną ochronną (strzałka, powiększenie 400 x) przetworzone w sposób według wynalazku. Dokument został wykonany w wyniku badania histologicznego cienkich przekrojów zakonserwowanego materiału jaj (4% formaldehyd, umieszczenie w żywicy epoksydowej do mikroskopu TEM, zabarwienie na niebiesko toluidyną) przed przetworzeniem i po nim przy pomocy egzogennego środka utwardzającego według wynalazku. [0037] Eksperymenty na dużą skalę na pozyskanych jajach jesiotra (Acipenser baerii) pokazały, że sposób opracowany na jeżowcach może zostać bez zmian zastosowany, przynosząc pożądane efekty. Konserwacja solą kuchenną i boraksem przeprowadzona po utwardzeniu jaj oraz eksperymenty typu shelf life przez okres 12 miesięcy pokazały, że jaja pozostają stabilne. [0038] Na rysunkach 4A do C przedstawione są zdjęcia z mikroskopu świetlnego przekrojów kriostatycznych HaE, zdjęcia z mikroskopu elektronowego bardzo cienkich

18 przekrojów jaj jesiotra zakonserwowanych GA oraz osmem i umieszczonych w żywicy epoksydowej. Zdjęcia przedstawiają zmiany błony owulowanych jaj jesiotra, przeprowadzone w sposób według wynalazku. [0039] Rysunek 4A przedstawia zdjęcie z mikroskopu świetlnego przekroju owulowanego jaja jesiotra bez zastosowania procedury według wynalazku. Powłoka (linia ciągła) jaj jesiotra, otaczająca plazmę jaj, składa się z kilku warstw błon. Wewnętrzna błona oznaczona jest gwiazdką (*), zewnętrzna błona (błona zapładniająca) oznaczona jest trzema gwiazdkami (***). Rysunek 4Aa przedstawia zdjęcie z mikroskopu elektronowego, powiększone x w strefie błony zewnętrznej (*) oraz fragment powiększony x z luźnymi kłębkami włókien tyrozyny. [0040] Rysunek 4B przedstawia owulowane jajo jesiotra poddane działaniu 115 mg/l chlorku wapnia według wynalazku. Rysunek 4Bb przedstawia zdjęcie z mikroskopu elektronowego, powiększone x oraz fragment powiększony x z zagęszczoną siatką tyrozyny. Rysunek 4C przedstawia owulowane jajo jesiotra poddane działaniu 0,01 % roztworu nadtlenku wodoru. Rysunek 4Cc przedstawia zdjęcie z mikroskopu elektronowego, powiększone x oraz fragment powiększony x z zagęszczonymi nitkami siatki tyrozyny. [0041] Przy porównaniu obrazków 4A (nieprzetworzone), 4B (poddane działaniu chlorku wapnia), 4C (poddane działaniu nadtlenku wodoru) można wyraźnie rozpoznać, że błona wewnętrzna (*) owulowanych jaj jesiotra, przetworzonych według wynalazku, zmniejsza średnicę i zagęszcza się dzięki sieci tyrozyny, podczas gdy zewnętrzna błona (***) powiększa średnicę, ale też gęstnieje. Gęstnienie prowadzi do utwardzenia błon jaj. Odpowiednie dawkowanie dodatków egzogennych z punktu widzenia rodzaju, ilości i długości trwania, wpływa na stopień twardości. [0042] Rysunki 5A D przedstawiają różne diagramy pomiarów udziałów części błony w % w całkowitej grubości błony kawioru, który jest obecnie dostępny w sprzedaży z

19 niedojrzałych jaj, (rysunek 5A, 5B), oraz owulowanych jaj (rysunek 5C, 5D) po zastosowaniu nadtlenku wodoru albo chlorku wapnia według wynalazku. Rysunki 5A i 5C przedstawiają zastosowanie nadtlenku wodoru H 2 O 2 (zastosowanie 0: bez zastosowania, zastosowanie 1: roztwór 0,01 %, zastosowanie 2: roztwór 0,02 %, zastosowanie 3: roztwór 0,05 %, zastosowanie 4: roztwór 0,1 %), rysunki 5B i 5D przedstawiają zastosowanie chlorku wapnia CaCl 2 H 2 O 2 (zastosowanie 0: bez zastosowania, zastosowanie 1: 115 mg/l, zastosownie 2: 123 mg/l, zastosowanie 3: 130 mg/l s I = na litr roztworu). Oznacza to, że dawka jonów wapnia w mikromolarnym zakresie znacznie większa ilośc jonów wapnia ma niż sa w normalnej wodzie pitnej lub studziennej. FM oznaczona jest błona zapłodnienia (błona fertilizacji), która bez zapłodnienia powstaje jedynie dzięki przetworzeniu według wynalazku, IM" zaś oznacza błonę wewnętrzną. [0043] Na rysunkach 5A i 5B, można zauważyć, że w wyniku przetwarzania kawioru, dostępnego obecnie w sprzedaży, tj. z niedojrzałych jaj, nie zachodzą znaczące zmiany w grubości błony, podczas gdy przesunięcie części grubości z wewnętrznej błony na wytworzoną błonę zapładniającą, wywołane utwardzeniem przy przetwarzaniu owulowanych jaj według wynalazku, według obrazków 5C i 5D jest znaczące. Przedstawiono mediany każdorazowo 50 pomiarów błony wewnętrznej (IM) oraz zewnętrznej błony zapłodnienia (FM) z podziałem wartości 25 % - 75 % kwartyli oraz wartościami minimalnymi i maksymalnymi.

20 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób przygotowywania owulowanych jaj zwierząt wodnych w celu uzyskania delikatesowego produktu spożywczego, obejmujący następujące etapy:. Pozyskanie owulowanych jaj bez uszkodzenia zwierzęcia wodnego,. egzogenna obróbka świeżo pozyskanych owulowanych jaj w roztworze wodnym z dodatkiem molekuł transdukcyjnosygnalnych nadtlenku wodoru i/albo chlorku wapnia, które występują również naturalnie w komórce jajowej, w celu stabilizacji fizjologicznej błony komórki jajowej poprzez aktywację Ovoperoxidase, oraz następującą po nim. konserwację. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że egzogenne oddziaływanie na owulowane jaja odbywa się w kąpieli wodnej z roztworem wodnym z 0,01; 0,02; 0,05 albo 0,1 procentowym dodatkiem nadtlenku wodoru. 3. Sposób według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że egzogenne oddziaływanie na owulowane jaja odbywa się w kąpieli wodnej z roztworem wodnym z 0,01 procentowym udziałem nadtlenku wodoru przez 1 do 5 minut, przy czym długość oddziaływania określana jest w zależności od wymaganej twardości przetwarzanych owulowanych jaj. 4. Sposób według zastrzeżeń 1-3, znamienny tym, że egzogenne oddziaływanie na owulowane jaja odbywa się w kąpieli wodnej z roztworem wodnym z dodatkiem chlorku wapnia w stężeniu 115 mg/l, 123 mg/l lub 130 mg/l.

21 Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że egzogenne oddziaływanie na owulowane jaja odbywa się w kąpieli wodnej z roztworem wodnym z dodatkiem chlorku wapnia o stężeniu 115 mg/l przez 10 do 20 minut, przy czym długość oddziaływania określana jest w zależności od wymaganej twardości przetwarzanych owulowanych jaj. 6. Sposób według zastrzeżeń 1-5, znamienny tym, że oddziaływanie na owulowane jaja w kąpieli wodnej polega na kombinacji roztworu wodnego z dodatkiem nadtlenku wapnia i chlorku wapnia i trwa przez 1 do 20 minut, przy czym długość oddziaływania określana jest w zależności od oczekiwanej twardości przetwarzanych owulowanych jaj. 7. Sposób według zastrzeżeń 1-6, znamienny tym, że obejmuje proces płukania owulowanych jaj w roztworze fizjologicznym soli kuchennej w warunkach sterylnych przed oddziaływaniem egzogennym. 8. Sposób według zastrzeżeń 1-7, znamienny tym, że pozyskiwanie owulowanych jaj następuje od żywych zwierząt wodnych. 9. Sposób według zastrzeżeń 1-8, znamienny tym, że pozyskiwanie owulowanych jaj następuje od ryb i skorupiaków towarowych. 10. Sposób według zastrzeżenia 9, znamienny tym, że pozyskiwanie owulowanych jaj następuje od jesiotra, jako ryby towarowej, celem produkcji czarnego kawioru.

22 Owulowane jaja zwierząt wodnych, przetworzone sposobem według zastrzeżeń 1-10 na delikatesowy produkt spożywczy, znamienne tym, że posiadają utwardzoną zewnątrzkomórkową powłokę zewnętrzną z siatką nitek proteinowych oraz nieodwracalnie wbudowanymi molekułami tyrozyny, nie pozostając przy tym w stanie zapłodnienia.

23

24

25

26

27

28

29