(86)Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/US94/13268

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "(86)Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 29.12.1994,PCT/US94/13268"

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) (13) B1 (21 ) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86)Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/US94/13268 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W096/20724, PCT Gazette nr 31/96 (51) IntCl7 Â61K 38/28 C12N 15/17 A61P3/10 (54) Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipepty d hybrydowy (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 24/97 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/01 (73) Uprawniony z patentu: BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP., Iselin, US (72) Twórcy wynalazku: Jacob R. Hartman, Holon, IL Simona Mendelovitz, Tel Aviv, IL Marian Górecki, Rehovot, IL (74) Pełnomocnik: Muszyński Andrzej, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący m ikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znam ienny tym, że obejmuje: (a)otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie; (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego; (c)ufałdow yw anie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie; (d)poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny; (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.

2 Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydow y Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znamienny tym, że obejmuje: (a)otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie; (b)odzyskiw anie polipeptydu hybrydowego; (c)ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie; (d)poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny; (e)oczyszczania tak wytworzonej insuliny. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid został wybrany z grupy składającej się z pdbast-lat zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69361, p λbast-lat zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69363, pbast-r zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresjonowanie z etapu (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odzyskiwanie w etapie (b) obejmuje: (i)niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu; (ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu z lizatu przez wirowanie; i (iii)rozpuszczanie precypitatu. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w etapie (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ph wynosi 11,0-11, Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że inkubacja zachodzi w obecności kwasu askorbinowego. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że ph wynosi 11,0-11, Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie. 10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin. 11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (d) obejmuje ponadto: (i) doprowadzanie ph do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze C w ciągu 30 minut do 16 godzin. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose.

3 Polipeptyd hybrydowy zawierający proinsulinę i peptyd liderowy połączony z N końcem proinsuliny, przy czym polipeptyd ten jest ufałdowany i posiada właściwe wiązania dwusiarczkowe. 17. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że peptyd liderowy pochodzi z N końca CuZnSOD. 18. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 17, znam ienny tym, że peptyd liderowy obejmuje poprzedzone przez aminokwas Met, 62 aminokwasy, po których następuje reszta Arg. 19. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg. 20. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny dwupeptydem Lys-Arg. 21. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znam ienny tym, że reszty cysteiny peptydu liderowego zostały zastąpione resztami seryny. * * * W opisie tym znajdująsię odniesienia do różnych publikacji poprzez liczby arabskie w nawiasach. Pełne informacje na temat tych odnośników można znaleźć przy końcu opisu. Ujawnienia tych publikacji, poprzez odnośniki literaturowe, włączono w ten sposób w całości do opisu w celu pełniejszego opisania stanu wiedzy, której dotyczy ten wynalazek. Insulina jest hormonem polipeptydowym mającym zasadnicze znaczenie w kontrolowaniu metabolizmu glukozy i podaje się ją codziennie pacjentom cierpiącym na cukrzycę, zaburzenie metaboliczne charakteryzujące się niedostatecznym dostarczaniem insuliny. In vivo hormon syntetyzowany jest najpierw w postaci długiej cząsteczki prekursorowej, następnie modyfikowany do jej postaci aktywnej biologicznie, składającej się z łańcucha A i łańcucha B. Bardziej szczegółowo, gen preproinsuliny ulega transkrypcji w komórkach beta gruczołu wydzielania wewnętrznego, trzustki, na prekursor mrna, z którego wycinane są następnie introny, z wytworzeniem dojrzałego mrna. mrna ten ulega translacji na preproinsulinę (NH2 preregion-łańcuch B-peptyd C-łańcuch A-COOH), która następnie ulega modyfikacjom z utworzeniem proinsuliny i ostatecznie insuliny. Pierwszym etapem modyfikacji jest proteolityczne usunięcie preregionu, który służy jako hydrofobowa sekwencja sygnałowa do przenoszenia powstającego łańcucha przez błony mikrosomalne szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W preproinsulinie ludzkiej długość preregionu wynosi 24 aminokwasy. W proinsulinie dwa regiony łańcucha polipeptydowego, które staną się dojrzałą insuliną, łańcuchy B i A, połączone są ze sobą peptydem C (lub łańcuchem C), który zawiera w końcach N i C dwie pary aminokwasów zasadowych. W większości peptydów C parami tymi są Arg-Arg i Lys-Arg. Ludzki peptyd C, włącznie z dwiema flankującymi parami aminokwasów zasadowych, obejmuje 35 aminokwasów. Peptyd C łączy dwie części polipeptydu w celu wspomagania tworzenia właściwych mostków dwusiarczkowych pomiędzy odcinkami A i B. Dlatego też, rola peptydu C nie zależy w znacznej mierze od jego struktury. W rzeczywistości, jego zastąpienie przez krótszy syntetyczny mostek nadal umożliwia właściwe ufałdowanie cząsteczki proinsuliny (1,2). Ufałdowywanie proinsuliny następuje z towarzyszącym utlenieniem dwóch międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych i jednego wiązania dwusiarczkowego w łańcuchu A. Na ostatnim etapie dojrzewania enzymy proteolityczne rozszczepiają przy aminokwasach zasadowych z uwolnieniem peptydu C i utworzeniem dojrzałej insuliny (3). W insulinie człowieka łańcuch A ma długość 21 aminokwasów, podczas gdy łańcuch B ma długość 30 aminokwasów. Światowe zapotrzebowanie na insulinę przekracza kilka ton rocznie i istnieje silny deficyt podaży. Tradycyjnie, insulinę wytwarzano z ograniczonych źródeł zwierzęcych, głównie preparatów trzustkowych bydła i świni. Insulina ta różni się od insuliny ludzkiej i może wywoływać niekorzystną reakcję immunologiczną. Badania przeprowadzone w latach 1960-tych zademonstrowały wytwarzanie insuliny in vitro. Syntezę insuliny uzyskano przez połączenie łańcuchów A i B w postaci S-sulfonowanej (4)

4 lub przez spontaniczne ponowne utlenianie zredukowanej proinsuliny (5).Ta ostatnia metoda nie była praktyczna do wytwarzania insuliny na dużą skalę z powodu bardzo niskiego stężenia białka w mieszaninie, w której zachodzi utlenianie. Insulinę można następnie odzyskać po traktowaniu trypsyną i karboksypeptydazą B (6). Ostatnio dostępna stała się półsyntetyczna i biosyntetyczna insulina ludzka. Półsyntetyczną insulinę ludzką wytwarza się z insuliny świni przez katalizowaną trypsyną wymianę alaniny na treoninę w pozycji 30 łańcucha beta (jedyna różnica pomiędzy insuliną świni i człowieka). Zrekombinowana insulina ludzka wytwarzana albo w E. coli, albo drożdżach, przypuszczalnie zastąpi insuliny wytwarzane wszystkimi innymi drogami. Biosyntetyczną zrekombinowaną insulinę ludzką produkuje się obecnie dwiema drogami: albo przez wytwarzanie oddzielnie łańcuchów A i B w E. coli i następnie ich łączenie (7,8), albo przez enzymatyczne przekształcenie polipeptydów podobnych do proinsuliny, otrzymywanych przez ekspresję albo w E. coli (1,8), albo drożdżach (2,9). W większości przypadków proinsulinę wytwarza się jako białko hybrydowe, które ulega akumulacji jako białko sprecypitowane wewnątrzkomórkowo. Hybrydę tę oczyszcza się normalnie i rozszczepia CNBr w celu uwolnienia polipeptydu proinsuliny. Ten ostatni modyfikuje się dalej przez oksydacyjną siarczynolizę do S-sulfonianu proinsuliny. Następnie S-sulfonian proinsuliny oczyszcza się i poddaje ufałdowaniu w warunkach redukujących z utworzeniem proinsuliny (8). Przekształcenie proinsuliny w insulinę uzyskuje się przez połączone działanie trypsyny i karboksypeptydazy B (6). Publikacja europejskiego opisu patentowego numer B 1, przyznanego Novo Nordisk A/S, opisuje proinsulinę o wzorze B-Lys-Arg-A i jej zastosowanie do przygotowywania insuliny w drożdżach. Publikacja europejskiego opisu patentowego numer B 1, przyznanego Chiron Corp., opisuje białko hsod-proinsuliny wytwarzane przez drożdże. Białko hsod-proinsuliny poddaje się przed ufałdowywaniem rozszczepieniu bromkiem cyjanu i siarczynolizie. Hoechst ujawnia w publikacji europejskiego opisu patentowego numer , że błędne rekombinanty prekursorów insuliny (tj. zrekombinowane produkty insuliny z niewłaściwymi lub częściowo niewłaściwymi międzycząsteczkowymi mostkami dwusiarczkowymi) można przekształcać we właściwe produkty insuliny bez siarczynolizy przez poddawanie błędnych rekombinantów reakcji z nadmiarem markaptanu w środowisku wodnym w obecności organicznego układu oksydoredukcyjnego. Pierwotny etap siarczynolizy występuje po odszczepieniu (chemicznym lub enzymatycznym) z polipeptydu fuzyjnego rodnika aminokwasowego lub peptydowego (co zachodzi po lizie komórki gospodarza), po tym sześć reszt cysteiny prekursora insuliny przekształca się w ich S-sulfoniany. W kolejnym etapie renaturacji z tego S-sulfonianu proinsuliny wytwarza się naturalną proinsulinę przez utworzenie trzech właściwych mostków dwusiarczkowych. Podczas tego etapu renaturacji wytwarzane są tak zwane błędne rekombinanty. Hoechst ujawnia ponadto, w publikacji PCT międzynarodowego opisu patentowego numer WO 91/03550, sposób przygotowywania białek fuzyjnych obejmujących pożądane białko (np. proinsulinę) i składnik balastowy. Przed ufałdowywaniem przeprowadza się siarczynolizę, podczas gdy składnik balastowy odszczepia się jednocześnie z łańcuchem C proinsuliny, po ufałdowaniu. Ponadto, Hoechst opisuje w europejskim opisie patentowym numer B 1 mini-proinsulinę (B-Arg-A) i jej zastosowanie do przygotowywania mono-arg insuliny i insuliny. Opisują oni dalej białka fuzyjne, które obejmują B-Arg-A i składnik balastowy. Składnik balastowy odszczepia się przez działanie bromkiem cyjanu i przeprowadza siarczynolizę przed ufałdowywaniem polipeptydu. Wynalazek ten ujawnia wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej ulepszonym i wydajnym sposobem. Zrekombinowane polipeptydy hybrydowe proinsuliny, obejmujące sekwencję liderową, syntetyzuje się w E. coli. Po częściowym oczyszczeniu poddaje się je ufałdowaniu z wciąż przyłączonym peptydem liderowym w warunkach, które umożliwiają poprawne ufałdowanie. Aktywną biologicznie insulinę ludzką wytwarza się następnie przez łączne traktowanie trypsyną i karboksypeptydazą B, w wyniku czego enzymy te odszczepiają jednocześnie

5 peptyd łiderowy i łańcuch C. Oczyszczona insulina ludzka jest zatem identyczna z naturalnie występującą insuliną ludzką. Z tego nowego sposobu wyeliminowano niebezpieczne i niedogodne procedury związane z trawieniem polipeptydów hybrydowych CNBr i siarczynolizą stosowaną do blokowania licznych grup SH, ponieważ cały polipeptyd hybrydowy proinsuliny można efektywnie ufałdować w jego strukturę natywną nawet w obecności peptydu liderowego i nie zablokowanych reszt cysternowych. Aktywną zrekombinowaną insulinę ludzką uwalnia się przez trawienie proteolityczne i następnie oczyszcza. Krótki opis figur Mapy restrykcyjne trzech plazmidów przedstawionych na figurach 3-5 nie określają wszystkich miejsc restrykcyjnych obecnych w tych plazmidach. Jednakże, przedstawiono te miejsca restrykcyjne, które konieczne są do pełnego zrozumienia wynalazku. Figura 1: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pbast-r. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD. Figura 2: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pdbast-lat lub p λjbast-lat. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD. Figura 3: Struktura plazmidu pbast-r, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC Figura 4: Struktura plazmidu pdbast-lat, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptydhybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC Figura 5: Struktura plazmidu p λ,bast-lat, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC Figura 6: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowa DNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, ulegającego ekspresji by plazmid pbast-r. Figura 7: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowa DNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, eksprymowanego przez plazmidy pdbast-lat i p λbast-lat. Figura 8: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast w zależności od ph mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego proinsuliny (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono w różnych ph, jak wskazano, w 100 mm buforze glicynowym, w temperaturze 4 C w ciągu około 16 godzin, przy stężeniu albo 1 mg/ml, albo 0,5 mg/ml polipeptydu hybrydowego. Ufałdowany materiał traktowano trypsyną(1 :500 w/w) w ciągu 30 minut w temperaturze 37 w ph 9 i oznaczano pod kątem immunoreaktywnej (IR) insuliny stosując oznaczenie radioimmunologiczne z wykorzystaniem 125J-insuliny (Amersham) i zrekombinowanej insuliny ludzkiej (Calbiochem) jako standardu. Figura 9: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozpuszczono w 8 M m oczniku, 5 mm H Cl w stężeniu około 30 m g/m l i rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml 100 mm glicyną-naoh, ph 11,0. Ufałdowywanie prowadzono w temperaturze 22 C (temperatura pokojowa) w ciągu 20 godzin. ph roztworu doprowadzono następnie HCl do 8,8. Dodano karboksypeptydazę B (1:1000 w/w, Sigma) i trypsynę (1:2000 w/w, Sigma) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37 C w ciągu 60 minut. Mieszaniny, w których prowadzono trawienie zakwaszono do ph 3 przed rozcieńczeniem 10 mm HCl. Próbki o objętości 150 μl analizowano przez wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) na kolumnie 5 μ Lichrosphere 100 RP-8 (Merck) o wymiarach 250 x 4 mm, którą równoważono 50 mm fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mm NaClO4, ph 3, zawierającym 31,5% (v/v)

6 acetonitryl. Kolumnę rozwijano liniowym gradientem 31,5-40,5% acetonitrylu podczas 75 minut przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Monitorowano absorbancję przy długości fali 220 nm. A: 5 μg insuliny standardowej (Boehringer-Mannheim); B: zrekombinowana insulina ludzka wytworzona w następstwie traktowania enzymatycznego; C: ufałdowany polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina. Figura 10: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od ph mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie. Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh posiadającym wskazane wartości ph i poddawano ufałdowaniu w temperaturze 22 C w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymami i analizę RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9. Ilość zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego obliczono na podstawie pola powierzchni piku, który posiadał ten sam czas retencji jak insulina standardowa. Figura 11: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od stężenia kwasu askorbinowego w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh w temperaturze 22 C w ph 11,2 w obecności wskazanych stężeń kwasu askorbinowego. Próbki traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B (jak dla figury 9) po 5- i 25-godzinnych okresach ufałdowania. Wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej analizowano metodą RP-HPLC (jak dla figury 9). Figura 12: Autentyczność insuliny ludzkiej wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowgo SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mm buforze glicyna-naoh, ph 11,2, i w obecności 1,2 mm kwasu askorbinowego w temperaturze 22 C w ciągu 16 godzin. Po traktowaniu enzymatycznym (jak dla figury 9), mieszaninę poddano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose zrównoważonej 20 mm Tris-HCl, ph 8. Zrekombinowaną insulinę ludzką eluowano liniowym gradientem 0-0,4 M NaCl w 20 mm Tris-HCl, ph 8. Frakcje piku połączono i zakwaszono HCl do ph 3. Zrekombinowaną insulinę ludzką oczyszczono dalej od cząsteczek insulinopodobnych przez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Główny pik zebrano, odsolono na kolumnie z Sephadex G-25 w 0,25 M kwasie octowym i zliofilizowano. Przygotowano próbki (5 μg zrekombinowanej insuliny ludzkiej) w 10 mm HCl i poddano analizie przez RP-HPLC w takich samych warunkach. A: insulina standardowa; B: zrekombinowana insulina ludzka oczyszczona przez HPLC; C: połączona próbka zrekombinowanej insuliny ludzkiej oczyszczonej przez HPLC i insuliny standardowej. Figura 13: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat w zależności od stężenia białka w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie. Polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) poddawano ufałdowaniu w 100 mm buforze glicyna-naoh, ph 11,2, przy końcowym stężeniu białka od 0,5 mg/ml do 10 mg/ml, jak wskazano. Każdą mieszaninę, w której prowadzono ufałdowywanie, wzbogacono o 2,5 mola kwasu askorbinowego na mol grup SH. Ufałdowywanie przeprowadzono w temperaturze 24 C (temperatura pokojowa) w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymatyczne i analizę przez RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9. Figura 14: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego w zależności od czasu ufałdowywania.

7 Precypitat wewnątrzkomórkowy rozpuszczono w 20 mm buforze glicyna-naoh, 33 μm EDTA, ph 11,2 w stężeniu około 2,6 A280 na ml. ph doprowadzono do N wodorotlenkiem sodowym. Roztwór pozostawiono z mieszaniem na 10 minut. ph zmiareczkowano do 11,2 stężonym kwasem solnym. Dodano węgiel aktywowany (przemyty kwasem, Sigma) do 0,1 % w/v stężenia końcowego i mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut. Zawiesinę odwirowano (20 minut, obrotów na minutę) w temperaturze 20 C. A280 sklarowanego supematantu wynosiła około 2,15. Uzupełniono kwas askorbinowy do 3 mm stężenia końcowego. Ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu proinsuliny przeprowadzono jak przedstawiono, z energicznym mieszaniem w temperaturze pokojowej (22-23 C). W różnych punktach czasowych eksperymentu (począwszy od rozpuszczenia) pobierano próbki o objętości 10 ml, miareczkowano je do ph 8,8 i trawiono karboksydazą B (1:1000 w/w) i trypsyną(1 :2000 w/w) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37 C w obecności 50 μm ZnCl2. Trawienie zakończono przez zakwaszenie. Zawartość insuliny w każdej poddanej trawieniu próbce określono przez analizę poprzez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Postęp reakcji ufałdowania przejawia się zwiększeniem ilości insuliny (po strawieniu) i obniżeniem poziomu wolnych grup tiolowych, które oznaczano w reakcji Ellmana (16). Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny ludzkiej, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu zawierającego proinsulinę w warunkach, które umożliwiają tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych, poddawanie ufałdowanego polipeptydu z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi rozszczepieniu enzymatycznemu w celu utworzenia aktywnej insuliny ludzkiej oraz oczyszczanie aktywnej insuliny ludzkiej. Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę oraz peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, przy czym polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe. Plazmidy pbast-r, pdbast-lat i pa,bast-lat zdeponowano 26 lipca 1993 r. w E. coli stosownie do, i zgodnie z wymaganiami Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytu Mikroorganizmów do Celów Procedury Patentowej w American Type Culture Collection (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerami dostępu ATCC odpowiednio 69362, i W znaczeniu tu stosowanym, polipeptyd hybrydowy obejmuje peptyd liderowy połączony kowalencyjnie z pożądanym polipeptydem. Polipeptyd hybrydowy według tego wynalazku obejmuje proinsulinę i korzystnie obejmuje SOD jako peptyd liderowy. W znaczeniu tu stosowanym, ufałdowywanie obejmuje ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę bez rozszczepiania CNBr przed ufałdowywaniem i bez siarczynolizy dla zablokowania grup SH przed ufałdowywaniem, przy czym ufałdowywanie umożliwia tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego. W znaczeniu tu stosowanym, tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego obejmuje tworzenie trzech wiązań dwusiarczkowych pomiędzy CysB7-CysA7, CysB19-CysA20 i CysA6-CysA11 insuliny (reszty cysteiny ponumerowano według ich numeracji w dojrzałej insulinie). W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina obejmuje polipeptyd obejmujący, kolejno od końca N do końca C, łańcuchy B, C i A insuliny. W znaczeniu tu stosowanym, peptyd łańcucha C insuliny obejmuje naturalnie występujący peptyd C oraz każdy inny oligopeptyd, dipeptyd lub pojedynczy aminokwas, który może zostać odszczepiony trypsynąi karboksypeptydazą B. W znaczeniu tu stosowanym, peptyd liderowy obejmuje każdy peptyd lub polipeptyd kowalencyjnie połączony z łańcuchem B insuliny, który umożliwia ufałdowanie i utworzenie wiązań dwusiarczkowych, i który można odszczepić stosując trypsynę. Korzystnie, peptydem liderowym jest SOD. W znaczeniu tu stosowanym, SOD obejmuje każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej CuZnSOD lub MnSOD, i rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną SOD, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową z sekwencją aminokwasową ta-

8 kiej części w porównaniu z naturalnie występującą SOD. DNA kodujący SOD można poddawać mutacji metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauer i in. (1985), Gene 37: Peptyd liderowy może obejmować, w miejsce SOD, każdy inny peptyd, polipeptyd lub białko, bądź każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej takiego peptydu, polipeptydu lub białka, przy czym rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną rzeczonego peptydu, polipeptydu lub białka, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową takiej części w porównaniu z sekwencją aminokwasową naturalnie występującego peptydu, polipeptydu lub białka; peptyd liderowy musi jednakże umożliwiać ufałdowanie i tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego. W znaczeniu tu stosowanym, insulina może obejmować homolog naturalnie występującej insuliny. W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina może obejmować homolog naturalnie występującej proinsuliny. W znaczeniu tu stosowanym, termin homolog dotyczący polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według tego wynalazku, oznacza polipeptyd, który posiada zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową i zasadniczo taką samą aktywność biologiczną, jak insulina. A więc, homolog może różnić się od polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według wynalazku przez dodanie, delecję lub podstawienie jednej lub więcej nie mających zasadniczego znaczenia reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że otrzymany polipeptyd zachowuje aktywność biologiczną insuliny. Specjaliści w tej dziedzinie mogą łatwo określić, które reszty aminokwasowe można dodać, wydeletować lub podstawić (włącznie z tym, jakimi aminokwasami można dokonać podstawienia) stosując ustalone dobrze znane procedury, obejmujące na przykład konwencjonalne metody projektowania i wytwarzania kodujących sekwencji DNA do bakteryjnej ekspresji homologów polipeptydowych tego polipeptydu, modyfikację sekwencji cdna i genomowych technikami ukierunkowanej mutagenezy, konstruowanie zrekombinowanych białek i wektorów ekspresyjnych oraz pomiar aktywności biochemicznej polipeptydów z zastosowaniem konwencjonalnych oznaczeń biochemicznych. Powyższa d e f i nicja homologów insuliny w równym stopniu dotyczy homologów proinsuliny. Przykłady homologów insuliny wytworzonych metodami według tego wynalazku są homologi delecyjne, zawierające mniej niż wszystkie reszty insuliny występującej naturalnie, homologi substytucyjne, w których jedną lub więcej określonych reszt zastępuje się innymi resztami, i homologi addycyjne, w których jedną lub więcej reszt dodaje się do końców lub w środkowej części polipeptydu insuliny, przy czym wszystkie homologi wykazują aktywność biologiczną insuliny. Przykładami homologów są analogi insuliny ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym numer , a także analog insuliny Humalog Eli Lilly, jak ujawniono w Eli Lilly and Company Report to Shareholders Zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową określono w niniejszym opisie jako obejmującą podstawienia i/lub delecje i/lub addycje aminokwasów w sekwencji aminokwasowej i może obejmować ona do dziesięciu (10) reszt zgodnie z grupami homologicznymi lub równoważnymi, jak opisali np. Albert L. Lehninger, Biochemistry, wydanie drugie, Worth Publishers Inc. (1975), rozdział 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Anglia (1989) oraz Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, tom 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), rozdział 9. Podstawienia takie są znane specjalistom w tej dziedzinie. DNA kodujący polipeptyd insuliny można poddawać mutacjom metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauera i in. (1985), Gene 37: Zmutowaną sekwencję można wstawiać do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, jak opisano w niniejszym opisie, które wprowadza się do komórek, poddawanych następnie traktowaniu, w wyniku którego zmutowany DNA kieruje ekspresją homologu polipeptydu. Plazmidy według tego wynalazku, zawierające sekwencję kodującą polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, m ogą być przystosowane do ekspresji w bakteriach, drożdżach,

9 grzybach lub komórkach ssaków, takich jak CHO, zarodkowe komórki kurczęcia, fibroblasty, bądź inne znane linie komórkowe, i dodatkowo zawierają elementy regulacyjne konieczne do ekspresji sklonowanego genu w bakteriach, drożdżach, grzybach lub komórkach ssaków, w taki sposób zlokalizowane w stosunku do kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd hybrydowy, aby umożliwiać jego ekspresję. Wymagane do ekspresji elementy regulujące obejm ują sekwencje promotorowe wiążące polimerazę RNA oraz miejsce wiążące rybosom. Plazmidy według tego wynalazku eksprym ują polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że plazmidy zdeponowane w związku z tym zgłoszeniem można łatwo zmienić znanymi technikami (np. przez ukierunkowaną mutagenezę lub wstawianie łączników), aby kodowały ekspresję homologicznych polipeptydów. Techniki takie opisano np. w Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Odpowiednie elementy regulujące są położone w plazmidzie, w stosunku do DNA kodującego polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, w taki sposób, że powodują ekspresję polipeptydu hybrydowego w odpowiedniej komórce gospodarza. W korzystnych rozwiązaniach wynalazku elementy regulujące umiejscowione są blisko przed DNA kodującym polipeptyd hybrydowy. W wynalazek ten włączone są także różne miejsca wiążące rybosomy (RBS) dla nadania mrna ulegającemu transkrypcji z DNA kodującego obejmujący proinsulinę polipeptyd hybrydowy zdolności wiązania z rybosomami w komórce gospodarza, takie jak RBS deo. Plazmidy według wynalazku zawierają także kodon inicjacji ATG. DNA kodujący polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę znajduje się w jednej ramce odczytu z kodonem inicjacji ATG. Plazmidy według wynalazku zawierają także sekwencję DNA obejmującą miejsce początku replikacji z plazmidu bakteryjnego zdolnego do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza. Odpowiednie miejsca początku replikacji można otrzymać z licznych źródeł, takich jak plazmid pbr322 (numer dostępu ATCC 37017). Plazmidy według tego wynalazku zawierają także sekwencję DNA, która zawiera gen odpowiedzialny za cechę fenotypową umożliwiającą selekcję lub identyfikację, która przejawia się, gdy plazmid obecny jest w komórce gospodarza, taki jak gen oporności, np. oporności na ampicylinę, chloramfenikol lub tetracyklinę. Przykładami wektorów, które można stosować do ekspresji kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy hybrydowe (obejmujące proinsulinę) są wirusy, takie jak wirusy bakteryjne, np. bakteriofagi (takie jak fag lambda), kosmidy, plazmidy i inne wektory. Geny kodujące polipeptydy hybrydowe obejmujące proinsulinę wstawia się do odpowiednich wektorów metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, wykorzystując konwencjonalne miejsca rozpoznawane przez enzym endonukleazę restrykcyjną można strawić zarówno wstawki, jak i wektor z utworzeniem końców z wzajemnie komplementarnymi parami zasad, które liguje się następnie stosując ligazę DNA. Alternatywnie, z DNA wstawki można zligować syntetyczne łączniki zawierające sekwencje zasad komplementarne do miejsca restrykcyjnego w DNA w e- ktora, który następnie trawi się enzymem restrykcyjnym przecinającym w tym miejscu. Dostępne są również inne sposoby. Korzystnymi komórkami gospodarza bakteryjnego są komórki E. coli. Przykładami odpowiednich komórek E. coli są szczepy SФ733 (cytrstra) lub 4300, ale inne szczepy E. coli i inne bakterie również można stosować jako gospodarzy plazmidów. Bakterie stosowane jako gospodarze mogą należeć do jakiegokolwiek szczepu, włącznie ze szczepami auksotroficznymi (takimi jak A 1645), prototroficznymi (takimi jak A4255) i litycznymi; szczepami F+ i F-; szczepami zawierającymi sekwencję represorową ci 857 profaga λ. (takimi jak A 1645 i A4255) oraz szczepami pozbawionymi represorów deo i/lub genu deo (patrz publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer , opublikowana 22 lutego 1989 r). Szczep E. coli SФ733 i szczep E. coli 4300 zdeponowano odpowiednio pod numerami dostępu ATCC i

10 Wszystkie opisane powyżej szczepy gospodarzy is. coli można wyleczyć z zawartych w nich plazmidów metodami dobrze znanymi w nauce, np. opisaną przez R.P. Novicka w Bacteriol. Review 33, 210 (1969) metodą z zastosowaniem bromku etydyny. Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu obejmującego proinsulinę w warunkach umożliwiających tworzenie właściwego wiązania dwusiarczkowego, poddawanie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe polipeptydu hybrydowego rozszczepieniu enzymatycznemu z wytworzeniem insuliny oraz oczyszczanie insuliny. Insulina posiada aktywność i właściwości komercjalnie dostępnej insuliny ludzkiej. W korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0. W innym korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-30 godzin w ph około 8,5-12,0 w obecności kwasu askorbinowego. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, ph podczas ufałdowywania wynosi 11,0-11,25. W innym szczególnie korzystnym rozwiązaniu, stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie. W jeszcze innym rozwiązaniu, okres inkubacji wynosi około 5 godzin. W innym rozwiązaniu, poddawanie ufałdowywaniu obejmuje doprowadzanie ph do około 8,8-9,0 i rozszczepianie polipeptydu hybrydowego trypsyną i karboksypeptydaząb w temperaturze około C w ciągu około 30 minut do 16 godzin. W innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC. W jeszcze innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pdbast-lat zdeponowany pod numerem dostępu ATCC W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pλbast-lat zdeponowany pod numerem dostępu ATCC W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pbast-r zdeponowany pod numerem dostępu ATCC W korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy otrzymuje się przez traktowanie komórki bakteryjnej zawierającym DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, w taki sposób, aby DNA kierował jego ekspresją i odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki. Uznaje się, że traktowanie obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy. Uznaje się ponadto, że odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki obejmuje zniszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, izolowanie precypitatu wewnątrzkomórkowego z lizatu przez wirowanie, solubilizację precypitatu i ewentualnie oczyszczanie polipeptydu hybrydowego przez chromatografię lub ultrafiltrację. Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę i peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, który to polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe. W korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy pochodzi z końca N CuZnSOD. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy obejmuje 62 aminokwasy poprzedzone aminokwasem M et i zakończone resztą Arg. W korzystnym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg. W innym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny dipeptydem Lys-Arg.

11 Powyższe dwie cząsteczki proinsuliny muszą zostać wytworzone jako białka hybrydowe, w innym przypadku poziomy ekspresji są skrajnie niskie i nie m ają znaczenia komercjalnego. We wszystkich korzystnych rozwiązaniach reszty cysteiny peptydu liderowego zastąpiono resztami seryny. Poniższe przykłady podano, aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, ale nie są zam ierzone, i nie powinno się ich interpretować jako ograniczające w jakikolwiek sposób jego zakres. Przykłady nie obejmują szczegółowych opisów konwencjonalnych metod wykorzystanych podczas konstruowania wektorów, wstawiania genów kodujących polipeptydy do takich wektorów, oraz wprowadzania otrzymanych plazmidów do gospodarzy. Przykłady nie obejmują również opisu konwencjonalnych metod wykorzystanych do oznaczania polipeptydów w y- tworzonych przez takie układy gospodarz-wektor. Metody takie są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i opisane zostały w licznych publikacjach, włącznie z podaną poniżej dla przykładu: Sambrook, J., Fritsch. E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Przykład 1. Konstruowanie plazmidów wytwarzających pbast-r, pdbast-lat i pa,bλ ST-LAT eksprymujących polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina Skonstruowano bakteryjne wektory ekspresyjne, które wytwarzają duże ilości białek hybrydowych w W.coli pod kontrolą albo promotora deo P1P2, albo λpl. Proinsulinę wytwarzano w postaci białka hybrydowego, ponieważ stwierdzono, że bakterie zawierające wektor ekspresyjny kodujący łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny nie wytwarzały wykrywalnego polipeptydu. Białka hybrydowe obejmują peptyd liderowy, o długości 62 aminokwasów, pochodzący z końca N CuZnSOD, poprzedzany od strony końca N resztą Met i zakończony od strony końca C resztą Arg łączącą go z łańcuchem B insuliny. Łańcuch B insuliny połączony jest z łańcuchem A insuliny krótkim peptydem łańcucha C, składającym się z Lys-Arg lub Arg. Dwie cysteiny oryginalnie występujące w części SOD zastąpiono resztami seryny. A. Plazmid pbast-r Skonstruowano szereg plazmidów zakończony pbast-r, który po transformacji właściwych komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu pbast-r, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 3; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 6. Plazmid pbast-r ma długość około 4380 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atll-m scl w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami S cal-h aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A vaii-n dei w D N A E. coli, który zaw iera promotory d eo P1P2 i miejsce wiążące rybosom (RBS) (13). 4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N del-p pum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 172 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam HI i H indh II. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i AatII (10).

12 Plazmid pbast-r, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-lys-arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepue. coli SФ733 (cytrstra) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC B. Plazmid pdbast-lat Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony pdbast-lat, który po transformacji właściwych komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu pdbast-lat, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 4; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7. Plazmid pdbast-lat ma długość około 4377 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atii-m sci w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami S cal-h aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A vall-n deí w DNA E. coli, który zawiera promotory deo P 1P2 i RJBS (13). 4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N del-ppum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam HI i H indiii. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i AatII (10). Plazmid pdbast-lat, który nadaj e oporność na tetracyklinę i który koduj e hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepu E. coli SФ733 (cytrstra) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC C. Plazmid p λbast-lat Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony p λbast-lat, który po transformacji zmienionych metodami inżynierii genetycznej komórek gospodarza E. coli (zawierających represor ci857) był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej. Strukturę plazmidu p λbast-r, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 5; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7. Plazmid p λbast-lat ma długość około 3777 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara): 1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami A atii-m sci w pbr322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę. 2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami ScaI-H aell w pbr322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA. 3. Fragment DNA o długości 330 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Bam HI-EcoRI w plazmidzie psodα13 (14), który zawiera promotor λpl i fragment A vrii-n dei o długości 30 bp zawierający miejsce wiążące rybosom deo.

13 Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami N dei -P pum I w cdna CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12). 5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuM I i Bam HI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny. 6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami Bam H I i Hind III. 7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami H indiii i A atii (10). Plazmid pλ,bast-lat, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-arg-łańcuch A insuliny pod kontrolą promotora αxpl, wprowadzono do szczepu E. coli 4300 (F-, bio, cl857) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC Komórki bakteryjne namnażano w temperaturze 30 C. Wytwarzanie polipeptydu hybrydowego indukowano po zmianie temperatury na 42 C. Przykład 2. Fermentacja, warunki wzrostu i oczyszczanie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina I. Hodowle podstawowe Podstawową hodowlę szczepu E. coli SФ733, zawierającego plazmid pdblast-lat (lub pbast-r) namnażano na podłożu kazeinowym (29 g/litr hydrolizatu kazeinowego, 10 g/litr ekstraktu drożdżowego i 5 g/litr NaCl) wzbogaconego o tetracyklinę (10 mg/litr). Następnie hodowle rozcieńczano dwukrotnie podłożem do zamrażania i przechowywano w temperaturze -80 C. Podłoże do zamrażania: K2HPO4 6,3 g KH2PO4 1,8 g cytrynian sodowy 0,45 g M gs 04 7H2O 0,09 g (NH4)2SO4 0,9 g Glicerol 44 g Na 500 ml II. Inokulum Inokulum namnażano w podłożu do wytwarzania (patrz poniżej). Jałowe podłoże w kolbie do wytrząsania zaszczepiano hodowlą podstawową i inkubowano w ciągu 15 godzin na wytrząsarce w temperaturze 37 C i przy około 200 obrotach na minutę. Jeśli zachodziła potrzeba, przeprowadzano kolejne etapy namnażania inokulum w napowietrzanych fermentorach z mieszaniem. Jałowe podłoże zaszczepiano 2-10% hodowlą z kolby i inkubowano w ciągu 15 godzin w temperaturze 37 C w ph 7±0,5 z wytrząsaniem i napowietrzaniem dla utrzymania poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem. III. Wytwarzanie Podłoże do wytwarzania: K2HPO4 KH2PO4 cytrynian sodowy NH4Cl K2SO4 FeSO4 7H2O M gs04 7H2O 8 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 0,6 g/litr 0,04 g/litr 0,4 g/litr

14 CaCl2 roztwór pierwiastków śladowych tetracyklina glukoza glicerol Roztwór pierwiastków śladowych: MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O CoCl2 7H2O Na2M oo4 2H2O CaCl2 2H2O CuSO4 5H2O H3BO3 HCl (32%) M nso4 H2O M nso4 H2O MnSO4 H2O MnSO4 H2O 0,02 g/litr 3 ml/litr 0,01 g/litr 2 g/litr 1 ml/litr 1 g/litr 2,78 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 1,85 g/litr 0,5 g/litr 100 ml/litr 1 g/litr 1 g/litr 1 g/litr 1 g/litr Podłoże do wytwarzania zaszczepiano 0,5-10% hodowlą inokulum i inkubowano w temperaturze 37 C. Szybkości wytrząsania - napowietrzania ustawiono dla utrzymania poziomu tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem. ph utrzymywano na poziomie 7±0,2 stosując NH3. Dla dostarczenia źródeł energii i węgla wstrzykiwano jałowe roztwory 50% glukozy i 30% glicerolu. Po osiągnięciu stężenia komórek OD660 = 25, wstrzykiwano jałowe roztwory 10% glukozy i 30% glicerolu i namnażanie kontynuowano w ciągu około 5godzin, do uzyskania stężenia komórek około OD660 = 60. Następnie hodowlę schładzano i komórki odzyskiwano przez wirowanie. Fermentacja E. coli w obecności każdego związku spośród glukozy, glicerolu, galaktozy lub ich kombinacji jako źródła węgla ułatwiała ekspresję polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina. IV. Oczyszczanie Polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina eksprymowane przez plazmidy pbast-r i pdbast-lat ulegały akumulacji w precypitacie wewnątrzkomórkowym, który izolowano zgodnie z następującą procedurą: 1 g (mokrej masy) osadu bakteryjnego zawieszano w 10 ml buforu zawierającego 50 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm EDTA i traktowano lizozymem (Merck, 2500 u/ml) w temperaturze 37 C w ciągu 2 godzin. Następnie mieszaninę sonifikowano i dodawano Nonidet-P-40 (Sigma) lub Triton X 100 do 2% stężenia końcowego i mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Precypitat osadzano przez wirowanie i przemywano wodą. Polipeptyd hybrydowy oczyszczano prawie do homogenności przez chromatografię anionowymienną w następujący sposób. Precypitat rozpuszczono w 8 M moczniku, 20 mm Tris-HCl, 200 mm β-merkaptoetanolu, ph 8,2. Roztwór klarowano przez wirowanie i poddawano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia LKB), uprzednio zrównoważonej 8 M mocznikiem, 20 mm Tris-HCl, 20 mm β-merkaptoetanolem, ph 8,2. Zbierano materiał nie ulegający związaniu i białko hybrydowe wytrącano albo (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia, lub zatężano przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 10 Kd, a następnie diafiltrację wobec 100 mm buforu glicyna-hcl, ph 3,1. Alternatywnie, polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina eksprymowany przez plazmid pbast-r oczyszczono prawie do homogenności przez rozpuszczenie w 8 M moczniku i przez ultrafiltrację kolejno przez membrany o przepuszczalności do 100 kd i 50 kd (Filtron). Polipeptyd hybrydowy zatężono na membranie o przepuszczalności do 10 kd i wytrącono (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia.

15 Przykład 3. Ufałdowywanie i enzymatyczne rozszczepianie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina Hybrydowe polipeptydy proinsuliny, otrzymane przez wytrącenie (NH4)2SO4 lub ultrafiltrację (przykład 2) rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 8,5-12,0 do stężenia końcowego około 1 mg/ml. A. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r odbywało się w temperaturze około 4-37 C w ciągu okresu około 1-24 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych. ph roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HCl do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze C w ciągu minut. Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pbast-r rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 11,0 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 6-16 godzin w temperaturze 25 C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1:500 w/w) i karboksypeptydazą B (1:200 w/w) w temperaturze 37 C w ciągu minut. Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pbast-r przedstawiono schematycznie na figurze 1. B. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat odbywało się w temperaturze około 7-31 C w ciągu okresu około 5-30 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych. ph roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HCl do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B w temperaturze C w ciągu 30 minut do 16 godzin. Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pdbast-lat rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mm HCl i rozcieńczano 100 mm buforem glicynowym, ph 11,0-11,25 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 5 godzin w temperaturze 25 C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1: w/w) i karboksypeptydazą B (1: w/w) w temperaturze 25 C w ciągu 16 godzin. Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat przedstawiono schematycznie na figurze 2. Przykłady warunków specyficznych dla obu powyższych both A i B podano szczegółowo w legendach do figur Przykład 4. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r Tworzenie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast/r określano przez oznaczenie radioimmunologiczne i RP-HPLC, jako standard stosując komercjalną insulinę ludzką (Calbiochem). Teoretyczna wydajność zrekombinowanej insuliny ludzkiej, obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej polipeptydu hybrydowego proinsuliny, wynosi 45,6%. Na podstawie figury 8 jest oczywiste, że optymalne ufałdowywanie zachodzi w ph 11. Przy tej wartości ph wytwarzanie insuliny stanowi około 80% wydajności teoretycznej (co odpowiada około 40% wyjściowej ilości polipeptydu hybrydowego). Insulinę ludzką wytwarzaną z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r wykrywano przez RP-HPLC. Stosowano kolumnę Vydac 218TP54 o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna) (Separation Group), 5 μ, wielkość porów 300 Å w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 1 ml/min. Jako eluent A stosowano 0,1 %

16 kwas trifluorooctowy (TFA) w H2O, a jako eluent B 0,08% TFA w acetonitrylu. Kolumnę przemywano w ciągu 5 minut buforem równoważącym (25% eluent B), a następnie, w ciągu 37,5 minut, liniowym gradientem 25-50% eluentu B. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm lub 280 nm. Analiza insuliny ludzkiej po trawieniu enzymatycznym ufałdowanego polipeptydu hybrydowego z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi z zastosowaniem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami ujawniła główny pik o takim samym czasie retencji, jak standardowa insulina ludzka. Przygotowano dwie szarże na małą skalę, otrzymując odpowiednio 26 mg i 13 mg insuliny ludzkiej. Insulinę ludzką oczyszczono z roztworu poddanemu traktowaniu enzymatycznemu (ph 9) przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 3 Kd lub 5 Kd (Filtron), a następnie chromatografię na CM-Sepharose (bufor cytrynianowy, ph 3). Frakcje piku odsolono, zliofilizowano i poddano sekwencjonowaniu końca N i analizie składu aminokwasowego. Skład aminokwasowy obu szarży zrekombinowanej insuliny ludzkiej był zasadniczo identyczny z naturalnie występującą insuliną ludzką (patrz tabela 1, preparat 1). Sekwencję 5 aminokwasów końca aminowego preparatów insuliny określono przez degradację Edmana. Stwierdzono, że jest ona identyczna z końcem NH2 zarówno łańcucha A, jak i B insuliny ludzkiej, co potwierdza autentyczność produktu otrzymanego in vitro. Jednakże, wyniki sekwencjonowania wskazują na obecność dodatkowej reszty Arg w pierwszej pozycji w około 25% cząsteczek. Wynik ten odpowiada rozszczepieniu przez trypsynę pomiędzy Lys i Arg, wewnątrz sekwencji łącznikowej, z pozostawieniem zatem dodatkowej reszty Arg na końcu aminowym łańcucha A. Stwierdzono, że specyficzną hydrolizę przez trypsynę po C-końcowej stronie Arg można uzyskać przez przeprowadzenie reakcji w ph 11. W tym podwyższonym ph większość grup ɛ-aminowych Lys nie jest obdarzona ładunkiem (pk = 10,3), umożliwiając zatem selektywne rozszczepienie. Przez przeprowadzenie etapu trawienia trypsyną w ph 11 (patrz Tabela 1, preparat 2), po którym przeprowadzono trawienie karboksypeptydazą B w ph 8,5, uzyskano dwa preparaty 1 mg i 6,5 mg oczyszczonej insuliny. Sekwencjonowanie N-końców ujawniło, że ilość insuliny zawierającej dodatkową Arg została obniżona do około 5%. Aminokwas Tabela 1 Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej Liczba reszt Teoretyczna Insulina standardowa Preparat 1 Preparat Asx 3 3,20 3,38 3,26 Thr 3 2,98 2,83 2,68 Ser 3 2,84 2,53 2,77 Glx 7 7,15 7,73 7,23 Pro 1 1,28 1,13 1,09 Gly 4 4,24 4,39 4,25 Ala 1 1,00 1,28 1,04 Cys 6 5,88 5,11 5,79 Val 4 3,82 4,58 3,88 Ile 2 2,04 1,96 1,96

17 Leu 6 5,87 6,10 5,99 Tyr 4 3,80 3,80 3,87 Phe 3 3,15 3,56 3,03 His 2 2,04 2,05 2,08 Lys 1 1,01 1,05 1,02 Arg 1 0,96 1,30 1,18 c.d. tabeli 1 Preparat 1 i 2 przedstawiają skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r. Rozszczepienie trypsyną przeprowadzono w ph 9 (preparat 1) lub w ph 11 (preparat 2). Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej oczyszczonych preparatów insuliny. Przykład 5. Analiza peptydowa oczyszczonej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pbast-r Oczyszczoną insuliną ludzką, wytworzoną jak opisano w powyższych przykładach, poddano analizie peptydowej wykorzystując endoproteinazę Glu-C (Sigma), która hydrolizuje wiązania polipeptydowego karboksylowej stronie reszt glutamylowych. Bardziej szczegółowo, próbki insuliny (100 μg), wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r, trawiono 5 μg Glu-C w ciągu 6 godzin w temperaturze 37 C w objętości 100 μl 0,1 M Tris-HCl, ph 7,8. Przeprowadzono analizę HPLC: próbki komercjalnie dostępnej (kontrolnej) insuliny i insuliny wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanej przez plazmid pbast-r zakwaszono do ph około 3 i rozdzielono przez RP-HPLC. Zastosowano kolumnę Vydac 218TP54, o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna), 5 μ, wielkość porów 300 Å. Kolumnę zrównoważono 50 mm fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mm NaClO4, ph3, zawierającym 31,5% (v/v) acetonitryl, i rozwijano liniowym gradientem 35-45% acetonitrylu w ciągu 75 minut z szybkością przepływu 1 ml/minutę. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm. Wszystkie peptydy oczekiwane na podstawie reakcji kontrolnej zostały utworzone, chociaż niewielki pik po piku odpowiadającym jednemu z fragmentów pochodzi prawdopodobnie z cząsteczki insulinopodobnej dez-thr(b30) (15). Przykłady 4 i 5 wskazują, że zrekombinowany polipeptyd eksprymowany przez plazmid pbast-r posiada sekwencję naturalnie występującej insuliny ludzkiej. M ała część wytwarzanego zrekombinowanego białka obejmowała takie formy, jak cząsteczki insulinopodobne Arg(Ao), dezamino- lub dez-thr(b30). Te niepożądane produkty uboczne można wyeliminować stosując procedury chromatograficzne, takie jak RP-HPLC, jak opisano powyżej. Przykład 6. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat W celu uniknięcia tworzenia produktu ubocznego, Arg(Ao) insuliny (przykład 4 i 5), plazmid ekspresyjny pbast-r zmodyfikowano, tak aby zawierał DNA kodujący tylko resztę Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny, w przeciwieństwie do DNA kodującego Lys-Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-r. W wyniku tego otrzymano plazmidy ekspresyjne pdba- ST-LAT (przykład 1B) i pλbast-lat (przykład 1C).

18 W następstwie ufałdowywania i traktowania enzymatycznego trypsyną i karboksypeptydazą B ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanego przez nowy plazmid ekspresyjny pdbast-lat zachodziło wydajne wytwarzanie insuliny. Występowanie zanieczyszczeń insulinopodobnych było niskie (figura 9). Ufałdowywanie było optymalne w ph 11,25 (figura 10) i było znacząco wzmacniane w obecności około 2 moli kwasu askorbinowego na mol grup SH w mieszaninie reakcyjnej (figura 11). W pływ stężenia białka na wydajność insuliny wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny określono w szeregu reakcji uwzględniających optymalne w arunki ufałdow y- wania. Optymalną wydajność uzyskiwano, gdy stężenie białka nie przekraczało 1,5 mg/ml (figura 13). Insulinę oczyszczano przez chromatografię na DEAE-Sepharose, po której następowała RP-HPLC (jak opisano na figurze 9). Jak wynika z figury 12, wytworzona zrekombinowana insulina ludzka miała taki sam czas retencji, jak standardowa (dostępna komercjalnie) insulina ludzka. Skład aminokwasowy preparatu oczyszczonej zrekombinowanej insuliny ludzkiej jest identyczny, jak dla insuliny standardowej (patrz tabela 2, insulina zrekombinowana). Należy zauważyć, że tabela 2 wskazuje, iż insulina wytworzona z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowana przez plazmid pdbast-lat nie posiada dodatkowej reszty Arg połączonej z łańcuchem A insuliny (Arg(Ao) insulina), jak opisano w przykładzie 4. A zatem, preferowanym plazmidem do wytwarzania insuliny jest plazmid pdbast-lat, a preferowaną sekwencją hybrydowego polipeptydu proinsuliny jest ta przedstawiona na figurze 7. Aminokwas T abela 2 Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej Liczba reszt Teoretyczna Insulina standardowa Insulina rekombinowana Asx 3 3,20 3,32 Thr 3 2,98 2,73 Ser 3 2,84 2,71 Glx 7 7,15 7,41 Pro 1 1,28 1,02 Gly 4 4,24 4,46 Ala 1 1,00 1,09 Cys 6 5,88 5,28 Val 4 3,82 4,00 Ile 2 2,04 1,91 Leu 6 5,87 6,34 Tyr 4 3,80 3,64 Phe 3 3,15 3,06 His 2 2,04 2,18 Lys 1 1,01 1,02 Arg 1 0,96 1,07

19 Przedstawiono skład aminokwasowy standardowej insuliny ludzkiej i zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat. Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej preparatów oczyszczonej insuliny. Przykład 7. Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego Stosując nieoczyszczony precypitat wewnątrzkomórkowy, przeprowadzono ulepszoną metodę ufałdowywania i enzymatycznego przekształcania hybrydowego polipeptydu proinsuliny w insulinę, pozwalającą na ominięcie potrzeby wstępnego etapu oczyszczania, opisanego w przykładzie 2, część IV. Wydajne wytwarzanie insuliny zachodziło po enzymatycznym rozszczepieniu ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi trypsyną i karboksypeptydazą B (figura 4 i tabela 3). Wydajności insuliny obliczano jako procent początkowego stężenia białka (A280) oznaczonego na etapie rozpuszczania precypitatu w ph 12 (figura 14). Wykazano, że ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu SOD-proinsulina z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego jest optymalne po około 4,5 godzinach od początku doświadczenia (figura 14). Tabela 3 podsumowuje częściowe oczyszczanie insuliny z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pbast-lat z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego przygotowanego z hodowli fermentacyjnej o objętości jednego litra i o O.D.660 wynoszącej 45. Rozpuszczanie i ufałdowywanie przeprowadzono jak opisano dla figury 14. Po 4,5 godzinach od rozpuszczenia, cały roztw ór zawierający ufałdow any hybrydowy polipeptyd proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, zmiareczkowano stężonym kwasem solnym do ph 8,8. Dodano ZnCl2 (do 50 μm stężenia końcowego), karboksydazę B (1:4000 w/w) i trypsynę (1:6000 w/w). Trawienie prowadzono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37 C i zakończono przez dodanie fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) do 0,5 mm stężenia końcowego. A naliza przez HPLC (jak opisano na figurze 9) wykazała, że wydajność insuliny wynosiła 169 mg. Insulinę oczyszczono przez kolejne etapy chrom atografii anionowymiennej i oddziaływań hydrofobowych. Poddaną trawieniu mieszaninę po ufałdowywaniu nałożono na kolumnę DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zrównoważoną uprzednio buforem zawierającym 20 mm Tris-HCl, 10 mm NaCl, ph 8, w ilości około 50 jednostek A2g0na ml złoża. Związany materiał przemyto buforem zawierającym 20 mm Tris-HCl, 100 mm NaCl, ph 8, i insulinę wyeluowano 250 mm NaCl w tym samym buforze. Połączone frakcje zawierające insulinę odpowiadały 20% nałożonego białka i posiadały czystość 37,1%. Do połączonych frakcji wyeluowanych z DEAE dodano siarczanu amonowego do stężenia 410 mm i nałożono na kolumnę Phenyl-Sepharose Fast Flow uprzednio zrównoważoną buforem zawierającym 20 mm Tris HCl,540 mm siarczan amonowy w ilości około 12 jednostek A280 na ml złoża. Zw iązany m ateriał przemyto buforem do rów noważenia i insulinę wyeluowano buforem zawierającym 20 mm Tris HCl, 220 mm siarczan amonowy, ph 8. Frakcje zawierające insulinę odpow iadały 42,3% nałożonego białka i posiadały czystość 74,1%. W wyniku tego procesu częściowego oczyszczania wytworzono 120 mg insuliny, identycznej z insuliną standardową, co odpowiada wydajności insuliny 5,16%. Dalsze oczyszczanie insuliny można przeprowadzić stosując metody znane w tej dziedzinie, np. sączenie m olekularne, RP-HPLC i krystalizację (17).

20 Tabela 3 Oczyszczanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej, wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pdbast-laz, po rozpuszczeniu nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego, ufałdowywaniu i traktowaniu enzymatycznym trypsyną i karboksypeptydazą B Etap oczyszczania A280 Minimalna ilość insuliny wg. HPLC - w mg % czystości Rozpuszczanie precypitatu Traktowanie węglem drzewnym Ufałdowywanie i traktowanie enzymatyczne ,8 Połączone frakcje po DEAE-Sepharose ,1 Połączone frakcje po Phenyl-Sepharose ,1 A280 przedstawia całkowitą absorbancję przy długości fali 280 nm na każdym etapie oczyszczania. Obecność insuliny oznaczano przez analizę HPLC w stosunku do insuliny standardowej, jak opisano dla figury 9, i odpowiada ona głównemu pikowi insuliny standardowej.

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Nowoczesne systemy ekspresji genów Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP

WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE Ewa Waszkowska ekspert UPRP Źródła informacji w biotechnologii projekt SLING Warszawa, 9-10.12.2010 PLAN WYSTĄPIENIA Umocowania prawne Wynalazki biotechnologiczne Statystyka

Bardziej szczegółowo

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. 1 Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i

Bardziej szczegółowo

TATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe

TATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe Promotory genu Promotor bliski leży w odległości do 40 pz od miejsca startu transkrypcji, zawiera kasetę TATA. Kaseta TATA to silnie konserwowana sekwencja TATAAAA, występująca w większości promotorów

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu:

Bardziej szczegółowo

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany 1 2 3 Drożdże są najprostszymi Eukariontami 4 Eucaryota Procaryota 5 6 Informacja genetyczna dla każdej komórki drożdży jest identyczna A zatem każda komórka koduje w DNA wszystkie swoje substancje 7 Przy

Bardziej szczegółowo

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Drożdżowe systemy ekspresyjne Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris

Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Drożdże Pichia pastoris należą do drożdży metanolotroficznych tj. zdolnych do wykorzystywania

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/05666 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/05666 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA () OPIS PATENTOWY (9) PL () 005 () Numer zgłoszenia: 35360 (3) B Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej () Data zgłoszenia: 0.06.000 (6) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

E.coli Transformer Kit

E.coli Transformer Kit E.coli Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli. Metoda chemiczna. wersja 1117 6 x 40 transformacji Nr kat. 4020-240 Zestaw zawiera komplet odczynników

Bardziej szczegółowo

TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów

TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Eksparesja genów TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Przepisywanie informacji genetycznej z makrocząsteczki DNA na mniejsze i bardziej funkcjonalne cząsteczki pre-mrna Polimeraza RNA ETAP I Inicjacja

Bardziej szczegółowo

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. wersja 0916 6 x 20 transformacji Nr kat. 4010-120 Zestaw zawiera

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli Wersja 0211 6x40 transformacji Nr kat. 4020-240 Zestaw zawiera komplet odczynników do przygotowania sześciu

Bardziej szczegółowo

Wykład 14 Biosynteza białek

Wykład 14 Biosynteza białek BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

Bardziej szczegółowo

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 4 Jak działają geny?

Bardziej szczegółowo

Biologia medyczna, materiały dla studentów

Biologia medyczna, materiały dla studentów Zasada reakcji PCR Reakcja PCR (replikacja in vitro) obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 162995 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 283854 (22) Data zgłoszenia: 16.02.1990 (51) IntCl5: C05D 9/02 C05G

Bardziej szczegółowo

etyloamina Aminy mają właściwości zasadowe i w roztworach kwaśnych tworzą jon alkinowy

etyloamina Aminy mają właściwości zasadowe i w roztworach kwaśnych tworzą jon alkinowy Temat: Białka Aminy Pochodne węglowodorów zawierające grupę NH 2 Wzór ogólny amin: R NH 2 Przykład: CH 3 -CH 2 -NH 2 etyloamina Aminy mają właściwości zasadowe i w roztworach kwaśnych tworzą jon alkinowy

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ 1. Gen to odcinek DNA odpowiedzialny

Bardziej szczegółowo

47 Olimpiada Biologiczna

47 Olimpiada Biologiczna 47 Olimpiada Biologiczna Pracownia biochemiczna zasady oceniania rozwia zan zadan Część A. Identyfikacja zawartości trzech probówek zawierających cukry (0 21 pkt) Zadanie A.1 (0 13 pkt) Tabela 1 (0 7 pkt)

Bardziej szczegółowo

CEL ĆWICZENIA: Zapoznanie się z przykładową procedurą odsalania oczyszczanych preparatów enzymatycznych w procesie klasycznej filtracji żelowej.

CEL ĆWICZENIA: Zapoznanie się z przykładową procedurą odsalania oczyszczanych preparatów enzymatycznych w procesie klasycznej filtracji żelowej. LABORATORIUM 3 Filtracja żelowa preparatu oksydazy polifenolowej (PPO) oczyszczanego w procesie wysalania siarczanem amonu z wykorzystaniem złoża Sephadex G-50 CEL ĆWICZENIA: Zapoznanie się z przykładową

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN

Bardziej szczegółowo

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/GB00/00413 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/GB00/00413 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197893 (21) Numer zgłoszenia: 348857 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 10.02.2000 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019

Bardziej szczegółowo

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych dr Małgorzata Kozłowska Ekspert w UPRP dr Ewa Waszkowska

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych aspekty praktyczne dr Małgorzata Kozłowska Ekspert

Bardziej szczegółowo

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość Ćwiczenie 6 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Biologia Molekularna z Biotechnologią =============================================================================================== Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1706494 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 10.01.2005 05704663.3 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/62 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego

Bardziej szczegółowo

Test kwalifikacyjny Lifescience dla licealistów 2015

Test kwalifikacyjny Lifescience dla licealistów 2015 Test kwalifikacyjny Lifescience dla licealistów 2015 Imię nazwisko (pseudonim): 1. Daltonizm (d) jest cechą recesywną sprzężoną z płcią. Rudy kolor włosów (r) jest cechą autosomalną i recesywną w stosunku

Bardziej szczegółowo

(21) Numer zgłoszenia: (54) Sposób wytwarzania preparatu barwników czerwonych buraka ćwikłowego

(21) Numer zgłoszenia: (54) Sposób wytwarzania preparatu barwników czerwonych buraka ćwikłowego RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)167526 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 292733 (22) Data zgłoszenia: 10.12.1991 (51) IntCl6: C12P 1/00 C12N

Bardziej szczegółowo

SEMINARIUM 8:

SEMINARIUM 8: SEMINARIUM 8: 24.11. 2016 Mikroelementy i pierwiastki śladowe, definicje, udział w metabolizmie ustroju reakcje biochemiczne zależne od aktywacji/inhibicji przy udziale mikroelementów i pierwiastków śladowych,

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2135881 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 09010789.7

Bardziej szczegółowo

PL B1. UNIWERSYTET EKONOMICZNY W POZNANIU, Poznań, PL BUP 21/09. DARIA WIECZOREK, Poznań, PL RYSZARD ZIELIŃSKI, Poznań, PL

PL B1. UNIWERSYTET EKONOMICZNY W POZNANIU, Poznań, PL BUP 21/09. DARIA WIECZOREK, Poznań, PL RYSZARD ZIELIŃSKI, Poznań, PL PL 215965 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 215965 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 384841 (51) Int.Cl. C07D 265/30 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia:

Bardziej szczegółowo

Zawartość. Wstęp 1. Historia wirusologii. 2. Klasyfikacja wirusów

Zawartość. Wstęp 1. Historia wirusologii. 2. Klasyfikacja wirusów Zawartość 139585 Wstęp 1. Historia wirusologii 2. Klasyfikacja wirusów 3. Struktura cząstek wirusowych 3.1. Metody określania struktury cząstek wirusowych 3.2. Budowa cząstek wirusowych o strukturze helikalnej

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa tel. 22 572 0735, 606448502

Bardziej szczegółowo

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa dr Bartosz Walter Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna Co może byd wynalazkiem Wynalazek biotechnologiczny Ochrona patentowa Procedura zgłoszenia patentowego Gdzie, kiedy i jak warto patentowad

Bardziej szczegółowo

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ Replikacja organizacja widełek replikacyjnych Transkrypcja i biosynteza białek Operon regulacja ekspresji genów Prowadzący wykład: prof. dr hab. Jarosław Burczyk REPLIKACJA

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197408 (21) Numer zgłoszenia: 346772 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 21.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) 159844 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 273721 ( 2) Data zgłoszenia: 14.07.1988 (51) IntCl.5: C12N 15/51

Bardziej szczegółowo

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ Replikacja organizacja widełek replikacyjnych Transkrypcja i biosynteza białek Operon regulacja ekspresji genów Prowadzący wykład: prof. dr hab. Jarosław Burczyk REPLIKACJA

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII ĆWICZENIA Z BIOCHEMII D U STUDENTfiW WYDZIAŁU LEKARSKIEGO Pod redakcją Piotra Laidlera, Barbary Piekarskiej, Marii Wróbel WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO ĆWICZENIA Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW WYDZIAŁU

Bardziej szczegółowo

KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY

KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY Ćwiczenie nr 2 KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY I. Kinetyka hydrolizy sacharozy reakcja chemiczna Zasada: Sacharoza w środowisku kwaśnym ulega hydrolizie z wytworzeniem -D-glukozy i -D-fruktozy. Jest to reakcja

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Translacja i proteom komórki

Translacja i proteom komórki Translacja i proteom komórki 1. Kod genetyczny 2. Budowa rybosomów 3. Inicjacja translacji 4. Elongacja translacji 5. Terminacja translacji 6. Potranslacyjne zmiany polipeptydów 7. Translacja a retikulum

Bardziej szczegółowo

Metody badania ekspresji genów

Metody badania ekspresji genów Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego

Bardziej szczegółowo

HODOWLA PERIODYCZNA DROBNOUSTROJÓW

HODOWLA PERIODYCZNA DROBNOUSTROJÓW Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest porównanie zdolności rozkładu fenolu lub wybranej jego pochodnej przez szczepy Stenotrophomonas maltophilia KB2 i Pseudomonas sp. CF600 w trakcie prowadzenia hodowli

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN CZĘŚĆ TEORETYCZNA Mechanizmy promujące wzrost rośli (PGP) Metody badań PGP CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Mechanizmy promujące wzrost roślin. Odczyt. a) Wytwarzanie

Bardziej szczegółowo

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II 10 października 2013: Elementarz biologii molekularnej www.bioalgorithms.info Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II Komórka: strukturalna i funkcjonalne jednostka organizmu żywego Jądro komórkowe: chroniona

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym,

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ. Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011

BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ. Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011 BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011 Acylaza penicylinowa Enzym hydrolizuje wiązanie amidowe w penicylinach Reakcja przebiega wg schematu: acylaza Reszta: fenyloacetylowa

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu

Bardziej szczegółowo

PL 216012 B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL 11.10.2010 BUP 21/10

PL 216012 B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL 11.10.2010 BUP 21/10 PL 216012 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 216012 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391223 (22) Data zgłoszenia: 14.05.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

Biotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych, która wykorzystuje procesy biologiczne na skalę przemysłową. Inaczej są to wszelkie działania na

Biotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych, która wykorzystuje procesy biologiczne na skalę przemysłową. Inaczej są to wszelkie działania na Biotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych, która wykorzystuje procesy biologiczne na skalę przemysłową. Inaczej są to wszelkie działania na żywych organizmach prowadzące do uzyskania konkretnych

Bardziej szczegółowo

Przegląd budowy i funkcji białek

Przegląd budowy i funkcji białek Przegląd budowy i funkcji białek Co piszą o białkach? Wyraz wprowadzony przez Jönsa J. Berzeliusa w 1883 r. w celu podkreślenia znaczenia tej grupy związków. Termin pochodzi od greckiego słowa proteios,

Bardziej szczegółowo

X / \ Y Y Y Z / \ W W ... imię i nazwisko,nazwa szkoły, miasto

X / \ Y Y Y Z / \ W W ... imię i nazwisko,nazwa szkoły, miasto Zadanie 1. (3 pkt) Nadtlenek litu (Li 2 O 2 ) jest ciałem stałym, występującym w temperaturze pokojowej w postaci białych kryształów. Stosowany jest w oczyszczaczach powietrza, gdzie ważna jest waga użytego

Bardziej szczegółowo

PODSTAWY STECHIOMETRII

PODSTAWY STECHIOMETRII PODSTAWY STECHIOMETRII 1. Obliczyć bezwzględne masy atomów, których względne masy atomowe wynoszą: a) 7, b) 35. 2. Obliczyć masę próbki wody zawierającej 3,01 10 24 cząsteczek. 3. Która z wymienionych

Bardziej szczegółowo

PL B1. FRYDRYCHOWSKI ANDRZEJ, Gdańsk, PL BUP 08/05. ANDRZEJ FRYDRYCHOWSKI, Gdańsk, PL WUP 09/10

PL B1. FRYDRYCHOWSKI ANDRZEJ, Gdańsk, PL BUP 08/05. ANDRZEJ FRYDRYCHOWSKI, Gdańsk, PL WUP 09/10 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12)OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206813 (21)Numer zgłoszenia: 362811 (22)Data zgłoszenia: 13.10.2003 (13) B1 (51) Int.Cl. C08H 1/06 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

PL B1. Sposób usuwania zanieczyszczeń z instalacji produkcyjnych zawierających membrany filtracyjne stosowane w przemyśle spożywczym

PL B1. Sposób usuwania zanieczyszczeń z instalacji produkcyjnych zawierających membrany filtracyjne stosowane w przemyśle spożywczym PL 214736 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214736 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 388142 (51) Int.Cl. B01D 65/06 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia:

Bardziej szczegółowo

Regulacja Ekspresji Genów

Regulacja Ekspresji Genów Regulacja Ekspresji Genów Wprowadzenie o Ekspresja genu jest to złożony proces jego transkrypcji do mrna, o Obróbki tego mrna, a następnie o Translacji do białka. 4/17/2019 2 4/17/2019 3 E 1 GEN 3 Promotor

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

PL B1. Kwasy α-hydroksymetylofosfonowe pochodne 2-azanorbornanu i sposób ich wytwarzania. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL

PL B1. Kwasy α-hydroksymetylofosfonowe pochodne 2-azanorbornanu i sposób ich wytwarzania. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL PL 223370 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 223370 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 407598 (51) Int.Cl. C07D 471/08 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia:

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

Novabeads Food DNA Kit

Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii molekularnej, umożliwiającym izolację DNA z produktów spożywczych wysoko przetworzonych. Metoda oparta

Bardziej szczegółowo

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616 Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616 10 izolacji Nr kat. 995-10 Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 500 µg 1 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny

Bardziej szczegółowo

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej.

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Wprowadzenie DNA i białka W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Białka: łańcuchy złożone z aminokwasów (kilkadziesiąt kilkadziesiąt

Bardziej szczegółowo

PL B1. Ośrodek Badawczo-Rozwojowy Izotopów POLATOM,Świerk,PL BUP 12/05

PL B1. Ośrodek Badawczo-Rozwojowy Izotopów POLATOM,Świerk,PL BUP 12/05 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201238 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 363932 (51) Int.Cl. G21G 4/08 (2006.01) C01F 17/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22)

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału

Bardziej szczegółowo

Slajd 1. Slajd 2. Proteiny. Peptydy i białka są polimerami aminokwasów połączonych wiązaniem amidowym (peptydowym) Kwas α-aminokarboksylowy aminokwas

Slajd 1. Slajd 2. Proteiny. Peptydy i białka są polimerami aminokwasów połączonych wiązaniem amidowym (peptydowym) Kwas α-aminokarboksylowy aminokwas Slajd 1 Proteiny Slajd 2 Peptydy i białka są polimerami aminokwasów połączonych wiązaniem amidowym (peptydowym) wiązanie amidowe Kwas α-aminokarboksylowy aminokwas Slajd 3 Aminokwasy z alifatycznym łańcuchem

Bardziej szczegółowo

Reakcje utleniania i redukcji Reakcje metali z wodorotlenkiem sodu (6 mol/dm 3 )

Reakcje utleniania i redukcji Reakcje metali z wodorotlenkiem sodu (6 mol/dm 3 ) Imię i nazwisko.. data.. Reakcje utleniania i redukcji 7.1 Reaktywność metali 7.1.1 Reakcje metali z wodą Lp Metal Warunki oczyszczania metalu Warunki reakcji Obserwacje 7.1.2 Reakcje metali z wodorotlenkiem

Bardziej szczegółowo

Chemiczne składniki komórek

Chemiczne składniki komórek Chemiczne składniki komórek Pierwiastki chemiczne w komórkach: - makroelementy (pierwiastki biogenne) H, O, C, N, S, P Ca, Mg, K, Na, Cl >1% suchej masy - mikroelementy Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona

Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Enzymy proteolityczne, klasyfikacja, rola biologiczna. 2. Enzymy proteolityczne krwi. 3. Wewnątrzkomórkowa

Bardziej szczegółowo

PL B1. SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt nad Menem,DE ,DE, BUP 26/

PL B1. SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt nad Menem,DE ,DE, BUP 26/ RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 196626 (21) Numer zgłoszenia: 326936 (22) Data zgłoszenia: 20.06.1998 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/17 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów

Bardziej szczegółowo

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna

Bardziej szczegółowo

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych

Bardziej szczegółowo

Spis treści. 1. Wiadomości wstępne Skład chemiczny i funkcje komórki Przedmowa do wydania czternastego... 13

Spis treści. 1. Wiadomości wstępne Skład chemiczny i funkcje komórki Przedmowa do wydania czternastego... 13 Przedmowa do wydania czternastego... 13 Częściej stosowane skróty... 15 1. Wiadomości wstępne... 19 1.1. Rys historyczny i pojęcia podstawowe... 19 1.2. Znaczenie biochemii w naukach rolniczych... 22 2.

Bardziej szczegółowo

BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA

BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA 1. Wprowadzenie do biotechnologii. Rys historyczny. Zakres i znaczenie nowoczesnej biotechnologii. Opracowanie procesu biotechnologicznego. 7. Produkcja biomasy. Białko mikrobiologiczne.

Bardziej szczegółowo

WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW

WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW WPŁYW SUBSTANCJI TOWARZYSZĄCYCH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ OSADÓW Wstęp W przypadku trudno rozpuszczalnej soli, mimo osiągnięcia stanu nasycenia, jej stężenie w roztworze jest bardzo małe i przyjmuje się, że ta

Bardziej szczegółowo

Geny i działania na nich

Geny i działania na nich Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których

Bardziej szczegółowo

Gel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617

Gel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617 Gel-Out Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617 50 izolacji, 250 izolacji Nr kat. 023-50, 023-250 Pojemność kolumny do izolacji DNA - do 20 µg DNA, minimalna pojemność - 2 µg DNA (przy zawartości

Bardziej szczegółowo

(54) Sposób przerobu zasolonych wód odpadowych z procesu syntezy tlenku etylenu

(54) Sposób przerobu zasolonych wód odpadowych z procesu syntezy tlenku etylenu RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186722 (21) Numer zgłoszenia: 327212 (22) Data zgłoszenia: 03.07.1998 (13) B1 (51) IntCl7 C07C 31/20 C07C

Bardziej szczegółowo

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach,

Bardziej szczegółowo

(21)Numer zgłoszenia: 308742. (87)Data i numer publikacji zgłoszenia. międzynarodowego: 11.05.1994, WO94/10325, PCT Gazette nr 11/94

(21)Numer zgłoszenia: 308742. (87)Data i numer publikacji zgłoszenia. międzynarodowego: 11.05.1994, WO94/10325, PCT Gazette nr 11/94 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 178040 (21)Numer zgłoszenia: 308742 (22) Data zgłoszenia: 05.11.1993 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (86) D ata i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6 RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy

Bardziej szczegółowo

AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA im. Stanisława Staszica w Krakowie OLIMPIADA O DIAMENTOWY INDEKS AGH 2017/18 CHEMIA - ETAP I

AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA im. Stanisława Staszica w Krakowie OLIMPIADA O DIAMENTOWY INDEKS AGH 2017/18 CHEMIA - ETAP I Związki manganu i manganometria AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA 1. Spośród podanych grup wybierz tą, w której wszystkie związki lub jony można oznaczyć metodą manganometryczną: Odp. C 2 O 4 2-, H 2 O 2, Sn

Bardziej szczegółowo

Informacje dotyczące pracy kontrolnej

Informacje dotyczące pracy kontrolnej Informacje dotyczące pracy kontrolnej Słuchacze, którzy z przyczyn usprawiedliwionych nie przystąpili do pracy kontrolnej lub otrzymali z niej ocenę negatywną zobowiązani są do dnia 06 grudnia 2015 r.

Bardziej szczegółowo

KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb. Metoda cyjanmethemoglobinowa: Zasada metody:

KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb. Metoda cyjanmethemoglobinowa: Zasada metody: KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb Metoda cyjanmethemoglobinowa: Hemoglobina i niektóre jej pochodne są utleniane przez K3 [Fe(CN)6]do methemoglobiny, a następnie przekształcane pod wpływem KCN w trwały związek

Bardziej szczegółowo

Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska

Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska Adam Dawidowski Klasa III b (autor) mgr Beata Ulczyńska (opiekun) BADANIE WPŁYWU GENU orf654 Z OPERONU mboii NA ZJAWISKO PRZESUNIĘCIA RAMKI ODCZYTU TRANSLACJI -1 W ZMUTOWANYM GENIE mboiim2δ I Akademickie

Bardziej szczegółowo

Zestawy do izolacji DNA i RNA

Zestawy do izolacji DNA i RNA Syngen kolumienki.pl Gotowe zestawy do izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych Zestawy do izolacji DNA i RNA Katalog produktów 2012-13 kolumienki.pl Syngen Biotech Sp. z o.o., 54-116 Wrocław, ul. Ostródzka

Bardziej szczegółowo