(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)175422

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego , PCT/DK93/00004 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO93/14121, PCT Gazette nr 18/93 (51) IntCl6: C12N 9/24 C12N 15/12 C12N 9/64 (54) Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz (30) Pierwszeństwo: ,DK,92/00001 (73) Uprawniony z patentu: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, DK (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 09/95 (72) Twórcy wynalazku: Fanny Norris, Hellerup, DK Kjeld Norris, Hellerup, DK Soren E. Bjorn, Lyngby, DK Lars Ch. Petersen, Horsholm, DK Ole H. Olsen, Bronshoj, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/98 (74) Pełnomocnik: Dehnel Zofia, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz o sekwencji aminokwasowej: X 1 Asp Phe Cys Phe Leu Asp X2 X3 Cys X4 X5 X 7X 8X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gln Cys Arg Phe X10 Tyr Cys X1 X 12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Cys Lys Asn Be Cys Asp X 15(SEQ ID Nr 1), gdzie X 1oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, X2 do X14 każde z osobna oznacza resztę naturalnie występującego aminokwasu z wyjątkiem Cis, a X15 oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X1do X15 jest różna od odpowiadającej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej i przy czym X4 ma znaczenie inne niż Leu, znamienny tym, że hoduje się komórki zawierające DNA obejmującej sekwencję DNA kodującą wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz w warunkach sprzyjających ekspresji białka i odzyskuje się otrzymane białko z hodowli.

2 Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz o sekwencji aminokwasowej: X1Asp Phe Cys Phe Leu Asp X2 X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe X10 Tyr Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp X15 (SEQ ID Nr 1), gdzie X1 oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, X2 do X 14 każde z osobna oznacza resztę naturalnie występującego aminokwasu z wyjątkiem Cis, a X15 oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X1do X15 jest różna od odpowiadającej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej i przy czym X4 ma znaczenie inne niż Leu, znamienny tym, że hoduje się komórki zawierające DNA obejmującej sekwencję DNA kodującą wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz w warunkach sprzyjających ekspresji białka i odzyskuje się otrzymane białko z hodowli. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X1oznacza Lys-Pro. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X2 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Arg, Thr, Asp, Pro,, Lys, Gln, Ser, Ile i Val. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X2 oznacza Thr lub Pro. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X3 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Pro, Thr, Leu, Arg, Val i Ile. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X3 oznacza Pro lub Ile. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X4 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe,, Ser, Met, Trp, Tyr, Gln, Asn i Ala. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X4 oznacza Lys, Val, Ile, Thr, Met, Gln lub Arg. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X5 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ala,, Thr, Arg, Phe, Gln i Asp. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X5 oznacza Ala, Thr, Asp lub. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ala, Lys, Leu,, His, Ser, Asp, Gln,, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile i Met. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X6 oznacza Arg, Phe, Ala, Leu lub Tyr.

3 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X7 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Met, Gln,, Thr, Leu, Val i Phe. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X7 oznacza Ile. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X8 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gln,, Arg, Pro i Phe. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X8 oznacza Ile lub Thr. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X9 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ser, Ala, Gln, Lys i Leu. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X9 oznacza Arg. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X1 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Gln, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg i Val. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X 10 oznacza Val lub Lys. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X 11oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród, Met, Gln,, Leu, Arg, Lys, Pro i Asn. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X 11 oznacza Arg lub Leu. 23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X12 oznacza Ala lub. 24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X 13 oznacza resztę aminokwasową dobrana spośród Lys, Asn i Asp. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X13 oznacza Lys lub Asn. 26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Val, Tyr, Asp,, Thr,, Leu, Ser, Ile, Gln, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp i Lys. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X14 oznacza Lys lub. 28. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X15 oznacza. 29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej, w której X1oznacza Lys-Pro, a X 15 oznacza. 30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej: X1Asp Phe Cys Phe Leu Asp X2 X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gln Xt7 Lys Gln Cys Arg Phe 1 0 Tyr Cys X11 X12 X13 Met Asn

4 Asn Phe X14 Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp X15 (SEQ ID Nr 2), w którym X1 do X15 oznacza reszty aminokwasowe określone w zastrz. 1, X oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Gln,, Ala, Ser, Val i Phe, w szczególności Gln lub Ala, a X17 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Thr i Ala. 31. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Leu Asn Met Asn Asn Phe Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 3). 32. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ HD nr 4). 33. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 5). 34. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Val Tyr Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 6). * * * Przedmiot wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wariant ludzkiej domeny, hamującej proteazy, typu Kunitz, DNA kodujący ten wariant, sposób wytwarzania tego wariantu i preparat farmaceutyczny zawierający ten wariant. Stan techniki Krwinki białe cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych (zwane leukocytami obojętnochłonnymi, czyli neutrofilami, lub PMN) i fagocyty jednojądrzaste (monocyty) odgrywają ważną rolę przy uszkodzeniach tkanek, zakażeniach, ostrych i przewlekłych stanach zapalnych oraz gojeniu się ran. Komórki przemieszczają się z krwi obwodowej do miejsca zapalenia i, w następstwie odpowiedniego pobudzenia, uwalniają związki utleniające (O2O, O-2, H2O2 i HOCl), jak również ziarnistości zawierające różne enzymy proteolityczne. Ziarnistości wydzielnicze zawierają między innymi fosfatazę zasadową, metaloproteinazy, jak np. żelatynę i kolagenazę, oraz proteazy serynowe, takie jak elastaza neutrofilowa, katepsyna G i proteinaza 3. Utajone metaloproteinazy uwalniane są wraz z tkankowym inhibitorem metaloproteinazy (TIMP). Mechanizm aktywacji nie został w pełni wyjaśniony, ale prawdopodobne jest, że w procesie tym odgrywa rolę utlenienie grup tiolowych i/lub rozkład białka. Tak więc aktywność swobodnej metaloproteinazy zależy od unieczynnienia TIMP. Proteazy serynowe: elastaza neutrofilowa, katepsyna G i proteinaza-3 znajdują się wewnątrz azurochłonnych ziarnistości leukocytów w postaci aktywnych enzymów, tworzących kompleks z glikozaminoglikanami. Kompleksy te są nieaktywne, ale po wydzieleniu rozłączają się, uwalniając aktywne enzymy. W osoczu znajdują się duże ilości inhibitorów: inhibitora α1-proteinazy (α1-pi) i inhibitora α1-chymotrypsyny (α1-chi), służących do zobojętnienia aktywności proteaz. Jednakże PMN zdolne są do miejscowego unieczynniania inhibitorów. I tak α1-pi, stanowiący najważniejszy inhibitor elastazy neutrofilowej, wrażliwy jest na utlenienie w centrum reaktywnym (Met 358) przez tlenowe metabolity wyzwolonych PMN. Ogranicza to powinowactwo α1-pi do elastazy neutrofilowej o około 2000 razy.

5 Po miejscowym zobojętnieniu α1-pi elastaza zdolna jest do rozkładu niektórych inhibitorów innych enzymów proteolitycznych. Elastaza rozkłada α1-chl i w ten sposób wzmaga aktywność katepsyny G. Elastaza rozkłada również TIMP, czego wynikiem jest rozkład tkanki przez metaloproteinazy. Następnie elastaza rozkłada antytrombinę III i kofaktor II heparyny, oraz inhibitor układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych (TFPI), który prawdopodobnie przyczynia się do powstawania skrzepu. Z drugiej jednak strony zdolności elastazy neutrofilowej do rozkładu czynników krzepnięcia przypisuje się wpływ przeciwny, tak więc sumaryczny efekt działania elastazy nie jest jasny. Wpływ elastazy neutrofilowej na fibrynolizę jest bardziej jednoznaczny. Elastaza rozkłada inhibitor aktywatora plazminogenu i inhibitor α2-plazminy, w związku z czym aktywność fibrynolityczna rośnie. Oba te inhibitory są zresztą utleniane i unieczynniane przez metabolity O2. PMN zawierają duże ilości proteaz serynowych; dziennie uwalnia się 200 mg każdej z proteaz leukocytowych, które mają zwalczać czynniki inwazyjne w ustroju. W wyniku ostrego zapalenia dochodzi do wielokrotnego wzrostu ilości uwalnianego enzymu. W normalnych warunkach rozkład białka utrzymywany jest na dopuszczalnie niskim poziomie przez duże ilości inhibitorów α1-pi, α1-chi i α2-makroglobuliny. Istnieją jednak pewne dane wskazujące, że niektóre choroby przewlekłe spowodowane są patologicznym rozkładem białka, którego przyczyną jest nadmierne pobudzenie PMN, spowodowane np. przez odpowiedź autoimmunologiczną, przewlekłe zakażenie, dym tytoniowy lub inne czynniki drażniące itp. Wiadomo, że aprotynina (bydlęcy inhibitor trypsyny trzustkowej) jest inhibitorem różnych proteaz serynowych, w tym również trypsyny, chymotrypsyny, plazminy i kalikreiny i jest stosowana w leczeniu ostrego zapalenia trzustki, różnych stanów zespołu wstrząsu, krwawienia hiperfibrynolitycznego oraz zawału mięśnia sercowego (por. np. J. E. Trapnell i in, Brit. J. Surg. 61, 1974, str. 177; J. McMichan i in, Circulatory Shock 9, 1982, str. 107; L. M. Auer i in, Acta Neurochir. 49,1979, str. 207; B. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129,1977, str. 164; i B. Schneider, Artzneim.-Forsch. 26, 1976, str. 1606). Podawanie aprotyniny w wysokich dawkach znacząco zmniejsza utratę krwi przy operacjach kardiochirurgicznych, włącznie z operacjami w krążeniu pozaustrojowym (por. np. B. P. Bidstrup i in., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97,1989, str ; W. van Oeveren i in, Ann. Thorac. Surg. 44, 1987, str ). Uprzednio wykazano (por. H. R. Wenzel i H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed. 20, 1981, str. 295), że niektóre analogi aprotyniny, na przykład aprotynina (1-58, Val15) wykazują stosunkowo wysoką wybiórczość dla elastazy granulocytamej oraz działanie hamujące kolagenazę; aprotynina (1-58, Ala15) wykazuje słaby wpływ na elastazę, podczas gdy aprotynina (3-58, Arg15, Ala17, Ser42) wykazuje wybitny wpływ hamujący kalikreinę osoczową (por. WO 89/10374). Wykazano jednakże, że przy podawaniu in vivo aprotynina wykazuje działanie nefrotoksyczne u szczurów, królików i psów po powtarzanych wstrzyknięciach stosunkowo wysokich dawek aprotyniny (Bayer, Trasylol. Inhibitor of Proteinase; E. Glaser i in. w "Verhandlugen der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, München, 1972, str ). Nefroloksyczność (to znaczy pojawianie się zmian chorobowych), obserwowaną w przypadku aprotyniny, przypisać można akumulacji aprotyniny w komórkach kanalików bliższych nerek, będącej wynikiem wysoce dodatniego ładunku netto aprotyniny, który powoduje, że wiąże się ona z ujemnie naładowaną powierzchnią kanalików. Nefrotoksyczność ogranicza kliniczne zastosowanie aprotyniny, zwłaszcza tam, gdzie niezbędne byłoby podawanie wysokich dawek inhibitora, jak na przykład w operacjach w krążeniu pozaustrojowym. Aprotynina jest poza tym białkiem bydlęcym, może zatem zawierać jedną lub więcej determinant antygenowych, zdolnych wywołać niepożądaną odpowiedź immunologiczną przy stosowaniu aprotyniny u ludzi. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem identyfikacja ludzkich inhibitorów proteaz tego samego typu, co aprotynina (tzn. inhibitorów typu Kunitz), o profilu hamowania podobnym lub zmodyfikowanym w celu osiągnięcia pożądanego profilu hamowania. Istota wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wariant ludzkiej domeny II typu Kunitz, hamującej proteazy, inhibitora układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych (TFPI), przy czym wariant ten zawiera następującą sekwencję aminokwasów: X1Asp Phe Cys Phe Leu

6 Asp X2 X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe X10 Tyr Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp X15 (SEQ ID Nr 1), gdzie X1 oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z, wyjątkiem Cys, X2 do X 14 każde z osobna oznacza resztę naturalnie występującego aminokwasu z wyjątkiem Cys, a X15 oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, z zastrzeżeniem, że co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X do X jest różna od odpowiadającej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej. W niniejszym kontekście określenie "reszta naturalnie występującego aminokwasu" oznaczać ma dowolny z 20 powszechnie wystających aminokwasów, to znaczy Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met,, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp,, Lys, Arg i His. TFPI, znany również jako inhibitor zewnątrzpochodnego układu krzepnięcia (EPI) lub inhibitor krzepnięcia związany z lipoproteinami (LACI), wyizolowany został prze Broze i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, str oraz EP ); sklonowano również gen kodujący to białko, por. EP Analiza drugorzędowej struktury tego białka wykazała, że białko to zawiera trzy domeny hamujące typu Kunitz, od aminokwasu 22 do aminokwasu 79 (I), od aminokwasu 93 do aminokwasu 150.(11) i od aminokwasu 185 do aminokwasu 242 (III). Wykazano, że domena I typu Kunitz TFPI wiąże TF/FVIIa, natomiast domena II typu Kunitz wiąże FXa (Girard i in., Naturę 338, 1989, str ). Podstawiając jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej z położeń wskazanych powyżej, można zmienić profil hamowania domeny II typu Kunitz TFPI tak, aby wybiórczo hamowała ona elastazę neutrofilową, katepsynę G i/lub proteinazę 3. Następnie możliwe byłoby wytworzenie wariantów, które swoiście hamowałyby enzymy związane z krzpnięciem lub fibrynolizą (np. plazminę lub kalikreinę osoczową) lub kaskadę dopełniacza. Zaletą domeny II typu Kunitz TFPI jest to, że ma ona ujemny ładunek netto w przeciwieństwie do aprotyniny, która, jak to wspomniano powyżej, ma wysoce dodatni ładunek netto. Można zatem wytworzyć warianty wynalazku o niższym ładunku dodatnim netto od aprotyniny, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia nerek przy podawaniu dużych dawek tych wariantów. Inną zaletą jest fakt, że w przeciwieństwie do aprotyniny wariant taki jest ludzkim białkiem (fragmentem), tak więc znacząco ogranicza się występowanie niepożądanych odczynów immunologicznych przy stosowaniu go u ludzi. Szczegółowy opis wynalazku Przykładami korzystnych wariantów domeny II typu Kunitz TFPI są warianty, w których X1stanowi Lys, Pro; lub w których X2 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Arg, Thr, Asp, Pro,, Lys, Gln, Ser, Ile i Val, w szczególności, w których X2 stanowi Thr lub Pro; lub w których X3 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Pro, Thr, Leu, Arg, Val i Ile, w szczególności w których X3 stanowi Pro lub Ile; lub w których X4 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe,, Ser, Met, Trp, Tyr, Gln, Asn i Ala, w szczególności w których X4 stanowi Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gln lub Arg; lub w których X5 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ala,, Thr, Arg, Phe Gln i Asp, w szczególności, w których X5 stanowi Ala, Thr, Asp lub ; lub w których X stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ala, Lys, Leu,, His, Ser, Asp, Gln,, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile i Met, w szczególności w których X6 stanowi Arg, Phe, Ala, Leu lub Tyr; lub w których X7 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Met, Gln,, Thr, Leu, Val i Phe, w szczególności w których X7 stanowi Ile; lub w których X8 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gln,, Arg, Pro i Phe, w szczególności w których X8 stanowi Ile lub Thr; lub w których X9 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ser, Ala, Gln, Lys i Leu, w szczególności w których X9 stanowi Arg; lub w których X10 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Gln, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg i Val, w szczególności w których X10 stanowi Val lub Lys; lub w których X 1 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród, Met, Gln,, Leu, Arg, Lys, Pro i Asn, w szczególności w których X1 stanowi Arg lub Leu; lub w których X12 stanowi Ala lub ; lub w których X13 stanowi Lys, Asn i Asp, w szczególności w których X13 stanowi Lys lub Asn; lub w której X14 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Val, Tyr, Asp,, Thr,, Leu, Ser, Ile, Gln, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp i Lys, w szczególności w których X4

7 stanowi Lys lub ; lub w których X15 stanowi. W korzystnym wykonaniu X1stanowi Lys, Pro, a X15 stanowi, natomiast X2 do X14 stanowią reszty aminokwasowe określone powyżej. Warianty domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, korzystnie, nie powinny zawierać reszty Met w regionie wiążącym proteazę (to znaczy reszt aminokwasowych oznaczonych przez X3 do X14). Analogicznie jak w przypadku opisanego powyżej α1-pi, reszta Met w dowolny, z tych położeń spowodowałaby, że inhibitor stałby się wrażliwy na unieczynienie prze utlenienie przez tlenowe metabolity produkowane przez PMN, a nieobecność reszty Met w tych położeniach powinna, przeciwnie, uczynić inhibitor bardziej stabilnym w obecności takich tlenowych metabolitów. Pożądana może być zmiana sposobu glikolizacji wariantu domeny II typu Kunitz przy wytwarzaniu go przez komórkę gospodarza. Wariant według wynalazku może zatem, w jednym z wykonań, mieć następującą sekwencję aminokwasów: X1Asp Phe Cys Phe Leu Asp X2 X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gln X17 Lys Gln Cys Arg Phe X 10 Tyr Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp X 15 (SEO ID Nr 2), gdzie X1 do X15 stanowią reszty aminokwasowe określone w zastrz. 1, X1 stanowi reszta aminokwasową dobrana spośród Gln,, Ala, Ser, Val i Phe, w szczególności Gln lub Ala, a X 17 stanowi reszta aminokwasową dobrana spośród Thr i Ala. Aktualnie korzystnymi wariantami wynalazku są takie warianty, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych, znajdujących się w miejscu wiążącym proteazę domeny Kuntz, tzn. jedna lub więcej reszt aminokwasowych X3 do X14 (odpowiadających położeniom 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 34, 39,40, 41 i 46 aprotyniny) jest podstawionych w miejsce aminokwasów znajdujących się w tym samym położeniu (położeniach) aprotyniny aktywnej. Przykłady takich wariantów stanowią Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Leu Asn Met Asn Asn Phe Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 3); Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg De Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 4); Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 5); lub Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Val Tyr Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (SEQ ID nr 6). Inną cechą charakterystyczną wynalazku jest DNA kodujące ludzki wariant domeny hamującej typu Kunitz według wynalazku. DNA według wynalazku można wytworzyć syntetycznie za pomocą znanych standardowych metod, na przykład metody fosfamidynowej, opisanej przez S. L. Beaucage i M. H. Caruthers, Tetrahedron Latters 22, 1981, str , lub metody opisanej przez Matthes i in., EMBO Journal 3, 1984, str Według metody fosfamidynowej syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym urządzeniu do syntezy DNA, a następnie oczyszcza się je, paruje, wiąże przy pomocy ligazy i klonuje w odpowiednich wektorach. Można zamiast tego stosować gen lub fragment cdna, kodujące domenę II typu Kunitz TFPI (uzyskując gen lub fragment cdna przez sondowanie, odpowiednio, biblioteki genomu lub biblioteki cdna w poszukiwaniu fragmentu DNA, kodującego TFPI, stosując syntetyczne sondy oligonukleotydowe i izolując stamtąd sekwencję DNA kodującą domenę II). Następnie modyfikuje się sekwencję DNA w jednym lub więcej miejsc odpowiadających miejscu (miejscom), w których pożądane jest dokonanie podstawienia aminokwasu; modyfikacji dokonuje się np. poprzez mutagenezę ukierunkowaną na konkretne miejsce z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów, kodujących pożądaną sekwencję aminokwasów w celu osiągnięcia homologicznej rekombinacji, ják w metodach znanych ze stanu techniki.

8 Kolejną cechą charakterystyczną wynalazku jest rekombinacyjny wektor ekspresyjny, zawierający fragment DNA według wynalazku. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny może stanowić dowolny wektor, dogodny dla zastosowania do rekombinacji DNA; wybór wektora zależeć będzie często od komórki - gospodarza, do której wektor ma być wprowadzony. Wektor może zatem stanowić wektor autonomicznie replikujący się, to znaczy wektor istniejący jako jednostka pozachromosomalna, którego replikacja nie zależy od replikacji chromosomalnej; wektorem tym może na przykład być plazmid. Zastosowanym wektorem może być zamiast tego taki wektor, który, wprowadzony do komórki gospodarza, włączany jest do jej genomu i replikowany jest razem z chromosomem (chromosomami), do których został włączony. Sekwencja DNA, kodująca wariant domeny II TFPI według wynalazku, powinna być wewnątrz wektora złączona z odpowiednią sekwencją promotorową, jednakże w sposób umożliwiający działanie. Promotor stanowić może dowolna sekwencja DNA, wykazująca aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza; promotor pochodzić może z genów kodujących białka homologiczne lub heterologiczne dla komórki gospodarza. Przykładami promotorów odpowiednich do sterowania transkrypcją DNA kodującego wariant domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku w komórkach ssaków są: promotor SV 40 (Subramani i in., Mol. Celi Biol. 1, 1981, str ), promotor MT-1 (gen metalotioneiny) (Palmiter i in., Science 222, 1983, str ) oraz główny opóźniony promotor adenowirusa 2. Do promotorów odpowiednich do zastosowania w komórkach drożdży należą promotory pochodzące z drożdżowych genów glikolizy (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255, 1980, str ; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, str ) lub genów dehydrogenazy alkoholowej (Young i in., w Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (pod red. Hollaender i in.), Plenum Press, New York, 1982), oraz promotory TPI1 (US 4, 599, 311) lub ADH2-4c (Russell i in., Naturę 304, 1983, str ). Promotorami odpowiednimi do użycia w komórkach grzybów nitkowatych są np. promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4, 1985, str ), lub promotor tpia. Sekwencja DNA, kodująca wariant domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku może również być przyłączona, w sposób umożliwiający działanie, do odpowiedniej sekwencji terminacyjnej, takiej jak sekwencja terminacyjna ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., op. cit.), lub, u grzybów, promotory TPI1 (Alber i Kawasaki, op. cit.) lub ADH3 (McKnight i in., op. cit). Wektor może także zawierać takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV 40 lub z regionu E lb adenowirusa 5), sekwencje wzmagające transkrypcję (np. sekwencja wzmagająca SV 40) i sekwencje wzmagające translację (np. sekwencje kodujące RNA adenowirusa VA). Rekombinacyjny wektor ekspresyjny według wynalazku może także zawierać sekwencję DNA umożliwiającą wektorowi replikację w danej komórce gospodarza. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka) jest zapoczątkowanie replikacji przez SV, lub (gdy komórką gospodarza jest komórka drożdży) geny replikacji plazmidu 2 (i drożdży REP 1-3 i zapoczątkowanie replikacji. Wektor może również zawierać możliwy do wyróżnienia znacznik (np. gen, którego produkt uzupełnia brak w komórce gospodarza, jak np. gen kodujący reduktazę dwuhydrofolanu (DHFR), lub gen nadający oporność na lek, na przykład neomycynę, hygromycynę lub metotreksat, lub gen TPI Schizosaccharomyces pombe (opisany przez P. R. Russell, Gene 40, 1985, str ). Sposoby związania przy użyciu ligazy sekwencji DNA, odpowiednio, inicjującej i terminacyjnej, wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, i wprowadzania ich do odpowiednich wektorów zawierających informację niezbędną dla replikacji, są dobrze znane specjalistom (por. np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Komórkę gospodarza, do której wprowadzany jest wektor ekspresyjny według wynalazku, może stanowić dowolna komórka zdolna do produkcji wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, a korzystnie, komórka eukariotyczna, jak na przykład komórka ssaka, drożdży lub grzyba. Drożdże, używane jako komórki - gospodarze według wynalazku, mogą stanowić dowolne drożdże, które, w hodowli, produkują duże ilości wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według

9 wynalazku. Przykładami odpowiednich drożdży są szczepy gatunków drożdży Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe łub Saccharomyces uvarum. Transformacja komórek drożdży może dokonać się na przykład przez wytworzenie protoplastu, a następnie transformację w sposób sam przez się znany. Przykładami odpowiednich linii komórkowych komórek ssaków są linie komórkowe: COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekcji komórek ssaków i ekspresji sekwencji DNA wprowadzonych do komórek opisane zostały na przykład przez: Kaufman i Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, str , Southern i Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, str ; Loyter i in.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,1982, str ; Wigier i in., Cell 14,1978, str. 725; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, str. 603; Graham i van der Eb, Virology 52, 1973, str. 456 oraz Neuman i in., EMBO J. 1, 1982, str Zamiast wyżej wymienionych, jako komórek gospodarza według wynalazku używać można komórek grzybów. Przykładami odpowiednich komórek grzybów są komórki grzybów nitkowatych, na przykład Aspergillus spp. lub Neurospora spp., w szczególności szczepów Aspergillus oryzae lub Aspergillus niger. Zastosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano na przykład w EP Przedmiotem niniejszego wynalazku jest następnie sposób wytwarzania wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, składający się z wyhodowania komórki według powyższego opisu w warunkach sprzyjających ekspresji wariantu i odzyskania powstałego wariantu z hodowli. Do hodowli komórek stosować można dowolną konwencjonalną pożywkę, odpowiednią do hodowli komórek ssaków lub grzybów (w tym również drożdży), w zależności od wyboru komórki - gospodarza. Wariant wydzielany będzie przez komórki - gospodarzy do pożywki i może być z niej odzyskany przy zastosowaniu konwencjonalnych metod, obejmujących wydzielenie komórek z pożywki przez odwirowanie lub filtrację, strącenie białkopodobnych składników nadsączu lub filtrację za pomocą soli, np. siarczanu amonowego oczyszczenie za pomocą różnych metod chromatograficznych, na przykład chromatografii jonowymiennej lub chromatografii powinowactwa, lub tp. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również preparat farmaceutyczny, zawierający wariant domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Preparat według wynalazku może wytworzony z zastosowaniem dowolnej ze znanych metod wytwarzania preparatów farmaceutycznych, jak to na przykład opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, Typowo będzie to preparat przeznaczony do podawania ogólnego w postaci wstrzyknięć lub wlewów dożylnych i jako taki zawierać może jałową wodę albo roztwór soli fizjologicznej lub glukozy. Zamierzeniem jest uzyskanie wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, wykazującego zalety przy użyciu dla celów leczniczych proponowanych dla natywnej aprotyniny lub analogów aprotyniny o innych profilach hamowania, szczególnie dla tych celów, które wymagają zastosowania dużych dawek aprotyniny. Wskazania do leczniczego zastosowania wariantu według wynalazku wynikają z jego zdolności hamowania ludzkich proteaz serynowych, np. trypsyny, plazminy, kalikreiny, elastazy, katepsyny G i proteinazy-3, i obejmują (ale nie są do nich organiczne) ostre zapalenie trzustki, stany zapalne, małopłytkowość, zachowanie funkcji płytek krwi, ochronę narządów, gojenie się ran, wstrząs (w tym również płuco wstrząsowe) oraz stany wywołujące krwawienie hiperfibrynolityczne, rozedmę płuc, reumatoidalne zapalenie stawów, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych (ARDS), przewlekłe zapalne choroby jelit i łuszczycę, innymi słowy choroby, co do których sądzi się, że mogą być spowodowane patologicznym rozkładem białka, powodowanym przez elastazę, katepsynę G lub proteinazę-3, uwalniane z wyzwolonych PMN. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie domeny II inhibitora typu Kunitz TFPI lub jej wariantu, jak to opisano powyżej, do wytworzenia leku, służącego zapobieganiu lub leczeniu chorób lub stanów związanych z patologicznym rozkładem białka przez proteazy uwolnione z nadmiernie pobudzonych PMN. Jak to wskazano powyżej, korzystnie

10 może być jednoczesne z domeną hamującą II typu Kunitz TFPI lub jej wariantem stosowanie heparyny. Niezależnie od farmaceutycznego zastosowania opisanego powyżej, domena II typu Kunitz TFPI lub jej wariant, jak to wyszczególniono powyżej, mogą być stosowane do wyizolowania pożytecznych substancji naturalnych, np. proteaz lub receptorów, z materiału ludzkiego; substancje te bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z domeną II typu Kunitz TFPI przy zastosowaniu na przykład testów przesiewowych lub chromatografii powinowactwa. PRZYKŁADY Metody ogólne. Postępowano zgodnie z opisanymi standardowymi technikami DNA (Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Wytworzono syntetyczne oligonukleotydy przy pomocy automatycznego urządzenia do syntezy DNA (380B, AppIled Biosystems), stosując metodę fosfamidynową na regulowanym podłożu ze szkła porowatego (Beaucage, F. L. i Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, (1981), ). Określono sekwencję DNA z zastosowaniem techniki terminacji dwudezoksy łańcucha (Sanger, F., Micklen, S. i Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74 (1977), ). Przeprowadzono polimerazowe reakcje łańcuchowe (PCR) przy pomocy urządzenia do cykli cieplnych DNA (Perkin Elmer Cetus). Po hydrolizie w 6M HCl w temperaturze 110 C w uszczelnionych próżniowo rurkach przez 24 godziny, przeprowadzono analizę aminokwasów. Analizę przeprowadzono za pomocą automatycznego analizatora aminokwasów Beckman 121MB, zmodyfikowanego do procesu mikrodrążenia. Analizę sekwencji aminokwasów od końca N przeprowadzono z zastosowaniem automatycznej degradacji Edman przy pomocy urządzenia do badania sekwencji w fazie gazowej, AppIled Biosystems 470A. W celu wykrycia i ilościowego oznaczenia uwolnionych aminokwasów PTH w każdym cyklu urządzenia do badania sekwencji przeprowadzono analizę z zastosowaniem bezpośredniej chromatografii cieczowej wysokosprawnej z odwróconymi fazami. Oznaczono ciężar cząsteczkową za pomocą spektrometru masowego z desorpcją plazmy (PDMS) BIO-ION 20, wyposażonego w około 15 cm rurę wylotową, zastosowanego w trybie dodatnim. Przeanalizowano próbki o objętości 5 μl każda w zestawie napięcia przyspieszającego do 15 kv i zebrano jony dla 5 milionów rozszczepień. Dokładność oznaczenia ciężaru cząsteczkowego jonów wynosi około 0,1% dla dobrze zdefiniowanych maksimów, w przeciwnym razie jest ona nieco mniejsza. Przykład 1. Wytwarzanie drugiej domeny typu Kunitz inhibitora układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych, TFPI-2, ze szczepu drożdży KFN Z pochodzącej z wątroby ludzkiej linii komórkowej HepG2 (ATCC HB 8065) wyizolowano cdna kodujący pełnej długości TFPI i wprowadzono jako fragment 0,8 kb BamHI-XbaI do ekspresyjnego wektora ssaka, pkfn-1168, jak to zostało opisane (Pedersen, A. H., Nordfang, O., Norris, F., Wilberg F. C., Christensen, P. M., Moelle, K. B., Meidahl-Pedersen, J., Beck, T. C., Norris, K., Hedner, U. i Kisiel, W., 1990, J. Biol. Chem. 265, ). Sekwencję DNA wprowadzonego fragmentu podano w SEQ ID Nr 7. TFPI-2 kodowany jest przez nukleotydy , jak to wskazano. TFPI-2: w reakcji PCR zastosowano jako matryce 1,0 ig fragment 0,9 kb BamHI-XbaI z pkfn 1168, zawierający 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2526 (GCTGAGAGATTGGAGAAGCCAGATTTCTGCTT) i NOR-2528 (CTGT- CT AG ATT A ACC AT CTT C AC AAAT GTT). 17 3'-końcowych zasad NOR-2526 jest tożsamych z zasadami 365 do 381 genu TFPI-2 w SEQ ID Nr 7, a 21 5'-końcowych zasad jest tożsamych z zasadami 215 do 235 syntetycznego genu stanowiącego lider (zob. fig. 2) z pkfn-1000, opisanego powyżej. Sekwencja inicjująca NOR-2528 jest komplementarna do zasad 521 do 540 w SEQ ID Nr 7 i ma 5'-wydłużenie zawierające kodon zatrzymujący translację, po którym następuje miejsce XbaI. Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μl, używając zestawu handlowego (Gene- Amp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 94 przez 20 sekund, 50 przez 20 sekund i 72 przez 30 sekund. Po 19 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72

11 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 210 bp, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Lider sygnału: jako matrycy w reakcji PCR użyto 0,1 μg fragmentu 0,7 kb PvuII z pkfn-1000, opisanego poniżej, zawierającego 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1478 (GTAAAACGACGGCCAGT) i NOR-2523 (TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC). NOR-1478 jest komplementarna do sekwencji położonej bezpośrednio przed miejscem EcoRI w SEQ ID Nr 9. Sekwencja inicjująca NOR-2523 jest komplementarna do 17 3'-końcowych zasad syntetycznego genu, stanowiącego lider sygnału, pkfn-1000, zob. SEQ ID Nr 9. Przeprowadzono reakcję PCR według powyższego opisu, w wyniku czego otrzymano fragment 257 bp. Plazmid pkfn-1000 jest pochodną plazmidu ptz19r (Mead, D. A., Szczesna-Skorupa, E. i Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986), 67-74), zawierającm DNA kodujący syntetyczny peptyd drożdżowy, stanowiący lider sygnału. Plazmid pkfn-1000 opisano w WO 90/ Sekwencję DNA 235 bp, położona za miejscem EcoRI pkfn-1000, i kodowaną sekwencję aminokwasów syntetycznego drożdżowego lidera sygnału podano w SEQ ID Nr 9. Lider sygnału TFPI-2: zmieszano po około 0,1 (Ig każdego z dwóch fragmentów PCR opisanych powyżej. Przeprowadzono reakcję PCR z użyciem 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1478 i NOR-2528, stosując następujący cykl: 94 przez 1 minutę, 50 przez 2 minuty i 72 przez 3 minuty. Po 16 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Powstały fragment 442 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1 % żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pmt636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pmt 636. Plazmid pmt-636 opisany jest w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym Nr PCT/DK88/ pmt636 jest wahadłowym wektorem pochodzącym z E. coli - S. cerevisiae, zawierającym gen TPI (POT) ze Schizosaccharomyces pombe (Russell, P. R., Gene 40 (1985) ), promotor i sekwencję terminacyjną (terminator) izomerazy triozofosforanu S. cerevisiae, TPIp i TPIt (Alber, T. i Kawasaki, G J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), ). Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r-, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2, prawidłowo wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału. Wybrano jeden plazmid pkfn-1605 do dalszego zastosowania. Budowę plazmidu pkfn przedstawiono na fig. 1. Kaseta ekspresji plazmidu pkfn-1605 zawiera następującą sekwencję: TPIp - lider sygnału KFN TFPI2 - TPIt Sekwencję DNA fragmentu 412 pb EcoRI-XbaI z pkfn-1605 przedstawiono w SEQ ID Nr 11. Transformacja drożdży: szczep S. cerevisiae MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) hodowano na pożywce YPGaL (1% wyciągu drożdżowego Bacto, 2% peptonu Bacto, 2% galaktozy, 1% mleczanu) do gęstości optycznej wynoszącej 0,6 w 600 nm. 100 ml hodowli zebrano poprzez odwirowanie, przepłukano 10 ml wody, ponownie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitu, 25 mm Na2EDTA o odczynie ph=8,0 i 6,7 mg/ml ditiotreitu. Zawiesinę inkubowano w 30 C przez 15 minut, następnie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitu, 10 mm Na2EDTA, 0,1 M cytrynianu sodowego o odczynie ph=5,8 i 2 mg preparatu Novozym 234. Zawiesinę inkubowano w 30 C przez 30 minut, komórki zebrano przez odwi- rowanie, przepłukano 10 ml 1,2 M sorbitu i 10 ml CAS (1,2 M sorbitu, 10 mm CaCh, 10 mm Tris HCl (Tris=Tris(hydroksymetylo)aminometan, ph=7,5) i ponownie zawieszono w 2 ml CAS. Dla transformacji zmieszano 0,1 ml komórek ponownie zawieszonych w CAS z około 1μg plazmidu pknf-1605 i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodano 1 ml (20% glikol polietylenowy 4000, 20 mm CaCh, 10 mm CaCh, 10 mm Tris HCl, ph=7,5) i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odwirowano, a granulkę ponownie zawieszono w 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitu, 33% obj. YPD,

12 ,7 mm CaCh, 14 μg/ml leucyny) i inkubowano w 30 C przez 2 godziny. Zawiesinę odwirowano, a granulkę ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbitu. Następnie dodano 6 ml specjalnego agaru (pożywka SC według Sherman i in., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) zawierająca 1,2 M sorbitu i 2,5% agar) w 52 C i zawiesinę wylano na wierzch płytek zawierających tę samą pożywkę z sorbitem, zestaloną agarem. Po 3 dniach w 30 C kolonie transformacyjne pobrano, ponownie wyizolowano i zastosowano do zapoczątkowania hodowli płynnych. Wybrano jedną taką kolonię transformacyjną KFN-1593 do dalszej charakterystyki. Fermentacja: hodowano szczep drożdży KFN-1593 na pożywce YPD (1% wyciągu z drożdży, 2% peptonu (z Laboratoriów Difco) i 3% glukozy). 1 litr hodowli szczepu wytrząsano w 30 C do uzyskania gęstości optycznej wynoszącej 24 w 650 nm. Po odwirowaniu wyizolowano nadsącz. Oczyszczenie: nadsącz drożdży (1000 ml) o odczynie doprowadzonym do ph=3,0 za pomocą kwasu fosforowego, nałożono na kolumnę Szybkiego Przepływu S-Sefarozy (Pharmacia, 2,6 x 3,6 cm) zrównoważoną 25 mm dwuwodorofosforanu sodowego o odczynie ph=3,5. Po przepłukaniu buforem równoważącym, TFPI-2, przetestowany ze względu na aktywność hamowania trypsyny, eluowano buforem zawierającym 1 M chlorku sodowego (40 ml). Na kolumnie Sephadex G-25 (Pharmacia, 2,6 x 34 cm), zrównoważonej i eluowanej wodorowęglanem amonowym o odczynie ph=7,5, uzyskano odsolenie. Dalszego oczyszczenia dokonano stosując kolumnę Mono S (Pharmacia, 0,5 x 5 cm) poprzez elucję gradientową w czasie 23 minut przy prędkości przepływu 1 ml/min z chlorku sodowego od 0 do 0,43 M w 25 mm dwuwodorofosforanie sodowym, 10% obj. nitrylu octowym przy odczynie o ph=3,5. N-glikozylowany TFPI-2 i nieglikozylowany TFPI-2 eluowane były, w odpowiednio, 0,20 M i 0,26 M chlorku sodowym. Ostatecznego oczyszczenia nieglikozylowanego TFPI-2 dokonano, przez chromatografię cieczową wysokosprawną z odwróconymi fazami, na kolumnie C18 (Novo Nordisk A/S, 0,4 x 25 cm) poprzez elucję gradientową przez 30 minut z prędkością przepływu 1 ml/min w nitrylu octowym od 0 do 50% i 0,1 % kwasie trójfluorooctowym. TFPI-2 eluowano w 40% nitrylu octowym. Oczyszczony produkt liofilizowano i ponownie rozpuszczono w wodzie do stężenia około 200 nm. Jednakowej objętości próbki tego roztworu analizowano ze względu na skład aminokwasowy (tabela 1), sekwencję aminokwasów, ciężar cząsteczkowy (PDMS; stwierdzony: MW 6840,8, z obliczeń: 6840,6) i aktywność hamującą proteazy. Przykład 2. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T 191] ze szczepu drożdży KFN W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 μg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2 z plazmidu pkfn Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTCTTGC) i M-460 (GTTATTAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTACATATTCCAGGATC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGA- ATGA) i M-459 (GATCCTGTATGTAAAGCTCGT ATTATC AGGT ATTTTT AT A AC). NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-460 jest komplementarny do pozycji 263 do 307 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem sześciu niekomplementamych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-459 jest komplementarny do M-460. Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μl, używając zestawu handlowego (Gene- Amp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 1 minutę i 72 przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 444 bp z pierwszej PCR i fragment 285 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 μg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 2 minuty i 72 przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut.

13 Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1 % żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb Ncol-XbaI z pmt636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pmt636. Plazmid pmt-636 opisany jest w przykładzie 1. Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r-, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T 191], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału. Wybrano jeden plazmid pkfn-1798 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pkfn-1798 przedstawiono w SEQ ID Nr 13. W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pkfn-1798, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1811 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1. Przykład 3. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN Oczyszczono KFN 1593 z pożywki hodowlanej drożdży, jak to opisano w przykładzie 1. Stężenie KFN 1593 określono używając 1% E280nm=8,3 i Mw=6500. Trypsyna świńska pochodziła z firmy Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dania), chymotrypsyna bydlęca (poddana obróbce TLCK) i świńska kalikreina trzustkowa pochodziły z firmy Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA), a ludzka plazmina i ludzka kalikreina osoczowa pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). Ludzką neutrofilową elastazę i katepsynę G oczyszczono z wyciągów z PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), ). Substraty nitroanillidu peptydylowego S2251, S2586, S2266, S2302 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). M4765 i S7388 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA), a FX-a - z firmy NycoMed (Oslo, Norwegia). Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami KFN-1593 przez 30 minut. Następnie dodano substraty i zmierzono w 405 nm resztkową aktywność proteinazową. Wyniki przedstawiono na Fig. 2 i Fig. 3. Niemodyfikowana domena II typu Kunitz TFPI (KFN 1593) jest inhibitorem trypsyny (K1 = 5 x 10-9M) i czynnika X (K1=150 nm). KFN 1593 wykazuje umiarkowane hamowanie plazminy i elastazy neutrofilowej, podczas gdy w zasadzie nie stwierdza się hamowania katepsyny G i kalikrein. T a b e l a 1 Aminokwas TFPI-2 Aminokwas TFPI-2 Teoret. Wykryto Teoret. Wykryto Ala 0 0,31 Leu 3 3,04 Cys 6 5,14 Met 1 0,82 Asx 9 8,94 Pro 2 2,08 Glx 9 9,25 Arg 3 2,86 Phe 5 4,89 Ser 0 0,17 6 6,01 Thr 3 2,92 His 0 0,13 Val 0 0,16 Ile 3 2,82 Trp 0 - Lys 4 4,12 Tyr 4 3,75 W sumie 58 57,41 Przykład 4. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R] ze szczepu drożdży KFN-1867.

14 W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 μg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] z plazmidu pknf Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAG- TCTTGC) i M-462 (CCAGTGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAG- TGGCTCATGA) i M-461 (GGTGGATGCAGGGGCAATATCAATTTTGAGA- CACTGG). NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-462 jest komplementarny do pozycji 341 do 380 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem dwóch niekomplementarnych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-461 jest komplementarny do M-462. Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μl, używając zestawu handlowego (Gene- Amp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95 przez 1 minutę; 50 przez 1 minutę i 72 przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 518 bp z pierwszej PCR i fragment 209 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 μg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 2 minuty i 72 przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pmt636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pmt636. Plazmid pmt-636 opisany jest w przykładzie 1. Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r\ m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T191, L39R], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału. Wybrano jeden plazmid pkfn-1861 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pkfn-1861 przedstawiono w SEQ ID Nr 15. W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pkfn-1861, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1867 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T 191, L39R] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1. Przykład5. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, Tl 91, L39R, E46K] ze szczepu drożdży KFN W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 (J.g fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] z plazmidu pknf Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAG- TCTTGC) i M-464 (CCAGTGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAG- TGGCTCATGA) i M-463 (GGTGG ATGC AGGGGC A AT AT G A AC A ATTTT A AGA- CACTGG). NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-464 jest komplementarny do pozycji 341 do 380 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem trzech niekomplementarnych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-463 jest komplementarny do M-464. Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μl, używając zestawu handlowego (Gene- Amp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 1 minutę i 72 przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 518 bp z pierwszej PCR i fragment 209 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 μg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95 przez

15 minutę, 50 przez 2 minuty i 72 przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pmt636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pmt636. Plazmid pmt-636 opisany jest w przykładzie 1. Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r-, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T191, L39R, E46K], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału. Wybrano jeden plazmid pkfn-1862 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pkfn-1862 przedstawiono w SEQ ID Nr 17. W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pkfn-1798, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1868 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T 191, L39R, E46K] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1. Przykład 6. Mutacja wielokrotna TFPI-2 w pozycjach 15 i 16. W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 μg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2 z plazmidu pkfn Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTCTTGC) i M-749 (AAT ACCTGGT AAT AT AA(C/G)C(C/G) A( A/C) AC AT ATTCC AGG ATC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGA- ATGA) i M-750 (GATCCTGTATGT(T/G)T(C/G)G(C/G)TTATATTACCAGGTATT) NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-749 jest komplementarny do pozycji 263 do 299 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem czterech niekomplementamych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-750 jest komplementarny do M-749. Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μl, używając zestawu handlowego (Gene- Amp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 1 minutę i 72 przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 439 bp z pierwszej PCR i fragment 285 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 μg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95 przez 1 minutę, 50 przez 2 minuty i 72 przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72 utrzymywano przez 10 minut. Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 2,8 kb NcoI-XbaI z plazmidu ptz19r (Mead, D. A., Szczesna-Skopura, E. i Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986) 67-74). Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r-, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonując DNA zidentyfikowano następujące sześć plazmidów kodujących wskazane analogi TFPI wbudowane w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.

16 Plazmid pkfn-1885 pkfn-1883 pkfn-1905 pkfn-1882 pkfn-1887 pkfn-1886 Analog TFPI-2-[R15F] TFPI-2-[R15F, G16A] TFPI-2-[R15L] TFPI-2-[R15L, G16A] TFPI-2-[R15 V] TFPI-2-[R15V, G16A] Fragmentów 412 bp RcoRI-XbaI z tych plazmidów użyto do wytworzenia plazmidów ekspresyjnych, jak to opisano w przykładzie I. Transformacja szczepu drożdży MT-663, opisana w przykładzie 1, dała w wyniku następujące szczepy drożdży: Szczep drożdży Analog KFN-1896 KFN-1894 KFN-1928 KFN-1893 KFN-1898 KFN-1897 TFPI-2-[R15F] TFPI-2-[R15F, G16A] TFPI-2-[R15L] TFPI-2-[R15L, G16A] TFPI-2-[R15 V] TFPI-2-[R15V, G16A] Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1811 w pożywce YPD, analizę pod kątem analogów TFPI-2 w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1. Przykład 8. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN 1811, 1867 i Z pożywki hodowli drożdży oczyszczono trzy warianty TFPI (domena II). Ich stężenia określono według absorbancji w 214 nm przy zastosowaniu BTPI jako standardu. Końcowe stężenie określono przez miareczkowanie trypsyną. Trypsynę ludzką i ludzkie białka rekombinacyjne, czynnik VIIa, aktywowane białko C (ACP) i tpa uzyskano z firmy Novo Nordisk A/S (Bagvaerd, Dania), podobnie jak ludzką trombinę. Bydlęcą chymotrypsynę i kalikreinę gruczołową uzyskano z firmy Siga Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Niepełny ludzki tkankowy czynnik rekombinacyjny otrzymano z firmy Corvas (San Diego, Kalifornia, USA). Ludzką neutrofilową katepsynę G oczyszczono z wyciągów PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), ). Ludzka plazmina pochodziła z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja), upa pochodziła z firmy Serono (Mediolan, Włochy), ludzki czynnik Xa był darem od dr. W Kisiel (Albuquereque, stan Nowy Meksyk, USA), a ludzka kalikreina osoczowa była darem od dr. I. Schousboe (Kopenhaga, Dania). Substraty nitroanilidu peptydylowego S2251, S2302, S2266, S2586, S2288, S2444, S2366 i S2238 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). S7388 i M4765 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a czynnik Xa-1 pochodził z firmy Nycomed (Oslo, Norwegia). Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami wariantu domeny Kunitz przez 30 minut. Następnie dodano substrat (0,6 mm) i zmierzono resztkową aktywność proteinazową w 405 nm. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Te trzy warianty stanowią silne swoiste inhibitory plazminy, nie powodując jednocześnie znaczącego hamowania innych testowanych proteinaz osoczowych. Tabela 1 Enzym Stężenie enzymu Substrat Składowa K1(nM) K FN 1811 K FN 1867 KFN Trypsyną 10 nm S2251 <<1 <<1 <<1

17 cd. tabeli Plazmina 4nM S Elastaza neutrof. 10 nm M4765 n.i. n.i. n.i. Neutr. katepsyna G 50 nm S7388 n i n.i. n.i. Kalikreina osocz. 3nM S2302 >100 >100 >100 Kalikreina grucz. 1 U/ml S2266 >100 >100 >100 Chymotrypsyna 2,5 nm S tpa 10 nm S2288 n i. n.i. n.i. Czynnik VIIa/TF 10 nm/15 nm FXa-1 n.i. n.i. n.i. Czynnik Xa 3 nm FXa-1 n.i. n.i. n.i. upa 5 nm S2444 n.i. n.i. n.i. APC 5 nm S2366 n.i. n.i. n.i. Trombina 3 NIHu/ml S2238 n.i. n.i. n.i. Przykład 9. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN 1893, 1897, 1898 i Z pożywki hodowli drożdży oczyszczono cztery warianty TFPI (domena II). Ich stężenia określono według absorbancji w 214 nm przy zastosowaniu BTPI jako standardu. Trypsynę świńską uzyskano z firmy Novo Nordisk A/S (Bagvaerd, Dania), chymotrypsynę bydlęcą (poddaną obróbce TLCK) uzyskano z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Niepełny ludzki tkankowy czynnik rekombinacyjny uzyskano z firmy Corvas (San Diego, Kalifornia, USA). Ludzką plazminę uzyskano z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). Ludzką neutrofilową katepsynę G i elastazę oczyszczono z wyciągów PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), ). Substraty nitroanilidu peptydylowego S2251, S2586 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). S7388 i M4765 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami wariantu domeny Kunitz przez 30 minut. Następnie dodano substrat (0,6 mm) i zmierzono resztkową aktywność proteinazową w 405 nm. Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Stwierdzono, że te cztery warianty domeny II Kunitz TFPI (KFN 1893, 1897, 1898, 1928) stanowią silne inhibitory elastazy neutrofilowej. Tabela 2 Enzym Stężenie enzymu Substrat Składowa K1 (nm) KFN 1893 KFN 1897 KFN 1898 KFN 1928 Trypsyna 10 nm S2251 n.i. n.i. n.i. n.i. Chymotrypsyna 2,5 nm S2568 <5 w.i. w.i. <5 Elastaza neutrof. 4 nm M4765 0,23 0,46 0,35 2,2 Neutr. katapsyna G 50 nm S7388 n.i. n.i. n.i. n.i. Plazmina 4 nm S2251 n.i. n.i n.i. n.i n.i. - brak hamowania w stęż. <1 μm; w.i. słabe hamowanie w 100 nm

18 WYDRUK SEKWENCJI. (1) INFORMACJA OGÓLNA: (i) ZGŁASZAJĄCY: (A) NAZWA: Novo Nordisk A/S (B) ULICA: Novo Alle (C) MIASTO: Bagsvaerd (E) KRAJ: Dania (F) KOD POCZTOWY: DK-2880 (G) TELEFON: (H) TELEFAKS: (I) TELEKS: (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Wariant inhibitora proteaz ludzkich typu Kunitz. (iii) LICZBA SEKWENCJI: 18 (iv) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA: (A) TYP NOŚNIKA: dysk elastyczny (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 1: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 57 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iv) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 1: Xaa Asp Phe Cys Phe Leu Asp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Met Asn Asn Phe Xaa Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp Xaa (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 57 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 2: Xaa Asp Phe Cys Phe Leu Asp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Tyr Asn Xaa Gln Xaa Lys Gln Cys Arg Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Met Asn Asn Phe Xaa Thr Leu Cys Lys Asn Iie Cys Asp Xaa 50 55

19 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 3: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3: Lys Fro Asp Phe Cys Phe Leu Siu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln C ys Arg Phe Lys Tyr Cys Leu Asn Met Asn Asn Phe Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 4: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe L ys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Arg Phe Lys Tyr Cys Arg Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp 50 55

20 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 6: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn G ln Thr Lys G ln Cys Arg Phe Val Tyr 20 Cys Arg Ala 25 Lys Met Asn Asn Phe 30 Lys Thr Leu Cys Lys Asn Ile Cys Asp 55 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 7: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 495 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (C) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cdna (iv) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7: GGATCCT TCCACCATGA AAGTACA TGCACTTTGG GCTTCTGTAT GCCTGCTGCT 60 TAATCTTGCC CCTGCCCCTC TTAATGCTGA TTCTGAG GATC ACACAATTAT 120 CACAGATACG GAGTTGCCAC CACTACT TATGCATTCA TTTTGTGCAT TCAA6GCGGA 180 TGATGGCCCA TGTAAAGCAA TCATAAG ATTTTTCTTC AATATTTTCA CTCGACAGTG 240 C G A A G A A T T ATATATGGGG GATGTGG AAATCAT CGATTTA GTCTGGA 300 GTSCAAAAAA ATG T G TACAA GAGATAATGC A AACAGGAT ATAAAGACAA CATTGCAACA 360 A AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAT CCT GGA ATA TGT CGA 409 Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Asp Pro Ile Cys Arg GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT 457 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn G ln Thr Lys G ln Cys CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA 505 Arg Phe Lys Tyr 35 Cys Leu 40 Asn Met Asn Asn Phe 45 Thr