(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: ,WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/35 ( ) C07K 14/415 ( ) C07K 1/16 ( ) A61P 37/08 ( ) (54) Sposób wytwarzania i sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 uzyskiwany takim sposobem i jego zastosowanie jako leku oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki główny alergen (30) Pierwszeństwo: , EP, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/05 (73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH, Darmstadt, DE (72) Twórca(y) wynalazku: ROLAND SUCK, Hamburg, DE HELMUT FIEBIG, Schwarzenbek, DE OLIVER CROMWELL, Wentorf, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Łukaszyk Szymon Kancelaria Patentowa Łukaszyk PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania alergenów pyłku brzozy, które wyróżniają się brakiem lub przynajmniej redukcją wiązania immunoglobiny E, to jest hipoalergicznością. Alergeny te całkowicie zachowują przy tym stosowną terapeutyczną stymulację limfocytów T. Mogą być zatem stosowane w specyficznej immunoterapii jako środki terapeutyczne o niewielkich skutkach ubocznych. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 uzyskiwany takim sposobem i jego zastosowanie jako leku oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki główny alergen. Stan techniki Zasięg alergii typu 1 rozszerzył się znacznie na całym świecie w ostatnich dziesięcioleciach. Aż do 20% ludności w krajach uprzemysłowionych cierpi z powodu takich dolegliwości jak alergiczny nieżyt nosa, zapalenie spojówek lub dychawica oskrzelowa, wywoływanych przez alergeny obecne w powietrzu (aeroalergeny), które uwalniane są z różnorodnych źródeł takich jak pyłki roślin, roztocza, ssaki (psy, koty, konie), czy pleśniaki. Poważne alergie mogą być także powodowane przez owady żądlące lub kąsające, takie jak pszczoły czy osy. Substancjami wywołującymi alergie typu 1 są proteiny, glikoproteiny lub polipeptydy. Alergeny te reagują poprzez błonę śluzową po strawieniu lub za pomocą przeciwciał IgE wiążą się z powierzchnią komórek tucznych uczulonych osób po użądleniu lub ukąszeniu. Jeżeli dwie lub większa liczba cząsteczek IgE jest usieciowanych razem przez alergen, skutkuje to uwolnieniem mediatorów (np. histaminy, prostaglandyn) i cytokin przez komórki efektora, a tym samym wywołanie objawów alergicznych. Pyłki brzozy są najczęstszymi inicjatorami reakcji alergicznych wśród pyłków drzew (Jarolim E. et al., 1989, Allergy 44:385-95). Ponad 90% cierpiących na alergie pyłku brzozy posiada przeciwciała IgE przeciwko głównemu alergenowi Bet v 1 (Elfman, L. et al., 1997, Int. Arch. Allergy Immunol., 113: ). Za pomocą sekwencji cdna, możliwe jest wytworzenie alergenów rekombinowanych, które mogą mieć zastosowanie w diagnostyce i terapii alergii (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50, ). Wytwarzanie rekombinowanych alergenów Bet v 1 (rbet v 1) i ich oczyszczenie dla celów farmaceutycznych opisali na przykład Hoffmann-Sommergruber et al. (Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39). Ponadto możliwa jest specyficzna modyfikacja genetyczna alergenów rekombinowanych, pozwalająca na osiągnięcie obniżonego potencjału alergicznego (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162 (4): ; Valenta et al., 1999, Biol. Chem. 380: ; Singh et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85). Odmiany alergenów tego typu są obiecujące dla specyficznej immunoterapii alergii typu 1. Potencjalną niedogodnością odmiany alergenów rekombinowanych jest fakt, że modyfikacja ich struktury pierwotnej prowadzi do zablokowania lub obniżenia reaktywności epitopów limfocytów T, które są konieczne dla uzyskania skuteczności terapeutycznej. Możliwość ta może być wykluczona jedynie wtedy, kiedy pierwotna struktura odpowiadająca alergenom naturalnym, służy jako podstawa dla wytworzenia rekombinowanego białka. W przypadku głównego alergenu pyłku brzozy Bet v 1, preparat wytwarza się metodami rekombinacji w dwóch połowach (Vrtala, S., et al., 1997, J. Clin. Invest. 99: ) lub jako trimer (Vrtala, S., et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 118:218-9) celem jego optymalizacji dla celów terapeutycznych, to znaczy obniżenia jego możliwości wiązania IgE. Potencjalna strata epitopów limfocytów T i nierozpuszczalność białek jest także niekorzystnym efektem tych rozwiązań. Kolejną niedogodność można dostrzec w złożonym sposobie wytwarzania takich odmian rbet v 1. Odpowiednim punktem wyjściowym dla wytwarzania głównego rekombinowanego alergenu, jaki może być wykorzystany do zastosowań terapeutycznych będzie odpowiednia cząsteczka, której struktura pierwotna odpowiada typowi dzikiemu, która charakteryzuje się nieograniczoną stymulacją limfocytów T, ale posiada obniżoną aktywność IgE, czyli jest hipoalergiczna. Cel ten osiągnięto według wynalazku poprzez przeprowadzenie serii etapów biochemicznego oczyszczania znanych per se, z wykorzystaniem rozpuszczalnego rekombinowanego głównego alergenu rbet v 1 jako materiału wyjściowego. Nieoczekiwanie w białkach oczyszczonych w ten sposób zaobserwowano obniżoną aktywność IgE przy zachowanej jednocześnie stymulacji limfocytów T. Od-

3 PL B1 3 powiednio sposób według wynalazku dostarcza ulepszonej efektywności terapeutycznej, przy znacząco zredukowanych lub przy braku efektów ubocznych. Forma sposobu wytwarzania alergenów rekombinowanych jest tu szczególnie istotna, ponieważ białka są w trakcie poszczególnych etapów sposobu przekształcane są do konformacji, która nie ma lub ma zasadniczo obniżone powinowactwo do IgE przy stałej stymulacji limfocytów T. Opis figur rysunku Fig. 1A: SDS-PAGE dla charakteryzacji hipoalergicznego rbet v 1, Ścieżka 1: Standardowe białko dla oszacowania ciężaru cząsteczkowego, Ścieżka 2: Naturalne nbet v 1, Ścieżka 3: rbet v 1 oczyszczone sposobem według wynalazku, Ścieżka 4: rbet v 1 oczyszczone zgodnie ze stanem techniki. Fig. 1B: Pasmo nitrocelulozy SDS-PAGE z rysunku Fig. 1A. Fig. 2A: Pasmo nitrocelulozy dla określenia aktywności IgE w serum 20 poszczególnych pacjentów, Pozycja 3: Naturalne nbet v 1, Pozycja 4: rbet v 1 oczyszczone sposobem według wynalazku, Pozycja 5: rbet v 1 oczyszczone zgodnie ze stanem techniki. Fig. 2B: Pasmo nitrocelulozy dla określenia rodzaju próbek Bet v 1, Pasma 21-26: Różne poliklonalne przeciwciała królika przeciw-bet v 1, Pasmo 27: Monoklonalne przeciwciało mysie 6B6 przeciw-bet v 1, Fig. 3: Test EAST Ilościowej oceny wiązań IgE. Stężenie inhibitora wiązania IgE-Bet v 1 w μg/ml naniesiono na osi pionowej, a stopień inhibicji w [%] na osi poziomej. Fig. 4: Wyznaczenie stymulacji limfocytów T poprzez odmiany Bet v 1. Porównano stężenie naturalnego nbet v 1, konwencjonalnie oczyszczonego rekombinowanego rbet v 1 oraz rekombinowanego rbet v 1 oczyszczonego sposobem według wynalazku oraz odpowiednie wskaźniki stymulacji (SI) uzyskane dla różnych linii limfocytów T (ang. T-cell lines - TCL) oraz klonów limfocytów T (ang. T-cell clones - TCC). Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu biochemicznego oczyszczania, w rezultacie którego wytwarzane są białka mające właściwości zmodyfikowane według wynalazku za pomocą efektywnego oczyszczania z zastosowaniem specyficznych eluentów, na przykład, do wytwarzania alergenów otrzymanych metodami rekombinacji. Właściwości te obejmują brak, a przynajmniej zasadnicze obniżenie aktywności IgE, przy jednoczesnym zachowaniu stymulacji limfocytów T. Istotą wynalazku jest zatem sposób obniżania aktywności IgE głównego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, który obejmuje zastosowanie rozpuszczalnego rekombinowanego głównego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 i przeprowadzenie przedstawionych poniżej etapów chromatografii dla jego oczyszczenia oraz następującego po tym etapu zobojętniania. Istotą wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 za pomocą wieloetapowego oczyszczania chromatograficznego z zastosowaniem jako eluentu zasadniczo niebuforowanych zasad wodnych oraz następującego po tym etapu zobojętniania, gdzie zastosowanym materiałem wyjściowym jest rozpuszczalne surowe białko rbet v 1 otrzymane metodami rekombinacji. W korzystnym przykładzie realizacji sposobu takiego sposobu według wynalazku rozpuszczalne surowe białko rbet v 1 otrzymane sposobami rekombinacji jest wytworzone w komórkach E. coli. Etapy oczyszczania chromatograficznego korzystnie obejmują chromatografię anionowymienną (ang. anion exchange chromatography), chromatografię oddziaływań hydrofobowych (ang. hydrophobic interaction chromatography) oraz filtrację żelową i mogą być przeprowadzane raz, kilka razy jeden po drugim lub kilka razy zamiennie. Jednak etapy oczyszczania chromatograficznego korzystnie przeprowadzane są w następującej sekwencji: pierwsza filtracja żelowa, chromatografia anionowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, druga filtracja żelowa. Oczyszczanie chromatograficzne jest zwykle przeprowadzane przy stężeniu zasady od 5 do 100 mm, ale korzystnie od 5 do 40 mm a szczególnie korzystnie od 10 do 30 mm, gdzie podstawową substancją jest korzystnie NaOH. W miejsce układu czysto wodnego możliwe jest także zastosowanie układu mieszanego zawierającego, na przykład wodę i metanol. Można także rozważyć układ bezwodny, na przykład układ metanolowy. Korzystne jest jednak zastosowanie układu wodnego.

4 4 PL B1 W zależności od odpowiedniego etapu chromatografii, do eluentu mogą zostać dodane różne stężenia soli obojętnej - korzystnie NaCI - aż do około 5 M. Obniżenie wartości ph do wartości tolerowanej przez względnie czułe białka, jakie może okazać się tu konieczne, może zostać osiągnięte poprzez dodanie wodorowęglanu sodu. Ustalenie warunków fizjologicznych na końcu procesu oczyszczania może być także powodem dodania wodorowęglanu sodu podczas etapów chromatografii. Zasadniczo możliwe są stężenia do 100 mm. Przeprowadza się to jednak korzystnie w fizjologicznym zakresie poniżej 20 mm, a szczególnie korzystnie przy 11 mm. W przypadku rbet v 1, obniżenie wartości ph nie jest niezbędne. Pomimo tego wodorowęglan sodu jest ogólnie dodawany w zastosowaniu sposobu według wynalazku względem rbet v 1 celem możliwości ustalenia stężeń fizjologicznych w prosty sposób na końcu oczyszczania. Istotą wynalazku jest więc sposób wytwarzania głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, w którym zasadniczo niebuforowane eluenty podstawowe pozwalają na oczyszczenie białek w roztworze w warunkach łagodnych a tym samym w stanie nadającym się do chromatografii. W korzystnej realizacji sposobu, surowe białko rbet v 1 jest wstępnie oczyszczane przed przeprowadzeniem właściwego oczyszczania za pomocą chromatografii, na przykład chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub chromatografii jonowymiennej, i/lub wysalania, gdzie, w przeciwieństwie do następującego oczyszczania właściwego, stosuje się eluent lub roztwór buforowany. Wyjściowymi materiałami dla tego sposobu są rozpuszczalne, rekombinowane alergeny wytwarzane w bakteriach lub innych odpowiednich komórkach gospodarza (na przykład drożdżach). Ponieważ sposób według wynalazku jest możliwy do ogólnego zastosowania dla tych produktów ekspresji, rozpuszczalne alergeny różnego pochodzenia, mogą nim być oczyszczone, poddane ponownemu procesowi formowania i poddane formulacji. W szczególności, w przypadku odpowiedniego podobieństwa tych alergenów różnego pochodzenia do głównego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, można oczekiwać, że uzyskane zostaną odpowiednie właściwości według wynalazku. Jednak sposób ten jest szczególnie odpowiedni do wytwarzania głównego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 otrzymanego metodami rekombinacji. Naturalny główny alergen pyłku brzozy nbet v 1 jest także zasadniczo odpowiedni jako materiał wyjściowy. Ostateczne zobojętnianie rekombinowanych składników aktywnych poprzez modyfikacje wartości ph umożliwia - przy założeniu odpowiedniego doboru stężeń składników eluentu - bezpośrednie uzyskanie gotowego do użycia roztworu fizjologicznego. Farmaceutycznie aktywne składniki mogą być stosowane bezpośrednio po zobojętnieniu jako preparaty pozajelitowe. Dodatkowo można przeprowadzić powtarzalny i standaryzowany proces w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice - GMP), który będzie konieczny w przypadku farmaceutyków. Wynalazek służy zatem do wytwarzania ulepszonych preparatów dla specyficznej immunoterapii alergii, które uzyskuje się sposobem według wynalazku. Znacznie obniżona lub brak aktywności IgE dostarcza korzystnych parametrów dla specyficznej immunoterapii. Rekombinowane hipoalergiczne alergeny otrzymane tym sposobem mogą zatem wpływać na polepszenie terapii chorób alergicznych. Istotą wynalazku jest więc główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 otrzymywany sposobem według wynalazku, a w szczególności jego zastosowanie jako leku. Możliwe jest oczywiście, celem dalszego wpływania na właściwości głównego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 - na przykład celem osiągnięcia dalszego obniżenia aktywności IgE lub dalszego zwiększenia stymulacji limfocytów T - przeprowadzenie farmaceutycznie dopuszczalnych modyfikacji białka, a tym samym wytworzenie jego pochodnych. Modyfikacje te mogą być z jednej strony modyfikacjami genetycznymi na poziomie DNA, gdzie odpowiednie są na przykład, aminokwasowe insercje, delecje i substytucje, podział białka na fragmenty i fuzja białka lub jego fragmentów z innymi białkami lub peptydami. Jednak modyfikacje te mogą mieć też charakter czysto chemiczny, mając miejsce na poziomie cząsteczkowym. Istotą wynalazku jest zatem zastosowanie głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 według wynalazku dla otrzymania leku do specyficznej immunoterapii alergii, w inicjacji której uczestniczy główny alergen pyłku brzozy rbet v 1. W końcu istotą wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 według wynalazku. Składniki aktywne według wynalazku, oraz opcjonalnie zaróbki i/lub środki wspomagające mogą być przekształcone do odpowiedniej formy dozowania

5 PL B1 5 wraz z przynajmniej jedną stałą, ciekłą i/lub półciekłą zaróbką i/lub środkiem wspomagającym i opcjonalnie w kombinacji z jednym lub większą liczbą dalszych składników aktywnych. Kompozycje te mogą być stosowane jako środki terapeutyczne w medycynie lub weterynarii. Odpowiednimi zaróbkami są organiczne lub nieorganiczne substancje, jakie nadają się do podawania pozajelitowego i nie reagują z hipoalergicznym głównym alergenem pyłku brzozy rbet v 1. Odpowiednie do podawania pozajelitowego są, w szczególności, roztwory, korzystnie na bazie oleju lub wody, ponadto zawiesiny, emulsje bądź implanty. Hipoalergiczny główny alergen pyłku brzozy rbet v 1 według wynalazku może być także liofilizowany a otrzymany liofilizat wykorzystywany na przykład do wytwarzania zastrzyków. Wskazane kompozycje mogą być sterylizowane i/lub mogą zawierać środki wspomagające, takie jak środki zwilżające, konserwanty, stabilizatory i/lub środki nawilżające, emulgatory, sole dla modyfikacji ciśnienia osmotycznego, substancje buforowe i/lub wiele dalszych składników aktywnych. Ponadto odpowiedni preparat głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 według wynalazku umożliwia wytwarzanie preparatów bazowych, na przykład poprzez adsorpcję na wodorotlenku aluminium. Sposób wytwarzania według wynalazku opisano ogólnie poniżej. W opisie tym wszystkie materiały chromatograficzne wymienione na zasadzie przykładu pochodzą od firmy Amersham Biosciences (Freiburg, Niemcy). Pierwszy etap wstępnego oczyszczania dla usunięcia kwasów nukleinowych może obejmować chromatografię oddziaływań hydrofobowych przeprowadzaną w warunkach fizjologicznych (przy ph od 6 do 8, nie powodującym denaturacji), gdzie następuje zatężanie białka docelowego. Alternatywnie można przeprowadzić wysalanie lub chromatografię jonowymienną. Przeprowadzenie wspomnianego pierwszego etapu oczyszczania wstępnego nie jest jednak absolutnie konieczne dla uzyskania efektu według wynalazku. Następny etap oczyszczania służy do przekształcenia białek w słaby eluent solny o stężeniu w zakresie od 10 do 100 mm, na przykład 20 mm NaCI, przykładowo za pomocą filtracji żelowej na kolumnie Sephadex G-25. Tworzą się dzięki temu warunki, które zwiększają wydajność chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem eluentów alkalicznych. Roztwór białkowy przygotowany w ten sposób jest następnie wykorzystywany do chromatografii anionowymiennej, na przykład z zastosowaniem kolumny Source Q. Większość alergenów wiąże się tu z nośnikiem. Eluent alkaliczny powoduje, że nawet poprzednio słabo rozpuszczalne lub nierozpuszczalne białka pozostają w roztworze. Wymywanie gradientem NaCI skutkuje częściowym usunięciem zanieczyszczeń bakteryjnych i fragmentów składników aktywnych. W dwóch dalszych etapach oczyszczania za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofobowych oraz filtracji żelowej, wstępnie oczyszczone i zrównoważone alergeny są zasadniczo odseparowywane od dalej obecnych zanieczyszczeń bakteryjnych. W tym celu stosuje się zasadniczo te same eluenty zawierające niskocząsteczkową zasadę i zmienny stosunek nieorganicznej soli obojętnej. Do eluentu można korzystnie dodawać nieorganiczną sól obojętną oraz opcjonalnie NaHCO 3. Dzięki temu alergeny mogą się wiązać do kolumny w chromatografii oddziaływań hydrofobowych z zastosowaniem, na przykład, do 5 M NaCI, 20 mm NaOH i 11 mm NaHCO 3 i mogą być następnie wymywane z zastosowaniem roztworu alkalicznego o niskiej zawartości lub nie zawierającego soli, na przykład 20 mm NaOH. Stężenia związków NaOH, NaCI i NaHCO 3 obecnych w eluencie dobiera się korzystnie tak, aby typowe stężenia dla fizjologicznego roztworu solnego mogły być określone w etapie zobojętniania następującym po etapie oczyszczania. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 za pomocą jednego lub większej liczby etapów oczyszczania chromatograficznego, z zastosowaniem zasadniczo niebuforowanych zasad wodnych jako eluentu, oraz następującego po tym etapu zobojętniania, znamienny tym, że zastosowanym materiałem wyjściowym jest rozpuszczalne surowe białko rbet v 1 otrzymane metodami rekombinacji. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalne surowe białko rbet v 1 otrzymane sposobami rekombinacji zostało wytworzone w komórkach E. coli.

6 6 PL B1 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy oczyszczania chromatograficznego obejmują chromatografię anionowymienną (ang. anion exchange chromatography), chromatografię oddziaływań hydrofobowych (ang. hydrophobic interaction chromatography) i filtrację żelową. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że etapy oczyszczania chromatograficznego są przeprowadzane w następującej sekwencji: pierwsza filtracja żelowa, chromatografia anionowymienną, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, druga filtracja żelowa. 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że zasada zastosowana jako eluent ma stężenie w zakresie od 5 mm do 100 mm, korzystnie od 5 mm do 40 mm. 6. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że zasadą zastosowaną jako eluent jest NaOH. 7. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienny tym, że do eluentu dodaje się nieorganiczną sól obojętną oraz opcjonalnie NaHCO Sposób według dowolnego z zastrz. 1-7, znamienny tym, że nieorganiczną solą obojętną dodawaną do eluentu jest NaCI. 9. Sposób według dowolnego z zastrz. 6-8, znamienny tym, że stężenia związków NaOH, NaCI i NaHCO 3 obecnych w eluencie dobiera się tak, aby typowe stężenia dla fizjologicznego roztworu solnego mogły być określone w etapie zobojętniania następującym po etapie oczyszczania. 10. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienny tym, że surowe białko rbet v 1 jest wstępnie oczyszczane w roztworze buforowym za pomocą chromatografii i/lub wysalania. 11. Sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1, znamienny tym, że rozpuszczalny główny alergen pyłku brzozy rbet v 1 otrzymany metodami rekombinacji jest podawany sposobowi zdefiniowanemu w dowolnym z zastrz Główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 uzyskiwany sposobem zdefiniowanym w dowolnym z zastrz Główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 zdefiniowany w zastrz. 12 jako lek. 14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rbet v 1 zdefiniowany w zastrz. 12 oraz opcjonalnie zaróbki i/lub środki wspomagające. 15. Zastosowanie głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rbet v 1 zdefiniowanego w zastrz. 12 dla otrzymywania leku do specyficznej immunoterapii alergii, w rozpoczęciu której uczestniczy główny alergen pyłku brzozy rbet v 1.

7 PL B1 7 Rysunki

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.