PL B1. SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt nad Menem,DE ,DE, BUP 26/

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/17 ( ) C12N 15/63 ( ) C12N 15/62 ( ) C07K 14/62 ( ) A61K 38/28 ( ) (54) Nowe pochodne insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory pochodnych insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej i zastosowanie nowych pochodnych insuliny (30) Pierwszeństwo: ,DE, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/98 (73) Uprawniony z patentu: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt nad Menem,DE (72) Twórca(y) wynalazku: Johann Ertl,Bremthal,DE Paul Habermann,Eppstein,DE Karl Geisen,Frankfurt,DE Gerhard Seipke,Hofheim,DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/08 (74) Pełnomocnik: Zofia Sulima, Sulima Grabowska Sierzputowska, Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.j. PL B1 (57) 1. Nowe pochodne insuliny o ogólnym wzorze 1, w których (A1-A5) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej, (A12-A19) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A12 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej, A21 oznacza Asn, (B8-B18) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej, (B20-B26) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B26 łańcucha B insuliny ludzkiej, A8, A9 i A10 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A8, A9 i A10 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B30 oznacza -OH lub resztę aminokwasu w pozycji B30 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub atom wodoru, B3 oznacza resztę występującego w naturze zasadowego aminokwasu, B27, B28 i B29 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, albo niezależnie resztę innego występującego w naturze aminokwasu, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B jest zastąpiona resztą innego występującego w naturze aminokwasu, wybraną z reszt obojętnych i kwasowych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory pochodnych insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej i zastosowanie nowych pochodnych insuliny. Na całym świecie około 120 milionów ludzi cierpi na cukrzycę, w tym około 12 milionów ludzi chorych jest na cukrzycę typu 1 i stosowanie insuliny jest dla nich obecnie jedyną możliwą terapią. Chorzy są skazani przez całe życie na wstrzykiwanie insuliny, z reguły kilka razy dziennie. Chociaż cukrzyca typu 2, na którą cierpi 100 milionów ludzi, nie jest zasadniczo związana z niedoborem insuliny, jednak w wielu przypadkach leczenie insuliną jest uważane za odpowiednią lub jedynie możliwą postać terapii. Wraz z trwaniem choroby duża liczba pacjentów cierpi na tak zwane powikłania cukrzycowe. Dotyczy to w znacznym stopniu uszkodzeń mikro- i makronaczyniowych, które w zależności od rodzaju i rozległości uszkodzeń prowadzą do niewydolności nerek, ślepoty, utraty kończyn lub do podwyższonego ryzyka chorób serca i układu krążenia. Przyczyną tego jest przede wszystkim chronicznie podwyższony poziom glukozy we krwi, ponieważ nawet przy starannej terapii insulinowej nie osiąga się normalnego poziomu glukozy, odpowiadającego regulacji fizjologicznej (Ward J.D. (1989) British Medical Bulletin 45, ; Drury P.L. i inni (1989) British Medical Bulletin 45, ; Kohner E.M. (1989) British Medical Bulletin 45, ). U ludzi zdrowych wydzielanie insuliny jest ściśle związane ze stężeniem glukozy we krwi. Podwyższony poziom glukozy, jaki występuje po posiłkach, jest szybko kompensowany podwyższonym uwalnianiem insuliny. Na czczo poziom insuliny w osoczu spada do wartości podstawowej, wystarczającej do ciągłego zaopatrywania w glukozę narządów i tkanek wrażliwych na glukozę. Optymalizacja terapii, tak zwana intensywna terapia insulinowa, jest obecnie ukierunkowana przede wszystkim na to, aby zminimalizować zmiany stężenia glukozy we krwi, szczególnie odchylenia w górę. (Bolli G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16; Berger M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S25-S32). Prowadzi to do znacznego ograniczenia przypadków uszkodzeń cukrzycowych związanych z postępem choroby (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, ). Biorąc pod uwagę fizjologię wydzielania insuliny można przyjąć, że dla lepszej intensywnej terapii insulinowej, w przypadku preparatów podawanych podskórnie, potrzebne są dwa preparaty insulinowe o różnej dynamice farmakologicznej. Dla kompensacji wzrostu zawartości glukozy we krwi po posiłkach insulina musi szybko dopływać i powinna działać tylko kilka godzin. Dla podstawowego dostarczania, szczególnie w nocy, powinno się dysponować preparatem długo działającym, nie wykazującym żadnego wyraźnego maksimum i dostarczającym insulinę bardzo wolno. Preparaty oparte na ludzkiej i zwierzęcej insulinie spełniają wymagania intensywnej terapii insulinowej tylko w ograniczonym stopniu. Szybko działająca insulina (stara insulina) po podaniu podskórnym dociera za wolno do krwi i działa zbyt długo. Wskutek tego poposiłkowy poziom insuliny jest zbyt wysoki, a w kilka godzin po posiłku zawartość glukozy we krwi spada w zbyt dużym stopniu (Kang S. i inni (1991) Diabetes Care 14, ; Home P.J. i inni (1989) British Medical Bulletin 45, ; Bolli G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16. Natomiast dostępne insuliny podstawowe, przede wszystkim insuliny NPH, cechują się za krótkim czasem działania i wykazują zbyt wyraźne maksimum. Oprócz możliwości wpływania na profil działania metodami galenowymi, technika genowa stwarza obecnie możliwość wytwarzania pochodnych insuliny o określonych właściwościach, takich jak dostępność i czas działania, przez samą zmianę właściwości strukturalnych. Dzięki zastosowaniu odpowiednich pochodnych insuliny można zatem osiągnąć znacznie lepsze ustawienie poziomu glukozy we krwi, ściślej przypominające stosunki naturalne. Pochodne insuliny o przyspieszonym działaniu opisano w EP , EP i EP EP dotyczy związków z podstawieniami między innymi w pozycjach B27 i B28, jednak nie z podstawieniem w pozycji B3. W EP opisano pochodne insuliny mające w pozycji B29 reszty różnych aminokwasów, korzystnie proliny, lecz nie kwasu glutaminowego. W EP ujawniono pochodne insuliny z resztą lizyny lub argininy w pozycji B28, które ewentualnie dodatkowo mogą być zmodyfikowane w pozycji B3 i/lub A21.

3 PL B1 3 W EP ujawniono pochodne insuliny, chronione przed modyfikacjami chemicznymi, w których zmienione są reszta asparaginy w pozycji B3 i co najmniej jedna inna reszta aminokwasu w pozycjach A5, A15, A18 lub A21. Nie opisano jednak związków z modyfikacjami w pozycjach B27, B28 lub B29. Nie ma tam wskazówki, że te związki mają zmienioną dynamikę farmakologiczną, skutkującą szybszym działaniem. W WO 92/00321 opisano pochodne insuliny, w których co najmniej jedna reszta aminokwasu w pozycjach B1-B6 jest zastąpiona resztą lizyny lub argininy. Według WO 92/00321 tego rodzaju insuliny wykazują przedłużone działanie. Nie ujawniono jednak związków z modyfikacjami w pozycjach B27, 28, 29. Istniało zapotrzebowanie na takie pochodne insuliny, które po podaniu, zwłaszcza podskórnym, wykazują przyspieszone działanie w porównaniu z insuliną ludzką, sposób ich wytwarzania, odpowiednie produkty pośrednie oraz ich prekursory. Pochodnymi insuliny są pochodne naturalnie występujących insulin, a mianowicie insuliny ludzkiej (SEQ ID NO: 1 = łańcuch A insuliny ludzkiej; SEQ ID NO: 2 = łańcuch B insuliny ludzkiej, patrz wykaz sekwencji) lub insulin zwierzęcych, które w wyniku podstawienia co najmniej jednej reszty występującego w naturze aminokwasu i/lub przyłączenia co najmniej jednej reszty aminokwasu i/lub grupy organicznej odróżniają się od odpowiednich, pod innymi względami takich samych, insulin występujących w naturze. Wynalazek dotyczy nowych pochodnych insuliny o ogólnym wzorze 1, w którym (A1-A5) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej, (A12-A19) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A12 do A19 łańcucha insuliny ludzkiej, A21 oznacza Asn, (B8-B18) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej, (B20-B26) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B26 łańcucha B insuliny ludzkiej, A8, A9 i A10 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A8, A9 i A10 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B30 oznacza -OH lub resztę aminokwasu w pozycji B30 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub atom wodoru, B3 oznacza resztę występującego w naturze zasadowego aminokwasu, B27, B28 i B29 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, albo niezależnie resztę innego występującego w naturze aminokwasu, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B jest zastąpiona resztą innego występującego w naturze aminokwasu, wybraną z reszt obojętnych i kwasowych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodnych soli. Korzystne są pochodne insuliny, w których A8 oznacza alaninę (Ala), A9 oznacza serynę (Ser), A10 oznacza walinę (Val), a B30 oznacza alaninę (Ala), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których A8 oznacza treoninę (Thr), A9 oznacza serynę (Ser), a A10 oznacza izoleucynę (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Szczególnie korzystne są pochodne insuliny, w których B30 oznacza alaninę (Ala), oraz ich fizjologicznie zgodne sole lub pochodne, albo pochodne insuliny, w których B30 oznacza treoninę (Thr), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B1 łańcucha B stanowi reszta fenyloalaniny (Phe), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta histydyny (His), lizyny (Lys) lub argininy (Arg), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, a zwłaszcza te pochodne, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta histydyny (His), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, albo te pochodne, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta argininy (Arg), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, względnie te pochodne, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta lizyny (Lys), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy obejmującej izoleucynę (Ile), kwas asparaginowy (Asp) i kwas glutaminowy (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy kwasowych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole, a zwłaszcza te pochodne, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, albo te pochodne, w których co najmniej

4 4 PL B1 jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których co najmniej jedna reszta aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B jest zastąpiona resztą występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy obojętnych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole, a zwłaszcza te pochodne, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Szczególnie korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, albo pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, względnie pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Szczególnie korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, albo pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, względnie pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Szczególnie korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Wyjątkowo korzystne są pochodne insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję (SEQ ID NO: 3), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są pochodne insuliny, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole, a zwłaszcza pochodne insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję Wyjątkowo korzystne są pochodne insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania nowych pochodnych insuliny oraz ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych powyżej, polegającego na tym, że konstruuje się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny, w którym reszta aminokwasu w pozycji A1 łańcucha A jest połączona z resztą aminokwasu w pozycji B30 łańcucha B poprzez łańcuch peptydowy o ogólnym wzorze 2, w którym R 1 n oznacza łańcuch peptydowy mający n reszt aminokwasów, a n oznacza liczbę całkowitą 0-34, a łańcuch B w pozycji B1 jest przedłużony łańcuchem peptydowym o ogólnym wzorze 3, w którym R 2 m oznacza łańcuch peptydowy mający m reszt aminokwasów, m oznacza liczbę całkowitą 0-40, a p oznacza liczbę 0, 1 lub 2, prowadzi się ekspresję w komórkach gospodarza i uwalnia pochodną insuliny z tego prekursora metodami chemicznymi i/lub enzymatycznymi. Korzystnie jako komórki gospodarza stosuje się bakterie, a zwłaszcza E. coli. Korzystnie jako komórki gospodarza stosuje się drożdże, a zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae. W przypadku wytwarzania pochodnej insuliny, w której łańcuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 3, albo jej fizjologicznie zgodnej soli, prekursor pochodnej insuliny korzystnie ma następującą sekwencję

5 PL B1 5 W przypadku wytwarzania pochodnej insuliny, w której łańcuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 5, albo jej fizjologicznie zgodnej soli, prekursor pochodnej insuliny korzystnie ma następującą sekwencję W przypadku wytwarzania pochodnej insuliny, w której łańcuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 4, albo jej fizjologicznie zgodnej soli, prekursor pochodnej insuliny korzystnie ma następującą sekwencję Wynalazek dotyczy ponadto prekursora pochodnej insuliny mającego sekwencję SEQ ID NO: 6. Wynalazek dotyczy również prekursora pochodnej insuliny mającego sekwencję SEQ ID NO: 8. Wynalazek dotyczy także prekursora pochodnej insuliny mającego sekwencję SEQ ID NO: 7. Wynalazek dotyczy ponadto sekwencji DNA kodującej prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 6. Wynalazek dotyczy również sekwencji DNA kodującej prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 8. Wynalazek dotyczy także sekwencji DNA kodującej prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7. Wynalazek dotyczy ponadto wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 6. Wynalazek dotyczy również wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 8. Wynalazek dotyczy także wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7.

6 6 PL B1 Wynalazek dotyczy ponadto komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 lub SEQ ID NO: 8. Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera co najmniej jedną pochodną insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodną sól zdefiniowaną powyżej, korzystnie w postaci rozpuszczonej, bezpostaciowej i/lub krystalicznej, oraz ewentualnie dodatkowo zawiera substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie, korzystnie siarczan protaminy, przy czym pochodna insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodna sól razem z siarczanem protaminy występuje w postaci substancji współwykrystalizowanej. Wynalazek dotyczy także roztworu o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, charakteryzującego się tym, że zawiera środek farmaceutyczny zdefiniowany powyżej w postaci rozpuszczonej. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania pochodnych insuliny i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego wykazującego aktywność insulinową o szybko występującym działaniu. W szczególności wynalazek dotyczy Lys(B3), Glu(B29)-insuliny ludzkiej. Spośród dwudziestu występujących w naturze aminokwasów kodowanych genetycznie, do obojętnych aminokwasów należą glicyna (Gly), alanina (Ala), walina (Val), leucyna (Leu), izoleucyna (Ile), seryna (Ser), treonina (Thr), cysteina (Cys), metionina (Met), asparagina (Asn), glutamina (Gln), fenylo-alanina (Phe), tyrozyna (Tyr), tryptofan (Trp) i prolina (Pro), do zasadowych aminokwasów należą arginina (Arg), lizyna (Lys) i histydyna (His), a do kwasowych aminokwasów należą kwas asparaginowy (Asp) i glutaminowy (Glu). Pochodne insuliny według wynalazku oraz ich fizjologicznie zgodne sole korzystnie stanowią pochodne insuliny bydlęcej, insuliny świńskiej lub insuliny ludzkiej, a mianowicie pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, w których A8 oznacza resztę alaniny (Ala), A9 oznacza resztę seryny (Ser), A10 oznacza resztę waliny (Val), a B30 oznacza resztę alaniny (Ala) (reszty aminokwasów A8 do A10 i B30 insuliny bydlęcej); A8 oznacza resztę treoniny (Thr), A9 oznacza resztę seryny (Ser), a A10 oznacza resztę izoleucyny (Ile) (reszty aminokwasów A8 do A10 insuliny ludzkiej lub świńskiej), przy czym B30 oznacza resztę alaniny (Ala) (reszta aminokwasu B30 insuliny świńskiej); albo B30 oznacza resztę treoniny (Thr) (reszta aminokwasu B30 insuliny ludzkiej, patrz SEQ ID NO: 2). Szczególnie korzystne są pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, z resztami aminokwasów A8 do A10 i B30 insuliny ludzkiej, które poza tym odznaczają się tym, że (A1-A5) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej (patrz SEQ ID NO: 1), (A12-A19) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A12 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej (patrz SEQ ID NO: 1), (B8-B18) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej (patrz SEQ ID NO: 2), (B20-B26) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B26 łańcucha B insuliny ludzkiej (patrz SEQ ID NO: 2). Korzystne są także pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu, wybraną z grupy reszt obojętnych lub kwasowych aminokwasów; pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu, wybrana z grupy obejmującej resztę izoleucyny (Ile), kwasu asparaginowego (Asp) i kwasu glutaminowego (Glu), a korzystnie co najmniej jedna reszta aminokwasu w pozycjach B27, B28 łańcucha B jest zastąpiona resztą występującego w naturze aminokwasu, wybraną z grupy reszt obojętnych aminokwasów, albo szczególnie korzystnie co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), albo pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu, wybrana z grupy reszt kwasowych aminokwasów, korzystnie co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), korzystnie resztę aminokwasu w pozycji B27 lub B28 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), albo co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego. Szczególnie korzystne są także pochodne insuliny o wzorze 1 oraz ich fizjologicznie zgodne sole, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), a resztę

7 PL B1 7 aminokwasu w pozycji A21 stanowi reszta asparginy (Asp), przy czym korzystnie łańcuch A ma sekwencję Pochodne insuliny o wzorze 1 można korzystnie wytwarzać drogą inżynierii genetycznej. W sposobie wytwarzania pochodnych insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 5, przydatne są wyżej określone prekursory o sekwencjach odpowiednio SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 lub SEQ ID NO: 8. W przypadku wytwarzania pochodnej insuliny o sekwencjach aminokwasów w postaci SEQ ID NO: 9 (łańcuch A) i SEQ ID NO: 10 (łańcuch B), prekursor tej pochodnej insuliny ma korzystnie następującą sekwencję Nowe pochodne insuliny o wzorze 1 wytwarza się głównie drogą inżynierii genetycznej z wykorzystaniem ukierunkowanej mutagenezy, znanymi sposobami. W tym celu dla pożądanej pochodnej insuliny o wzorze 1 konstruuje się genową strukturę kodującą i w komórkach gospodarza, korzystnie w komórkach bakterii, takich jak E. coli, albo drożdży, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, doprowadza się do ekspresji i gdy struktura genowa koduje białko fuzyjne, z białka fuzyjnego uwalnia się pochodną insuliny o wzorze 1. Analogiczne sposoby opisano np. w EP-A , EP-A , EP-A , EP-A i zgłoszeniu patentowym DE P Odszczepienia części stanowiącej białko fuzyjne można dokonać metodami chemicznymi po roztworzeniu komórek, za pomocą chlorowcocyjanu (EP-A ). W procesie wytwarzania z udziałem prekursorów preproinsuliny zawierających część odpowiadającą białku fuzyjnemu (presekwencja) według US , odszczepienie części stanowiącej białko fuzyjne następuje w późniejszym etapie, razem z odszczepieniem peptydu C. Prekursor insuliny poddaje się następnie utleniającej sulfitolizie, np. sposobem według R. C. Marshalla i A. S. Inglisa opisanym w Practical Protein Chemistry - A Hanbook (wydawca A. Darbre) 1986, str , oraz poddaje się renaturyzacji w obecności tiolu, z utworzeniem prawidłowych mostków disulfidowych, np. metodą opisaną przez G. H. Dixona i A.C. Wardlowa w Nature (1960), str Prekursor insuliny można także składać bezpośrednio (EP-A , EP-A ). Peptyd C usuwa się przez odszczepienie za pomocą trypsyny, np. metodą Kemmlera i innych, J.B.C. (1971), str , a pochodną insuliny o wzorze 1 oczyszcza się znanymi sposobami, takimi jak chromatografia (np. EP-A ) oraz krystalizacja. Gdy n we wzorze 2 oznacza 0, odszczepienie za pomocą trypsyny służy do przerwania wiązania peptydowego pomiędzy łańcuchami A i B.

8 8 PL B1 W tym sposobie koniec C łańcucha B jest zakończony resztą argininy lub dwiema resztami argininy. Można je usunąć enzymatycznie za pomocą karboksypeptydazy B. Pochodne insuliny według wynalazku wykazują pełną aktywność biologiczną. Wykazano to przez jej dożylne podawanie królikom, w wyniku którego nastąpiło obniżenie poziomu glukozy we krwi (przykłady 5 i 6). Szybkie działanie po podaniu podskórnym wykazano metodą klamry metabolicznej utrzymującej prawidłowe stężenie cukru we krwi, na psach będących na czczo (przykład 7). Podawano 0,3 le/kg. Preparatem odniesienia była insulina ludzka. W metodzie klamry metabolicznej mierzy się stężenie glukozy we krwi, w krótkich odstępach czasu po wstrzyknięciu insuliny, i poprzez wlew uzupełnia się glukozę w celu dokładnego skompensowania spadku jej stężenia. Zaletą takiego postępowania jest to, że u zwierząt nie występuje rozregulowanie organizmu, jakie nastąpiłoby przy znacznym spadku stężenia glukozy we krwi, po dawce insuliny. Ilość i czasowy przebieg podawanej glukozy charakteryzuje działanie insuliny. Lys(B3), Glu(B29)-insulina (SEQ ID NO: 3) i Lys(B3), Ile(B28)- -insulina (SEQ ID NO: 4) wykazują znaczne szybsze działanie niż insulina ludzka. Maksymalne działanie (szybkość infuzji glukozy) insuliny ludzkiej osiąga się po 100 minutach, natomiast Lys(B3), Glu(B29)-insuliny (SEQ ID NO: 3) po 80 minutach, a Lys(B3), Ile(B28)-insuliny (SEQ ID NO: 4) już po 60 minutach. Dlatego analogi te, wstrzyknięte tuż przed posiłkiem, lepiej kompensują poposiłkowy wzrost stężenia glukozy we krwi niż insulina ludzka. Opisane pochodne insuliny nadają się zarówno do terapii cukrzycy typu 1, jak i cukrzycy typu 2, korzystnie w połączeniu z insuliną podstawową. Nośnikami fizjologicznie nieszkodliwymi i zgodnymi z pochodnymi insuliny są jałowe roztwory wodne, którym nadano izotoniczność z krwią przez dodanie gliceryny, soli kuchennej, glukozy. Nośniki te zawierają znane konserwanty, takie jak np. fenol, m-krezol lub ester kwasu p-hydroksybenzoesowego, oraz dodatkowo substancje buforujące, takie jak np. octan sodu, cytrynian sodu, fosforan sodu. Do nastawiania ph stosuje się rozcieńczone kwasy (zwykle HC1) albo zasady (zwykle Na-OH). Preparaty mogą ponadto zawierać jony cynku. Pochodne insuliny można stosować w preparatach farmaceutycznych w postaci fizjologicznie zgodnych soli. Dowolna część jednej lub kilku pochodnych insuliny może występować w mieszaninie niezależnie od siebie w postaci rozpuszczonej, bezpostaciowej lub krystalicznej. Czasami korzystne jest dodawać do środka farmaceutycznego według wynalazku odpowiedniej ilości odpowiednich stabilizatorów, zapobiegających wytrącaniu się białek przy obciążeniach termiczno-mechanicznych, w kontakcie z różnymi materiałami. Takie substancje są znane np. z EP-A-18609, DE-A lub WO-83/ Pochodne insuliny według wynalazku odznaczają się szybko występującym działaniem. W praktycznej terapii insulinowej zazwyczaj szybko działającą insulinę miesza się z preparatami zawierającymi substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie (np. insuliną NPH). W zależności od składu uzyskuje się preparaty, których profil działania odpowiada nakładającym się profilom poszczególnych składników, o ile składniki te są trwałe i na siebie wzajemnie nie wpływają. Po zmieszaniu pochodnej insuliny z ludzką insuliną NPH należy jednak oczekiwać, że szczególnie przy długotrwałym przechowywaniu zachodzi wymiana pomiędzy rozpuszczoną pochodną i krystaliczną insuliną NPH. W wyniku tego zmienia się w nieprzewidywalny sposób zarówno dynamika farmakologiczna insuliny o przedłużonym działaniu, jak i rozpuszczonej, szybko działającej insuliny. W celu uniknięcia tego, celowe jest zmieszanie szybko działającej pochodnej podczas stosowania z substancją pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie, np. z insuliną NPH. Taką postać pochodnej insuliny o przedłużonym działaniu można dowolnie zmieszać z rozpuszczoną, szybko działającą postacią insuliny, bez zmiany zawartości jednej lub drugiej postaci na skutek procesu wymiany w czasie przechowywania preparatu. Jakkolwiek wynalazek dotyczy zasadniczo szybko działających pochodnych insuliny, możliwe jest także przygotowanie tego rodzaju pochodnych w postaci o przedłużonym działaniu, przy czym korzystnie jako substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie stosuje się siarczan protaminy, a pochodna insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodna sól razem z siarczanem protaminy występuje w postaci substancji współwykrystalizowanej. P r z y k ł a d 1. Konstruowanie Lys(B3)-proinsuliny, jako etap wyjściowy dla związanych z wynalazkiem plazmidów w przykładach 2-4

9 PL B1 9 W opisie patentowym US opisano wektor pint 90d i starter PCR Tir i Insu 11. Składniki te służą jako materiały wyjściowe do konstruowania plazmidu pint 125d, kodującego żądaną Lys(B3)-proinsulinę. Dodatkowo zsyntetyzowano starter Insu 35 o sekwencji 5' TTT GTG AAG GAG GAG CTG 3' i Insu 36 o sekwencji 5' GAG GTG CTG CTT GAG AAA 3'. Przeprowadzono reakcję PCR ze starterami Tir i Insu 36 K oraz drugą reakcję ze starterami Insu 11 i Insu 35. Jako matryca posłużył do tego pint 90d DNA. Produkty obu reakcji PCR są częściowo komplementarne, toteż gdy połączy się je w trzeciej reakcji PCR ze starterami Tir i Insu 11, otrzymuje się fragment kodujący odmianę proinsuliny zawierającą resztę lizyny w pozycji 3 łańcucha B. W celu oczyszczenia ten fragment PCR wytrąca się w etanolu, suszy, a następnie trawi się enzymami restrykcyjnymi Nco 1 i Sal 1, zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę reakcyjną rozdziela się metodą elektroforezy żelowej i wyodrębnia się fragment Nco 1/Sal 1. W wyżej wspomnianym zgłoszeniu opisano plazmid pint 91d, kodujący mini-proinsulinę. Gdy za pomocą Nco 1 i Sal 1 odszczepi się sekwencję kodującą mini-proinsulinę i wyodrębni resztkowy plazmid-dna, to można ten resztkowy plazmid-dna z otrzymanym fragmentem PCR Nco 1/Sal 1 przekształcić w reakcji z ligazą T 4 w plazmid pint 125 d. Transformuje się go w E. coli K12, gdzie następuje jego namnażanie, po czym wyodrębnia się go. Po weryfikacji struktury plazmidu metodą analizy sekwencyjnej DNA i analizy restrykcyjnej, pint 125d-DNA służy jako matryca DNA do wprowadzania dalszych mutacji do tej odmiany proinsuliny. P r z y k ł a d 2. Konstruowanie Lys (B3) Glu (B29)-proinsuliny Dla wytworzenia muteiny zsyntetyzowano starter 329 o sekwencji 5' TTC TAC AGA CCC GAG ACC CGC GGC ATC G- 3' i 329b o sekwencji 5' GCC GCG GGT CTC GGG TGT GTA GAA GAA GC 3' Jako matrycę zastosowano DNA plazmidu pint125d i pint91d. Starter 329a poddaje się reakcji PCR ze starterem Insu 11 na matrycy pint91d, a starter 329b z Tir (patrz przykład powyżej) na matrycy pint125d. Oba produkty PCR są częściowo komplementarne, toteż można je ze sobą połączyć w bezpośredniej reakcji PCR i ponownie poddać reakcji ze starterami Tir i Insu 11. Powstaje w ten sposób fragment DNA kodujący żądaną muteinę. Fragment ten podwójnie trawi się enzymami restrykcyjnymi Nco 1 i Sal 1, a następnie powstały fragment Nco 1/Sal 1 wprowadza się do resztkowego plazmidu DNA pint 91d w reakcji z ligazą T4. Powstały plazmid pint 329, po namnożeniu w E. coli K12, weryfikuje się pod względem żądanej struktury metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Pochodna proinsuliny kodowana przez ten plazmid charakteryzuje się wymianą obu aminokwasów i członem łączącym C, składającym się z aminokwasu argininy. P r z y k ł a d 3. Konstruowanie Lys (B3) Ile (B27)-proinsuliny Konstruowanie przeprowadzono w sposób analogiczny jak w poprzednim przykładzie, z udziałem par starterów: KB3 JB 27A 5' TTC TAC ATC CCC AAG ACC CGC CG 3' i Insu 11 oraz K B3 J 27B 5' CTT GGG GAT GTA GAA GAA GCC TCG 3' i Tir. W obu reakcjach PCR jako matrycę zastosowano DNA plazmidu pint125d. Tak jak to opisano w przykładzie 1, produkty obu reakcji PCR połączono w trzeciej reakcji i produkt sklonowano w sposób podany w tym przykładzie. W wyniku tego otrzymano plazmid pint332. P r z y k ł a d 4. Konstruowanie Lys (B3) Ile (B28)-proinsuliny Konstruowanie przeprowadzono w sposób analogiczny jak w przykładzie 3, z udziałem par starterów: KB3 JB 28A 5' TAC AGA ATC AAG ACC CGC CGG GAG-3' i Insu 11 oraz KB J B28B

10 10 PL B1 5' GGT CTT GAT TGT GTA GAA GAA GCC TCG-3' i Tir. W wyniku tego otrzymano plazmid pint 333. Ekspresja skonstruowanych odmian insuliny Plazmidy pint 329, 332 i 333 transformowano np. każdorazowo w E. coli K12 W3110. Zrekombinowane bakterie, zawierające plazmidy kodujące poszczególne odmiany insuliny, poddano fermentacji zgodnie z przykładem 4 opisu patentowego US i w ten sposób otrzymano potrzebny materiał wyjściowy do wytwarzania poszczególnych odmian insuliny. P r z y k ł a d 5. Konstruowanie Lys (B3) Ile (B28), Asp (A21)-proinsuliny Konstruowanie przeprowadzono zgodnie z przykładem 3. Zamiast pint125d matrycą dla reakcji PCR był jednak DNA plazmidu pint333, skonstruowanego w przykładzie 4. Zastosowano przy tym następującą parę starterów: P-pint365 5-TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG-3' i Tir. W wyniku tego otrzymano plazmid pint 365. P r z y k ł a d 6. Biologiczna aktywność Lys(B3), Glu(B29)-insuliny po dożylnym podaniu królikom T a b e l a 1 Czas [h] Insulina ludzka Lys(B3), Glu(B29)-Insulina ,25 89,17 89,47 0,5 67,56 58,32 0,75 73,24 66, ,13 68,21 1,5 78,12 71, ,47 80, ,01 94, ,55 99,78 8 królików otrzymało dożylnie podane rodzaje insuliny (0,2 le/kg). W ciągu następnych 4 godzin w podanych punktach czasowych oznaczano stężenie glukozy we krwi i przeliczano je na procenty wartości początkowej dla czasu 0. Wyniki podano w tabeli 1. Średnie wartości nie wykazują znaczących różnic pomiędzy biologiczną aktywnością insuliny ludzkiej i Lys(B3), Glu(B29)-insuliny. P r z y k ł a d 7. Biologiczna aktywność Lys(B3), Ile(B27)-insuliny i Lys(B3), Ile(B28)-insuliny po dożylnym podaniu królikom 6 królików otrzymało dożylnie podane rodzaje insuliny (0,2 le/kg). W ciągu następnych 4 godzin w podanych punktach czasowych oznaczano stężenie glukozy we krwi i przeliczano je na procenty wartości początkowej dla czasu 0. Wyniki podano w tabeli 2. Średnie wartości nie wykazują znaczących różnic pomiędzy biologiczną aktywnością insuliny ludzkiej, Lys(B3), Ile(B27)-insuliny i Lys(B3), Ile(B28)-insuliny. T a b e l a 2 Czas [h] Insulina H Lys(B3), Ile (B27)-Insulina Lys(B3), Ile (B28)-Insulina ,33 67,8 62,6 63,3 0,66 54,9 60,6 55,8 1 55,2 66,8 59,3

11 PL B cd. tabeli 2 1, ,2 66,7 2 77,8 90,9 81,6 3 91,5 96,3 97,2 4 99, ,6 P r z y k ł a d 8. Dynamika farmakologiczna Lys(B3), Glu(B29)-insuliny i Lys(B3), Ile (B28)- insuliny, po podskórnym podaniu psom Każdorazowo 4 psy otrzymywały podskórny zastrzyk podanych rodzajów insuliny (0,3 le/kg). Stężenie glukozy we krwi utrzymywano na poziomie 3,7 do 4 mmoli/l przez ciągłą infuzję glukozy. Podano średnią szybkość infuzji glukozy ±SEM, przez 240 minut od momentu wstrzyknięcia (t = 0). Wyniki podano w tabelach 3 i 4 oraz na wykresach przedstawionych na rysunku.

12 12 PL B1

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1

17 PL B1 17

18 18 PL B1

19 PL B1 19

20 20 PL B1

21 PL B1 21

22 22 PL B1

23 PL B1 23 Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe pochodne insuliny o ogólnym wzorze 1, w których (A1-A5) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej, (A12-A19) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A12 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej, A21 oznacza Asn, (B8-B18) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej, (B20-B26) oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B26 łańcucha B insuliny ludzkiej, A8, A9 i A10 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach A8, A9 i A10 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B30 oznacza -OH lub resztę aminokwasu w pozycji B30 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, B1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub atom wodoru, B3 oznacza resztę występującego w naturze zasadowego aminokwasu, B27, B28 i B29 oznaczają reszty aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, albo niezależnie resztę innego występującego w naturze aminokwasu, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasów w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B jest zastąpiona resztą innego występującego w naturze aminokwasu, wybraną z reszt obojętnych i kwasowych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 2. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których A8 oznacza alaninę (Ala), A9 oznacza serynę (Ser), A10 oznacza walinę (Val), a B30 oznacza alaninę (Ala), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 3. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których A8 oznacza treoninę (Thr), A9 oznacza serynę (Ser), a A10 oznacza izoleucynę (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 4. Pochodne insuliny według zastrz. 3, w których B30 oznacza alaninę (Ala), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 5. Pochodne insuliny według zastrz. 3, w których B30 oznacza treoninę (Thr), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 6. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których resztę aminokwasu w pozycji B1 łańcucha B stanowi reszta fenyloalaniny (Phe), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 7. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta histydyny (His), lizyny (Lys) lub argininy (Arg), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 8. Pochodne insuliny według zastrz. 7, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta histydyny (His), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 9. Pochodne insuliny według zastrz. 7, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta argininy (Arg), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 10. Pochodne insuliny według zastrz. 7, w których resztę aminokwasu w pozycji B3 łańcucha B stanowi reszta lizyny (Lys), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 11. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy obejmującej izoleucynę (Ile), kwas asparaginowy (Asp) i kwas glutaminowy (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 12. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy kwasowych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 13. Pochodne insuliny według zastrz. 12, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 14. Pochodne insuliny według zastrz. 12, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 15. Pochodne insuliny według zastrz. 1, w których co najmniej jedna reszta aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B jest zastąpiona resztą występującego w naturze aminokwasu wybranego z grupy obojętnych aminokwasów, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 16. Pochodne insuliny według zastrz. 15, w których co najmniej jedną resztę aminokwasu w pozycjach B27, B28 i B29 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 17. Pochodne insuliny według zastrz. 13, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 18. Pochodne insuliny według zastrz. 13, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.

24 24 PL B1 19. Pochodne insuliny według zastrz. 13, w których resztą aminokwasu w pozycji B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu asparaginowego (Asp), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 20. Pochodne insuliny według zastrz. 14, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 21. Pochodne insuliny według zastrz. 14, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 22. Pochodne insuliny według zastrz. 14, w których resztę aminokwasu w pozycji B29 łańcucha B stanowi reszta kwasu glutaminowego (Glu), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 23. Pochodne insuliny według zastrz. 16, w których resztę aminokwasu w pozycji B28 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 24. Pochodne insuliny według zastrz. 22, w których łańcuch B ma sekwencję 25. Pochodne insuliny według zastrz. 15, w których resztę aminokwasu w pozycji B27 łańcucha B stanowi reszta izoleucyny (Ile), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. 26. Pochodne insuliny według zastrz. 25, w których łańcuch B ma sekwencję 27. Pochodne insuliny według zastrz. 23, w których łańcuch B ma sekwencję 28. Sposób wytwarzania nowych pochodnych insuliny oraz ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych w zastrz. 1, znamienny tym, że konstruuje się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny, w którym reszta aminokwasu w pozycji A1 łańcucha A jest połączona z resztą aminokwasu w pozycji B30 łańcucha B poprzez łańcuch peptydowy o ogólnym wzorze 2, w którym R 1 n oznacza łańcuch peptydowy mający n reszt aminokwasów, a n oznacza liczbę całkowitą 0-34, a łańcuch B w pozycji B1 jest przedłużony łańcuchem peptydowym o ogólnym wzorze 3, w którym R 2 m oznacza łańcuch peptydowy mający m reszt aminokwasów, m oznacza liczbę całkowitą 0-40, a p oznacza liczbę 0, 1 lub 2, prowadzi się ekspresję w komórkach gospodarza i uwalnia pochodną insuliny z tego prekursora metodami chemicznymi i/lub enzymatycznymi. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się bakterie. 30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że jako bakterie stosuje się E. coli. 31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się drożdże. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że jako drożdże stosuje się Saccharomyces cerevisiae. 33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania pochodnej insuliny zdefiniowanej w zastrz. 24 prekursor pochodnej insuliny ma następującą sekwencję

25 PL B Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania pochodnej insuliny zdefiniowanej w zastrz. 26 prekursor pochodnej insuliny ma następującą sekwencję 35. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania pochodnej insuliny zdefiniowanej w zastrz. 27 prekursor pochodnej insuliny ma następującą sekwencję 36. Prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Sekwencja DNA kodująca prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Sekwencja DNA kodująca prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Sekwencja DNA kodująca prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7.

26 26 PL B1 45. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą prekursor pochodnej insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 lub SEQ ID NO: Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną pochodną insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodną sól zdefiniowaną w zastrz Środek farmaceutyczny według zastrz. 46, znamienny tym, że zawiera pochodną insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodną sól w postaci rozpuszczonej, bezpostaciowej i/lub krystalicznej. 48. Środek farmaceutyczny według zastrz. 47, znamienny tym, że dodatkowo zawiera substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie. 49. Środek farmaceutyczny według zastrz. 48, znamienny tym, że jako substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie zawiera siarczan protaminy, przy czym pochodna insuliny i/lub jej fizjologicznie zgodna sól razem z siarczanem protaminy występuje w postaci substancji współwykrystalizowanej. 50. Roztwór o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, znamienny tym, że zawiera środek farmaceutyczny zdefiniowany w zastrz. 46 w postaci rozpuszczonej. 51. Zastosowanie pochodnych insuliny i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania środka farmaceutycznego wykazującego aktywność insulinową o szybko występującym działaniu. 52. Lys(B3), Glu(B29)-insulina ludzka. Rysunki

27 PL B1 27

28 28 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.