Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Klaudyny Lewandowskiej pt. Polimorfizm genu TAS2R38

Transkrypt

1 Sopot, 5 stycznia 2018 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Klaudyny Lewandowskiej pt. Polimorfizm genu TAS2R38 a predyspozycja do próchnicy u dzieci z Pomorza Zachodniego Promotor: prof. dr hab. Andrzej Ciechanowicz Choroby cywilizacyjne są definiowane jako powszechnie występujące schorzenia, do których wystąpienia lub rozprzestrzenienia przyczynił się postęp techniczny, rozwój przemysłu i zmiany społeczne. Komponenta dziedziczna chorób cywilizacyjnych jest złożona stanowiąc poważne wyznanie dla badaczy zajmujących się genetyką molekularną tych chorób. Powszechnie uważa się iż model dziedziczenia wieloczynnikowego, czyli interakcje wielu genów i czynników środowiskowych, najlepiej odzwierciedla ich patomechanizm. Stwierdzenie to jest również zasadne w odniesieniu do próchnicy, globalnej choroby infekcyjnej, będącej jednym z najbardziej rozpowszechnionych problemów zdrowotnych dzieci i główną u nich przyczyną straty uzębienia. Pomimo, iż próchnica jest wywołana przez bakterie, które poprzez wytworzenie kwasów inicjują proces demineralizacji zęba, stopień nasilenia jak i tempo progresji zmian wykazuje zmienność międzyosobniczą znacznego stopnia. Identyfikacja czynników genetycznych odpowiedzialnych za część tej zmienności ma znaczenie dla poszerzenia podstawowej wiedzy o podłożu genetycznym jak i biologii procesu próchnicowego. W przedstawionej do oceny pracy doktorskiej badania skupiły się na ocenie jednego z postulowanych w literaturze tematu czynników molekularnych predysponujących do rozwoju próchnicy: genotypu genu TAS2R38 warunkującego odczuwanie gorzkiego smaku fenylotiomocznika. Doktorantka określiła częstości

2 występowania poszczególnych alleli w grupie prawie 400 dzieci a następnie zbadała korelacje między typem genotypu a fenotypem klinicznym. Temat podjęty przez mgr Lewandowską w przedłożonej mi do oceny pracy doktorskiej jest ciekawy, a wyniki uzyskane na unikatowej grupie dzieci skrupulatnie scharakteryzowanej klinicznie, ze względu na rzadkość połączenia dokładnego badania stomatologicznego z analizą genetyczną, stanowią znaczący wkład do wiedzy na temat patomechanizmu próchnicy. Ponadto, należy podkreślić że tego rodzaju badania nie były dotąd wykonywane na populacji polskich chorych. Rozprawa liczy 92 strony i składa się z 10 rozdziałów w układzie typowym dla prac doktorskich. Właściwy tekst poprzedzony jest wykazem stosowanych skrótów (niestety nie wszystkich, por. niżej) co znacznie ułatwia jego lekturę. Tekst jest uzupełniony 3 czytelnymi rycinami i 16 tabelami umieszczonymi w tekście pracy oraz suplementem prezentującym uzyskane dane surowe (zał.1) oraz wzory ankiet stosowane do oceny zakresu opieki stomatologicznej (zał. 2 i 3). Piśmiennictwo obejmuje 110 pozycji, wśród których dominują prace autorów zagranicznych a z których prawie połowa (51) opublikowana została w ciągu ostatnich 5 lat. Nie są jednak cytowane polskie publikacje związane z tematyką doktoratu, nawet pochodzące z tego samego ośrodka (np. Szmidt M. i współ. 2015). Niepotrzebnym również wydaje się cytowanie podręczników stomatologii, gdyż w większości fragmenty te dotyczą szeroko już znanych kwestii. Z drugiej strony Doktorantka wykazała staranność w doborze bibliografii np. dotarła do tekstów z lat 30 zeszłego stulecia, które są pionierskimi pracami z zakresu genetyki smaku; cytuje też prace opublikowane w języku niemieckim i duńskim. Cała rozprawa została napisana zwartym, syntetycznym stylem. W liczącym 9 stron wstępie Doktorantka w sposób zwięzły przedstawia etiopatogenezę próchnicy: zarówno historię naturalną procesu próchnicowego jak i aktualny stan wiedzy na temat predyspozycji genetycznej do rozwoju zmian próchnicowych. Jasno i przejrzyście omawia również genetyczne podstawy (nie)zdolności do odczuwania gorzkiego smaku fenylotiomocznika oraz postulowane znaczenie genotypów genu TAS2R58 2

3 w predyspozycji do rozwoju próchnicy. Cele podjętych badań zostały czytelnie sformułowane w trzech równorzędnych punktach. W kolejnym rozdziale została starannie scharakteryzowana grupa badana oraz przedstawione szczegóły metodologiczne badania. Zwraca uwagę duża liczebność badanych podgrup oraz jej reprezentatywność (uzębienie mleczne, mieszane i stałe), co podnosi rangę uzyskanych wyników jak i ułatwia uzyskanie istotności w analizach statystycznych. Metody laboratoryjne zostały przedstawione w sposób dokładny i wyczerpujący. Również analizy statystyczne omówione zostały w sposób precyzyjny, za wyjątkiem kwestii rekonstrukcji haplotypów która opisana jest w sposób zbyt lakoniczny, utrudniający powtórzenie analiz. Analiza statystyczna została wykonana zgodnie z zasadami sztuki genetyki populacyjnej. Wyniki badań zostały przedstawione w sposób klarowny dzięki przedstawieniu wyników w formie czytelnych tabel oraz kolorowych rycin przedstawiających chromatogramy poszczególnych diplotypów. Niektóre wyniki są potwierdzeniem danych uzyskanych we wcześniejszych pracach, ale wiele obserwacji rozszerza istniejącą wiedzę i ma charakter nowatorski. Za najważniejsze uważam wykazanie, iż polimorfizmy c.145g>c, c.785t>c oraz c.886a>g genu TAS2R38 tworzące haplotypy determinujące zróżnicowaną wrażliwość na gorzki smak fenylotiomocznika są istotnie, choć przeciwstawnie w zależności do wieku dzieci (generacji zębów) związane z ryzykiem próchnicy. W dyskusji Doktorantka krytycznie zestawia wyniki własne z danymi literaturowymi, umiejętnie wskazując na nowatorskie aspekty uzyskanych wyników jak i na ograniczenia pracy wiążące się z charakterystyką grupy badanej i zastosowaną metodologią badawczą. Doktorantka nie tylko porównuje uzyskane wyniki do innych prac analizujących genotypy genu TAS2R38, ale również przytacza historyczne prace oceniające fenotypowo wrażliwość na PTC i ryzyko próchnicy umożliwiając bardziej kompleksową, globalną ocenę zjawiska. Właściwy tekst pracy zakończony jest trzema wnioskami sformułowanymi adekwatnie do uzyskanych wyników. W mojej opinii praca zyskałaby jednak na przeredagowaniu brzmienia ostatniego wniosku kwestię 3

4 ochronnego charakteru diplotypu z co najmniej jednym haplotypem CCG w grupie 3- latków połączyć należałoby z wnioskiem 2. Moje uwagi jako recenzenta są głównie natury redakcyjnej: Str.5 Doktorantka nie przedstawiła objaśnień stosowanych w tekście skrótów: GTA, AVI, 1KG, TDI, EEC. Str.13 Doktorantka sugeruje, że dopiero opublikowanie sekwencji ludzkiego genomu umożliwiło analizy sprzężeń i identyfikację genów-kandydatów rozwoju próchnicy. Badania takie były jednak przeprowadzane już wcześniej, a poznanie sekwencji ludzkiego genomu jedynie je ułatwiło. Str (Tab. 1 i 2) Opis loci/genów sprzężonych z próchnicą jest zbyt lakoniczny. Wskazane było by uzupełnienie opisu o nr ref. OMIM (zarówno genu jak i ew. choroby znim związanej), nazwę i krótką charakterystykę białka kodowanego przez dany gen oraz informację o charakterze związku z próchnicą (efekt ochronny? związek z wcześniejszym rozwojem choroby? związek z rodzajem diety?). Dla łatwiejszego porównania obu Tabel wskazane byłoby ujednolicenie zasady wymienienia markerów genetycznych: albo wg. kolejności alfabetycznej nazw genów albo wg. pozycji chromosomowej. W tekście brak zaś porównania obu Tabel czy są jakieś pozycje wspólne? Str. 18 cecha (..) dziedziczy się autosomalnie recesywnie powinno być dziedziczy się w sposób autosomalny, recesywny gdyż są to dwa niezależne określenia charakteru dziedziczenia. Str. 21 Doktorantka podaje, iż wykonane badania stanowiły część projektu Analiza wpływu wybranych czynników środowiskowych, klinicznych i genetycznych na stan uzębienia dzieci w województwie zachodniopomorskim. Nie podaje jednak informacji na temat kierownika w/w projektu, jednostek oraz osób zaangażowanych w jego realizację oraz źródła finansowania. 4

5 Str. 21 oraz zał. 2 i 3 Doktorantka podaje, iż w grupie 12-latków zostało zrealizowane badanie ankietowe, jednak dalej w tekście nie podaje jego wyników ani też nie nawiązuje do niego w dyskusji. Str. 22 oraz 49, 51 Doktorantka nie podała sekwencji referencyjnej genu TAS2R38 RefSeq/Esnembl etc.; dalej w tekście posiłkuje się określeniem allel dziki w stosunku do alleli sprzężonych w haplotypie GTA warunkującym recesywną cechę braku odczuwania smaku PTC. Wprowadza to zamieszanie, gdyż sugeruje iż allel częstszy koduje cechę rzadszą. Opierając się o dane z sekwencji referencyjnej genomu i/lub dane z baz 1000G, ExAC itp., Doktorantka mogłaby wskazać który z alleli w danym locus jest częstszy, a który rzadszy i w stosunku do tego ostatniego używać określenia MAF (ang. minor allele frequency ). Str. 23 Czytelniej byłoby przedstawić skład mieszaniny reakcyjnej PCR i warunków amplifikacji DNA w formie Tabeli. W składzie mieszaniny brak jest informacji o użytej polimerazie DNA. Str. 25 W analizie wieloczynnikowej stosowano korektę względem płci, nie wyjaśniono jednak jak czynnik ten wpływać może na rozwój próchnicy. Str. 38 Tabela 7. Wskazane byłoby opatrzenie Tabeli szczegółową legendą, jak również warto wzbogać ją o informacje dot. dystansu fizycznego pomiędzy poszczególnymi SNP. Str. 51 Doktorantka porównuje częstość występowania badanych alleli genu z innymi populacjami europejskimi analizowanymi w ramach projektu 1000 Genomes; brak jednak odniesienia do częstości alleli w populacjach słowiańskich, w tym polskiej (np. dane z BioBanku POPULOS, Uniw. w Łodzi). Str. 51 Doktorantka podkreśla iż w badanej grupie stwierdzono bardzo istotną i ścisła, choć niezupełną nierównowagę sprzężenia pomiędzy poszczególnymi parami analizowanych polimorfizmów. Jednakże, w dyskusji Doktorantka nie omówiła związanych z tym ograniczeń metody in-silico rekonstrukcji haplotypów jak również ich ekstrapolacji na diplotypy. Nie przeprowadziła również, chociaż wybiórczego, 5

6 eksperymentalnego potwierdzenia konkretnych haplotypów w reprezentatywnych próbkach. Str Bibliografia niespójny charakter podawania cytowań oraz liczne literówki wymagają korekty edytorskiej. Ponadto, w tekście pracy znajduje się kilka niefortunnych kalek z języka angielskiego np. według mojej najlepszej wiedzy, nie przynosi więc ona [metoda] wyników fałszywie dodatnich, brak jednorodności osób badanych, co do wieku. Również odmiana kilku nazwisk obcych w dopełniaczu zapisywana jest niepoprawnie z wykorzystaniem apostrofu np. Mendl a, Wendell a, Yildiz a. W sumie wszystkie te nieścisłości lub błędy nie zmieniają merytorycznej oceny pracy. Uważam, że Doktorantka osiągnęła stawiane sobie cele. W podsumowaniu stwierdzam, że rozprawa mgr inż. Klaudyny Lewandowskiej spełnia kryteria stawiane rozprawom doktorskim i zwracam się do Rady Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Nauczania w Języku Angielskim Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie z wnioskiem o dopuszczenie do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Beata S. Lipska-Ziętkiewicz Debinki Gdansk Tel Fax b.lipska@gumed.edu.pl 6