(54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny),

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP95/03573 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO96/08563, PCT Gazette nr 13/96 (13) B1 (51) Int.Cl.7 C12N 15/12 C07K 14/435 C12N 15/62 A61K 38/17 (54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie Asp-Pallidipiny, sposób oczyszczania Asp-Pallldiplny, rekombinacyjny wektor, gospodarz bakteryjny, sposób wytwarzania leku i Asp-Pallidipina (30) Pierwszeństwo: ,EP, (73) Uprawniony z patentu: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT, Berlin, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/97 (72) Twórcy wynalazku: Christiane Noeske-Jungblut, Berlin, DE Andreas Becker, Berlin, DE Bernard Haendler, Berlin, DE (45) o udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/02 (74) Pełnomocnik: Gromek Ewa, POLSERVICE PL B1 (57)1. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), hamującego indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawierająca (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, gdzie kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; przy czym Asp-Pal lidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami, które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana w (b) z postranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka; znam ienny tym, że (aa) transfekuje się co najmniej jedną bakterię właściwym wektorem, zawierającym operatywnie związaną ( i) Rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, hamujące indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3 ; Kompozycja farmaceutyczna do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi u ssaka, znamienna tym, że zawiera Asp-Pallidipinę stanowiącą rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N- terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane Zastosowanie Asp-Pallidipiny do wytwarzania leku do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi u ssaka, znamienne tym, że stosuje się rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N- terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane Rekombinacyjny wektor, znamienny tym, że obejmuje operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, mającą sekwencje aminokwasowe wybrane spośród: (a) sekwencji wskazanych jako (aa) SEKW. NR ID : 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowego wariantu lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, Gospodarz bakteryjny, transformowany rekombinacyjnym wektorem, charakteryzującym się tym, że obejmuje operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, mającą sekwencje aminokwasowe wybrane spośród: (a) sekwencji wskazanych jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowego wariantu lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza sekwencjami nie zawierającymi kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym...

2 Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie Asp-Pallidipiny, sposób oczyszczania Asp-Pallidipiny, rekombinacyjny wektor, gospodarz bakteryjny, sposób wytwarzania leku i Asp-Pallidipina Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), hamującego indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawierająca (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, gdzie kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; przy czym Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasową (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to al lelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami, które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N- terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana w (b) z postranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka; znamienny tym, że (aa) transfekuje się co najmniej jedną bakterię właściwym wektorem, zawierającym operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym podczas ekspresji i transportu do peryplazmy prekursor białka zawierający peptyd sygnałowy i Asp-Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny; (bb) poddaje się ekspresji prekursor białka zawierającego Asp-Pallidipinę i sekwencję peptydu sygnałowego; (cc) transportuje się Asp-Pallidipinę z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym rozcięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu wytwarza dojrzałą Asp-Pallidipinę, (dd) wydziela się Asp-Pallidipinę przez ekstrakcję peryplazmy, i (ee) oczyszcza się Asp-Pallidipinę. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się bakterię transfekowaną odpowiednim wektorem, zawierającym operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym podczas ekspresji i transportu do peryplazmy prekursor białka zawierający peptyd sygnałowy i Asp- Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny; w warunkach, w których (A) prekursor białka zawierający Asp-Pallidipinę i sygnałową sekwencję peptydową ulega ekspresji, i (B) Asp- Pallidipina jest transportowana z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym przecięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu daje dojrzałą Asp- Pallidipinę, oraz oczyszcza się tak wytworzoną Asp-Pallidipinę z peryplazmy. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że DNA kodujący sygnałową sekwencję koduje sygnałową sekwensję alkalicznej fosfatazy (APazy). 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako bakterię stosuje się E.coli. 5. Rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, hamujące indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność

3 dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana w (b) z po translacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka. 6. Rekombinacyjne białko według zastrz. 5, znamienne tym, że wytwarza się je sposobem, w którym (aa) transfekuje się co najmniej jedną bakterię właściwym wektorem, który to wektor zawiera operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym podczas ekspresji i transportu do peryplazmy prekursor białka 5 zawierający peptyd sygnałowy i Asp-Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny; (bb) poddaje się ekspresji prekursor białka zawierającego Asp- Pallidipinę i sygnałową sekwencję; (cc) transportuje się Asp-Pallidipinę z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym rozcięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu wytwarza dojrzałą Asp-Pallidipinę, (dd) wydziela się Asp-Pallidipinę przez ekstrakcję peryplazmy, i (ee) oczyszcza się Asp-Pallidipinę. 7. Rekombinacyjne białko według zastrz. 5, znamienne tym, że wytwarza się je sposobem, w którym hoduje się bakterię transfekowaną odpowiednim wektorem, który to wektor zawiera operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym podczas ekspresji prekursor białka zawierający peptyd sygnałowy i Asp-Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny; w warunkach, w których (A) prekursor białka zawierający Asp-Pallidipinę i sygnałową sekwencję peptydo wą ulega ekspresji, i (B) Asp-Pallidipina jest transportowana z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym przecięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu daje dojrzałą Asp-Pallidipinę, oraz oczyszcza się tak wytworzoną Asp-Pallidipinę z peryplazmy. 8. Asp-Pallidipina według zastrz. 7, znamienna tym, że DNA kodujący sygnałową sekwencję koduje sygnałową sekwencję alkalicznej fosfatazy (APase). 9. Kompozycja farmaceutyczna do hamowania indukowanej kolagenem agragacji płytek krwi u ssaka, znamienna tym, że zawiera Asp-Pallidipinę stanowiącą rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; łub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami, które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym zn-3 terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. 10. Zastosowanie Asp-Pallidipiny do wytwarzania leku do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi u ssaka, znamienne tym, że stosuje się rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami, które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana

4 w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka. 11. Zastosowanie Asp-Pallidipiny do wytwarzania leku do leczenia raka z komórkami przerzutowego nowotworu, znamienne tym że stosuje się rekombinacyjne białko Asp- Pallidipina, zawierające (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, przy czym kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; gdzie Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: (a) sekwencje wskazane jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowy wariant lub muteina dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza tymi sekwencjami które nie zawierają kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, lub (c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub jego wariant lub muteina wspomniana w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka. 12. Sposób oczyszczania Asp-Pallidipiny, znamienny tym, że (i) oczyszcza się metodą chromatografii kationo wymiennej; (ii) oczyszcza się metodą wymiany anionowej; i (iii) oczyszcza się metodą wykluczania rozmiarów. 13. Rekombinacyjny wektor, znamienny tym, że obejmuje operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, mającą sekwencje aminokwasowe wybrane spośród: (a) sekwencji wskazanych jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ED.: 3; lub (b) allelowego wariantu lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza sekwencjami nie zawierającymi kwasu aspartowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym przy ekspresji prekursor białka zawierający peptyd sygnałowy i Asp- Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny. 14. Gospodarz bakteryjny, transformowany rekombinacyjnym wektorem, charakteryzującym się tym, że obejmuje operatywnie związaną (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, mającą sekwencje aminokwasowe wybrane spośród: (a) sekwencji wskazanych jako (aa) SEKW. NR ID.: 1; (bb) SEKW. NR ID.: 2; lub (cc) SEKW. NR ID.: 3; lub (b) allelowego wariantu lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub muteiny mają aktywność dojrzałego białka, poza sekwencjami nie zawierającymi kwasu asparaginowego połączonego z peptydem związanym z N-terminalnym końcem Pallidipiny, (ii) drugą cząsteczkę DNA kodującą odpowiednią sekwencję peptydu sygnałowego, oraz (iii) przydatny promotor; przy czym przy ekspresji prekursor białka zawierający peptyd sygnałowy i Asp-Pallidipinę jest przecinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Asp-Pallidipiny. 15. Gospodarz bakteryjny według zastrz. 14, znamienny tym, że jest nim E. coli. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina hamujące indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, kompozycja farmaceutyczna do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi u ssaka, zastosowanie Asp-Pallidipiny do wytwarzania leku do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi u ssaka, sposób oczyszczania Asp- Pallidipiny, rekombinacyjny wektor, gospodarz bakteryjny, sposób wytwarzania leku i Asp- Pallidipina. Kolagen jest najsilniejszym znanym induktorem agregacji ludzkich płytek krwi. Np., po uszkodzeniu ścianki naczynia i wystawieniu na działanie kolagenu, płytki krwi przywierają

5 gwałtownie i ulegają aktywacji. (H. R. Baumgartner (1977) Thromb. Haemostas. 37:1-16; J. Hawiger (1987) Human Pathol. 18: ) Indukowana kolagenem agregacja płytek krwi u ludzi stanowi więc czynniki ryzyka dla pacjentów między innymi przechodzących procedury wpływające na naczynia krwionośne, np., plastykę naczyń lub posocznicę, cierpiących na zawał serca, zdrowiejących po leczeniu zawału serca. W pewnych przypadkach jest konieczne hamowanie indukowanej kolagenem agregacji płytek. Pewne związki znane są z inhibicji takiej agregacji. Np., syntetyczne oligopeptydy hamują indukowaną kolagenem agregację płytek krwi wiążąc się z płytkami. Patrz, np., Bevers i in. (1985) "Collagen Derived Octapeptide Inhibits Platelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin", Thrombosis Research, 37: ; Kamiguian i in. (1983) "Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the Platelet/Collagen Interaction", Thrombosis Research 32: ; Caen i in. (1981) "Oligopeptides with specific inhibiting properties of collagen-induced aggregation, process for preparing the same and pharmaceutical compositions containing them"; oraz europejski opis patentowy EPA Innym źródłem inhibitora indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi jest inhibitor z jadu węża o nieznanej budowie. Patrz Smith i in., "Identification of 50 kdalton snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen" (1991) FEBS 283: Trzecim takim inhibitorem, ze śliny pijawki lekarskiej, jest opisany przez Munro i in. (1991) "Calin - a platelet adhesion inhibitor from the saliva of the medicinal leech", Blood Coagulation i Fibrinolysis 2: Publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP (Merck & Co. Inc. z 15 kwietnia 1992) opisuje białko o masie cząsteczkowej około 16 kilodaltonów (kd) i zdolności hamowania indukowanej kolagenem agregacji ludzkich płytek, pochodzące z gruczołu ślinowego pijawki Haemaenteria officinalis. LAPP jest białkiem 16 kda pijawki Haemaenteria officinalis opisanym przez Connolly'ego i in. (1992) J. Biol. Chem. 267: Patrz także Moubatin, opisany u Waxmana i Connolly'ego (1993) J. Biol. Chem. 268: Jeszcze innym typem inhibitora indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi jest substancja wydzielana z owadów, opisana w publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP Te białka są nazywane "Pallidipinami". Fosfataza alkaliczna (APaza) jest białkiem E. coli wydzielanym do przestrzeni peryplazmicznej. APazę zsyntetyzowano jako prekursor białka, mający 21-aminokwasową liderową sekwencję wycinaną przez liderową peptydazę w czasie przemieszczania przez wewnętrzną błonę bakterii do przestrzeni peryplazmicznej (Y. Kikuchi i in. (1981) Nuci. Acids Res. 9: ). Biosyntezę reguluje stężenie fosforanu w środowisku hodowli, a eksport produktów heterologicznych genów umieszczonym poniżej promotora APazy osiąga się stosując niskie stężenia fosforanu (C. Monteilhet i in. (1993) Gene 125: ). Naturalne źródło białka Pallidipiny jest ograniczone. Procesy biotechnologiczne są logicznym rozwiązaniem dla wytwarzania Pallidipiny. Ekspresja Pallidipiny w komórkach nerki młodych chomików (europejski opis patentowy EP ) zachodzi z szybkością, którą należałoby zwiększyć w celu ekspresji Pallidipiny w ilościach przemysłowych. Tak więc potrzebny był ulepszony układ ekspresji. Istniało więc zapotrzebowanie na ulepszony sposób wytwarzania rekombinacyjnej Pallidipiny, hamującej indukowaną kolagenem agregację płytek krwi, mający wysoką wydajność i pozwalający na powtarzalne wydzielanie białka w wysokim stopniu oczyszczonego. Nowy sposób nie powinien ujemnie wpływać na biologiczną aktywność powstającego białka Pallidipiny. Okazało się, że problem ten można rozwiązać dzięki sposobowi wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipina), która to Asp-Pallidipina hamuje indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawiera: (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, gdzie kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; przy czym Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe:

6 a) sekwencje wskazane jako aa) SEKW. NR ID.: 1; bb) SEKW. NR ID.: 2; lub cc), SEKW. NR ID.: 3; lub b) allelowe warianty lub modyfikacje, lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub modyfikacje lub muteiny nie wpływają znacząco na aktywność białka, lub c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1do 3 lub ich warianty lub muteiny wspomniane w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka; złożonemu z etapów: aa) transfekcji co najmniej jednej bakterii właściwym wektorem, który to wektor zawiera: (i) kod DNA lub cdna rekombinacyjnej Asp-Pallidipiny (ii) przydatną sekwencję białka sygnałowego odcinaną tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej od strony Pallidipiny i (iii) przydatny promotor; bb) ekspresji prekursora białka zawierającego Asp-Pallidipinę i sygnałową sekwencję; cc) transportu Asp-Pallidipiny z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym rozcięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu wytwarza Asp- Pallidipinę, dd) wydzielania Asp-Pallidipiny przez ekstrakcję peryplazmy, i ee) oczyszczenia Asp-Pallidipiny. E. coli jest układem szybkiej ekspresji do wytwarzania heterologicznych, np., eukariotycznych, białek. Nieprawidłowe zwinięcie białek stanowi często problem podczas ekspresji eukariotycznych genowych produktów przez E. coli, i może to spowodować zmniejszenie aktywności produktów ekspresji. Prawdopodobieństwo poprawnego zwinięcia białka jest znacznie wyższe, gdy białko jest transportowane do peryplazmy komórek E. coli, niż gdy pozostaje w cytoplazmie. Transport białek do peryplazmy jest indukowany przez sekwencje białka sygnałowego związane z dojrzałymi białkami; te sekwencje białka sygnałowego wraz z sekwencjami dojrzałego białka określa się nazwą "prekursorów białka". Poprawne przecinanie prekursora białka pomiędzy sekwencją białka sygnałowego i dojrzałego białka oznacza konieczna do ekspresji dojrzałych eukariotycznych białek w E. coli: sekwencja sygnałowa i sekwencja dojrzałego białka ma wpływ na poprawne przecinanie. Dlatego nie wszystkie sekwencje białka sygnałowego są zgodne ze wszystkimi sekwencjami kodującymi. Sygnałowa sekwencja fosfatazy alkalicznej E. coli jest skuteczna w eksporcie prekursorów białek. Wiadomo jednak, że kombinacja danej sekwencji białka sygnałowego i sekwencji dojrzałego białko nie musi koniecznie spowodować dobrego przetwarzania prekursora białka. Zaskakująco odkryto, że wydajność sposobu wytwarzania 5 według wynalazku jest 15 razy wyższa niż wydajność układu ekspresji w komórkach nerki młodych chomików. Wyniki te pokazano w przykładach. Funkcjonowanie i aktywność Asp-Pallidipiny, w porównaniu z układem eukariotycznym ekspresji w komórkach nerki młodych chomików, nie jest pogarszana przez sposób według wynalazku. Dalszą korzyścią jest to, że proteaza (np., liderowa peptydaza) konieczna do przecięcia prekursora białka jest wytwarzana przez sam ą E. coli. Oczyszczanie dojrzałej Asp-Pallidipiny jest znacznie łatwiejsze w sposobie według wynalazku niż oczyszczanie wytworzonych białek przechowywanych w cytoplazmie bakterii. Wystarcza szok osmotyczny do uwolnienia Asp-Pallidipiny zakumulowanej w peryplazmie. W korzystnej odmianie, DNA kodujący sekwencję białka sygnałowego koduje sygnałową sekwencję fosfatazy alkalicznej (APase), korzystnie APase E. coli. Przedmiotem wynalazku jest sposób, w którym wektor dla Asp-Pallidipiny według wynalazku pochodzi z wektora psb94 (U. Boidol i in. (1982) Mol. Gen. Genet. 185: ). Kolejnym aspektem wynalazku jest wektor jak powyżej i dodatkowo przydatne białko sygnałowe, przydatny promotor i, w razie potrzeby, przydatny składnik polepszający. Wektory

7 opisano szczegółowo w literaturze z przykładów i w europejskich publikacjach EP , i Bakteria E. coli jest korzystnym gospodarzem. Przydatne są także inne mikroorganizmy, np., Bacillus subtilis. Ponadto przedmiotem wynalazku jest rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, która to Asp-Pallidipina hamuje indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawiera: (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, gdzie kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; przy czym Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: a) sekwencje wskazane jako aa) SEKW. NR ID.: 1; bb) SEKW. NR ID.: 2; lub cc) SEKW. NR ID.: 3; lub b) allelowe warianty lub modyfikacje, lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub modyfikacje lub muteiny mają zasadniczo taką aktywność, jak Asp-Pallidipina o SEKW. NR ID. 1 do 3, lub c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1do 3 lub ich warianty lub muteiny wspomniane w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka Przedmiotem wynalazku jest rekombinacyjne białko Asp-Pallidipina, która to Asp- Pallidipina hamuje indukowaną kolagenem agregację płytek krwi u ssaka, i zawiera: (i) białko (Pallidipinę) wybrane z grupy białek Pallidipiny, oraz (ii) aminokwas, kwas asparaginowy, gdzie kwas asparaginowy jest związany wiązaniem peptydowym z N-terminalnym końcem Pallidipiny; przy czym Asp-Pallidipina ma następujące sekwencje aminokwasowe: a) sekwencje wskazane jako aa). SEKW. NR ID.: 1; bb) SEKW. NR ID.: 2; lub cc) SEKW. NR ID.: 3; lub b) allelowe warianty lub modyfikacje, lub muteiny dowolnej sekwencji SEKW. NR ID. 1 do 3, które to allelowe warianty lub modyfikacje lub muteiny nie wpływają znacząco na aktywność białka, lub c) białko według którejkolwiek z SEKW. NR ID. 1 do 3 lub ich warianty lub muteiny wspomniane w (b) z potranslacyjnymi modyfikacjami nie wpływającymi znacząco na aktywność dojrzałego białka; wytwarzaną w procesie złożonemu z etapów aa) transfekcji co najmniej jednej bakterii właściwym wektorem, który to wektor zawiera: (i) pierwszą cząsteczkę DNA lub cdna, kodującą rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugą cząsteczkę DNA, kodującą przydatną sekwencję peptydu sygnałowego oraz (iii) przydatny promotor; przy czym po ekspresji prekursor białka zawierający białko sygnałowe i Asp-Pallidipinę jest rozcinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji 5 aminokwasowej dojrzałej Pallidipiny bb) ekspresji prekursora białka zawierającego Asp-Pallidipinę i sekwencję peptydu sygnałowego; cc) transportu Asp-Pallidipiny z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym rozcięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu wytwarza dojrzałą Asp-Pallidipinę,

8 wydzielania Asp-Pallidipiny przez ekstrakcję peryplazmy, i ee) oczyszczenia Asp-Pallidipiny W kolejnej korzystnej odmianie, Asp-Pallidipinę wytwarza się w procesie obejmującym etapy: hodowania bakterii transfekowanej właściwy wektorem, gdzie wektor zawiera operatywne połączenie: (i) pierwszej cząsteczki DNA lub cdna, kodującej rekombinacyjną Asp-Pallidipinę, (ii) drugiej cząsteczki DNA, kodującej przydatną sekwencję peptydu sygnałowego oraz (iii) przydatny promotor; przy czym po ekspresji prekursor białka zawierający białko sygnałowe i Asp-Pallidipinę jest rozcinany tak, że kwas asparaginowy znajduje się w pozycji +1 sekwencji aminokwasowej dojrzałej Pallidipiny, w warunkach, w których ulega ekspresji prekursor białka zawierający Asp-Pallidipinę i sekwencję peptydu sygnałowego; Asp-Pallidipina jest transportowana z cytoplazmy bakterii do peryplazmy, przy czym rozcięcie prekursora białka przez co najmniej jedną proteazę podczas transportu wytwarza dojrzałą Asp-Pallidipinę, oraz oczyszczenia Asp-Pallidipiny z peryplazmy. Korzystne jest białko, w którym sekwencja białka sygnałowego jest sygnałową sekwencją fosfatazy alkalicznej (APase), korzystnie APase E. Coli. Przemysłowym zastosowaniem białek według wynalazku jest ich zastosowanie jako kompozycji farmaceutycznej zawierającej białko według wynalazku w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. Allelowe odmiany lub modyfikacje wspomniane powyżej obejmują zmiany w sekwencji nukleotydów lub aminokwasów, zmianę genotypu lub fenotypu. Co najmniej jeden nukleotyd lub jeden aminokwas może być podstawiony, wycięty lub wstawiony. Większość delecji, insercji i substytucji w szczególności, nie ma wytwarzać radykalnych zmian w charakterystyce białka według wynalazku. Zmodyfikowane lub zmutowane białka według wynalazku można wytwarzać rutynowo i odsiewać w celu określenia dokładnego wpływu substytucji, delecji lub insercji, przez porównanie funkcji zmodyfikowanego lub zmutowanego białka z charakterystycznymi funkcjami białka według wynalazku, np., białek o SEKW. NR ID. 1 do 3, lub rodzimej Pallidipiny, stwierdzając, czy zmienione białko ma porównywalną aktywność, np., biologiczną aktywność. Kod genetyczny jest degeneratywny; to jest większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden kodon trzech nukleotydów. Odpowiednio, allelowa odmiana lub modyfikacja w sekwencji nukleotydowej może lub może nie zmieniać sekwencji aminokwasowej. Tak więc, allelowe zmiany występują przede wszystkim na poziomie DNA i mogą także wtórnie występować na poziomie sekwencji aminokwasowej. Kodowanie sekwencji DNA dla białka według wynalazku można zmodyfikować konwencjonalnymi technikami wytwarzając odmiany końcowego białka według wynalazku wciąż mającego zasadniczo tę samą aktywność jak białko według wynalazku, np., Asp- Pallidipina z SEKW. NR ID. 1 do 3, lub w porównaniu z rodzimą Pallidipiną. Aktywność mierzy się zgodnie z przykładami. Tak więc można dodać, podstawić lub usunąć jeden lub więcej aminokwasów, np., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 do 15 aminokwasów, bez znaczącego wpływu na aktywność białka według wynalazku. Substytucje można ogólnie wykonywać zgodnie z poniższą tablicą 1, gdy konieczna jest modulacja końcowej sekwencji aminokwasowej białka według wynalazku. Znaczące zmiany funkcji lub immunologicznej identyczności osiąga się wybierając podstawienia mniej konserwatywne niż w tablicy 1, to jest wybierają; reszty różniące się znaczniej wpływem na zachowanie (a) struktury łańcucha głównego polipeptydu w obszarze podstawienia, np., konformacji płaskiej lub śrubowej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki, lub c) objętości łańcuchów bocznych.

9 Tabela 1 Normalne podstawienia aminokwasów w białku Początkowe reszty Ala Arg Asn Asp Cys Gin Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Ser Thr Trp Tyr Przykładowe podstawienia Gly,Ser Lys Gin,His Glu Ser Asn Asp Ala,Pro Asn,Gln Leu, Val Ile,Val Arg,Gln,Glu Leu,Tyr,Ile Met,Leu,Tyr Thr Ser Tyr Trp,Phe Val Ile,Leu Muteiny są zdefiniowane homologią pomiędzy dwoma porównywanymi białkami. Wyrażenie "homologia" obejmuje podobieństwa aminokwasów i luk w obu porównywanych sekwencjach. Podobieństwo aminokwasów jest zdefiniowane np. w tablicy 1. Korzystnie, muteiny według wynalazku obejmują sekwencję aminokwasów mających homologię co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 80%, znacznie korzystniej co najmniej 90%, i najkorzystniej co najmniej 95% z sekwencjąjednego z białek SEKW NR ID. 1 to 3. Przez "potranslacyjne zmiany" wspomniane powyżej rozumie się zmiany podczas lub po translacji, takie jak tworzenie mostków dwusiarczkowych i chemiczne modyfikacje aminokwasów. Białka często tworzą kowalencyjne wewnątrzłańcuchowe wiązania. Takie dwusiarczkowe wiązania powstają pomiędzy aminokwasami cysteina-sh w zwiniętym białku lub w białku zwijającym się podczas translacji. Wiązania stabilizują trójwymiarową strukturę białka Takie dwusiarczkowe wiązania rzadko powstają w cząsteczkach białka znajdujących się wciąż w cytozolu komórki, ponieważ znaczne komórkowe stężenie redukującego -SS- (dwusiarczek) związku glutationu zrywa większość takich wiązań. Gdy białka są poza cytoplazmą, są wydzielone lub znajdują się na powierzchni komórki, często tworzą dodatkowe kowalencyjne wewnątrzłańcuchowe wiązania Ponadto, aminokwasy można zmieniać zgodnie z opisem w zgłoszeniu PCT nr W091/ Są możliwe inne zmiany w bocznych łańcuchach aminokwasów. Białko według wynalazku ma czystość co najmniej 40%, korzystnie co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 80% i najkorzystniej co najmniej 90%. Czystość jest zdefiniowana przez ilość białka według wynalazku względem całkowitej ilości białka Stosując sposoby oczyszczania opisane w przykładach nie wykrywa się żadnych innych białek niż białka według wynalazku.

10 Stosując oczyszczone białko według wynalazku, można wytwarzać monoklonalne przeciwciała dobrze znanym sposobem Koehlera i Milsteina, który w szczególności wymaga konwencjonalnej immunizacji myszy lub królików oczyszczonym białkiem według wynalazku jako immunogenem, następnie wytworzenia hybrydom z wytwarzających przeciwciała komórek myszy lub królika. Korzystną odmianą wynalazku jest białko według SEKW. NR ID. 1, poddane ekspresji w E. coli szczep E 15. Asp-Pallidipina wykazuje farmakologiczną aktywność i może być więc przydatna jako lek. Asp-Pallidipinę można stosować w kompozycji farmaceutycznej zawierającej Asp- Pallidipinę w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie aktywną Asp-Pallidipinę według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną sól lub farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W szczególności, Asp-Pallidipina hamuje indukowaną kolagenem agregacji płytek i adhezję komórek nowotworu, korzystnie nowotworu przerzutowego komórek, do kolagenu. Asp-Pallidipina hamuje agregację płytek. Układ testowy opisano w przykładach. Asp- Pallidipina znacząco hamuje agregację płytek w stężeniu 0,5 do 50 μg białka. Najbardziej korzystna Asp-Pallidipina, białko o SEKW. NR ID. 1, ma IC50 50 nmol/1 silnie oczyszczonego białka zgodnie z przykładami. Asp-Pallidipina hamuje agregację płytek w stężeniach od 5 nmol/1 do około 1000 nmol/1. Wyniki z układów testowych in vitro wskazują, że białka według wynalazku można stosować jako lek lub do kuracji medycznej. Wyniki testu dla układów in vitro można skorelować z układem in vivo, ponieważ jest to układ ustalony w tej dziedzinie. R. J. Shebuski i in. (1990) Thrombosis and Haemostasis, 64: Asp-Pallidipinę można podawać dootrzewnowymi zastrzykami, raz dziennie lub 2 do 3 razy tygodniowo. Gdy zwierzęta otrzymują codzienne zastrzyki dla uzyskania stężenia we krwi 100 nmol/1, ich agregacja płytek ulega zmniejszeniu. W tych warunkach nie obserwuje się żadnych poważnych skutków ubocznych. Asp-Pallidipina powoduje inhibicję agregacji płytek u myszy w dziennych dawkach dających stężenie we krwi od około 10 nmol/1 do 1000 nmol/1. Asp-Pallidipina jest więc przydatna do leczenia uszkodzeń w miażdżycy tętnic lub za krzepicy lub do zapobiegania reokluzji po leczeniu zawału serca. Asp-Pallidipinę można stosować jako środek przeciwko miażdżycy tętnic i zakrzepom u ssaków, w tym ludzi, np., do leczenia ubytków miażdżycowych/zakrzepowych, np. wskutek zapadnięcia łysinek miażdżycowych lub związanych z zaburzeniem lub usunięciem śródbłonka, np., w posocznicy lub przy przeszczepach, lub przy leczeniu niestabilnej anginy. Można ją także zastosować do zapobiegania reokluzji po leczeniu zawału serca metodą fibrynolizy lub przez plastykę naczyń (PTCA). Jeśli stosuje się fibrynolityczną terapię (streptokinazą, t-pa lub innymi aktywatorami plazminogenu) do leczenia zawału serca, Asp-Pallidipinę można stosować jako adiuwant do zapobiegania reokluzji naczyń krwionośnych. Leczenie zawału serca balonowym katete rem (PTCA) uszkadza także ścianki naczyń, i to może prowadzić do tworzenia nowego zakrzepu. Można temu zapobiegać podając Asp-Pallidipinę podczas i po operacji. Asp- Pallidipinę można stosować w plastyce naczyń wieńcowych, jak też innej plastyce naczyń. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania leku do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi a tym samym do leczenia miażdżycy naczyń lub zakrzepicy lub do zapobiegania reokluzji po leczeniu zawału serca (tak więc białka są przydatne jako skuteczne profilaktycznie leki do leczenia pacjentów mogących podlegać chorobie lub stanowi) ; Lek ten pozwala na leczenie miażdżycy naczyń lub zakrzepicy lub zapobieganie reokluzji po leczeniu zawału serca, które przeprowadza się przez podawanie skuteczną ilość białka według wynalazku pacjentowi wymagającemu takiego leczenia. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do hamowania indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi zawierająca białko według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. Kompozycja ta może służyć do leczenia miażdżycy naczyń lub zakrzepicy lub do zapobiegania reokluzji po leczeniu zawału serca.

11 Dla takich wskazań właściwe dawkowanie będzie się oczywiście wahać w zależności od np., stosowanego związku według wynalazku, gospodarza, sposobu podawania oraz natury i ostrości leczonego stanu. Jednakże zwykle zadowalające wyniki u zwierząt uzyskuje się przy dziennych dawkach dających stężenie we krwi od 10 do 1000 nmol/1, korzystnie w dziennych dawkach od 30 do 300 nmol/1. Białka według wynalazku można podawać dowolną konwencjonalną drogą, w szczególności jelitowe lub pozajelitowe, np. w postaci wstrzykiwanych roztworów lub zawiesin. Korzystne jest wstrzykiwanie dootrzewnowe. Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające związki według wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym farmaceutycznym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Takie kompozycje można wytwarzać w konwencjonalny sposób. Patrz Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980). Białka według wynalazku hamują także adhezję komórek przerzutowego nowotworu do kolagenu. Układ testowy opisano w przykładach. Białka według wynalazku wykazują znaczącą inhibicję adhezji komórek przerzutowego nowotworu do kolagenu w stężeniu od 1 do 100 μg białka. Test najkorzystniejszego białka, białka o SEKW. NR ID. 1, daje wartość nmol/1 wysoce oczyszczonego białka zgodnie z przykładami 2 i 15. Białka według wynalazku wykazują inhibicję adhezji komórek przerzutowego nowotworu do kolagen w stężeniu od 10 do 2000 nmol/1. Wyniki z układów testowych in vitro wskazują że białka według wynalazku można stosować jako lek lub do kuracji medycznej. Wyniki testu dla układów in vitro można przenieść do układu in vivo, ponieważ jest to układ ustalony w tej dziedzinie. Chan i in. (1990), Science, 2: Białka według wynalazku można podawać podczas i po operacjach chirurgicznych pierwotnego nowotworu dla zapobiegania przerzutom wskutek odłączonych komórek nowotworu mogących dostawać się do strumienia krwi podczas operacji. Takie przeciwprze rzutowe działanie można wykazać w "doświadczalnym" i "spontanicznym" modelu zwierzęcym opisanym przez Chana i in. (1990), Science, 2: Białka według wynalazku można podawać dootrzewnowymi zastrzykami 2 do 3 razy tygodniowo. Gdy zwierzęta otrzymują codzienne zastrzyki dla uzyskania stężenia we krwi 200 nmol/1, mają obniżoną adhezję przerzutowego nowotworu komórek mierzoną przez zliczenie wartości centrów osiadłych przerzutowych komórek. Nie stwierdzono poważnych efektów ubocznych w tych warunkach. Białka według wynalazku wykazują tę inhibicję adhezji komórek przerzutowego nowotworu do kolagenu u myszy w dziennych dawkach do uzyskania stężenia we krwi od 20 do 2000 nmol/1, korzystnie stężenia od 60 do 600 nmol/1. Białka według wynalazku są więc przydatne do leczenia raka, szczególnie raka z komórkami przerzutowego nowotworu, najkorzystniej raka z komórkami silnie przerzutowego nowotworu. Przedmiotem wynalazku jest więc a) zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka z komórkami przerzutowego nowotworu (tak więc białka są przydatne jako skuteczne profilaktycznie leki podawane przed, np., chirurgicznym usunięciem nowotworów); przy pomocy to którego leku można leczyć raka z komórkami przerzutowego nowotworu, przez podawanie hamującą chorobę skuteczną ilość białka według wynalazku pacjentowi wymagającemu takiego leczenia; Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku służąca do leczenia raka z komórkami przerzutowego nowotworu, charakteryzuje się tym, że zawiera białko według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. Dla takich wskazań właściwe dawkowanie będzie się oczywiście wahać w zależności od, np., stosowanego związku według wynalazku, gospodarza, sposobu podawania oraz natury i ostrości leczonego stanu. Jednakże zwykle zadowalające wyniki u zwierząt uzyskuje się

12 przy dziennych dawkach dających stężenie we krwi od 20 do 2000 nmol/1, korzystnie w dziennych dawkach od 60 do 600 nmol/1. Białka według wynalazku można podawać dowolną konwencjonalną drogą, w szczególności jelitowe lub pozajelitowe, np. w postaci wstrzykiwanych roztworów lub zawiesin. Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające związki według wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym farmaceutycznym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Takie kompozycje można wytwarzać w konwencjonalny sposób. Patrz Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980). Termin "wydzielone" oznacza, że inhibitor według wynalazku lub inna jednostka występuje w postaci oddzielonej (oczyszczonej) od składników, z których powstała rekombina cyjnie lub syntetycznie. Wszystkie stopnie takiego wydzielania lub oczyszczania są objęte z natury. Korzystne są stopnie wydzielania lub oczyszczania, w których inhibitor jest przydatny do celów farmaceutycznych. Np., takie stopnie wydzielania (np., aktywności lub czystości) można rutynowo osiągnąć metodami chromatograficznymi, takimi jak stosowane w przykładach. Kolejne oczyszczania, np., do jednorodności, można rutynowo osiągnąć stosując konwencjonalne sposoby, takie jak opisane w następujących tekstach: Methods of Enzymology, tom 182, Guide to Protein Purification, wyd. Murray P. Deutscher, Academic Press 1990; Protein Purification Applications - A Practical Approach, wyd. E. L. V. Harris i S. Angel, IRL-Press 1990; Protein Purification, Principles and Practice, Robert Scopes, Springer-Verlag 1982; I Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, wyd. J.-C. Janson i L. Ryden, VCH publishers Czystość można określić jednym z wielu rutynowych sposobów, np., elektroforezę SDS na żelu poliakrylamidowym, analityczną HPLC, itp. Oczyszczony inhibitor można stosować do określania sekwencji aminokwasowej białka zgodnie ze sposobami rutynowymi dla specjalisty. Hewick, R.M. i in. (1981 ) J. Biol. Chem. 256, Sekwencję aminokwasową inhibitora według wynalazku można zastosować do określania sekwencji przydatnych sond DNA, które można stosować do znajdowania nowych inhibitorów, np., w innych gatunkach. Takie sondy można zsyntetyzować rutynowo, np., stosując automatyczne syntetyzatory DNA, a przesiewanie bibliotek genomowych lub cdna jest także zwykłą czynnością dla specjalisty. (Patrz międzynarodowa publikacja WO 90/07861, z 26 lipca 1990) W realizacji wynalazku konieczne jest stosowanie sekwencji DNA odpowiadającej (kod ującej) zarówno sekwencję DNA (gen) dla Asp-Pallidipiny, wydzielanej z naturalnego środowiska, np., w roztworze lub z wektorem, jak też jego muteiny. Sposoby wytwarzania mu tein są także rutynowe i konwencjonalne dla specjalisty, tak jak sposoby odsiewania dla testów skuteczności takich nowych białek, np., opisanych tutaj. Przydatne muteiny zawierają co najmniej część, np., co najmniej 5%, korzystnie co najmniej 50%, najkorzystniej co najmniej 90% biologicznej aktywności, np., inhibicji indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi, inhibitora opisanego tutaj. Następnie przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania, obejmujący następujący kolejne etapy: (i) oczyszczanie metodą chromatografii kationowymiennej; (ii) oczyszczanie metodą wymiany anionowej i (iii) oczyszczanie metodą wykluczania rozmiarów. W powyższym opisie i dalszych przykładach, wszystkie temperatury są nieskoiygowan e w stopniach Celsjusza; i jeśli nie podano inaczej, wszystkie części i procenty są wagowe. Przykład 1: Konstrukcja Wektora Ekspresji Do konstrukcji wektora według wynalazku, kodującego Asp-Pallidipinę, wykorzystuje się następujące sensowne i antysensowne startery: p3: 5'-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3' (Nrul) (SEKW. NR ID. 4); i

13 p4: 5'-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3' (BamHI) (SEKW. NR ID. 5). PCR obejmuje 8 cykli po 2 minuty w temperaturze 94 C, 1 minutę i 30 s w temperaturze 42 C i 2 minuty i 30 s w temperaturze 72 C stosując p3 i p4 jako parę starterów i 1 μg wzorca DNA. Po oczyszczaniu na żelu i trawieniu NruI i BamHI, fragment subklonuje się do psb/pho. Plazmid wytwarza się przez trawienie Xmal, następnie zabieg z fasolą Mung w celu utworzenia lepkiego nawisu 5' i trawienie BamHI. Konstrukt sprawdza się metodą całkowitego sekwencjonowania DNA wstawionych fragmentów stosując metodą kończenia łańcucha dideoksy (F. Sanger i in. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: ) i zestaw sekwencjonowania z [35S]dATP. Transformację kompetentnej E. coli E 15 konstruktem ekspresji Pallidipiny lub pustym plazmidem (transformacja pozorowana) prowadzi się stosując standardowe sposoby (J. Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Przykład 2: Ekspresja i Ekstrakcja Asp-Pallidipiny. W przypadku plazmidu psb/pho (z psb94; patrz J. Daum i in. (1989) Eur. J. Biochem, 185: ), całonocne kultury E15 (S. J. Hayashi i in. (1964) J. Biol. Chem. 239: ) rozcieńcza się do 8% (objętościowo) w niskofosforanowej pożywce i hoduje przez 6 godzin w temperaturze 37 C. (A. Becker i in. (1994) Protein Expression and Purification 5:50-56). Bakterie zbiera się po indukcji przez odwirowanie i zawiesza w 1/10 objętości 50 mmol/1 Tris-HCi (ph 8,0)/100 mmol/1 NaCl. Preparat zamraża się, rozmraża, i odwirowuje, otrzymując pierwszą frakcję supernatanta (SN1). Granulkę bakterii zawiesza się i równoważy przez 10 minut w temperaturze pokojowej w 0,5 mol/l sacharozy przed odwirowaniem. Supernatant (SN2) zachowuje się do analizy, a granulkę zawiesza się w lodowatej wodzie uzupełnionej 1 mmol/1 PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) i inkubuje przez 10 minut na lodzie. Po tym szoku osmotycznym komórki odwirowuje się i zbiera się supernatant (SN3). Granulkę zawierającą cytoplazmatyczną frakcję (CF) zawiesza się w 50 mmol/1 Tris-HCl (ph 8,0)/100 mmol/1 NaCl Przykład 3: Oczyszczanie rekombinacyjnej Asp-Pallidipiny. Frakcję supematanta zawierającą większość rekombinacyjnej Asp-Pallidipiny (SN1) ustawia się na ph 4,0 kwasem octowym i podano na kolumnę kationowymienną (Mono S, Pharmacia) stosując układ FPLC. Po przemyciu gradientem od 0 do 500 mmol/1 NaCl w octanie sodu ph 4,0, elucję Asp-Pallidipiny osiąga się 20 mmol/1 NaPi, ph 7,0. Eluowane frakcje zawierające Asp-Pallidipinę, jak oceniono metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE) i immunoblottingu, zebrano, odczyn ph ustawiono na 8,0 i podano na kolumnę anionowymienną (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Elucję Asp-Pallidipiny osiąga się gradientem od 0 do 1 mol/l NaCl w 20 mmol/1 octanu sodu ph 8,4. Do końcowego oczyszczania frakcje eluentu zawierające Asp-Pallidipinę zbiera się, zatęża w Seed-Vac (Ba chofer) i poddaje się chromatografii z wykluczaniem rozmiarów stosując Superose 12 (Pharmacia). Przykład 4: Próba agregacji płytek Próbę prowadzi się dokładnie jak opisano w publikacji C. Noeske-Jungbluta (C. No eske-jungblut (1994) J. Biol. Chem. 269: ). W skrócie, ludzką krew zbiera się do 1/6 objętości 71 mmol/1 kwasu cytrynowego/85 mmol/1 cytrynianu trój sodowego/111 mmol/1 glukozy. Bogate w płytki osocze otrzymuje się przez odwirowanie przy przyspieszeniu 135 g przez 20 minut. Asp-Pallidipinę inkubuje się z 500 μl bogatego w płytki osocza przez 1 minutę w temperaturze 37 C przed dodaniem kolagenu (2 μg/ml). Agregację obserwuje się stosując agregometr Micron i określa się maksymalną wartość. IC50 ma wartość około 50 nm. Nie widać znaczącej różnicy pomiędzy związkami z lub bez Asp w pozycji pierwszej. Określa się biologiczną aktywność i wydajność Asp-Pallidipiny oczyszczonej z przestrzeni peryplazmicznej E. coli. Bogate w płytki osocze inkubuje się z Asp-Pallidipiną i związkami kontrolnymi. Agregację indukuje się dodając kolagen. Dzikiego typu Pallidipinę oczyszczoną ze śliny używa się jako pozytywnej kontroli. Później stosuje się pewne inne kon-

14 strukty jako kontrolne, wykazując przewagę Asp-Pallidipiny według wynalazku. Białko według "wynalazku i kontroine dają różne wydajności (tabela 2). Tabela 2 Szczep rekombinacyjna Pallidipina rekombinacyjna arginylo-pallidipina rekombinacyjna aspartylo-pallidipina Wydajność 461 μ g 298 μg 864 μg Przykład 5: Adhezja komórek nowotworu do kolagenu zmniejsza się w obecności białka według wynalazku Białko według wynalazku hamuje adhezję komórek nowotworu do matrycy kolagenu. W ten sposób migrujące komórki nowotworu można powstrzymać częściowo lub całkowicie przed osadzaniem się w organach lub naczyniach krwionośnych, gdy białko według wynalazku znajduje się we krwi lub osoczu pacjenta. Komórki MTLn3 (komórki nowotworu sutka szczura) znakuje się 51 Cr. Płytkę ze studzienkami powleka się kolagenem (typ III) w temperaturze 4 C przez noc znakowanych komórek w 500 μl pożywki DMEM F 12, 20 mmol/1 Hepes, 1 mmol/1 wodorowęglanu, 1% BSA inkubuje się najpierw z 0, 2, 5 lub 10 μl białka według wynalazku ("Superose Pool", 0,5 mg białka/ml) odpowiednio przez 10 min w temperaturze 37 C. Następnie zawiesinę przenosi się do pokrytej kolagenem studzienki i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Następnie studzienki przemywa się i przywarte komórki usuwa 1 mol/l NaOH. Radioaktywność przywartych komórek zlicza się. Tabela 3 Ilość dodanego inhibitora (μl) Przyczepianie komórek (ilość zliczeń na minutę) Przykład 6: Wytwarzanie przeciwciała Około 100 μg inhibitora oczyszczonego według przykładów dodaje się do 0,5 ml pełnego adiuwanta Freunda i emulsję wstrzykuje się podskórnie królikowi. Po 2 tygodniach daje się drugi zastrzyk zawierający około 80 μg oczyszczonego inhibitora i 0,5 ml niepełnego adiuwanta Freunda. Po zastrzyku pobiera się kilka próbek surowicy w celu sprawdzenia wytwarzania specyficznego przeciwciała. Testuje się je w próbie metodą Western biot. 20 ng oczyszczonego inhibitora podaje się na 12,5% żelu poliakryloamidowego SDS i wykonuje się elektroforezę, blotting i wykrywanie zgodnie ze standardowymi sposobami opisanymi przez E. Harlowe, D. Lane, (1988) Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory (rozcieńczanie testowej surowicy 1:500, kozie anty-królicze sprzężone z peroksydazą IgG jako drugie przeciwciało, wykrywanie zestawem ECL z Amersham International, Amersham, UK). Blotting pokazuje, że antysurowica specyficznie reaguje z oczyszczonym inhibitorem.

15 LISTING SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE: (i) ZGŁASZAJĄCY: (A) NAZWA: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT (B) ULICA: MUELLERSTRASSE (C) MIASTO: BERLIN (E) KRAJ: NIEMCY (F) KOD POCZTOWY (ZIP): (G) TELEFON: (030) (H) TELEFAX: (030) (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: SPOSÓB WYTWARZANIA PALLIDIPINY, ZMODYFIKOWANEGO INHIBITORA AGREGACJI PŁYTEK INDUKOWANEJ KOLAGENEM (lii) LICZBA SEKWENCJI: 5 (iv) POSTAĆ KOMPUTEROWA: (A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent In Release #1,0, Version #1,30 (EPO) (v) DANE O ZGŁOSZENIU: NUMER ZGŁOSZENIA: EP (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID. 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 172 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: NIE

16 (V) TYP FRAGMENTU: koniec N (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 1: Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gin Val Cys Arg Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly Gly Lys Gly Gln Phe Ser Val Glu Cys Glu Va Pro As Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr Lys Rsn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile Ala Asp Rsp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Rsn Trp Ser Leu Asp Rsp Trp Phe Ser Rrg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Me Lys (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID. 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 171 aminokwasów (B) TYP: aminokwas

17 (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 2: Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gln Val Cys Arg Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly Val Lys Gly Gin Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID. 3:

18 (l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 172 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 3: Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Va Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gln Val Cys Arg Glu Ty Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Gln Lys Ser Gly Gly Lys Gly Gln Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp

19 Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID. 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = "sensowny starter" (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 4: GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G 31 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID. 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = "antysensowny starter" (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 5: GCGATAGGAT CCAAGCTTRT TACTTCATGT TATC 34

20 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.