data ĆWICZENIE 7 DYSTRYBUCJA TKANKOWA AMIDOHYDROLAZ

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 7 DYSTRYBUCJA TKANKOWA AMIDOHYDROLAZ Amidohydrolazy (E.C oraz E.C.3.5.2) są enzymami z grupy hydrolaz o szerokim powinowactwie substratowym, działającymi na wiązania węgiel-azot inne niż wiązania peptydowe (E.C.3.5), uczestniczącymi m.in. w I fazie katabolizmu ksenobiotyków, w tym leków. Enzymy te hydrolizują wiązania amidowe, prowadząc do powstania wolnej aminy (lub związku wielofunkcyjnego zawierającego tę grupę) oraz kwasu karboksylowego (lub związku wielofunkcyjnego zawierającego tę grupę). Doświadczenie 1 Cel: Oznaczenie stężenia białka w wybranych narządach wołu (wątroba, a, nerki, mózg). Zasada metody: Reakcja biuretowa jest reakcją barwną, której podlegają: większość peptydów, białka, dimocznik (biuret), diamidy. Wolne aminokwasy i dipeptydy nie dają dodatniej próby. Nazwa reakcji wywodzi się od nazwy biuretu, czyli dimocznika, który jest najprostszym ze związków podlegających tej reakcji. W środowisku zasadowym wiązanie peptydowe ulega tautomeryzacji do formy enolowej, zdolnej do dysocjacji. W tych warunkach jon Cu 2+ tworzy dwa wiązania z dwiema sąsiednimi grupami enolowymi i dwa wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje kompleks o barwie czerwonofioletowej lub niebieskofioletowej, a intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości zaangażowanych w reakcji wiązań peptydowych. str. 1

2 Przygotowanie materiału do badań y, nerki, i wołu, uzyskane w wyniku homogenizacji 0.5 g każdego narządu w 9.5 ml o, należy przechowywać w probówkach umieszczonych w lodzie. Odczynniki: 0.2 mol/l bufor Tris (trihydroksymetylo-aminometan) o (gotowy odczynnik) odczynnik biuretowy: roztwór zawierający 60 mmol/l CuSO4 5H2O, 1mol/l NaOH, 167 mmol/l winianu sodowopotasowy (gotowy odczynnik) 1% roztwór wodny deoksycholanu sodowego: 50 mg deoksycholanu sodowego należy rozpuść w 5 ml wody destylowanej. Procedura postępowania Przygotuj 5 probówek i podpisz je odpowiednio: O, W, N, M, P. odczynnik oznaczenie probówki O W N M P nerek (nierozcieńczony) % roztwór wodny deoksycholanu sodowego Zawartość probówek inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie do każdej probówki dodaj odpowiednio: woda destylowana 0.15 ml odczynnik biuretowy 1.25 ml 1.25 ml 1.25 ml 1.25 ml 1.25 ml Zawartość probówek zamieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po tym czasie zmierz absorbancję próbek W, N, M, P przy długości fali = 540 nm, względem próby odnośnikowej O. Dla uzyskanych wartości absorbancji odczytaj z krzywej wzorcowej do oznaczania stężenia białka metodą biuretową stężenie białka w każdym badanym homogenacie (). Uzyskane wyniki wykorzystaj w obliczeniach aktywności enzymu. Obserwacje: Wnioski: str. 2

3 Doświadczenie 2 Cel: Analiza dystrybucji tkankowej amidohydrolazy na podstawie porównania aktywności właściwej tego enzymu w wybranych narządach wołu (wątroba, a, nerki, mózg). Zasada metody: Amidohydrolaza katalizuje w środowisku o reakcję hydrolizy 4-L-leucyloamino do 4-amino i L-leucyny. Uwolniona 4-aminoantypiryna w ph 9.8 ulega ilościowemu sprzężeniu z fenolem w warunkach oksydacyjnych, stworzonych przez dodanie do środowiska reakcji sześciocyjanożelazianu(iii) potasowego (). Barwny produkt reakcji wykazuje maksimum absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przy długości fali = 500 nm. Absorbancja jest wprost proporcjonalna do ilości uwolnionej w toku reakcji enzymatycznej 4-amino. Odczynniki: 0.2 mol/l bufor Tris (trihydroksymetylo-aminometan) o (gotowy odczynnik) mol/l roztwór wodny 4-L-leucyloamino (gotowy odczynnik) 10% roztwór wodny (gotowy odczynnik, pod wyciągiem) 5% roztwór fenolu w wodzie (gotowy odczynnik, pod wyciągiem) 4% roztwór wodny sześciocyjanożelazianu(iii) potasowego () (gotowy odczynnik, pod wyciągiem) Przygotowanie materiału do badań W przypadku homogenatu nerek, ze względu na znacznie większą aktywność badanego enzymu w tym narządzie, należy dokonać 25-krotnego rozcieńczenia homogenatu poprzez przeniesienie do drugiej probówki 0.25 ml nerki i dodanie 6 ml o. Uzyskuje się w ten sposób 0.2% homogenat nerek. str. 3

4 2.1. Oznaczanie aktywności amidohydrolazy Przygotuj 8 probówek szklanych, podpisz odpowiednio jako: OW, W, ON, N, OM, M, OP, P i wprowadź do nich odpowiednio: (OW) (W) z 0.2% nerki (ON) z 0.2% nerki (N) (OM) (M) (OP) (P) 0.2% homogenatu nerek 0.2% homogenatu nerek Po wymieszaniu przygotowane próbki umieść w termobloku o temp. 37 C i inkubuj przez 15 minut. Po upływie czasu inkubacji dodawaj roztworu 4-Lleucyloamino kolejne odczynniki w stałych odstępach czasu do kolejnych próbek nie wyjmując ich z łaźni wodnej. roztworu roztworu roztworu Po wymieszaniu inkubuj próbki (trwa reakcja enzymatyczna) w tych samych warunkach (termoblok, 37 C) przez 30 minut. Po upływie czasu inkubacji dodawaj kolejne odczynniki w tych samych, co poprzednio, stałych odstępach czasu do kolejnych próbek, każdorazowo mieszając zawartość probówek. Dokładnie po 2.5 minutach od dodania zmierz absorbancję próbek badanych względem odpowiednich próbek odnośnikowych, przy długości fali =500nm Obliczanie aktywności amidohydrolazy Obliczanie aktywności enzymu w przeliczeniu na 1 gram tkanki Na podstawie udostępnionej przez asystenta krzywej wzorcowej: A = f (n) A - absorbancja n - ilość nmoli odczytaj ilości nmoli (n) uwolnionej w każdej z próbek badanych w trakcie reakcji enzymatycznej. W przypadku obliczania aktywności badanego enzymu w wątrobie, i ach zastosuj wzór: K= n 100 t K - aktywność amidohydrolazy wyrażona w nmol/min/g tkanki; n - ilość nmoli uwolnionej odczytana z krzywej; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min. str. 4

5 W przypadku obliczania aktywności badanego enzymu w nerce, ze względu na większe rozcieńczenia homogenatu, zastosuj wzór: K= n 2500 t K - aktywność amidohydrolazy wyrażona w nmol/min/g tkanki; n - ilość nmoli uwolnionej odczytana z krzywej; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min Obliczanie aktywności właściwej enzymu Obliczając aktywność właściwą badanego enzymu w każdym z narządów zastosuj wzór: K w= n t c Kw - aktywność amidohydrolazy wyrażona w nmol/min/mg białka; n - ilość nmoli uwolnionej odczytana z krzywej; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min.; c - zawartość białka w homogenatu [mg] odczytana z krzywej biuretowej Zestawienie wyników Badany narząd zawartość białka w homogenatu (c) [mg] Ilość uwolnionej amino (n) [nmol] Aktywność enzymu w 1 g tkanki (K) nmol min x g Aktywność właściwa enzymu (K w) nmol min x mg Wątroba Nerka Mózg Płuca Obserwacje: Wnioski: str. 5