(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. G06F 19/00 ( ) C12Q 1/68 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/01 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Diagnozowanie aneuploidii chromosomów u płodu przy użyciu sekwencjonowania genomowego (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/03 (73) Uprawniony z patentu: The Chinese University Of Hong Kong, HONG KONG, CN (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 KWAN CHEE CHAN, Hong Kong, CN YUK-MING DENNIS LO, HONG KONG, CN ROSSA WAI KWUN CHIU, HONG KONG, CN (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 18777/13/P-RO/MW EP Diagnozowanie aneuploidii chromosomów u płodu przy użyciu sekwencjonowania genomowego DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Ogólnie wynalazek dotyczy badań diagnostycznych aneuploidii chromosomów u płodu poprzez określenie nierównowagi pomiędzy różnymi sekwencjami kwasów nukleinowych, a w szczególności identyfikacji trisomii 21 (zespołu Downa) oraz innych aneuploidii chromosomów poprzez badanie próbki matki (np. krwi). TŁO [0002] Aneuploidia chromosomów u płodu wynika z obecności nieprawidłowej dawki (dawek) chromosomu lub regionu chromosomowego. Nieprawidłowa dawka (dawki) może być nieprawidłowo wysoka, np. obecność dodatkowego chromosomu 21 lub regionu chromosomowego w trisomii 21; lub nieprawidłowo niska, np. brak kopii chromosomu X w zespole Turnera. [0003] Typowe prenatalne metody diagnostyczne aneuploidii chromosomów u płodu np. trisomii 21 obejmują badanie materiałów płodu inwazyjnymi procedurami, takimi jak aminocenteza lub biopsja kosmówki, które niosą określone ryzyko utraty płodu. Nieinwazyjne procedury, takie jak przesiewowe badanie USG i użycie markerów biochemicznych są stosowane do stratyfikacji ryzyka ciężarnych kobiet przed ostatecznymi inwazyjnymi procedurami diagnostycznymi. Zazwyczaj przesiewowe metody mierzą jednak epifenomeny powiązane z aneuploidią chromosomów, np. trisomię 21 zamiast głównej nieprawidłowości chromosomalnej i w związku z tym mają suboptymalną dokładność diagnostyczną oraz inne wady, takie jak wysoka zależność od wieku ciąży. [0004] Odkrycie w 1997 r. pozakomórkowego DNA płodu krążącego w osoczu matki dało nowe możliwości nieinwazyjnej diagnozy prenatalnej (YMD Lo i RWK Chiu 2007 Nat Rev Genet 8, 71-77). Pomimo, że sposób ten sprawnie zastosowano do prenatalnej diagnozy zaburzeń genów determinujących płeć (JM Costa i wsp N Engl Med. 346, 1502) i niektórych zaburzeń pojedynczego genu (YMD Lo i wsp N Engl Med. 339, ), jego zastosowanie do prenatalnej detekcji aneuploidii chromosomów u płodu stanowi duże wyzwanie (YMD Lo i RWK Chiu 2007, patrz wyżej). Po pierwsze kwasy nukleinowe płodu współistnieją w osoczu matki z wysokim tłem kwasów nukleinowych pochodzenia matczynego, które często mogą zakłócać analizę kwasów nukleinowych płodu (YMD Lo i wsp Am J Hum Genet 62, ). Ponadto kwasy nukleinowe płodu krążą w osoczu matki przeważnie w postaci pozakomórkowej, utrudniając otrzymanie informacji o dawce genów lub chromosomów w genomie płodu. [0005] W ostatnim czasie dokonano znaczących postępów pokonujących te wyzwania (A Benachi i JM Costa 2007 Lancet 369, ). Jedno podejście wykrywa kwasy nukleinowe specyficzne dla płodu w osoczu matki, pokonując tym samym problem interferencji z tłem matki (YMD Lo i RWK Chiu 2007, patrz powyżej). Dawkę chromosomu 21 wywnioskowano ze współczynników polimorficznych alleli w molekułach DNA/RNA pochodzących z łożyska. Gdy próbki zawierają mniejszą ilość docelowego kwasu nukleinowego, sposób ten jest

3 2 jednak mniej dokładny i może być stosowany tylko do płodów, które są heterozygotyczne dla docelowego polimorfizmu, co jest tylko podzestawem populacji, jeśli używany jest jeden polimorfizm. [0006] Dhallan i wsp. (R. Dhallan i wsp. 2007, patrz wyżej, R. Dhallan i wsp Lancet 369, ) opisali alternatywną strategię wzbogacenia udziału krążącego DNA płodu poprzez dodanie formaldehydu do osocza matki. Udział sekwencji chromosomu 21 wniesiony przez płód do osocza matki określono poprzez ocenienie współczynnika alelli specyficznych dla płodu oddziedziczonych od ojca do alleli niespecyficznych dla płodu dla polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) na chromosomie 21. Współczynniki SNP zostały podobnie obliczone dla chromosomu referencyjnego. Następnie wywnioskowano nierównowagę chromosomu 21 u płodu poprzez wykrycie statystycznie istotnej różnicy pomiędzy współczynnikami SNP dla chromosomu 21 i tymi dla chromosomu referencyjnego, gdzie istotność jest definiowana przy użyciu stałej wartości p 0,05. Aby zapewnić pokrycie dużej części populacji, na chromosom wyznaczono ponad 500 SNP. Toczą się jednak spory w związku ze skutecznością wzbogacania DNA płodu przez formaldehyd dla otrzymania dużego udziału (GTY Chung i wsp Clin Chem 51, ), a tym samym odtwarzalność sposobu należy poddać dalszej ocenie. Również, ponieważ każdy płód i matka będą zawierać informacje dla różnej ilości SNP dla każdego chromosomu, moc testu statystycznego dla porównania współczynnika SNP będzie różna dla każdego przypadku (YMD Lo i RWK Chiu, 2007 Lancet 369, 1997). Ponadto, ponieważ podejścia te zależą od detekcji genetycznego polimorfizmu, ograniczają się do płodów heterozygotycznych dla tych polimorfizmów. [0007] Korzystając z reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i kwantyfikacji DNA locus chromosomu 21 i locus referencyjnego w kulturach aminocytów otrzymanych z płodów z trisomią 21 i euploidalnych Zimmermann i wsp. (2002 Clin Chem 48, ) byli w stanie rozróżnić dwie grupy płodów w oparciu o 1,5-krotny wzrost w sekwencjach DNA chromosomu 21 u pierwszej grupy. Ponieważ 2-krotna różnica w stężeniu szablonu DNA stanowi różnicę tylko jednego cyklu progowego (Ct), rozróżnienie 1,5-krotnej różnicy stanowi ograniczenie typowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Do otrzymania lepszych stopni rozróżnienia ilościowego potrzebne są alternatywne strategie. [0008] Opracowano cyfrowy PCR do detekcji odchyleń współczynnika alleli w próbkach kwasu nukleinowego (HW Chang i wsp J Natl Cancer Inst 94, ). Cyfrowy PCR jest techniką analizy kwasu nukleinowego opartą na amplifikacji, która wymaga rozprowadzenia próbki zawierającej kwasy nukleinowe do wielu pojedynczych próbek, gdzie każda próbka zawiera średnio nie więcej niż około jedną docelową sekwencję na próbkę. Specyficzne docelowe kwasy nukleinowe są amplifikowane primerami specyficznymi dla sekwencji do wygenerowania specyficznych amplikonów przez cyfrowy PCR. Docelowe loci kwasu nukleinowego i gatunki lub panel primerów specyficznych dla sekwencji do włączenia do reakcji są określane lub wybierane przed analizą kwasu nukleinowego. [0009] Klinicznie wykazano jego przydatność do detekcji utraty heterozygotyczności (LOH) w próbkach DNA guza (W. Zhou wsp Lancet 359, ). Do analizy wyników cyfrowego PCR sekwencyjne testy ilorazu prawdopodobieństwa (SPRT) zastosowano do wcze-

4 3 śniejszych badań dla sklasyfikowania wyników doświadczenia jako sugerujących obecność LOH w próbce lub jej brak (El Karoui i wsp Stat Med. 25, ). [0010] W sposobach użytych we wcześniejszych badaniach ilość danych zgromadzonych z cyfrowego PCR jest dosyć mała. W związku z tym dokładność może być ograniczona ze względu na małą liczbę punktów danych i typowe fluktuacje statystyczne. [0011] W związku z tym pożądana jest wysoka czułość i swoistość nieinwazyjnych testów dla zminimalizowania odpowiednio fałszywych wyników ujemnych i fałszywych wyników dodatnich. DNA płodu jest jednak obecne w niskim bezwzględnym stężeniu i reprezentuje małą część wszystkich sekwencji DNA w osoczu i surowicy matki. Dlatego też pożądane są również sposoby umożliwiające nieinwazyjną detekcję aneuploidii chromosomów u płodu poprzez maksymalizację ilości informacji genetycznych, które można wywnioskować z ograniczonej ilości kwasów nukleinowych płodu, które występują jako mała populacja w próbce biologicznej zawierającej kwasy nukleinowe pochodzenia matczynego. STRESZCZENIE [0012] Wynalazek zapewnia sposoby określania, czy nierównowaga sekwencji kwasu nukleinowego (np. nierównowaga chromosomów) istnieje w próbce biologicznej otrzymanej od ciężarnej kobiety. Określenie to można wykonać z wykorzystaniem parametru ilości kliniczne istotnego regionu chromosomowego w stosunku do innych regionów chromosomowych nieistotnych klinicznie (regiony tła) w próbce biologicznej. Zapewniany jest również czytelny dla komputera nośnik zakodowany wieloma instrukcjami sterującymi systemem komputerowym do realizowania tych sposobów. W jednym aspekcie, ilość chromosomów określana jest z sekwencjonowania molekuł kwasu nukleinowego w próbce matczynej, takiej jak mocz, osocze, surowica i innych stosownych próbkach biologicznych. Molekuły kwasu nukleinowego próbki biologicznej są losowo sekwencjonowane tak, że sekwencjonowana jest frakcja genomu. Wybierana jest jedna lub więcej wartości granicznych do określenia, czy zmiana występuje w porównaniu z ilością referencyjną (tj. nierównowaga), na przykład w odniesieniu do współczynnika ilości dwóch regionów chromosomowych (lub zestawów regionów). [0013] Według wynalazku biologiczna próbka otrzymana od ciężarnej kobiety noszącej płód jest analizowana do przeprowadzenia prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu. Próbka biologiczna obejmuje pozakomórkowe molekuły kwasu nukleinowego. Część wielu molekuł kwasu nukleinowego zawartych w próbce biologicznej jest losowo sekwencjonowana. W jednym aspekcie, ilość otrzymanych informacji genetycznych jest wystarczająca do dokładnej diagnozy, jednak nie jest nadmierna dla ograniczenia kosztów i ilości wymaganej wejściowej próbki biologicznej. Wstępnie określona liczba sekwencji jest otrzymywana z losowego sekwencjonowania, a każda sekwencja zostaje dopasowana przez system komputerowy do ludzkiego genomu. [0014] Określana jest pierwsza ilość sekwencji zidentyfikowana jako dopasowana do pierwszego chromosomu i druga ilość sekwencji zidentyfikowana jako dopasowana do jednego lub więcej drugich chromosomów. Określany jest parametr z pierwszej i drugiej ilości, gdzie parametr reprezentuje względną ilość pomiędzy pierwszą a drugą ilością, a następnie jest po-

5 4 równywany z jedną lub więcej wartościami granicznymi. W oparciu o porównanie określana jest klasyfikacja, czy u płodu aneuploidia chromosomów występuje dla pierwszego chromosomu. Sekwencjonowanie korzystnie maksymalizuje ilość informacji genetycznych, które można wywnioskować z ograniczonej ilości kwasów nukleinowych płodu, które występują jako mała populacja w próbce biologicznej zawierającej kwasy nukleinowe pochodzenia matczynego. [0015] Według jednego przykładowego wykonania próbka biologiczna otrzymana od ciężarnej kobiety jest analizowana do przeprowadzenia prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu. Próbka biologiczna zawiera molekuły kwasu nukleinowego. Identyfikowany jest udział procentowy DNA płodu w próbce biologicznej. Liczba N sekwencji do przeanalizowania w oparciu o pożądaną dokładność obliczana jest w oparciu o udział procentowy. Co najmniej N molekuł kwasu nukleinowego zawartych w próbce biologicznej jest losowo sekwencjonowanych. [0016] Inne wykonania wynalazku są skierowane na czytelny dla komputera nośnik związany z opisanymi tutaj sposobami. [0017] Naturę i korzyści wynalazku można lepiej zrozumieć w odniesieniu do następującego szczegółowego opisu i załączonych rysunków. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0018] FIG. 1 jest diagramem blokowym sposobu 100 do przeprowadzania prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu w próbce biologicznej otrzymanej od ciężarnej kobiety. [0019] FIG. 2 jest diagramem blokowym sposobu 200 do przeprowadzania prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu z wykorzystaniem losowego sekwencjonowania według wynalazku. [0020] FIG. 3A przedstawia wykres reprezentacji procentowej sekwencji chromosomu 21 w próbkach matczynego osocza dotyczących płodów z trisomią 21 lub euploidalnych według wykonania wynalazku. [0021] FIG. 3B przedstawia korelację pomiędzy frakcyjnymi stężeniami DNA płodu w osoczu matki określonymi przez masywnie równoległe sekwencjonowanie i cyfrowy PCR w mikropłynach według wykonania wynalazku. [0022] FIG. 4A przedstawia wykres reprezentacji procentowej dopasowanych sekwencji na chromosom według wykonania wynalazku. [0023] FIG. 4B przedstawia wykres różnicy (%) w reprezentacji procentowej na chromosom pomiędzy przypadkiem trisomii 21 a przypadkiem euploidu przedstawionej na FIG. 4A. [0024] FIG. 5 przestawia korelację pomiędzy stopniem nadreprezentacji w sekwencjach chromosomu 21 a frakcyjnymi stężeniami DNA płodu w matczynym osoczu dotyczącym płodów z trisomią 21 według wykonania wynalazku.

6 5 [0025] FIG. 6 przedstawia tabelę części ludzkiego genomu, którą przeanalizowano według wykonania wynalazku. T21 oznacza próbkę otrzymaną od ciężarnej kobiety noszącej płód z trisomią 21. [0026] FIG. 7 przedstawia tabelę wielu sekwencji wymaganych do rozróżnienia płodów euploidalnych od płodów z trisomią 21 według wykonania wynalazku. [0027] FIG. 8A przedstawia tabelę pierwszych dziesięciu położeń początkowych znaczników sekwencji dopasowanych do chromosomu 21 według wykonania wynalazku. [0028] FIG. 8B przedstawia tabelę pierwszych dziesięciu położeń początkowych znaczników sekwencji dopasowanych do chromosomu 22 według wykonania wynalazku. [0029] FIG. 9 przedstawia schemat blokowy przykładowego aparatu komputera stosowanego z systemem i sposobami według wykonania wynalazku. DEFINICJE [0030] W zastosowaniu pojęcie próbka biologiczna odnosi się do każdej próbki pobieranej od osobnika (np. człowieka, takiego jak ciężarna kobieta) i zawierającej jedną lub więcej molekuł kwasu nukleinowego stanowiącego punkt zainteresowania. [0031] Pojęcie kwas nukleinowy lub polinukleotydy odnosi się do kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) lub kwasu rybonukleinowego (RNA) i ich polimerów w jednoniciowej lub dwuniciowej postaci. O ile nie zostanie szczegółowo ograniczone, pojęcie obejmuje kwasy nukleinowe zawierające znane analogi naturalnych nukleotydów, które mają podobne co referencyjny kwas nukleinowy właściwości wiążące, i są metabolizowane podobnie do naturalnie występujących nukleotydów. O ile nie zostanie wskazane inaczej, określona sekwencja kwasu nukleinowego również bezwzględnie obejmuje ich typowo zmodyfikowane warianty (np. substytucje zdegenerowanego kodonu), allele, ortologi, SNP i komplementarne sekwencje, jak również wyraźnie wskazaną sekwencję. Szczególnie substytucje zdegenerowanego kodonu można otrzymać, generując sekwencje, w których trzecie położenie jednego lub więcej wybranych (lub wszystkich) kodonów jest zastąpione mieszaną zasadą i/lub resztą deoksyinozyny (Batzer i wsp. Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Phtsuka i wsp. J.Biol. Chem. 260: (1985); i Rossolini i wsp. Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Pojęcie kwas nukleinowy używane jest zamiennie z genem, cdna, mrna, małym niekodującym RNA, mikro RNA (mirna), RNA oddziałującym z białkami Piwi (pirna) i krótkim RNA o strukturze szpilki do włosów (shrna) kodowanym przez gen lub locus. [0032] Pojęcie gen oznacza segment DNA uczestniczący w tworzeniu łańcucha polipeptydowego. Może obejmować regiony występujące przed i za regionem kodującym (leader i trailer), jak również sekwencje interweniujące (introny) pomiędzy poszczególnymi segmentami kodującymi (eksonami). [0033] W zastosowaniu pojęcie reakcja odnosi się do każdego procesu obejmującego chemiczne, enzymatyczne lub fizyczne działanie, które wskazuje obecność lub brak określonej sekwencji polinukleotydu stanowiącej punkt zainteresowania. Przykładem reakcji jest reakcja amplifikacji, taka jak reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR). Innym przykładem reak-

7 6 cji jest reakcja sekwencjonowania poprzez syntezę lub ligację. Informacyjna reakcja jest reakcją wskazującą obecność jednej lub więcej określonych sekwencji polinukelotydu stanowiących punkt zainteresowania i w jednym przypadku, gdzie obecna jest tylko jedna sekwencja stanowiąca punkt zainteresowania. W zastosowaniu pojęcie studzienka odnosi się do reakcji we wstępnie określonej lokalizacji w ograniczonej strukturze np. w fiolce w kształcie studzienki, kuwecie lub komorze w matrycy PCR. [0034] W zastosowaniu pojęcie klinicznie istotna sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji polinukleotydu odpowiadającej segmentowi większej genomowej sekwencji, której potencjalna nierównowaga jest badana lub samej większej genomowej sekwencji. Jednym z przykładów jest sekwencja chromosomu 21. Inne przykłady obejmują chromosom 18, 13, X i Y. Jeszcze inne przykłady obejmują zmutowane sekwencje genetyczne, genetyczne polimorfizmy lub zmienność liczby kopii, które płody mogą odziedziczyć od jednego lub obojga rodziców. Jeszcze inne przykłady obejmują sekwencje, które są zmutowane, usunięte lub amplifikowane w guzie złośliwym, np. sekwencje, w których występuje utrata heterozygotyczności lub duplikacja genu. W niektórych wykonaniach wiele kliniczne istotnych sekwencji kwasu nukleinowego lub równoważnie wiele markerów klinicznie istotnej sekwencji kwasu nukleinowego można użyć do zapewnienia danych do detekcji nierównowagi. Na przykład dane z pięciu nie-kolejnych sekwencji na chromosomie 21 można użyć dodatkowo do określenia potencjalnej nierównowagi chromosomu 21, skutecznie zmniejszając objętość próbki do 1/5. [0035] W zastosowaniu pojęcie sekwencja kwasu nukleinowego tła odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego, dla której znany jest typowy stosunek do klinicznie istotnej sekwencji kwasu nukleinowego, na przykład stosunek 1 do 1. Dla przykładu sekwencja kwasu nukleinowego tła i klinicznie istotna sekwencja kwasu nukleinowego są dwoma allelami tego samego chromosomu, które różnią się heterozygotycznością. W innym przykładzie sekwencja kwasu nukleinowego tła jest jednym allelem, który jest heterozygotyczny w stosunku do drugiego allela, który jest klinicznie istotną sekwencją kwasu nukleinowego. Ponadto niektóre z sekwencji kwasów nukleinowych tła i klinicznie istotnych sekwencji kwasu nukleinowego mogą pochodzić od różnych osobników. [0036] W zastosowaniu pojęcie referencyjna sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego, której średnie stężenie na reakcję jest znane lub zostało równoważnie zmierzone. [0037] W zastosowaniu pojęcie nadreprezentowana sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego pomiędzy dwoma sekwencjami zainteresowania (np. klinicznie istotną sekwencją i sekwencją tła), która w próbce biologicznej jest w większej ilości niż druga sekwencja. [0038] W zastosowaniu pojęcie w oparciu o oznacza w oparciu przynajmniej częściowo o i odnosi się do jednej wartości (lub wyniku) używanego do określenia innej wartości, co występuje w powiązaniu wartości wejściowej sposobu i wyniku tego sposobu. W zastosowaniu

8 7 pojęcie pochodzi również odnosi się do powiązania wartości wejściowej sposobu i wyniku tego sposobu, co występuje, gdy ze wzoru obliczana jest pochodność. [0039] W zastosowaniu pojęcie ilościowe dane oznacza dane otrzymywane z jednej lub więcej reakcji i, które zapewniają jedną lub więcej wartości liczbowych. Na przykład liczba studzienek wykazujących znacznik fluoroscencyjny dla danej sekwencji będzie daną ilościową. [0040] W zastosowaniu pojęcie parametr oznacza wartość liczbową, która charakteryzuje zestaw danych liczbowych i/lub liczbowe powiązanie pomiędzy zestawami danych liczbowych. Na przykład parametrem jest stosunek (lub funkcja stosunku) pomiędzy pierwszą ilością pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego i drugą ilością drugiej sekwencji kwasu nukleinowego. [0041] W zastosowaniu pojęcie wartość graniczna oznacza wartość liczbową, której wartość używana jest do rozstrzygania pomiędzy dwoma lub więcej stanami (np. chorobowym i niechorobowym) klasyfikacji dla próbki biologicznej. Na przykład, jeśli parametr jest większy niż wartość graniczna, przeprowadzana jest pierwsza klasyfikacja danych ilościowych (np. stan chorobowy); lub jeśli parametr jest mniejszy niż wartość graniczna, przeprowadzana jest inna klasyfikacja danych liczbowych (np. stan niechorobowy). [0042] W zastosowaniu pojęcie nierównowaga oznacza każde znaczące odchylenie zdefiniowane co najmniej przez jedną wartość graniczną w ilości klinicznie istotnej sekwencji kwasu nukleinowego z referencyjnej ilości. Na przykład ilość referencyjna może być stosunkiem 3/5, a tym samym nierównowaga wystąpi, jeśli zmierzony stosunek będzie wynosił 1:1. [0043] W zastosowaniu pojęcie aneuploidia chromosomów oznacza zmianę w ilości chromosomów od tej z genomu diploidu. Zmiana może być zwiększeniem lub zmniejszeniem. Może obejmować cały jeden chromosom lub regionu chromosomu. [0044] W zastosowaniu pojęcie losowe sekwencjonowanie odnosi się do sekwencjonowania, w którym sekwencjonowane fragmenty kwasu nukleinowego nie zostały szczególnie zidentyfikowane ani wyznaczane przed procedurą sekwencjonowania. Primery specyficzne dla sekwencji do wyznaczania specyficznych loci genów nie są wymagane. Pule sekwencjonowanych kwasów nukleinowych różnią się pomiędzy próbkami, a nawet pomiędzy analizami dla jednej próbki. Tożsamości sekwencjonowanych kwasów nukleinowych ujawniane są jedynie z wygenerowanego wyniku sekwencjonowania. W niektórych wykonaniach wynalazku losowe sekwencjonowanie można poprzedzić procedurami do wzbogacenia próbki biologicznej o określone populacje molekuł kwasu nukleinowego dzielących niektóre wspólne właściwości. W jednym przykładzie wykonania każdy z fragmentów w próbce biologicznej ma jednakowe prawdopodobieństwo sekwencjonowania. [0045] W zastosowaniu pojęcie frakcja genomu ludzkiego lub część genomu ludzkiego odnosi się do mniej niż 100% sekwencji nukleotydu w ludzkim genomie, który zawiera około 3 miliardy par zasad nukleotydów. W kontekście sekwencjonowania odnosi się do mniej niż 1-krotnego pokrycia sekwencji nukleotydu w ludzkim genomie. Pojęcie to można wyrazić jako udział procentowy lub wartość bezwzględna nukleotydów/par zasad. Dla przykładu po-

9 8 jęcie to może zostać użyte do odniesienia się do rzeczywistej ilości wykonanego sekwencjonowania. Wykonania mogą określać wymaganą minimalną wartość dla sekwencjonowanej frakcji ludzkiego genomu do otrzymania dokładnej diagnozy. Jako inny przykład użycia pojęcie to może odnosić się do ilości sekwencjonowanych danych używanych do otrzymania parametru lub ilości dla klasyfikacji choroby. [0046] W zastosowaniu znacznik sekwencji odnosi się do łańcucha nukleotydów sekwencjonowanych z dowolnej części lub wszystkich molekuł kwasu nukleinowego. Na przykład znacznik sekwencji może być krótkim łańcuchem nukleotydów sekwencjonowanych z fragmentu kwasu nukleinowego, krótkim łańcuchem nukleotydów na obu końcach fragmentu kwasu nukleinowego lub sekwencjonowaniem całego fragmentu kwasu nukleinowego, który istnieje w próbce biologicznej. Fragment kwasu nukleinowego jest dowolną częścią większej molekuły kwasu nukleinowego. Fragment (np. gen) może występować osobno (tj. nie jest połączony) od innych części większej molekuły kwasu nukleinowego. SZCZEGÓŁOWY OPIS [0047] Wynalazek zapewnia sposoby określania występowania zwiększenia lub zmniejszenia (stan chorobowy) klinicznie istotnego regionu chromosomowego w porównaniu ze stanem niechorobowym. Zapewniany jest również czytelny dla komputera nośnik zakodowany wieloma instrukcjami sterującymi systemem komputerowym do realizowania tych sposobów. Określenie to można wykonać z wykorzystaniem parametru pierwszej ilości sekwencji zidentyfikowanych jako dopasowane do klinicznie istotnego regionu chromosomowego w stosunku do drugiej ilości sekwencji zidentyfikowanych jako dopasowane do innych regionów chromosomowych nieistotnych klinicznie (regiony tła) w próbce biologicznej, gdzie parametr reprezentuje względną ilość pomiędzy pierwszą a drugą ilością. Molekuły kwasu nukleinowego próbki biologicznej są losowo sekwencjonowane tak, że sekwencjonowana jest frakcja genomu, a pierwsza i druga ilość są określane z wyników sekwencjonowania. Wybierana jest jedna lub więcej wartości granicznych do określenia występowania zmiany w porównaniu do ilości referencyjnej (tj. nierównowaga), na przykład odnośnie stosunku ilości dwóch regionów chromosomowych (lub zestawów regionów). [0048] Zmiana wykryta w ilości referencyjnej może być odchyleniem (w górę lub w dół) w powiązaniu klinicznie istotnej sekwencji kwasu nukleinowego z innymi sekwencjami nieistotnymi klinicznie. W związku z tym stan referencyjny może być stosunkiem lub inną ilością (np. inną niż zgodność 1-1), a zmierzony stan oznaczający zmianę może być stosunkiem lub inną ilością, która różni się od ilości referencyjnej określonej przez jedną lub więcej wartości granicznych. [0049] Klinicznie istotny region chromosomowy (zwany również klinicznie istotną sekwencją kwasu nukleinowego) i sekwencja kwasu nukleinowego tła mogą pochodzić z pierwszego rodzaju komórek i z jednego lub więcej rodzajów drugich rodzajów komórek. Na przykład sekwencje kwasu nukleinowego płodu pochodzące z komórek płodu/łożyska są obecne w próbce biologicznej, takiej jak osocze matczyne, która zawiera tło matczynych sekwencji kwasu nukleinowego pochodzących z komórek matczynych. W jednym przykładzie wykona-

10 9 nia wartość graniczna jest określana przynajmniej częściowo na podstawie udziału procentowego pierwszego rodzaju komórek w próbce biologicznej. Należy zauważyć, że udział procentowy sekwencji płodu w próbce można określić poprzez loci pochodzące z płodu, a nie tylko mierząc klinicznie istotne sekwencje kwasu nukleinowego. Jak również opisano, wartość graniczną można określić przynajmniej częściowo na podstawie udziału procentowego sekwencji guza w próbce biologicznej, takiej jak osocze, surowica, ślina lub mocz, które zawierają tło sekwencji kwasu nukleinowego otrzymanych z niezłośliwych komórek w organizmie. I. SPOSÓB OGÓLNY [0050] Wynalazek zapewnia sposób przeprowadzania prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu w próbce biologicznej otrzymanej od ciężarnej kobiety. [0051] Otrzymywana jest próbka biologiczna od ciężarnej kobiety. Próbka biologiczna może być osoczem, moczem, surowicą lub dowolną inną stosowną próbką. Próbka zawiera molekuły kwasu nukleinowego od płodu i od ciężarnej kobiety. Na przykład molekuły kwasu nukleinowego mogą być fragmentami z chromosomów. [0052] Przynajmniej część wielu molekuł kwasu nukleinowego zawartego w próbce biologicznej jest losowo sekwencjonowana do otrzymania wstępnie określonej liczby sekwencji. Sekwencjonowana część reprezentuje frakcję ludzkiego genomu. W jednym przykładzie wykonania molekuły kwasu nukleinowego są fragmentami odpowiednich chromosomów. Sekwencjonować można jeden koniec (np. 35 par zasad (bp)), obydwa końce lub cały fragment. Sekwencjonować można podzestaw molekuł kwasu nukleinowego w próbce, który to podzestaw jest losowo wybierany i zostanie bardziej szczegółowo opisany w dalszej części. [0053] W jednym przykładzie wykonania losowe sekwencjonowanie jest przeprowadzane z wykorzystaniem masywnie równoległego sekwencjonowania. Masywnie równoległe sekwencjonowanie, takie jak otrzymywane na platformie 454 (Roche) (M. Margulies i wsp Nature 437, ), w analizatorze genomu Genome Analyzer Illumina (lub platformie Solexa), systemie SOLiD (Applied Biosystems), w technologii sekwencjonowania True Single Molecule DNA Helicos (TD Harris i wsp Science, 320, ), w technologii single molecule real-time (SMRT TM ) Pacific Biosciences i sekwencjonowanie przez nanopory (GV Soni i A. Meller 2007 Clin Chem 53: ) umożliwia równoległe sekwencjonowanie wielu molekuł kwasu nukleinowego wyizolowanych z próbki przy wysokich rzędach multipleksowania (Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003;1: ). Każda z tych platform sekwencjonuje klonalnie rozrośnięte lub nawet nieamplifikowane pojedyncze molekuły fragmentów kwasu nukleinowego. [0054] Ponieważ duża ilość odczytów sekwencjonowania, rzędu setek tysięcy do milionów, a nawet setek milionów lub miliardów, jest generowana z każdej próbki w każdym przebiegu, otrzymane odczyty sekwencjonowania tworzą reprezentacyjny profil mieszaniny gatunków kwasu nukleinowego w pierwotnej próbce. Na przykład profile haplotypu, transkryptomu i metylacji sekwencjonowanych odczytów przypominają te z pierwotnej próbki (Brenner i wsp. Nat Biotech 2000; 18: ; Taylor i wsp. Cancer Res 2007; 67: ). Ze względu

11 10 na duże próbkowanie sekwencji z każdej próbki, wiele identycznych sekwencji, takich jak te wygenerowane z sekwencjonowania puli kwasu nukleinowego przy wielu krotnościach pokrycia lub dużej redundancji również stanowi dobrą reprezentację ilościową wyniku poszczególnych gatunków kwasu nukleinowego lub locus w pierwotnej próbce. [0055] W oparciu o sekwencjonowanie (np. dane z sekwencjonowania) określana jest pierwsza ilość pierwszego chromosomu (np. klinicznie istotnego chromosomu). Pierwsza ilość określana jest z sekwencji zidentyfikowanych jako pochodzące z pierwszego chromosomu, tj. dopasowane do niego. Na przykład procedura bioinformatyczna można zostać następnie użyta do zlokalizowania każdej z tych sekwencji DNA do genomu ludzkiego. Może się zdarzyć, że część tych sekwencji zostanie odrzucona z kolejnej analizy, ponieważ występują one w regionach powtórzeń genomu ludzkiego lub w regionach poddawanych wewnątrz-osobniczym zmiennościom, np. zmienność liczby kopii. W związku z tym należy określić ilość chromosomów zainteresowania i jeden lub więcej innych chromosomów. [0056] W oparciu o sekwencjonowanie druga ilość jednego lub więcej chromosomów jest określana z sekwencji zidentyfikowanych jako pochodzące z jednego z drugich chromosomu, tj. dopasowane do niego. W tym przykładzie wykonania drugie chromosomy są wszystkimi innymi chromosomami z wyjątkiem pierwszego (tj. tego badanego). W innym przykładzie wykonania drugi chromosom jest tylko pojedynczym, innym chromosomem. [0057] Dostępnych jest wiele możliwości określania liczby chromosomów, w tym między innymi zliczanie liczby znaczników sekwencji, liczby sekwencjonowanych nukleotydów (par zasad) lub zakumulowanej długości sekwencjonowanych nukleotydów (par zasad) pochodzących z określonego chromosomu(ów) lub regionów chromosomowych. [0058] W innym przykładzie wykonania na wyniki sekwencjonowania można nałożyć reguły dla określenia tego, co jest zliczane. W jednym aspekcie, ilość można otrzymać w oparciu o udział sekwencjonowanego wyniku. Na przykład wynik sekwencjonowania odpowiadający fragmentom kwasu nukleinowego o określonym zakresie rozmiaru może zostać wybrany po analizie bioinformatycznej. Przykładami zakresów rozmiaru są w przybliżeniu < 300 bp, < 200 bp lub < 100 bp. [0059] Określany jest parametr z pierwszej i drugiej ilości, gdzie parametr reprezentuje względną ilość pomiędzy pierwszą a drugą ilością. Parametr może być na przykład prostym stosunkiem pierwszej ilości do drugiej lub pierwszej ilości do drugiej ilości powiększonej o pierwszą ilość. W jednym aspekcie, każda ilość może być zmienną niezależną funkcji lub osobnych funkcji, gdzie stosunek może być otrzymywany z tych osobnych funkcji. Znawca doceni ilość różnych odpowiednich parametrów. [0060] W jednym przykładzie wykonania parametr (np. reprezentacja frakcyjna) chromosomu potencjalnie zaangażowanego w aneuploidię chromosomów, np. chromosomu 21, chromosomu 18 lub chromosomu 13 może zostać następnie obliczony z wyników procedury bioinformatycznej. Reprezentację frakcyjną można otrzymać w oparciu o ilość wszystkich sekwencji (np. niektóre miary wszystkich chromosomów, w tym klinicznie istotnego chromosomu) lub określony zestaw chromosomu (np. tylko jeden inny chromosom niż ten badany).

12 11 [0061] Parametr porównywany jest z jedną lub więcej wartościami granicznymi. Wartości graniczne można określić na wiele odpowiednich możliwości. Możliwości te obejmują algorytm prawdopodobieństwa Bayesa, sekwencyjne testy ilorazu prawdopodobieństwa (SPRT), wyniki fałszywie dodatnie, przedział ufności, charakterystyki operacyjne odbiornika (ROC). Przykłady zastosowań tych sposobów i sposobów odnoszących się do próbek opisano w równolegle składanym zgłoszeniu OKREŚLANIE NIERÓWNOWAGI SEKWENCJI KWASU NUKLEINOWEGO PCT/GB2008/ [0062] W jednym przykładzie wykonania parametr (np. frakcyjna reprezentacja klinicznie istotnego chromosomu) jest następnie porównywany z referencyjnym zakresem określonym przy ciążach z normalnym (tj. euploidalnym) płodem. W niektórych wariantach procedury można zmodyfikować zakres referencyjny (tj. wartości graniczne) według frakcyjnego stężenia DNA płodu (f) w określonej próbce osocza matczynego. Wartość f można określić z zestawu danych sekwencjonowania, tj. z wykorzystaniem sekwencji mapowanych do chromosomu Y, jeśli płód jest męski. Wartość f można również określić w osobnej analizie, np. wykorzystując markery epigenetyczne płodu (KCA Chan i wsp Clin Chem 52, ) lub z analizy polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. [0063] W oparciu o porównanie ustalana jest klasyfikacja, czy u płodu występuje aneuploidia chromosomów dla pierwszego chromosomu. W jednym przykładzie wykonania klasyfikacja jest definitywnym tak lub nie. W innym przykładzie wykonania wynik może być nieklasyfikowany lub niepewny. W jeszcze innym przykładzie wykonania klasyfikacja może być wynikiem do interpretacji w późniejszym czasie, na przykład przez lekarza. II. SEKWENCJONOWANIE, DOPASOWANIE I OKREŚLANIE ILOŚCI [0064] Jak wspomniano powyżej, sekwencjonowana jest tylko frakcja genomu. W jednym aspekcie, nawet jeśli pula kwasów nukleinowych w próbce jest sekwencjonowana przy pokryciu genomowym <100% zamiast pokryciu wielu krotności i pośród udziału otrzymanych molekuł kwasu nukleinowego, większość z gatunków kwasu nukleinowego jest sekwencjonowana tylko raz. Również nierównowagę dawki określonego chromosomu lub regionów chromosomowych można określić ilościowo. Innymi słowy nierównowaga dawki chromosomu lub regionów chromosomowych jest wnioskowana z reprezentacji procentowej locus pośród innych mapowanych znaczników sekwencji próbki. [0065] Różni się to od sytuacji, w których ta sama pula kwasów nukleinowych jest sekwencjonowana wiele razy do otrzymania wysokiej redundancji lub wielu krotności pokrycia, w wyniku czego każdy gatunek kwasu nukleinowego jest sekwencjonowany wiele razy. W takich sytuacjach ilość sekwencji określonego gatunku kwasu nukleinowego w stosunku do sekwencji innego gatunku kwasu nukleinowego skorelowana jest z ich względnym stężeniem w pierwotnej próbce. Koszt sekwencjonowania rośnie wraz z liczbą krotności pokrycia wymaganych do otrzymania dokładnej reprezentacji gatunków kwasu nukleinowego. [0066] W jednym przykładzie udział takich sekwencji będzie pochodził z chromosomu zaangażowanego w aneuploidię, takiego jak chromosom 21 w tym przykładzie. Jeszcze inne sekwencje z tego ćwiczenia sekwencjonowania będą pochodziły z innych chromosomów. Bio-

13 12 rąc pod uwagę względny rozmiar chromosomu 21 w porównaniu z innymi chromosomami, można otrzymać znormalizowaną częstotliwość w zakresie referencyjnym, sekwencji specyficznych dla chromosomu 21 z tego ćwiczenia sekwencjonowania. Jeśli u płodu występuje trisomia 21, znormalizowana częstotliwość sekwencji pochodzących z chromosomu 21 z takiego ćwiczenia sekwencjonowania wzrośnie, umożliwiając wykrycie trisomii 21. Stopień zmiany znormalizowanej częstotliwości będzie zależał od frakcyjnego stężenia kwasów nukleinowych płodu w analizowanej próbce. [0067] W jednym przykładzie wykonania używany jest analizator genomu Genome Analyzer Illumina dla jednostronnego sekwencjonowania ludzkiego DNA genomowego i próbek DNA ludzkiego osocza. Analizator genomu Genome Analyzer sekwencjonuje klonalnie rozrośnięte pojedyncze molekuły DNA otrzymane na stałej powierzchni zwanej kuwetą przepływową. Każda kuweta przepływowa ma 8 torów do sekwencjonowania 8 poszczególnych próbek lub puli próbek. Każdy tor może wygenerować ~ 200 Mb sekwencji, co stanowi jedynie frakcję 3 miliardów par zasad sekwencji w genomie ludzkim. Każdą próbkę genomowego DNA lub DNA osocza sekwencjonowano z wykorzystaniem toru kuwety przepływowej. Wygenerowane krótkie znaczniki sekwencji dopasowano do sekwencji ludzkiego genomu referencyjnego, a pochodzenie chromosomu zanotowano. Całkowitą liczbę poszczególnych znaczników sekwencji dopasowanych do każdego chromosomu podano w tabeli i porównywano ze względnym rozmiarem każdego chromosomu oczekiwanym z referencyjnego ludzkiego genomu lub niechorobowych reprezentacyjnych próbek. Zidentyfikowano przyrosty lub ubytki chromosomu. [0068] Opisane podejście jest tylko jednym przykładem opisywanej strategii dawkowania genów/chromosomów. Alternatywnie przeprowadzić można sekwencjonowanie sparowanego końca. Zamiast porównywać długość sekwencjonowanych fragmentów z tą oczekiwaną w genomie referencyjnym, jak opisał to Campbell i wsp. (Nat Genet 2008; 40: ), zliczono liczbę dopasowanych znaczników sekwencji i posortowano je według położenia chromosomów. Przyrosty lub ubytki regionów chromosomowych lub całych chromosomów ustalono poprzez porównanie liczby znaczników z oczekiwanym rozmiarem chromosomu w referencyjnym genomie lub niechorobowej reprezentacyjnej próbce. Ponieważ sekwencjonowanie sparowanego końca umożliwia wywnioskowanie rozmiaru pierwotnego fragmentu kwasu nukleinowego, jednym przykładem jest skupienie się na zliczeniu liczby sparowanych znaczników sekwencji odpowiadających fragmentom kwasu nukleinowego określonego rozmiaru, takiego jak < 300 bp, < 200 bp lub < 100 bp. [0069] W innym przykładzie wykonania frakcja puli kwasu nukleinowego sekwencjonowanej w przebiegu jest dodatkowo wybierana przed sekwencjonowaniem. Na przykład techniki oparte na hybrydyzacji, takie jak matryca oligonukleotydowa może zostać użyta do pierwszego podwyboru dla sekwencji kwasu nukleinowego z określonych chromosomów, np. chromosomu potencjalnego aneuploidu oraz innego chromosomu(ów), który nie uczestniczy w badanej aneuploidii. Innym przykładem jest powybieranie z puli próbki lub wzbogacanie przed sekwencjonowaniem określonej podpopulacji sekwencji kwasu nukleinowego. Na przykład, jak omówiono powyżej, odnotowano, że molekuły DNA płodu w osoczu matczynym zawie-

14 13 rają krótsze fragmenty niż molekuły DNA pochodzenia matczynego (Chan i wsp. Clin Chem 2004;50: 88-92). W związku z tym można użyć jednej lub więcej sposobów znanych znawcom do frakcjonowania sekwencji kwasu nukleinowego w próbce według rozmiaru molekuły, np. poprzez elektroforezę w żelu, kolumny wykluczenia rozmiaru lub w podejściu opartym na mikropłynach. Jeszcze bardziej alternatywnie w przykładzie analizowania pozakomórkowego DNA płodu w osoczu matczynym część kwasu nukleinowego płodu można amplifikować sposobem tłumiącym tło matczyne, takim jak poprzez dodanie formaldehydu (Dhall i wsp. JAMA 2004; 291: 114-9). W jednym przykładzie wykonania część lub podzestaw wstępnie wybranej puli kwasów nukleinowych jest losowo sekwencjonowana. [0070] W zastosowaniu tym podobnie można użyć inne strategie sekwencjonowania pojedynczych molekuł, takie jak poprzez platformę Roche 454, platformę SOLiD Applied Biosystems, technologię sekwencjonowania True Single Molecule DNA Helicos, technologię single molecule real-time (SMRT TM ) Pacific Biosciences i sekwencjonowanie przez nanopory. III. OKREŚLANIE ILOŚCI CHROMOSOMÓW Z WYNIKU SEKWENCJONOWANIA [0071] Po masywnie równoległym sekwencjonowaniu przeprowadzono analizę bioinformatyczną do zlokalizowania pochodzenia chromosomowego znaczników sekwencji. Po tej procedurze znaczniki zidentyfikowane jako pochodzące z chromosomu potencjalnego aneuploidu, tj. chromosomu 21 w tym badaniu, są porównywane ilościowo ze wszystkimi znacznikami sekwencji lub znacznikami pochodzącymi z jednego lub więcej chromosomów, które nie dotyczą aneuploidii. Powiązanie pomiędzy wynikiem sekwencjonowania z chromosomu 21 oraz innych chromosomów różnych od chromosomu 21 dla badanej próbki jest porównywane z wartościami granicznymi otrzymanymi sposobami opisanymi w powyższej części do określenia, czy próbkę otrzymano od ciężarnej noszącej płód euploidalny lub z trisomią 21. [0072] Wiele różnych ilości obejmujących między innymi poniższe można otrzymać ze znaczników sekwencji. Na przykład liczbę znaczników sekwencji, tj. bezwzględny wynik dopasowany do określonego chromosomu można porównać z bezwzględnym wynikiem znaczników sekwencji dopasowanych do innych chromosomów. Alternatywnie frakcyjny wynik ilości znaczników sekwencji z chromosomu 21 w odniesieniu do wszystkich lub niektórych innych znaczników sekwencji można porównać z tym z innych chromosomów nie aneuploidu. Ponieważ w doświadczeniu sekwencjonowano 36 bp z każdego fragmentu DNA, liczbę nukleotydów sekwencjonowanych z określonego chromosomu można łatwo otrzymać z 36 bp pomnożonego przez wynik znaczników sekwencji. [0073] Ponadto, ponieważ każdą próbkę osocza matczynego sekwencjonowano jedynie z wykorzystaniem jednej kuwety przepływowej, która może sekwencjonować tylko frakcję ludzkiego genomu, statystycznie większość gatunków fragmentu DNA osocza matczynego była sekwencjonowana tylko do wygenerowania wyniku jednego znacznika sekwencji. Innymi słowy, fragmenty kwasu nukleinowego obecne w próbce osocza matczynego były sekwencjonowane przy pokryciu mniejszym niż 1-krotne. W związku z tym całkowita liczba sekwencjonowanych nukleotydów dla określonego chromosomu będzie głównie odpowiadać ilości, proporcji lub długości części sekwencjonowanego chromosomu. Dlatego też ilościowe

15 14 określenie reprezentacji chromosomu potencjalnego aneuploidu można otrzymać z frakcji liczby lub równoważnej długości nukleotydów sekwencjonowanych z chromosomu w odniesieniu do podobnie otrzymanej ilości z innych chromosomów. IV. WZBOGACENIE PULI KWASÓW NUKLEINOWYCH DO SEKWENCJONOWANIA [0074] Jak wspomniano powyżej i określono w poniższej części przykładów, tylko część ludzkiego genomu wymaga sekwencjonowania dla rozróżnienia przypadków trisomii 21 od przypadków euploidu. W związku z tym wzbogacenie puli kwasów nukleinowych do sekwencjonowania przed losowym sekwencjonowaniem frakcji wzbogaconej puli jest możliwe i ekonomiczne. Na przykład molekuły DNA płodu w osoczu matczynym zawierają krótsze fragmenty niż molekuły DNA pochodzenia matczynego (Chan i wsp. Clin Chem 2004; 50: 88-92). W związku z tym można użyć jednego lub więcej sposobów znanych znawcom do frakcjonowania sekwencji kwasu nukleinowego w próbce według rozmiaru molekuły, np. przez elektroforezę w żelu, kolumny wykluczenia rozmiaru lub przez podejście oparte na mikropłynach. [0075] Alternatywnie w przykładzie analizowania bezkomórkowego DNA płodu w osoczu matczynym, część kwasu nukleinowego płodu można jednak wzbogacić sposobem tłumiącym tło matczyne, takim jak dodanie formaldehydu (Dhallan i wsp. JAMA 2004; 291: ). Część sekwencji pochodzących od płodu zostanie wzbogacona w puli kwasu nukleinowego zawierającego krótsze fragmenty. Według FIG. 7 liczba znaczników sekwencji wymaganych do rozróżnienia przypadków euploidu od trisomii 21 będzie maleć wraz ze wzrostem frakcyjnego stężenia DNA płodu. [0076] Alternatywnie sekwencje pochodzące z chromosomu potencjalnego aneuploidu i jednego lub więcej chromosomów, które nie dotyczą aneuploidii, mogą zostać wzbogacone przez techniki hybrydyzacji, na przykład na mikromatrycach oligonukleotydowych. Wzbogacone pule kwasów nukleinowych zostaną następnie poddane losowemu sekwencjonowaniu. Umożliwi to zmniejszenie kosztów sekwencjonowania. V. LOSOWE SEKWENCJONOWANIE [0077] FIG. 2 przedstawia schemat blokowy sposobu 200 do przeprowadzania prenatalnej diagnozy aneuploidii chromosomów u płodu z wykorzystaniem losowego sekwencjonowania według wykonania wynalazku. W jednym aspekcie, dla podejścia masywnie równoległego sekwencjonowania, reprezentacyjne dane ze wszystkich chromosomów można wygenerować w tym samym czasie. Pochodzenie danego fragmentu nie jest wybierane z wyprzedzeniem. Sekwencjonowanie przeprowadzane jest losowo, a następnie można przeprowadzić przeszukiwanie bazy danych dla zobaczenia, skąd pochodzi dany fragment. Różni się to do sytuacji, w których określony fragment z chromosomu 21 oraz inny z chromosomu 1 są amplifikowane. [0078] W etapie 210 otrzymywana jest próbka biologiczna od ciężarnej kobiety. W etapie 220 liczba N sekwencji do przeanalizowania jest obliczana dla żądanej dokładności. W jednym przykładzie wykonania w pierwszej kolejności identyfikowany jest udział procentowy DNA płodu. Można tego dokonać na wszystkie stosowne możliwości znane znawcom. Identyfika-

16 15 cja może być po prostu odczytem wartości zmierzonej przez inną jednostkę. W tym przykładzie wykonania obliczenie liczby N sekwencji do przeanalizowania opiera się na udziale procentowym. Na przykład liczba sekwencji potrzebnych do przeanalizowania wzrośnie wraz ze spadkiem udziału procentowego DNA płodu i może zmaleć wraz ze wzrostem DNA płodu. Liczba N może być stałą lub względną wartością, taką jak wartość procentowa. W innym przykładzie wykonania można sekwencjonować liczbę N, o której wiadomo, że jest odpowiednia do dokładnej diagnozy choroby. Liczba N może być wystarczająca nawet przy ciążach ze stężeniami DNA płodu, które są na dolnym końcu typowego zakresu. [0079] W etapie 230 co najmniej N wielu molekuł kwasu nukleinowego zawartych w próbce biologicznej jest losowo sekwencjonowana. Właściwością tego pożądanego podejścia jest, że kwasy nukleinowe do sekwencjonowania nie są specyficznie identyfikowane ani wyznaczane przed analizą próbki, tj. sekwencjonowaniem. Do sekwencjonowania nie są potrzebne primery specyficzne dla sekwencji do wyznaczania specyficznych loci genów. Pule sekwencjonowanych kwasów nukleinowych różnią się pomiędzy próbkami i analizami dla tej samej próbki. Ponadto z poniższych opisów (FIG. 6) ilość wyniku sekwencjonowania wymagana do diagnozy przypadku może się różnić pomiędzy badanymi próbkami i populacją referencyjną. Aspekty te są wyraźnie odmienne od większości podejść diagnostycznych, molekularnych, takich jak te oparte na hybrydyzacji fluorescencji in situ, ilościowym PCR fluorescencji, ilościowym PCR w czasie rzeczywistym, cyfrowym PCR, porównawczej hybrydyzacji genomowej, mikromatrycowej porównawczej hybrydyzacji genomowej i tak dalej, gdzie docelowe loci genu wymagają wcześniejszego wstępnego określenia, a tym samym użycia primerów specyficznych dla locus lub zestawów sond lub ich paneli. [0080] W jednym przykładzie wykonania losowe sekwencjonowanie jest przeprowadzane na fragmentach DNA, które występują w osoczu ciężarnej kobiety i otrzymywane są genomowe sekwencje pochodzące pierwotnie od płodu lub matki. Losowe sekwencjonowanie obejmuje próbkowanie (sekwencjonowanie) losowej części molekuł kwasu nukleinowego występujących w próbce biologicznej. Ponieważ sekwencjonowanie jest losowe, w każdej analizie sekwencjonowany może być inny podzestaw (frakcja) molekuł kwasu nukleinowego (a tym samym genom). Wykonania będą obowiązywać, nawet gdy ten podzestaw będzie różny dla próbek i analiz, co może mieć miejsce, nawet korzystając z tej samej próbki. Przykładamy frakcji są w przybliżeniu 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20% lub 30% genomu. W innych wykonaniach frakcją jest co najmniej którakolwiek z tych wartości. [0081] Pozostałe etapy można przeprowadzić podobnie do ogólnego, powyższego sposobu. VI. WYBÓR PULI ZNACZNIKÓW SEKWENCJI PO SEKWENCJONOWANIU [0082] Jak opisano poniżej w przykładach II i III, podzestaw sekwencjonowanych danych jest wystarczający do rozróżnienia przypadków trisomii 21 od euploidu. Podzestaw sekwencjonowanych danych może być udziałem znaczników sekwencji, które spełniły określone parametry jakości. Na przykład w przykładzie II użyto znaczniki sekwencji, które unikatowo dopasowano do ludzkiego genomu referencyjnego do maskowania powtórzeń. Alternatywnie

17 16 można sekwencjonować reprezentacyjną pulę fragmentów kwasu nukleinowego ze wszystkich chromosomów, ale skupić się na porównaniu danych odnoszących się do chromosomu potencjalnego aneuploidu i danych odnoszących się do wielu chromosomów nie aneuploidu. [0083] Alternatywnie w trakcie analizy po sekwencjonowaniu można dokonać podwyboru podzestawu wyniku sekwencjonowania obejmującego znaczniki sekwencji wygenerowane z fragmentów kwasu nukleinowego odpowiadające określonemu okienku rozmiaru w pierwotnej próbce. Na przykład wykorzystując analizator genomu Genome Analyser Illumina można użyć sekwencjonowania sparowanego końca, które odnosi się do sekwencjonowania dwóch końców fragmentów kwasu nukleinowego. Sekwencjonowane dane z każdego sparowanego końca zostają następnie dopasowane do sekwencji ludzkiego genomu referencyjnego. Następnie można wywnioskować odległość lub liczbę nukleotydów rozciągających się pomiędzy dwoma końcami. Można również wywnioskować całkowitą długość pierwotnego fragmentu kwasu nukleinowego. Alternatywnie platformy sekwencjonowania, takie jak platforma 454 i potencjalnie niektóre techniki sekwencjonowania pojedynczych molekuł mogą sekwencjonować pełną długość krótkich fragmentów kwasu nukleinowego, na przykład 200 bp. Tym samym od razu znana będzie rzeczywista długość fragmentu kwasu nukleinowego z sekwencjonowanych danych. [0084] Taka analiza sparowanego końca jest również możliwa z wykorzystaniem innych platform sekwencjonowania, np. systemu SOLID Applied Biosystems. Dla platformy Roche 454, ze względu na jej wydłużoną długość odczytu w porównaniu z innymi systemami masywnie równoległego sekwencjonowania, można również określić długość fragmentu z jego całkowitej sekwencji. [0085] Korzyścią jest skoncentrowanie analizy danych na podzestawie znaczników sekwencji odnoszących się do krótkich fragmentów kwasu nukleinowego w pierwotnej próbce osocza matczynego, ponieważ zestaw danych będzie skutecznie wzbogacony o sekwencje DNA pochodzące od płodu. Dzieje się tak, ponieważ molekuły DNA płodu w osoczu matczynym zawierają krótsze fragmenty niż molekuły DNA pochodzące od matki (Chan i wsp. Clin Chem 2004; 50: 88-92). Według FIG. 7 liczba znaczników sekwencji wymaganych do rozróżnienia przypadków euploidu od trisomii 21 będzie maleć wraz ze wzrostem frakcyjnego stężenia DNA płodu. [0086] Wybór podzestawu puli kwasu nukleinowego po sekwencjonowaniu różni się od innych strategii wzbogacania kwasu nukleinowego, które przeprowadzane są przed analizą próbki, takich jak użycie elektroforezy w żelu lub kolumn wykluczenia rozmiarów do wyboru kwasów nukleinowych o określonych rozmiarach, co wymaga fizycznego oddzielenia wzbogaconej puli od puli kwasu nukleinowego tła. Fizyczne procedury wprowadzą więcej etapów doświadczenia i mogą być narażone na problemy, takie jak zanieczyszczenie. Wybór po sekwencjonowaniu in silico podzestawów wyniku sekwencjonowania umożliwi również zróżnicowanie wyboru w zależności od czułości i swoistości wymaganych do określenia choroby. [0087] Podejścia bioinformatyczne, obliczeniowe i statystyczne stosowane do określenia, czy próbka osocza matczynego jest otrzymywana od ciężarnej kobiety noszącej płód z trisomią 21

18 17 lub euploidalny mogą zostać skompilowane w produkcie programu komputerowego do określenia parametrów z wyniku sekwencjonowania. Działanie programu komputerowego będzie obejmowało określenie ilości z chromosomu potencjalnego aneuploidu, jak również ilości z jednego lub więcej innych chromosomów. Parametr zostanie określony i porównany ze stosownymi wartościami granicznymi do określenia, czy u płodu aneuploidia chromosomów występuje dla chromosomu potencjalnego aneuploidu. PRZYKŁADY [0088] Poniższe przykłady podano do zilustrowania, a nie ograniczenia zastrzeżonego wynalazku. I. PRENATALNA DIAGNOZA TRISOMII 21 PŁODU [0089] Do badania włączono osiem ciężarnych kobiet. Wszystkie ciężarne kobiety były w 1.szym i 2.gim trymestrze i były one w ciąży pojedynczej. Cztery z nich nosiło płód z trisomią 21, a cztery płód euploidalny. Od każdej uczestniczki pobrano dwadzieścia mililitrów krwi żylnej. Osocze matczyne zebrano po wirowaniu przy 1600 g przez 10 minut i dodatkowym wirowaniu przy g przez 10 minut. Następnie z 5-10 ml każdej próbki osocza ekstrahowano DNA. Następnie DNA osocza matczynego użyto do masywnie równoległego sekwencjonowania przy użyciu analizatora genomu Genome Analyzer Illumina zgodnie z instrukcjami producenta. W trakcie sekwencjonowania i analizy danych sekwencji diagnozy płodu były ukryte przed technikami przeprowadzającymi sekwencjonowanie. [0090] Pokrótce, około 50 ng DNA osocza matczynego użyto do przygotowania biblioteki DNA. Można rozpocząć od mniejszej ilości, takiej jak 15 ng lub 10 ng DNA osocza matczynego. Fragmenty DNA matczynego osocza były ślepo zakończone, ligowane do adapterów Solexa, a fragmenty bp wybrano poprzez oczyszczanie DNA z żelu. Alternatywnie ślepo zakończone i ligowane do adapterów fragmenty DNA osocza matczynego można poprowadzić przez kolumny (np. AMPure, Agencourt) dla usunięcia nieligowanych adapterów przed wytworzeniem klastrów. DNA ligowane do adapterów hybrydyzowano do powierzchni kuwet przepływowych, a klastry DNA wygenerowano z wykorzystaniem stacji do klastrowania Illumina, po czym przeprowadzono 36 cykli sekwencjonowania w analizatorze genomu Genome Analyzer Illumina. DNA z każdej próbki osocza matczynego sekwencjonowano przez jedną kuwetę przepływową. Sekwencjonowane odczyty skompilowano, wykorzystując Analysis Pipeline Solexa. Wszystkie odczyty dopasowano następnie do sekwencji referencyjnego genomu ludzkiego maskującego powtórzenia, zestaw 36 NCBI (numer dostępu do Gen- Bank: NC_ do NC_000024) z wykorzystaniem aplikacji Eland. [0091] W badaniu tym do zmniejszenia złożoności analizy danych dalej brane są pod uwagę tylko sekwencje zmapowane do unikalnej lokalizacji w referencyjnym genomie ludzkim maskującym powtórzenia. Alternatywnie można użyć inne podzestawy lub cały zestaw sekwencjonowanych danych. Zliczono całkowitą liczbę unikalnie zmapowanych sekwencji dla każdej próbki. Liczba sekwencji unikalnie dopasowanych do chromosomu 21 została wyrażona jako udział w całkowitym wyniku dopasowanych sekwencji dla każdej próbki. Ponieważ osocze matczyne zawiera DNA płodu w tle DNA pochodzenia matczynego, płód z trisomią 21

19 18 będzie wnosił dodatkowe znaczniki sekwencji pochodzące z chromosomu 21 ze względu na obecność dodatkowej kopii chromosomu 21 w genomie płodu. W związku z tym udział procentowy sekwencji chromosomu 21 w osoczu matczynym kobiety noszącej płód z trisomią 21 będzie wyższy niż u kobiety noszącej płód euploidalny. Analiza nie wymaga wyznaczenia sekwencji specyficznych dla płodu. Nie wymaga również wcześniejszego fizycznego oddzielenia kwasów nukleinowych płodu od matczynych. Nie wymaga rozróżnienia ani zidentyfikowania płodu z sekwencji matczynych po sekwencjonowaniu. [0092] FIG. 3A przedstawia udział procentowy sekwencji zmapowanych do chromosomu 21 (procentowa reprezentacja chromosomu 21) dla każdej z 8 próbek DNA osocza matczynego. Procentowa reprezentacja chromosomu 21 była znacznie wyższa w osoczu matczynym ciąż z trisomią 21 niż ciąż euploidalnych. Dane te sugerują, że nieinwazyjną prenatalną diagnozę aneuploidii płodu można otrzymać poprzez określenie procentowej reprezentacji chromosomu aneuploidu w porównaniu z tym z populacji referencyjnej. Alternatywnie nadreprezentację chromosomu 21 można wykryć przez porównanie reprezentacji procentowej chromosomu 21 otrzymanego doświadczalnie z procentową reprezentacją sekwencji chromosomu 21 oczekiwanych dla ludzkiego genomu euploidu. Można tego dokonać poprzez maskowanie lub niemaskowanie regionów powtórzeń w ludzkim genomie. [0093] Pięć z ośmiu ciężarnych kobiet nosiło płód męski. Sekwencje mapowane do chromosomu Y będą specyficzne dla płodu. Udział procentowy sekwencji zmapowanych do chromosomu Y został użyty do obliczenia frakcyjnego stężenia DNA płodu w próbce pierwotnego osocza matczynego. Ponadto frakcyjne stężenie DNA płodu zostało również określone poprzez użycie cyfrowego PCR w mikropłynach obejmującego paralogiczne geny białka palca cynkowego ZFX i białka palca cynkowego ZFY. [0094] FIG. 3B przedstawia korelację frakcyjnych stężeń DNA płodu wywnioskowanych przez procentową reprezentację chromosomu Y poprzez sekwencjonowanie i tych określonych przez cyfrową technikę PCR w mikropłynach ZFY/ZFX. Pomiędzy frakcyjnymi stężeniami DNA płodu w osoczu matczynym ustalonymi tymi dwoma sposobami istniała dodania korelacja. W analizie korelacji Pearsona współczynnik korelacji (r) wyniósł 0,917. [0095] Udziały procentowe sekwencji DNA w osoczu matczynym dopasowanych do każdego z 24 chromosomów (22 autosomy oraz chromosomy X i Y) dla dwóch reprezentacyjnych przypadków zostały przedstawione na FIG. 4A. Jedna ciężarna kobieta nosiła płód z trisomią 21, a pozostałe płód euploidalny. Procentowa reprezentacja sekwencji zmapowanych do chromosomu 21 jest większa u ciężarnej kobiety noszącej płód z trisomią 21 w porównaniu z ciężarną kobietą noszącą zdrowy płód. [0096] Na FIG 4B przedstawiono różnice (%) procentowej reprezentacji na chromosom pomiędzy próbkami DNA w osoczu matczynym powyższych dwóch przypadków. Procentowa różnica dla danego chromosomu jest obliczana z wykorzystaniem następującego wzoru: gdzie Różnica procentowa (%) = (P 21 P E )/P E x 100%,

20 19 P 21 = udział procentowy sekwencji DNA w osoczu dopasowanych do określonego chromosomu u kobiety ciężarnej noszącej płód z trisomią 21 i; P E = udział procentowy sekwencji DNA w osoczu dopasowanych do określonego chromosomu u kobiety noszącej płód euploidalny. [0097] Jak przedstawiono na FIG. 4B, nadreprezentacja sekwencji chromosomu 21 wynosi 11% w osoczu kobiety ciężarnej noszącej płód z trisomią 21 w porównaniu z ciężarną kobietą noszącą płód euploidalny. Dla sekwencji dopasowanych do innych chromosomów różnice pomiędzy dwoma przypadkami mieściły się w zakresie 5%. Ponieważ procentowa reprezentacja dla chromosomu 21 jest zwiększona przy trisomii 21 w porównaniu z próbkami osocza matczynego euploidu, alternatywnie różnica (%) może być wyrażona jako stopień nadreprezentacji w sekwencjach chromosomu 21. Oprócz różnic (%) i bezwzględnych różnic pomiędzy reprezentacjami procentowymi chromosomu 21, można obliczyć również stosunki wyników z próbek badanych i referencyjnych, które będą wskazywały na stopień nadreprezentacji chromosomu 21 w trisomii 21 w porównaniu z próbkami euploidu. [0098] Dla czterech ciężarnych kobiet noszących płód euploidalny średnia wynosząca 1,345% sekwencji DNA ich osocza została dopasowana do chromosomu 21. U czterech ciężarnych kobiet noszących płód z trisomią 21 płody były męskie. Dla każdego z tych trzech przypadków obliczono procentową reprezentację chromosomu 21. Jak opisano powyżej, określono różnicę (%) w procentowej reprezentacji chromosomu 21 dla każdego z tych trzech przypadków trisomii 21 ze średniej procentowej reprezentacji chromosomu 21 pochodzącej z wartości czterech przypadków euploidalnych. Innymi słowy, średnia z czterech przypadków noszących płód euploidalny została w tych obliczeniach użyta jako odniesienie. Frakcyjne stężenia DNA płodu dla tych trzech męskich przypadków trisomii 21 zostały wywnioskowane z ich odpowiedniej reprezentacji procentowej sekwencji chromosomu Y. [0099] Na FIG. 5 przedstawiono korelację pomiędzy stopniem nadreprezentacji sekwencji chromosomu 21 i frakcyjnych stężeń DNA płodu. Pomiędzy tymi dwoma parametrami wystąpiła znaczna, dodatnia korelacja. W analizie korelacji Pearsona współczynnik korelacji (r) wynosił 0,898. Wyniki te wskazują, że stopień nadreprezentacji sekwencji chromosomu 21 w osoczu matczynym odnosi się do frakcyjnego stężenia DNA płodu w próbce osocza matczynego. W związku z tym wartości graniczne w stopniu nadreprezentacji sekwencji chromosomu 21 stosowne dla frakcyjnych stężeń DNA płodu można określić do zidentyfikowania ciąż z płodami z trisomią 21. [0100] Określenie frakcyjnego stężenia DNA płodu w osoczu matczynym można również przeprowadzić osobno od przebiegu sekwencjonowania. Na przykład stężenie DNA chromosomu Y można wstępnie określić z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym, PCR w mikropłynach lub spektometrii mas. Na przykład na FIG. 3B wykazaliśmy, że pomiędzy stężeniami DNA płodu oszacowanymi na podstawie zliczenia chromosomu Y wygenerowanymi w trakcie przebiegu sekwencjonowania i stosunkiem ZFY/ZFX wygenerowanym zewnętrznie do przebiegu sekwencjonowania występuje dobra korelacja. W rzeczywistości stężenie DNA płodu można określić z wykorzystaniem loci innych niż chromosomu Y i odnoszących się do