(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/39 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 38/18 (06.01) A61P 17/00 (06.01) A61P /00 (06.01) A61P 7/ (06.01) (54) Tytuł wynalazku: Modulowanie aktywności HGF/HGFR do leczenia obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 07/50 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/03 (73) Uprawniony z patentu: THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION, Boston, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MICHAEL DETMAR, Boppelsen, CH KENTARO KAJIYA, Yokohama, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Izabela Szychulska-Hawranek KANCELARIA PRAWNO-PATENTOWA BELLEPAT ul. Grunwaldzka 58/ Przemyśl Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Modulowanie aktywności HGF/HGFR do leczenia obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych TŁO 5 Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) jest czynnikiem wzrostu, który może być znaleziony w ludzkiej surowicy. Receptor HGF (HGFR) został zidentyfikowany jako produkt proto-onkogenu c-met. Zob., np. Bottaro i in., Science, 1: (1991); Naldini i in., Oncogene, 6: (1991); WO 93/754. WO 02/29087 opisuje sposoby modulowania wzrostu naczyń chłonnych u ssaka przez podawanie VEGF, zwłaszcza VEGF-2. Opisany również w WO 02/29087 jest także sposób leczenia obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych przy użyciu VEGF-2. PODSUMOWANIE Wynalazek dostarcza terapeutycznie skuteczną ilość agonisty receptora czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) do zastosowania w leczeniu obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych u pacjenta, gdzie agonista jest wybrany z grupy składającej się z polipeptydu HGF lub jego aktywnego biologicznie fragmentu, i kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd HGF lub jego aktywny biologicznie fragment. Kolejne cechy są zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych. Opisany jest tu także sposób leczenia pacjenta posiadającego niechciany stan skóry, np. stan, który pogarsza strukturę skóry. Sposób obejmuje podawanie, pacjentowi, terapeutycznie skutecznej ilości modulatora HGF/HGFR. W jednym aspekcie, ujawnienie obejmuje zastosowanie terapeutycznie skutecznej ilości modulatora HGF/HGFR (np. agonisty lub antagonisty) do wytwarzania leku. W jednym aspekcie, modulator jest agonistą HGF/HGFR. Agonista HGF/HGFR jest środkiem, który bezpośrednio lub pośrednio zwiększa aktywność HGF/HGFR u pacjenta. Agonista może być zastosowany do leczenia stanu lub do wytwarzania leku do leczenia stanu, w którym pożądane jest zwiększone tworzenie naczyń chłonnych. Takie stany obejmowały obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych, np. nabytego obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych. Przykłady nabytego obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych obejmują obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych nabyty po operacji lub terapię promieniowaniem lub obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych spowodowany co najmniej częściowo przez infekcję, np. przez patogen, np. infekcję taka jak filarioza. Inne stany, w których pożądane jest zwiększone tworzenie naczyń chłonnych obejmują postarzoną skórę lub uszkodzą skórę, np. skórę uszkodzoną przez UVB. Jeszcze inne stany obejmują stany spowodowane częściowo przez czynnik genetyczny lub środowiskowy, np. promieniowanie ultrafioletowe. Przykładowo, stanem jest oddzielanie się naskórka, np. oddzielanie się naskórka spowodowane przez starzenie lub nadmierne wystawienie na światło ultrafioletowe. Wielu agonistów HGF/HGFR zwiększa aktywność sygnałową HGFR. Przykłady agonistów HGF/HGFR obejmują białko, które zawiera polipeptyd czynnika wzrostu hepatocytów (np. jak zmodyfikowany do swej dojrzałej heterodimerowej formy) lub jego biologicznie aktywny fragment lub analog, kwas nukleinowy kodujący czynnik wzrostu hepatocytów lub jego biologicznie aktywny fragment lub analog. Inne białka lub cząsteczki, np. przeciwciała i małe cząsteczki, mogą być także zastosowane do zwiększenia aktywności HGFR. Przykładowo, przeciwciała, które wiążą, i opcjonalnie sieciują (np. dimerują) HGFR mogą być także zastosowane do aktywności HGFR. Przykładowo, niechcianym stanem jest zapalne lub autoimmunologiczne zaburzenie skórne (np. łuszczyca), lub dermatoza rosacea. Terapeutycznie skuteczna ilość agonisty HGF/HGFR może być zastosowana do wytwarzania leku do leczenia takiego zapalnego lub autoimmunologicznego zaburzenia skórnego lub dermatozy rosacea. 1

3 5 W jednym aspekcie, modulator jest antagonistą HGF/HGFR. Antagonista HGF/HGFR jest środkiem, który bezpośrednio lub pośrednio zmniejsza aktywność HGF/HGFR w komórce lub u pacjenta. Antagoniści obejmują kwasy nukleinowe i białka, np. przeciwciała lub rozpuszczalne fragmenty receptora HGF. Przykładowo, antagonista może być białkiem, które oddziałuje z HGF i, np. zmniejsza powinowactwo wiązania HGF do HGFR powierzchni komórki. Przykładowo, białko może być (i) przeciwciałem, które rozpoznaje HGF lub HGFR, lub (ii) białkiem, które zawiera obszar zewnątrzkomórkowy HGFR, np. rozpuszczalny receptor HGF (np. złączony do domeny Fc). Przykłady antagonistów obejmują: cząsteczkę kwasu nukleinowego, która może wiązać się lub inaczej hamować mrna HGF, np. produkcję, przetwarzanie lub translację mrna. Jeszcze inni antagoniści obejmują: dominujące negatywne białko HGF lub jego fragment oraz środek, który zmniejsza ekspresję HGF kwasu nukleinowego (np. sztuczny czynnik transkrypcji lub kwas nukleinowy kodujący sztuczny czynnik transkrypcji). W pewnych implementacjach, modulator zmniejsza endogenny poziom HGF lub HGFR. 45 W jednym aspekcie, ujawnienie obejmuje sposób leczenia pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzenia nowotworowego, np. rakiem przerzutowym, szczególnie takim, który obejmuje przerzuty do komórek w naczyniach chłonnych lub rakiem, który posiada możliwość przerzutów do węzłów chłonnych. Sposób obejmuje podawanie, pacjentowi, terapeutycznie skutecznie ilości antagonisty HGF/HGFR, która zmniejsza aktywność HGF/HGFR u pacjenta. Terapeutycznie skuteczna ilość antagonisty HGF/HGFR może być zastosowana do wytworzenia leku do leczenia pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzeniem nowotworowym, np. rakiem przerzutowym. Antagoniści obejmują kwasy nukleinowe i białka, np. przeciwciała lub rozpuszczalne fragmenty receptora HGF. Przykładowo, antagonista może być białkiem lub innym środkiem, które oddziałuje z HGF i, np. zmniejsza powinowactwo wiązania HGF do HGFR powierzchni komórki. Przykładowo, białko może być przeciwciałem HGF lub pozakomórkowym obszarem HGFR, np. rozpuszczalnym receptorem HGF. Przykłady antagonistów obejmują: cząsteczkę kwasu nukleinowego, która może wiązać się lub inaczej hamować mrna HGF, np. produkcję, przetwarzanie lub translację mrna. Jeszcze inni antagoniści obejmują: dominujące negatywne białko HGF lub jego fragment oraz środek, który zmniejsza ekspresję HGF kwasu nukleinowego (np. sztuczny czynnik transkrypcji lub kwas nukleinowy kodujący sztuczny czynnik transkrypcji). W innym aspekcie, ujawnienie dotyczy sposobu leczenia pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzkiem zaburzenia nowotworowego, np. rakiem przerzutowym, szczególnie takim, który obejmuje przerzuty do komórek w naczyniach chłonnych lub rakiem, który posiada możliwość przerzutów do węzłów chłonnych. Sposób obejmuje podawanie, pacjentowi, terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty integryny α9, która zmniejsza aktywność integryny α9 u pacjenta. Przykładowo, antagonista jest białkiem lub innym środkiem, który oddziałuje z integryną α9 lub odpowiednikową podjednostką beta integryny oraz np. zmniejsza powinowactwo wiązania integryny do komórek. Przykładowo, białko może być przeciwciałem do integryny α9 lub odpowiednikowej podjednostki beta integryny lub pozakomórkowego obszaru receptora integryny α9. Terapeutycznie skuteczna ilość antagonisty integryny α9 może być zastosowana do wytwarzania leku do leczenia pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzenia nowotworowego, np. rakiem przerzutowym. Przykłady antagonistów obejmują: cząsteczkę kwasu nukleinowego, która wiąże lub inaczej hamuje mrna integryny α9, np. produkcję, przetwarzanie lub translacje mrna. Jeszcze inni antagoniści obejmują: dominujące negatywne białko integryny α9 lub jego fragment oraz środek, który zmniejsza ekspresję integryny α9 kwasu nukleinowego (np. sztuczny czynnik transkrypcji lub kwas nukleinowy kodujący sztuczny czynnik transkrypcji). W jeszcze innym aspekcie, ujawnienie dotyczy sposobu oceny komórki lub pacjenta (np. przy użyciu komórek uzyskanych od pacjenta). Sposób obejmuje ocenę ekspresji mrna integryny α9 i stanniokalcyny 1 lub białka w komórce lub w komórkach od pacjentach. Sposób może być zastosowany 2

4 5 do oceny aktywności HGF u pacjenta. Przykładowo, komórka lub komórki uzyskane od pacjenta obejmują komórki śródbłonkowe, np. komórki śródbłonka chłonnego (LEC). Komórka lub pacjent może być leczony, np. przed, podczas, lub po ocenie, za pomocą środka tu opisanego, np. agonisty lub antagonisty HGF/HGFR. Sposób może być stosowany do monitorowania pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzenia tu opisanego i który może być leczony środkiem tu opisanym. W innym aspekcie, ujawnienie dotyczy sposobu identyfikowania związku, który moduluje aktywność komórek śródbłonka chłonnego, np. proliferację lub migrację. Sposób obejmuje: dostarczenie komórki lub organizmu, w którym aktywność HGF/HGFR może być monitorowana; zetknięcie komórki lub organizmu z testowym związkiem; oraz ocenę aktywności HGF/HGFR w komórce lub organizmie. Przykładowo, komórka zawiera reporter aktywności HGF/HGFR lub organizm, który zawiera taką komórkę. Aktywność HGF/HGFR może być oceniona przez test, np. ekspresji białka lub mrna lub aktywność reportera. Zmiana aktywności reportera lub innego relewantnego parametru, przykładowo, wskazuje zmianę aktywności HGF/HGFR. Sposób może dalej obejmować ocenę wpływu testowego związku na proliferację komórek lub migrację komórek, np. proliferację lub migrację komórek śródbłonka chłonnego. W jednym aspekcie, reporter jest genem, który zawiera sekwencję kodującą wykrywalne białko oraz operatywnie połączony promotor, który zawiera region promotora genu HGF lub HGF-R, np. region od miejsca rozpoczęcia transkrypcji do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej, od kodonu inicjacyjnego MET do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej, lub od sekwencji TATA do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej. Komórka lub organizm jest ogólnie ssaka, np. ludzka lub nieludzka, np. myszy, szczura, chomika, świnki morskiej, małpy i tak dalej. W innym aspekcie, ujawnienie dotyczy sposobu identyfikowania związku, który moduluje aktywność komórki śródbłonka, przykładowo związku, który hamuje zależną od czynnika wzrostu hepatocytów proliferację lub migrację komórek śródbłonka chłonnego. Sposób obejmuje: dostarczenie komórki śródbłonka (np. komórki śródbłonka chłonnego) wyrażającej receptor czynnika wzrostu hepatocytów; zetknięcie komórki śródbłonka z czynnikiem wzrostu hepatocytów i związkiem testowym; oraz ocenę komórki, np. pod kątem właściwości, np. właściwości regulowanej przez HGF/HGFR, takiej jak proliferacja lub migracja. Przykładowo, sposób może obejmować określenie czy proliferacja lub migracja komórki śródbłonka chłonnego jest zmieniona w obecności związku testowego. Zmniejszenie proliferacji lub migracji może wskazywać, że związek testowy hamuje zależną od czynnika wzrostu hepatocytów proliferację komórek śródbłonka chłonnego. Komórka śródbłonka może być komórką ssaka, np. myszy, szczura, królika, chomika lub człowieka. Komórka może być wyhodowana lub wyizolowana; przykładowo, komórka jest linii komórkowej lub komórka pierwotną. W jednym aspekcie, komórka wyraża Prox1 i receptor kwasu hialuronowego LYVE-1. Sposób może obejmować ocenę związku testowego w obecności innego modulatora ścieżki HGF/HGFR, np. w obecności białka, które zawiera rozpuszczalne HGF, białka, które zawiera rozpuszczalną domenę zewnątrzkomórkową HGFR, lub przeciwciało do HGF lub HGFR. Sposób może obejmować ocenę fosforylacji tyrozyny receptora czynnika wzrostu hepatocytów, np. dla określenia czy testowy związek powoduje zmniejszenie. W jednym aspekcie, komórka nabłonka chłonnego wyraża rekombinacyjny receptor czynnika wzrostu hepatocytów lub jego mutant. 45 Sposób może dalej obejmować podawanie testowego związku organizmowi, np. człowiekowi lub ssakowi nieczłowiekowi. Sposób może dalej obejmować formułowanie testowego związku lub 3

5 zmodyfikowanego testowego związku, który zachowuje aktywność biologiczną testowego związku jako kompozycję farmaceutyczną, np. przez połączenie związku z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem. 5 W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu oceny testowego związku, np. związku, który jest nakładany miejscowo na badany organizm, np. organizm transgeniczny, który zawiera reporter aktywności ścieżki HGF/HGFR. Sposób obejmuje zetknięcie testowego związku z badanym organizmem i ocenę aktywności ścieżki HGF/HGFR. Przykładowo, ocena może obejmować ocenę ekspresji białek lub mrna HGF, HGFR, lub genu lub produktu genowego regulowanego przez HGFR, np. integryny α9 lub stanniokalcyny 1. Sposób może obejmować także ocenę związku testowego w obecności innego modulatora ścieżki HGF/HGFR, np. w obecności białka, które zawiera rozpuszczalne HGF białka, które zawiera rozpuszczalną domenę zewnątrzkomórkową HGFR, lub przeciwciało do HGF lub HGFR. W jednym aspekcie, reporter jest genem, który zawiera sekwencję kodującą wykrywalne białko oraz operatywnie połączony promotor, który zawiera region promotora genu HGF lub HGFR, integryny α9 lub stanniokalcyny 1, np. region od miejsca rozpoczęcia transkrypcji do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej, od kodonu inicjacyjnego MET do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej, lub od sekwencji TATA do pozycji co najmniej 0, 0, 0, 500, 800, 00, 00, lub 5000 zasad powyżej. Sposób może także obejmować ocenę dwóch lub więcej takich reporterów. Sposób może także obejmować wybór związku testowego (np. z biblioteki związków testowych), jeśli zwiększa on lub zmniejsza aktywność ścieżki HGF/HGFR. Wybrany związek testowy może być sformułowany, np. kompozycja farmaceutyczna, np. nadająca się do podawania miejscowego lub inną drogą podawania. Sposób może dalej obejmować podawanie kompozycji farmaceutycznej pacjentowi, np. pacjentowi posiadającemu lub zagrożonego ryzykiem opisanego tu zaburzenia. Szczegóły jednego lub więcej przykładów wykonania wynalazku są podane na załączonych rysunkach oraz w poniższym opisie. Inne cechy, cele, oraz zalety wynalazku staną się widoczne z opisu i rysunków, oraz z zastrzeżeń. OPIS RYSUNKÓW FIG. 1 przedstawia ilościowe dane RT-PCR dla poziomów mrna markera linii komórek chłonnych i ilościowe RT-PCR oraz testy immonublot dla mrna i białka HGFR, odpowiednio. FIG. 2 przedstawia podwójne barwienie immunofluoroscencyjne dla markera chłonnego LYVE-1 (zielony) i dla HGFR (czerwony), w naczyniach chłonnych. FIG. 3 przedstawia podwójną fluorescencję dla markera chłonnego LYVE-1 (zielony) i HGFR (czerwony) w komórkach śródbłonkowych worków limfatycznych podczas rozwoju embrionalnego myszy. FIG. 4 pokazuje dane dla testu proliferacji i migracji komórek śródbłonka chłonnego (LEC) dla komórek LEC traktowanych HGF. FIG. 5 przedstawia dane dla formacji in vitro rurek LEC, w odpowiedzi na HGF i formację in vivo naczyń chłonnych. FIG. 6 przedstawia podwójne barwienie immunofluoroscencyjne dla markera chłonnego LYVE-1 (zielony) i CD31 (czerwony) po eksperymentalnym zapaleniu skóry. FIG. 7 przedstawia dane QPCR dla poziomów mrna integryny α9 i stanniokalcyny 1 w LEC po traktowaniu HGF. 4

6 FIG. 8 przedstawia reprezentatywne obrazy histologiczne (H & F barwienie i immunofluorescencja dla wykrycia podoplaniny) jelita krętego u transgenicznych HGF (FIG. 8B, D, F, H) i dzikich myszy (FIG. 8a, C, E, G). Słupki skali: 0 μm. 5 FIG. 9 przedstawia analizę podwójnej immunofluorescencji skrawków uszu myszy pod kątem LYVE-1 (zielony) i CD31 (czerwony). Zaobserwowano indukcje tworzenia LYVE-1 dodatnich naczyń chłonnych 14 dni po implementacji peletek zawierających HGF o powolnym uwalnianiu (9B i C; groty strzałek) ale nie kontrolnych peletek (9A). Terapia układowa z użyciem blokującego przeciwciała anty-vegfr-3 (9C) nie hamowała HGF wzbudzanego tworzenia naczyń chłonnych, w porównaniu z terapią kontrolną IgG (9B). Nowoutworzone naczynia krwionośne zaobserwowano we wszystkich próbkach. P: Peletka. Słupki skali: 0 μm. SZCZEGÓŁOWY OPIS Stwierdzono, że, między innymi, receptor czynnika wzrostu hepatocytów (HGFR) jest wysoce wyrażony w komórkach śródbłonka chłonnego (LEC) układu limfatycznego. Traktowanie LEC za pomocą HGF promuje proliferację, migrację i organizację LEC w naczynia. Dodatkowo, podawanie HGF myszom znacznie promowało tworzenie nowych naczyń chłonnych. Dalej, wzbudzanie migracji LEC było w dużym stopniu za pośrednictwem integryny α9. Odpowiednio, możliwa jest terapia patologii, na które wpływa układ limfatyczny, przez modulowanie aktywności HGF/HGFR. Pacjent może być także zdiagnozowany przez ocenę parametru, który ocenia aktywność HGF/HGFR. Środki, które modulują aktywność HGF/HGFR mogą być zidentyfikowane, np. przy użyciu opisanych tu sposobów testowania i badań przesiewowych. I. HGF i HGFR 45 Dojrzała postać ludzkiego HGF (hhgf), odpowiadająca głównej postaci oczyszczonej z ludzkiej surowicy, jest połączonym dwusiarczkiem heterodimerem otrzymanym przez proteolityczne rozszczepianie pro-hormonu ludzkiego pomiędzy aminokwasami R494 i V495. Ten proces rozszczepiania wytwarza cząsteczkę złożoną z podjednostki α o 4 aminokwasach (M.W. 69 kda) i podjednostki β o 234 aminokwasach (M.W. 34 kda). Łańcuchy α i β są wytwarzane z jednego kodowania otwartej ramki odczytu dla białka prekursorowego pre-pro. W prognozowanej strukturze podstawowej przykładowego dojrzałego hhgf, utworzony jest międzyłańcuchowy mostek S-S pomiędzy Cys 487 łańcucha α oraz Cys 604 w łańcuchu β (zob. np. Nakamura i in., Nature 342:4-443, (1989)). Koniec N łańcucha α jest poprzedzony przez 54 aminokwasy, rozpoczynając grupą metioninową. Ten segment zawiera charakterystyczną sekwencję lidera (sygnału) hydrofobowego z 31 reszt oraz prosekwencję. Łańcuch α zaczyna się na aminokwasie (aa) 55, i zawiera cztery domeny Kringle. Domena Kringle 1 rozchodzi się od około aa 128 do około aa 6, domena Kringle 2 jest pomiędzy około aa 211 i około aa 288, domena Kringle 3 jest określona jako rozchodząca się od około aa 3 do około aa 383, oraz domena Kringle 4 rozchodzi się od około aa 391 do około aa 464 łańcucha α. Przykładowe HGF zawiera cztery domniemane miejsca glikozylacji, które znajdują się na pozycjach 294 i 2 łańcucha α i na pozycjach 566 i 653 łańcucha β. Receptor HGF (HGFR) został zidentyfikowany jako produkt proto-onkogenu c-met. Bottaro i in., Science, 1: (1991); Naldini i in., Oncogene, 6: (1991); WO 92/197 opublikowane 6 sierpnia 1992; WO 93/754 opublikowane 19 sierpnia Receptor ( c-met AKA) typowo zawiera, w swej rodzimej formie 190-kDa heterodimerową (połączony disiarczkiem 50-kDA łańcuch α i 145-kDa łańcuch β) białkową membranową kinazę tyrozynową (Park i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: (1987)). Aktywność wiązania HGF do jego receptora jest uważana za przekazywaną przez domenę funkcyjną zlokalizowaną w części końcowej N cząsteczki HGF, w tym dwie pierwsze domeny Kringle (Matsumoto i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181: (1991); Hartmann i in., Proc. Natl. Acad. 5

7 Sci., 89: (1992): Lokker i in., EMBO J., 11:03- (1992); Lokker i Godowski, J. biol. Chem., 268: (1991)). Po związaniu HGF, białko c-met staje się fosforylowane na resztach tyrozynowych podjednostki β 145-kDa. 5 W odniesieniu do sposobów tu ujawnionych, HGF może być wytworzone jako oczyszczony polipeptyd, dla którego sekwencja aminokwasów może być co najmniej 80% identyczna (tj. 85%, 87%, 89%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, lub 0% identyczna) do któregokolwiek NR ID SEKW. 1-4 wymienionych poniżej lub innych naturalnie występujących odmian HGF. Receptor HGF (HGFR) może być wytworzony jako oczyszczony polipeptyd, dla którego sekwencja aminokwasów może być co najmniej 80% identyczna (tj. 85%, 87%, 89%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, lub 0% identyczna) do któregokolwiek NR ID SEKW. 5-8 wymienionych poniżej lub innych naturalnie występujących odmian HGFR. Ludzkie HGF (NR ID SEKW.: 1) HGF Szympansa (NR ID SEKW.: 2) 6

8 HGF myszy (NR ID SEKW.: 3) HGF Szczura (NR ID SEKW.: 4) 5 Ludzkie HGFR (NR ID SEKW.: 5) 7

9 HGFR Szympansa (NR ID SEKW.: 6) 5 8

10 HGFR myszy (NR ID SEKW.: 7) HGFR Szczura (NR ID SEKW.: 8) 5 9

11 Przykładowe regiony HGFR obejmują: Region /region_name="semaphorin domain" /note="sema" /db_xref="cdd:341" Region /region_name="domain found in Plexins, Semaphorins and Integrins" /note="psi" /db_xref="cdd:3" Region /region_name="first repeat of the IPT domain of Plexins and Cell Surface Receptors (PCSR) /note="ipt_plexin_repeat1" /db_xref="cdd:27712" Region /region_name="second repeat of the IPT domain of Plexins and Cell Surface Receptors (PCSR)" /note="ipt_plexin_repeat2" /db_xref="cdd:27711" Region /region_name="third repeat of the IPT domain of Plexins and Cell Surface Receptors (PCSR)" /note="ipt_plexin_repeat3" /db_xref="cdd:27713" Region /region_name="ipt domain of Plexins and Cell Surface Receptors (PCSR) and related proteins" /note="ipt_pcsr" /db_xref="cdd:27705" 5 W pewnych aspektach, HGF, i jego biologicznie aktywne fragmenty są dostarczone jako oczyszczone polipeptydy. Oczyszczone polipeptydy obejmują polipeptydy, które są wytworzone in vitro (np. przez translację in vitro lub przy zastosowaniu automatycznego syntezatora polipeptydów) oraz polipeptydy, które są początkowo wyrażone w komórce (np. komórka prokariotyczna, komórka

12 5 eukariotyczna, komórka owada, komórka drożdży, komórka ssaka, komórka roślinna) i następnie oczyszczona. Komórki, które wyrażają oczyszczony polipeptyd mogą obejmować komórki, które kodują endogenny gen, komórki transdukowane wektorem ekspresji kodującym polipeptyd, oraz komórki, które są eksperymentalnie manipulowane dla wzbudzenia ekspresji endogennego genu, który nie jest typowo wyrażony w tym rodzaju komórki (np. technologia aktywacji genu). W pewnych aspektach, polipeptydy są białkami fuzyjnymi (np. fuzja HGFR-transferaza S glutation), które mogą zawierać miejsce rozszczepiania proteazy celem pozwolenia na rozszczepienie i separacje białka fuzyjnego w oddzielne polipeptydy. W pewnych aspektach, polipeptyd może zawierać sekwencję aminokwasów, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu (np. wielokrotny znacznik histydyny, znacznik FLAG itp.). Sposoby izolacji białek z komórek lub polipeptydów, które są wyrażone przez komórki, obejmują oczyszczanie metodą powinowactwa, chromatografię wykluczania, wysokosprawną chromatografię cieczową, oraz inne chromatograficzne sposoby oczyszczania. Polipeptydy mogą być zmodyfikowane po translacji, np. glikozylowane. Oczyszczone HGF (np. oczyszczone ludzkie HGF) może być uzyskane z linii komórkowej ssaka stabilnie transfekowanej cdna kodującym polipeptyd ludzkiego HGF wymieniony tu jako NR. ID SEKW.: 2 oraz wydzielające dojrzałe HGF jak opisano, np. w patencie US 5,686,292 na rzecz Schwall, lub Naka i in., Journal of Biol. Chem., 267 (28): , (1992). W pewnych aspektach, HGF może być odmianą jednołańcuchową, której brakuje aktywności mitogenicznej ale zachowuje wiązanie receptora o wysokim powinowactwie, jak opisano w Lokker i in., EMBO J., 11(7): 03-, (1992). II. HGF i HGFR modulatory HGF/HGFR 45 Wiele środków może być zastosowanych jako modulator HGF/HGFR do leczenia patologii dotyczących układu limfatycznego, np. wzbudzony obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych, naczyniaki chłonne, limfangiogeneza w raku lub przerzuty nowotworowe. Środek może być dowolnym rodzajem związku, który może być podawany pacjentowi (np. przeciwciała, białka, peptydy, glikoproteiny, glikopeptydy, glikolipidy, polisacharydy, oligosacharydy, kwasy nukleinowe, cząsteczki bioorganiczne, peptydomimetyki, środki farmakologiczne i ich metabolity, sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację, oraz tym podobne). W jednym aspekcie modulator HGF/HGFR jest biologiczny, np. białkiem posiadającym masę cząsteczkową wynoszącą pomiędzy 5-0 kda. Przykładowo, modulator HGF/HGFR może hamować wiązanie HGF do HGFR lub może zapobiegać aktywacji NF-κB z pośrednictwem HGF. Typowy modulator HGF/HGFR może wiązać się do HGFR, np. jednołańcuchowa odmiana HGF, której brakuje aktywności mitogenicznej, ale zachowuje wiązanie do receptora o wysokim powinowactwie (zob. np. Lokker i in., EMBO J., 11(7):03-, (1992)). Modulator HGF/HGFR, który wiąże się do HGF może zmienić strukturę przestrzenną HGF, utrudniać wiązanie HGF do HGFR, lub w inny sposób zmniejszać powinowactwo HGF do HGFR lub zapobiegać interakcji pomiędzy HGF i HGFR. Modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało) może wiązać się do HGF lub do HGFR z K d mniejszym niż -6, -7, -8, -9, lub - M. W jednym aspekcie, modulator HGF/HGFR wiąże się do HGF z powinowactwem co najmniej 5,,, 50, 0, 0, 500, lub 00 razy lepszym niż jego powinowactwo dla białka podobnego do czynnika wzrostu hepatocytów/stymulującego makrofagi (HGF1/MSP). W jednym aspekcie, modulator HGF/HGFR wiąże się do HGF lub HGFR z powinowactwem co najmniej 5,,, 50, 0, 0, 500, lub 00 razy lepszym niż jego powinowactwo do receptora stymulującego makrofagi 1 (RON) (np. NP_002438). Preferowany modulator HGF/HGFR wiąże się swoiście do HGF lub HGFR, tak jak przeciwciało swoiste HGF lub HGFR. Przykładowe cząsteczki białka HGF obejmują ludzkie HGF (np. NP_00932, przedstawione jako NR ID SEKW.:1), HGF szympansa (np. XP_519174, przedstawione jako NR ID SEKW.:2), HGF myszy (np. CAA554, przedstawiony jako NR ID SEKW.: 3), oraz HGR szczura (np A, przedstawiony jako NR 11

13 5 ID SEKW.: 4). Również objęte są białka, które zawierają sekwencje aminokwasów co najmniej 90, 92, 95, 97, 98, 99% identyczną oraz całkowicie identyczną z dojrzałym przetwarzanym regionem wyżej wymienionych białek HGF (np. sekwencja aminokwasów co najmniej 90, 92, 95, 97, 98, 99% identyczna lub całkowicie identyczna z aminokwasami NR ID SEKW.: 1 i białkami zakodowanymi przez kwas nukleinowy, która hybrydyzuje w warunkach bardzo rygorystycznych do ludzkiego, szympansiego, myszy lub szczurzego genu kodującego naturalnie występujące białko HGF. Korzystnie, białko HGF, w swej przetworzonej dojrzałej postaci może zapewnić co najmniej jedną aktywność HGF, np. wiązanie do HGFR. Obliczenia homologii lub identyczności sekwencji pomiędzy dwoma sekwencjami (terminy są tu stosowane zamiennie) są wykonywane następująco. Sekwencje są układane liniowo dla celów optymalnego porównania (np. luki mogą być wprowadzone w jednej lub obu spośród pierwszej i drugiej sekwencji aminokwasu lub kwasu nukleinowego dla optymalnego ułożenia liniowego oraz niehomologiczne sekwencje mogą być pomijane dla celów porównania). Optymalne ustawienie w linii jest określane jako najlepszy wynik przy użyciu programu GAP w pakiecie software GCG z matrycą oceniania Blossum 62 z karą za lukę wynoszącą 12, karą za przedłużoną lukę wynoszącą 4, oraz karą za lukę z powodu zmiany ramki odczytu wynoszącą 5. Reszty aminokwasowe lub nukleotydy na odpowiadających pozycjach aminokwasów lub pozycjach nukleotydów są wówczas porównywane. Gdy pozycja w pierwszej sekwencji jest zajęta przez tą samą resztę aminokwasową lub nukleotyd jak odpowiadająca pozycja w drugiej sekwencji, wówczas cząsteczki są identyczne na tej pozycji (użyta tu identyczność aminokwasu lub kwasu nukleinowego jest ekwiwalentna do homologii aminokwasu lub kwasu nukleinowego). Identyczność procentowa pomiędzy dwoma sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji dzielonych przez sekwencje. Zastosowany tu termin hybrydyzuje w warunkach bardzo rygorystycznych opisuje warunki dla hybrydyzacji i przemywania. Wskazówki dla wykonywania reakcji hybrydyzacji można znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), Wodne i niewodne sposoby są opisane w tej referencji i którykolwiek może być zastosowany. Bardzo rygorystyczne warunki hybrydyzacji obejmują hybrydyzowanie w 6X SSC w około 45 o C, następnie jedno lub dwa przemycia w 0.2X SSC, 0.1% SDS w 65 o C, lub zasadniczo podobne warunki. Przykładowe modulatory HGF/HGFR obejmują przeciwciała, które wiążą się do HGF lub HGFR oraz rozpuszczalne postaci HGFR, które konkurują z HGFR powierzchni komórki do wiązania się z HGF. Przykładem rozpuszczalnej postaci HGFR jest białko fuzyjne Fc, które zawiera co najmniej część pozakomórkowej domeny HGFR (np. rozpuszczalny wiążący się do HGF fragment HGFR), określane jako HGFR-Fc (zob. Mark i in., Journal of Biol. Chem., 267 (36): , (1992)). Inne rozpuszczalne postaci HGFR, np. postaci, które nie zawierają domeny Fc, mogą być także zastosowane. Modulatory HGF/HGFR jako przeciwciała są dalej omówione poniżej. Inne rodzaje modulatorów HGF/HGFR, np. małe cząsteczki, kwas nukleinowy lub aptamery na bazie kwasu nukleinowego, oraz peptydy, mogą być izolowane przez skrining np. jak opisano w Jhaveri i in., Nat. Biotechnol. 18: 1293 i patent US nr 5,223,9. Przykładowe testy dla określenia czy środek wiąże się do HGF lub HGFR i do określenia czy środek moduluje interakcję HGF/HGFR są opisane, np. w patencie US nr 6,468,529 na rzecz Schwall i in. Przykładowa rozpuszczalna forma białka HGFR zawiera region białka HGFR, który wiąże się do HGF, np. domenę pozakomórkową, np. domenę w regionie pozakomórkowym. Ten region może być fizycznie powiązany, np. złączony do innej sekwencji aminokwasów, np. domeny Fc, na jej końcu N- lub C-. Region, od którego HGFR może być oddzielony przez linker od heterologicznej sekwencji aminokwasów. Michieli i in. (05), Cancer Cell, 6:61-73, opisuje przykładowe białko fuzyjne HGFR

14 A. Przeciwciała 5 45 Przykładowe modulatory HGF/HGFR obejmują przeciwciała, które wiążą się do HGF i/lub HGFR. W jednym aspekcie, przeciwciało hamuje interakcję pomiędzy HGF i HGFR, np. przez fizyczne blokowanie interakcji, zmniejszenie powinowactwa HGF i/lub HGFR do jego odpowiednika, przerywania lub destabilizacji kompleksów HGF, sekwestrowanie HGF lub HGFR, lub kierowanie HGF lub HGFR do degradacji. W jednym aspekcie, przeciwciało może wiązać się do HGF lub HGFR na epitopie, który zawiera jedną lub więcej reszt aminokwasowych, które biorą udział w powierzchni międzyfazowej wiązania HGF/HGFR. Takie reszty aminokwasowe mogą być zidentyfikowane, np. przez skanowanie alaninowe. W innym aspekcie, przeciwciało może wiązać się do reszt, które nie biorą udziału we wiązaniu HGF/HGFR. Przykładowo, przeciwciało może zmienić układ przestrzenny HGF lub HGFR a przez to zmniejszyć powinowactwo wiązania, lub przeciwciało może przeszkadzać przestrzennie wiązaniu HGF/HGFR. Przeciwciało może wiązać się do podjednostki α lub podjednostki β HGF. Prócz przeciwciał, które wiążą się do HGF i/lub HGFR, mogą być zastosowane inne przeciwciała. W jednym aspekcie, przeciwciało może zapobiegać aktywacji zdarzenia lub aktywności z pośrednictwem HGF/HGFR. Przykładowo, możliwe jest zastosowanie przeciwciała do integryny α9, które jest podregulowane do góry przez HGF. Przykładowo, pewne przeciwciała do α9 mogą hamować wzbudzaną przez HGF migrację komórek. Zastosowany tu termin przeciwciało dotyczy białka, które zawiera co najmniej jeden zmienny region immunoglobuliny, np. sekwencje aminokwasową, która dostarcza zmienną domenę immunoglobulinową lub sekwencję zmiennej domeny immunoglobulinowej. Przykładowo, przeciwciało może zawierać zmienny region ciężkiego (H) łańcucha (skracany tu do VH) oraz zmienny region lekkiego (L) łańcucha (skracany tu do VL). W innym przykładzie, przeciwciało zawiera dwa zmienne regiony ciężkiego (H) łańcucha i dwa zmienne regiony lekkiego (L) łańcucha. Termin przeciwciało obejmuje wiążące się do antygenu fragmenty przeciwciał (np. jednołańcuchowe przeciwciała, fragmenty Fab, fragmenty F(ab ) 2, fragmenty Fd, fragmenty Fv, oraz fragmenty dab) jak również kompletne przeciwciała, np. nieuszkodzone i/lub o pełnej długości immunoglobuliny typów IgA, IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD, IgM (jak również jego podtypy). Lekkie łańcuchy immunoglobuliny mogą być typów kappa lub lambda. W jednym aspekcie, przeciwciało jest glikozylowane. Przeciwciało może być funkcjonalne dla zależnej od przeciwciała cytotoksyczności i/lub cytotoksyczności z pośrednictwem dopełniacza lub może być niefunkcjonalne dla jednej lub obu z tych aktywności. Regiony VH i VL mogą być dalej podzielone na regiony hiper zmienności, określane regionami determinującymi komplementarność ( CDR ), przeplatane z regionami, które są bardziej konserwatywne, określane regionami ramki (FR). Rozmiar FR i CDR został precyzyjnie określony (zob. np. Kabat, E.A. i in. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, Piąte Wydanie, Amerykański Departament Zdrowia i usług Społecznych, Publikacja NIH Nr ; oraz Chothia, C. i in. (1987) J. Mol. Biol. 196: ). Definicje Kabata są tu stosowane. Każde VH i VL typowo składa się z trzech CDR i czterech FR, rozmieszczonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Domena immunoglobulinowa dotyczy domeny ze zmiennej lub stałej domeny cząsteczek immunoglobuliny. Domeny immunoglobulinowe zazwyczaj zawierają dwa arkusze β złożone z około 7 nici β oraz konserwowane wiązanie dwusiarczkowe (zob. np. A.F. Williams i A.N. Barcley (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-5). Sekwencja zmiennej domeny immunoglobulinowej dotyczy sekwencji aminokwasów, która może tworzyć strukturę wystarczająca dla umieszczenia sekwencji CDR w układzie przestrzennym odpowiednim do wiązania antygenu. Przykładowo, sekwencja może obejmować całą lub część sekwencji aminokwasów naturalnie występującej zmiennej domeny. Przykładowo, sekwencja może pomijać jeden, dwa lub więcej N- lub C-końcowych aminokwasów, aminokwasy wewnętrzne, może 13

15 5 45 zawierać jedną lub więcej wkładek lub dodatkowe aminokwasy końcowe, lub może zawierać inne zmiany. W jednym aspekcie, polipeptyd, który zawiera sekwencję zmiennej domeny immunoglobulinowej może asocjować się z inną sekwencją zmiennej domeny immunoglobulinowej dla utworzenia docelowej struktury wiązania (lub miejsce wiązania antygenu ), np. struktury, która wchodzi w interakcję z HGF lub HGFR. Łańcuch VH lub VL przeciwciała może dalej zawierać cały lub część stałego regionu ciężkiego lub lekkiego łańcucha, dla utworzenia w ten sposób, odpowiednio, ciężkiego lub lekkiego łańcucha immunoglobulin. W jednym aspekcie, przeciwciało jest tetramerem dwóch ciężkich łańcuchów immunoglobulin i dwóch lekkich łańcuchów immunoglobulin. Ciężkie i lekkie łańcuchy immunoglobulin mogą być połączone przez wiązania dwusiarczkowe. Region stały ciężkiego łańcucha zazwyczaj zawiera trzy stałe domeny, CH1, CH2, i CH3. Region stały lekkiego łańcucha zazwyczaj zawiera domenę CL. Zmienny region ciężkiego i lekkiego łańcucha zawiera domenę wiążącą, która wchodzi w interakcję z antygenem. Stałe regiony przeciwciał zazwyczaj pośredniczą we wiązaniu przeciwciała do tkanek gospodarza lub czynników, w tym różnych komórek układu immunologicznego (np. komórki efektorowe) i pierwszy składnik (C1q) klasycznego systemu dopełniacza. Jeden lub więcej regionów przeciwciała może być ludzki, efektywnie ludzki, lub humanizowany. Przykładowo, jeden lub więcej zmiennych regionów może być ludzkich lub efektywnie ludzkich. Przykładowo, jeden lub więcej CDR, np. CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC, i CDR3 LC, może być ludzkie. Każdy CDR lekkiego łańcucha może być ludzki. CDR3 HC może być ludzki. Jeden lub więcej z obszarów ramki może być ludzki, np. FR1, FR2, FR3, i FR4 HC lub LC. W jednym aspekcie, wszystkie obszary ramki są ludzkie, np. pochodzące z ludzkiej komórki somatycznej, np. komórki hematopoetycznej, która wytwarza immunoglobuliny lub komórki niehematopoetycznej. W jednym aspekcie, ludzkie sekwencje są sekwencjami linii zarodkowej, np. zakodowanymi przez kwas nukleinowy z linii zarodkowej. Jeden lub więcej stałych regionów może być ludzki, efektywnie ludzki, lub humanizowany. W innym aspekcie, co najmniej 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, lub 98% regionów ramkowych (np. FR1, FR2, i FR3, kolektywnie, lub FR1, FR2, FR3, i FR4, kolektywnie) lub całe przeciwciało może być ludzie, efektywnie ludzkie, lub humanizowane. Przykładowo, FR1, FR2, i FR3 kolektywnie mogą być co najmniej 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, lub 99% identyczne, lub całkowicie identyczne, do ludzkiej sekwencji zakodowanej przez segment ludzkiej linii zarodkowej. Efektywnie ludzki zmienny region immunoglobulin jest zmiennym regionem immunoglobuliny, który zawiera dostateczną liczbę pozycji ludzkich aminokwasów w ramce tak, że zmienny region immunoglobuliny nie wywołuje odpowiedzi immunogennej u normalnego człowieka. Efektywnie ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem, które zawiera dostateczną liczbę pozycji ludzkich aminokwasów tak, że przeciwciało nie wywołuje odpowiedzi immunogennej u normalnego człowieka. Humanizowany zmienny region immunoglobulin jest zmiennym regionem immunoglobuliny, który jest zmodyfikowany tak, że zmodyfikowana forma wywołuje mniejszą odpowiedź odpornościową u ludzi niż czyni to forma nie zmodyfikowana, np. jest zmodyfikowana by zawierać dostateczną liczbę pozycji ludzkich aminokwasów w ramce tak, że zmienny region immunoglobulin nie wywołuje odpowiedzi immunogennej u normalnego człowieka. Opisy humanizowanych immunoglobulin zawierają, przykładowo, patenty US nr 6,7,213 i 5,693,762. W pewnych przypadkach, humanizowane immunoglobuliny mogą zawierać nieludzki aminokwas na jednej lub więcej pozycjach aminokwasów w ramce. Przeciwciała, które wiążą się do HGF lub HGFR mogą być wytwarzane różnymi środkami, w tym immunizację, np. przy użyciu zwierzęcia, lub sposobami in vitro takimi jak prezentacja fagowa. Całe lub część HGF lub HGFR może być użyte jako immunogen lub jako cel do wyboru. Przykładowo, HGF lub jego fragment lub HGFR lub jego fragment, może być użyty jako immunogen. W jednym aspekcie, 14

16 5 45 immunizowane zwierzę zawiera komórki wytwarzające immunoglobulinę z miejscami naturalnej, ludzkiej, lub częściowo ludzkiej immunoglobuliny w chromosomie (locusami). W jednym aspekcie, zwierzę nie będące człowiekiem zawiera co najmniej część ludzkiego genu immunoglobuliny. Przykładowo, możliwa jest inżynieria szczepów myszy wadliwie produkujących przeciwciała myszy za pomocą dużych fragmentów locusów miejsc ludzkiej lg. Odpowiednio, przy użyciu technologii hybrydoma, co najmniej częściowo ludzkie swoiste antygenowo przeciwciała monoklonalne o pożądanej swoistości mogą być wytwarzane i wybrane. Zob., np. XENOMOUSE TM, Green i in. (1994) Nat. Gen. 7:13-21; US ; patent US nr 5,789,650; oraz WO 96/396. Nieludzkie przeciwciała do HGF i HGFR mogą być także wytworzone, np. u gryzonia. Nieludzkie przeciwciało może być humanizowane, np. jak opisano w EP 239 0; patentach US nr 6,602,503; 5,693,791; oraz 6,7,213, deimmunizowane lub inaczej modyfikowane by je uczynić efektywnie ludzkie. EP (Winter i in.) opisuje zmienianie przeciwciał przez podstawienie (w danym zmiennym regionie) ich regionów determinujących komplementarność (CDR) dla jednego gatunku tymi od drugiego gatunku. Zazwyczaj, CDR nieludzkiego (np. mysiego) przeciwciała są podstawiane w odpowiednie regiony w ludzkim przeciwciele przez użyciu technologii rekombinacyjnego kwasu nukleinowego dla wytwarzania sekwencji kodujących pożądane podstawione przeciwciało. Ludzkie segmenty genowe stałego regionu pożądanego izotypu (zazwyczaj gamma I dla CH i kappa dla CL) mogą być dodane i humanizowane geny dla ciężkiego i lekkiego łańcucha mogą być współwyrażane w komórkach ssaków dla wytworzenia rozpuszczalnego humanizowanego przeciwciała. Inne sposoby humanizowania przeciwciał mogą być także zastosowane. Przykładowo, inne sposoby mogą wyjaśniać trójwymiarową strukturę przeciwciała, pozycje ramkowe, które są w trójwymiarowej bliskości do wiązania determinant, oraz sekwencji peptydów immunogennych. Zob. np. WO 90/07861; patenty US nr 5,693,762; 5,693,761; 5,585,098; oraz 5,5,1; Tempest i in. (1990) Biotechnology 9: i patent US nr 6,7,213. W pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się do HGF i HGFR mogą być wytworzone, np. przy użyciu ludzkich splenocytów zagruntowanych in vitro, jak opisano przez Boerner i in. (1991) J. Immunol. 147: Mogą być one wytworzone przez klonowanie repertuarowe (j. ang. repertoire cloning) jak opisano przez Persson i in. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: lub przez Huand i Stollar (1991) J. Immunol. Methods 141: ; także patent US nr 5,798,2. Duże ludzkie biblioteki nieimmunizowane prezentacją fagową mogą być także użyte do izolacji przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą być opracowane jako leki dla ludzi przy użyciu standardowej technologii fagowej (zob. np. Hoogenboom i in. (1998) Immunotechnology 4:1-, Hoogenbroom i in. (00) Immunol Today 2: ; oraz US ). Przeciwciała i inne białka tu opisane mogą być wytworzone w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. W jednym aspekcie, przeciwciała (np. scfv) są wyrażone w komórkach drożdży takich jak Pichia (zob., np. Powers i in. (01) J. Immunol. Methods 1:123-), Hanseula, lub Saccharomyces. Przeciwciała, szczególnie przeciwciała pełnej długości, np. IgG, mogą być wytworzone w komórkach ssaków. Przykładowe komórki ssaka gospodarza dla rekombinacyjnej ekspresji obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (w tym komórki CHO z negatywną reduktazą dihydrofolianową, opisane w Urlaub i chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: , zastosowano z wybieralnym markerem DHFR, np. jak opisano w Kauman i Sharp (1982) Mol. Biol. 9: ), linie komórek limfocytowych, np. komórek szpiczaka NS0 i komórek SP2, komórek COS, K562, oraz komórkę od zwierzęcia transgenicznego, np. transgenicznego ssaka. Przykładowo, komórka może być komórka śródbłonka ssaka. Prócz sekwencji kwasu nukleinowego kodującej domenę immunoglobulinową, wektory ekspresji rekombinacyjnej mogą mieścić dodatkowe sekwencje kwasów nukleinowych, takie jak sekwencje, które

17 5 regulują replikację wektora w komórkach gospodarza (np. początki replikacji) oraz selekcyjne geny markerowe. Selekcyjny gen markerowy ułatwia selekcję komórek gospodarza, do których wprowadzono wektor (zob., np. patenty US nr 4,399,216; 4,634,665; i 5,179,017). Przykładowe selekcyjne geny markerowe obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania w komórkach gospodarza dhfr z użyciem wyboru/wzmocnienia metotreksatem) i gen neo (dla wyboru G418). W przykładowym systemie dla rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała (np. przeciwciała pełnej długości lub jego części wiążącej antygen), wektor ekspresji rekombinacyjnej kodujący zarówno ciężki łańcuch przeciwciała jak i lekki łańcuch przeciwciała jest wprowadzany do komórek CHO dhfr przez transfekcję fosforanem wapnia. W wektorze ekspresji rekombinacyjnej geny ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała każdy jest połączony operatywnie do elementów regulacyjnych enhancera/promotora (np. pochodzących z SV, CMV, adenowirusa i tym podobnych, takich jak element regulacyjny enhancera CMV/promotora AdMLP lub element regulacyjny enhancera SV/promotora AdMLP) do napędzania wysokich poziomów transkrypcji genów. Wektor rekombinacyjnej ekspresji przenosi także gen DHFR, który pozwala na wybór komórek CHO, które zostały transfekowane wektorem przy użyciu wyboru/wzmocnienia metotreksatem. Wybrane transformowane komórki gospodarza są hodowane celem pozwolenia na ekspresję ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała i nienaruszone przeciwciało jest odzyskiwane z pożywki hodowlanej. Standardowe techniki biologii molekularnej są stosowane do wytworzenia wektora ekspresji rekombinacyjnej, do transfekowania komórek gospodarza, do wybierania komórek transformowanych, do hodowli komórek gospodarza, oraz do odzyskania przeciwciała z pożywki hodowlanej. Przykładowo, niektóre przeciwciała mogą być wyizolowane przez chromatografię powinowactwa z użyciem białka A lub białka B. Przeciwciała (i fuzje Fc) mogą także zawierać modyfikacje, np. modyfikacje, które zmieniają działanie Fc, np. dla zmniejszenia lub usunięcia interakcji z receptorem Fc lub C1q, lub obydwoma. Przykładowo, stały region ludzkiego lgg1 może być zmutowany na jednej lub więcej resztach, np. na jednej lub więcej resztach 234 i 237, np. zgodnie z numeracją w patencie US nr 5,648,260. Inne przykładowe modyfikacje obejmują te opisane w patencie US nr 5,648,260. Dla pewnych białek, które zawierają domenę Fc, system produkcji przeciwciało/białko może być przeznaczony do syntezy przeciwciał lub innych białek, w których region Fc jest glikozylowany. Przykładowo, domena Fc cząsteczki IgG jest glikozylowana na asparaginie 297 w domenie CH2. Domena Fc może także zawierać inne post-translacyjne modyfikacje komórek eukariotycznych. W innych przypadkach, białko jest wytwarzane w postaci, która nie jest glikozylowana. Przeciwciała i inne białka mogą być także wytwarzane przez zwierzę transgeniczne. Przykładowo, Patent US nr 5,849,992 opisuje sposób ekspresji przeciwciała w gruczole mlekowym ssaka transgenicznego. Transgen jest zbudowany, że zawiera promotor swoisty dla mleka i sekwencje kwasów nukleinowych kodujących przedmiotowe przeciwciało, np. przeciwciało tu opisane, i sekwencję sygnałową do wydzielania. Mleko wytwarzane przez samice takich ssaków transgenicznych zawiera, w nim wydzielone, przedmiotowe białko, np. przeciwciało lub białko fuzyjne Fc. Białko może być oczyszczone z mleka, lub dla pewnych zastosowań, zastosowane bezpośrednio. Sposoby opisane w kontekście przeciwciał mogą być przystosowane do innych białek, np. białek fuzyjnych Fc i rozpuszczalnych fragmentów receptora. B. Odmiany HGF W pewnych aspektach, białka HGF mogą być wariantami HGF, które są odporne na rozszczepianie proteolityczne przez enzymy, które są zdolne do konwersji in vivo HGF do jego postaci dwułańcuchowej. Warianty są korzystnie stabilizowane w postać jednołańcuchową przez skierowaną na miejsce 16

18 5 mutagenezę w regionie rozpoznanym przez enzym zdolny do konwersji HGF do jego formy dwułańcuchowej. Te odmiany HGF zachowują zasadniczo pełne powinowactwo wiązania receptora odpowiadającego dzikiego HGF, ale nie aktywują HGFR. W jednym aspekcie, warianty HGF mogą posiadać podwyższone powinowactwo wiązania receptora względem odpowiadającego dzikiego HGF ale być niezdolnymi do aktywowania HGFR. Takie związki są konkurencyjnymi antagonistami odpowiadającego dzikiego HGF i, gdy są obecne w wystarczającym stężeniu, są zdolne do hamowania wiązania dzikiego HGF do HGFR. Zob., np. Lokker i in., EMBO J., 11(7):03-, (1992) i Patent US nr 5,316,921 na rzecz Godowski i in. Odpowiednio, mogą być one stosowane jako antagoniści HGF/HGFR. C. Peptydy 45 W pewnych aspektach, modulator HGF/HGFR może być peptydem z 32 aminokwasów lub mniej, które niezależnie wiąże się do ale nie aktywuje docelowej cząsteczki (np. HGFR). Niektóre takie peptydy mogą zawierać jedno lub więcej wiązań dwusiarczkowych. Inne peptydy, tak zwane peptydy liniowe, są pozbawione cystein. W jednym aspekcie, peptydy są sztuczne, tj. nie występują w naturze lub nie są obecne w białku zakodowanym przez jeden lub więcej genomów w obrębie zainteresowania, np. genom ludzki. Peptydy syntetyczne mogą posiadać mało lub żadną strukturę w roztworze (np. niestrukturalne), struktury heterogeniczne (np. zmienne układy przestrzenne lub o poluźnionej strukturze), lub pojedynczą naturalną strukturę (np. wspólnie złożone). Niektóre syntetyczne peptydy przyjmują konkretna strukturę gdy wiążą się do docelowej cząsteczki. Niektóre przykładowe peptydy syntetyczne są tak zwanymi peptydami cyklicznymi, które posiadają co najmniej wiązanie dwusiarczkowe oraz, przykładowo, pętlę z około 4 do 12 reszt niecysteinowych. Przykładowe peptydy posiadają długość mniejszą niż 28, 24,, lub 18 aminokwasów. Sekwencje peptydowe, które niezależnie wiążą HGFR mogą być zidentyfikowane dowolnym z wielu sposobów. Przykładowo, mogą być wyselekcjonowane z biblioteki prezentacji lub macierzy peptydów. Po zidentyfikowaniu, takie peptydy mogą być wytworzone syntetycznie lub środkami do rekombinacji. Sekwencje mogą być włączone (np. włożone, dodane lub dołączone) do dłuższych sekwencji. Techniki omówione w Kay i in. Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego 1996) i patencie US nr 5,223,9 są przydatne do wytworzenia biblioteki potencjalnych spoiw odpowiadających wyselekcjonowanej matrycy macierzystej. Peptydowe biblioteki prezentacji mogą być wytworzone zgodnie z takimi technikami, i badane pod kątem peptydów, które wiążą się do i hamują HGFR. Dodatkowo, biblioteki fagowe lub wyselekcjonowane populacje z bibliotek fagowych mogą być przeciwselekcjonowane, np. przez przeciwselekcję za pomocą domeny wiążącej HGFR, której brakuje domeny SEMA (semaforyny) lub domeny PSI (pleksyny/semaforyny/integryny), które obie przyczyniają się do wiązania HGF. Takie procedury mogą być zastosowane do pomijania peptydów, które nie stykają się z miejscem wiązania HGF. Peptydy mogą być także zsyntezowane przy użyciu alternatywnych szkieletów, np. szkieletu peptoidowego, np. do wytworzenia związku, który posiada podwyższoną odporność na proteazę. W szczególności ten sposób może być użyty do wytworzenia związku, który wiąże się i hamuje aktywację HGFR i nie jest rozszczepiony, np. przez proteazy surowicy. Polipeptyd, który hamuje aktywację HGFR może być związany z (np. skoniugowany) polimerem, np. zasadniczo nieantygenowe polimery, takie jak tlenki polialkilenowe lub tlenki polietylenowe. Odpowiednie polimery będą się różnić zasadniczo wagą. Polimery posiadające przeciętną masę cząsteczkową wynoszącą od około 0 do około 000 (lub około 00 do około 000, oraz 00 do około 100) mogą być zastosowane. Wiele ugrupowań polimerowych może być dołączonych do jednego 17

19 polipeptydu, np. co najmniej dwa, trzy, lub cztery takie ugrupowania, np. posiadających przeciętną masę cząsteczkową wynoszącą około 00 do 7000 Daltonów. 5 Przykładowo, polipeptyd może być skoniugowany do rozpuszczalnego w wodzie polimeru, np. hydrofilowych polimerów poliwinylowych, np. alkohol poliwinylowy i poliwinylopirolidon. Nieograniczająca lista takich polimerów obejmuje homopolimery tlenku polialkilenowego takie jak glikol polietylenowy (PEG) lub glikole polipropylenowe, poliole polioksyetylenowane, ich kopolimery i ich blokowe kopolimery, pod warunkiem, że rozpuszczalność w wodzie kopolimerów blokowych jest zachowana. Dodatkowe przydatne polimery obejmują polioksyalkileny takie jak polioksyetylen, polioksypropylen, oraz blokowe kopolimery polioksyetylenu i polioksypropylenu (pluroniki); polimetakrylany; karbomery; rozgałęzione lub nierozgałęzione polisacharydy, które zawierają monomery sacharydów D-mannozę, D- i L-galaktozę, fukozę, fruktozę, D-ksylozę, L-arabinozę, kwas d-glukoronowy, kwas sialowy, kwas D-galakturonowy, kwas D-mannuronowy (np. kwas polimannuronowy, lub kwas alginowy), D-glukozaminę, D-galaktozaminę, D-glukozę i kwas neuraminowy w tym homopolisacharydy i heteropolisacharydy takie jak laktoza, amylopektyna, skrobia, skrobia hydroksyetylowa, amyloza, siarczan dekstranu, dekstran, dekstryny, glikogen, lub podjednostka polisacharydowa mukopolisacharydów kwaśnych, np. kwas hialuronowy; polimery alkoholi cukrowych takie jak polisorbitol i polimannitol; heparynę lub heparon. Inne związki mogą być także przyłączone do tego samego polimeru, np. cytotoksyna, znacznik lub inny środek celujący lub niezwiązany środek. Mono aktywowane, alkoksyzakończone tlenki polialkilenowe (POA), np. monometoksy-zakończone glikole polietylenowe (mpeg); C 1-4alkil-zakończone polimery; oraz bis aktywowane tlenki polietylenowe (glikole) mogą być zastosowane do sieciowania. Zob., np. US 5,951,974. D. Antagoniści kwasu nukleinowego 45 W pewnych implementacjach, stosowani są antagoniści kwasu nukleinowego dla zmniejszenia ekspresji genu endogennego kodującego HGF, HGFR, integrynę α9, lub stanniokalcynę 1. W jednym aspekcie, antagonista kwasu nukleinowego jest sirna, które celuje w mrna kodujące HGF lub HGFR. Inne rodzaje antagonistycznych kwasów nukleinowych mogą być także zastosowane, np. dsrna, rybozym, model potrójnej helisy, lub antysensowny kwas nukleinowy. W pewnych aspektach, antagoniści kwasu nukleinowego mogą być kierowani w dolnostrumieniowe cele efektorowe aktywacji HGFR (np. ludzka integryna α9, której przykładowa sekwencja jest wymieniona pod Genbank Nr NM_0027). sirna są krótkimi dwuniciowymi RNA (dsrna), które opcjonalnie zawierają overhangi. Przykładowo, region dupleksowy sirna posiada długość około 18 do nukleotydów, np. długość około 19,, 21, 22, 23, lub 24 nukleotydów. Typowo, sekwencje sirna są dokładnie komplementarne do docelowego mrna. dsrna i sirna mogą być w szczególności zastosowane do wygłuszania ekspresji genów w komórkach ssaków (np. ludzkich komórkach). sirna zawierają także krótkie RNA o strukturze spinki (shrna) z rdzeniami z 29-par zasad i 2-nukleotydowe 3 overhangi. Zob., np. Clemens i in. (00) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: ; Billy i in. (01) Proc. Natl. Sci. USA 98: ; Elbashir i in. (01) Nature, 411:494-8; Yang i in. (02) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: ; Siolas i in. (05), Nat. Biotechnol. 23(2): ; ; US , 01434, ; oraz Środki antysensowe mogą obejmować przykładowo, od około 8 do około 80 nukleozasad (tj. od około 8 do około 80 nukleotydów), np. około 8 do około 50 nukleozasad, lub około 12 do około nukleozasad. Związki antysensowe obejmują rybozymy, oligonukleotydy (oligozymy) zewnętrznych sekwencji prowadzących (EGS), oraz inne krótkie katalityczne RNA lub oligonukleotydy katalityczne, które hybrydyzują do docelowego kwasu nukleinowego i modulują jego ekspresję. Związki antysensowe mogą zawierać odcinek co najmniej ośmiu kolejnych nukleozasad, które są komplementarne do sekwencji w docelowym genie. Oligonukleotyd nie musi być 0% komplementarny do jego docelowej sekwencji 18

20 5 kwasu nukleinowego aby móc swoiście hybrydyzować się. Oligonukleotyd hybrydyzuje się swoiście gdy wiązanie oligonukleotydu do celu zakłóca normalne funkcjonowanie docelowej cząsteczki powodując utratę przydatności, i występuje wystarczający stopień komplementarności dla uniknięcia nieswoistego wiązania oligonukleotydu do niedocelowych sekwencji w warunkach, w których pożądane jest swoiste wiązanie, tj. w warunkach fizjologicznych w przypadku prób in vivo lub leczenia terapeutycznego lub, w przypadku prób in vitro, w warunkach, w których testy są przeprowadzane. Hybrydyzacja oligonukleotydów antysensowych za pomocą mrna (np. mrna kodującego HGF lub HGFR) może zakłócać jedną lub więcej normalnych funkcji mrna. Funkcje mrna, które będą zakłócane, będą obejmować wszystkie kluczowe funkcje takie jak, przykładowo, translokacja RNA do miejsca translacji białka, translacja białka z RNA, splatanie RNA dla uzyskania jednego lub więcej rodzajów mrna, aktywność katalityczna, w którą może być zaangażowana przez RNA. Wiązanie swoistego(ych) białka(ek) do RNA może być także zakłócone przez hybrydyzację oligonukleotydu antysensowego do RNA. Przykłady związków antysensowych obejmują sekwencje DNA lub RNA, które swoiście hybrydyzują do docelowego kwasu nukleinowego, np. mrna kodującego HGF lub HGFR. Region komplementarny może rozciągać się na pomiędzy około 8 do około 80 nukleozasad. Związki mogą zawierać jedną lub więcej zmodyfikowanych nukleozasad. Zmodyfikowane nukleozasady mogą obejmować, np., 5-podstawione pirymidyny takie jak 5-jodouracyl, 5-jodocytozyna, oraz C5- propynylopirymidyny takie jak C5-propynylocytozyna i C5-propynylouracyl. Inne odpowiednie zmodyfikowane nukleozasady obejmują N 4 -(C 1-C 12) alkiloaminocytozyny oraz N 4, N 4 -(C 1-C 12) dialkiloaminocytozyny. Zmodyfikowane nukleozasady mogą także obejmować 7-podstawione-8-aza-7- deazapuryny oraz 7-podstawione-7-deazapuryny takie jak, przykładowo, 7-jodo-7-deazapuryny, 7-cyjano- 7-deazapuryny, 7-aminokarbonylo-7-deazapuryny. Przykłady ich obejmują 6-amino-7-jodo-7- deazapuryny, 6-amino-7-cyjano-7-deazapuryny, 6-amino-7-aminokarbonylo-7-deazapuryny, 2-amino-6- hydroksy-7-jodo-7-deazapuryny, 2-amino-6-hydroksy-7-cyjano-7-deazapuryny, oraz 2-amino-6- hydroksy-7-aminokarbonylo-7-deazapuryny. Dalej, odpowiednimi zmodfikowanymi nukleozasadami są także N 6 -(C 1-C 12) alkiloaminopuryny oraz N 6, N 6 -(C 1-C 12) dialkiloaminopuryny, w tym N 6 - metyloaminoadenina i N 6, N 6 -dimetyloaminoadenina. Podobnie, inne 6-podstawione puryny obejmujące, przykładowo, 6-tioguaninę, mogą stanowić odpowiednie zmodyfikowane nukleozasady. Inne odpowiednie nukleozasady obejmują 2-tiouracyl, 8-bromoadeninę, 8-bromoguaninę, 2-fluoroadeninę, oraz 2-fluoroguaninę. Pochodne którejkolwiek z wyżej wymienionych zmodyfikowanych nukleozasad są także odpowiednie. Podstawniki któregokolwiek z poprzednich związków mogą obejmować C 1-C alkil, C 2-C alkenyl, C 2-C alkinyl, aryl, aralkil, heteroaryl, halo, amino, amido, nitro, tio, sulfonyl, karboksyl, alkoksy, alkilokarbonyl, alkoksykarbonyl, i tym podobne. Opisy innych rodzajów środków kwasów nukleinowych są także dostępne. Zob., np. patenty US nr 4,987,071; 5,116,742; i 5,093,246; Woolf i in. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); 89:75-9; Hasselhoff i Gerlach (1988), Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Anticancer drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; oraz Maher (1992) Bioassays 14:807-. E. Sztuczne Czynniki Transkrypcyjne 45 Sztuczne czynniki transkrypcyjne mogą być także zastosowane do regulowania ekspresji HGF, HGFR, integryny α9, lub stanniokalcyny 1. Sztuczny czynnik transkrypcyjny może być zaprojektowany bądź wyselekcjonowany z biblioteki, np. ze względu na zdolność wiązania się do sekwencji w endogennym genie kodującym HGF lub HGFR, np. w regionie regulacyjnym, np. promotorze. Przykładowo, sztuczny czynnik transkrypcyjny może być wytworzony przez selekcję in vitro (np. przy użyciu wyświetleń fagowych, patent US nr 6,534,261) lub in vivo, lub przez projekt w oparciu o kod rozpoznawania (zob., np. WO 00/42219 i patent US nr 6,511,808). Zob., np. Rebar i in. (1996) Methods Enzymol. 267:129; Greisman i Pabo (1997) Science 275:657; Isalan i in. (01) Nat. Biotechnol. 19:656; oraz Wu i in. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19

21 92: 344 w zakresie, między innymi, sposobów do tworzenia bibliotek zróżnicowanych domen palców cynkowych. 5 Opcjonalnie, sztuczny czynnik transkrypcyjny może być połączony do domeny regulującej transkrypcję, np. domena aktywująca do aktywacji transkrypcji lub domena represyjna do represji transkrypcji. W szczególności, domeny represyjne mogą być stosowane do zmniejszania ekspresji endogennych genów kodujących HGF lub HGFR. Sztuczny czynnik transkrypcyjny może sam być zakodowany przez heterologiczny kwas nukleinowy, który jest dostarczany do komórki lub same białko może być dostarczane do komórki (zob., np. patent US nr 6,534,261). Heterologiczny kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję kodującą sztuczny czynnik transkrypcyjny może być operatywnie połączony do indukowalnego promotora, np. celem umożliwienia dobrej kontroli poziomu sztucznego czynnika transkrypcyjnego w komórce, np. komórce śródbłonka. F. Kompozycje Farmaceutyczne Modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR, np. pozakomórkowy obszar HGFR połączony do Fc) może być sformułowany jako kompozycja farmaceutyczna, np. do podawania pacjentowi dla patologii związanej z układem limfatycznym (np. zaburzenie tu opisane, takie jak obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych, filarioza limfatyczna, naczyniaki chłonne, limfangiogeneza w raku, lub przerzuty nowotworowe). Zazwyczaj, kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Użyty tu zwrot farmaceutycznie akceptowalny nośnik obejmuje dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki rozpraszające, powłoki, środki antybakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorbcję, i tym podobne, które są kompatybilne fizjologicznie. Kompozycja może zawierać farmaceutycznie akceptowalną sól, np. kwasową sól addytywną lub zasadową sól addytywną (zob., np. Berge, S.M., i in. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Modulator HGF/HGFR może być sformułowany zgodnie ze standardowymi sposobami. Formulacja farmaceutyczna jest dobrze ustalona w sztuce, i jest dalej opisana, np. w Gennaro (red.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, wyd., Lippincott, Williams & Wilkins (00) (ISBN: ); Anse i in., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7 wyd., Lippincott, Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN:068727); oraz Kibbe (red.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3 wyd. (00) (ISBN: X). W jednym aspekcie, modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub HGFR-Fc) może być sformułowane z użyciem materiałów zaróbkowych, takich jak chlorek sodu, fosforan sodowy dwuzasadowy siedmiowodny, fosforan sodu jednozasadowy, oraz stabilizator. Może znajdować się, przykładowo, w buforowanym roztworze o odpowiednim stężeniu i może być przechowywany w 2-8 o C. Kompozycje farmaceutyczne mogą być w różnorodnych postaciach. Obejmują one, przykładowo, ciekłe, półstałe i stałe postaci dawkowania, takie jak roztwory ciekłe (np. roztwory do wstrzykiwania i do infuzji), dyspersje lub zawiesiny, tabletki, pastylki, proszki, liposomy i czopki. Preferowana postać może zależeć od zamierzonego trybu podawania i zastosowania terapeutycznego. Typowo, kompozycje dla środków tu opisanych są w postaci roztworów do wstrzykiwania lub roztworów do infuzji. Takie kompozycje mogą być podawane trybem pozajelitowym (np. dożylny, podskórny, śródotrzewnowy, lub domięśniowy zastrzyk). Terminy podawanie pozajelitowe i podawany pozajelitowo tu stosowane oznaczają tryby podawania inne niż przez przewód pokarmowy i miejscowo, zazwyczaj przez zastrzyk, i obejmują, choć bez ograniczania się do tego, zastrzyk i infuzję dożylne, domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, do oczodołu, dosercowe, śródskórne, śródotrzewnowe, do tchawicy, podskórne, podnaskórkowe, dostawowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, wewnątrzrdzeniowe, nadtwardówkowe i przez mostek.

22 5 Kompozycja może być sformułowana jako roztwór, mikroemulsja, dyspersja, liposom, lub inaczej uporządkowana struktura odpowiednia do stabilnego przechowywania w wysokim stężeniu. Sterylne roztwory do wstrzykiwania mogą być wytworzone przez włączenie opisanego tu środka w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z jednym lub kombinacją składników wyliczonych powyżej, jak wymagane, a następnie sterylizację przez filtrację. Ogólnie, dyspersje są wytwarzane przez włączenie opisanego tu środka do jałowego podłoża, które zawiera zasadowy ośrodek rozpraszający i wymaganych innych składników spośród tych wyliczonych powyżej. W przypadku jałowych proszków do wytwarzania jałowych roztworów do wstrzykiwania, preferowanym sposobem wytwarzania jest suszenie w próżni i liofilizacja, które daje proszek środka tu opisanego plus jakikolwiek dodatkowy pożądany składnik z jego roztworu uprzednio sterylizowanego przez filtrację. Właściwy stan ciekły roztworu może być zachowany, przykładowo, przez zastosowanie powłoki takiej jak lecytyna, przez zachowanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie surfaktantów. Przedłużone wchłanianie wstrzykiwanych kompozycji może być spowodowane przez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia wchłanianie, przykładowo, soli monostearynianowych i żelatyny. W pewnych aspektach, modulator HGF/HGFR może być wytworzony z nośnikiem, który będzie chronić związek przed gwałtownym uwalnianiem, takim jak formulacja o kontrolowanym uwalnianiu, w tym implanty, oraz mikrokapsułkowane systemy dostarczania. Mogą być zastosowane biodegradowalne, biokompatybilne polimery, takie jak etylen/octan winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry, i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich formulacji jest opatentowanych lub ogólnie znanych. Zob., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, Modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR) może być modyfikowany, np. przy użyciu ugrupowania, które poprawia jego stabilizację i/lub zatrzymanie w krążeniu, np. w krwi, surowicy, lub innych tkankach, np. co najmniej 1.5, 2, 5,, lub 50 krotnie. 45 Przykładowo, modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR) może być związany z polimerem, np. zasadniczo nieantygenowym polimerem, takim jak tlenek polialkilenowy lub tlenek polietylenowy. Odpowiednie polimery będą różnić się zasadniczo wagowo. Mogą być zastosowane polimery posiadające przeciętne masy cząsteczkowe wynoszące od około 0 do około 000 Daltonów (lub około 00 do około 000 oraz 00 do około 100). Przykładowo, modulator HGF/HGFR może być skoniugowany z polimerem rozpuszczalnym w wodzie, np. hydrofilowym polimerem poliwinylowym, np. alkoholem poliwinylowym lub poliwinylopirolidonem. Nieograniczająca lista takich polimerów obejmuje homopolimery tlenku polialkilenowego takie jak glikol polietylenowy (PEG) lub glikole polipropylenowe, poliole polioksyetylenowane, ich kopolimery i ich blokowe kopolimery, pod warunkiem, że rozpuszczalność w wodzie kopolimerów blokowych jest zachowana. Dodatkowe przydatne polimery obejmują polioksyalkileny takie jak polioksyetylen, polioksypropylen, oraz blokowe kopolimery polioksyetylenu i polioksypropylenu (pluroniki); polimetakrylany; karbomery; oraz rozgałęzione lub nierozgałęzione polisacharydy. Gdy modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR) jest stosowany w kombinacji z drugim środkiem, dwa środki mogą być sformułowane oddzielnie lub razem. Przykładowo, odpowiednie kompozycje farmaceutyczne mogą być zmieszane, np. tuż przed podaniem, i podawane razem lub mogą być podawane oddzielnie, np. w tym samym bądź różnych czasach. Układ limfatyczny odgrywa kluczową rolę w homeostazie tkankowej i płynów, która oddziałuje i na którą oddziałuje liczba patologii w tym, np. przerzuty nowotworowe; nabyty obrzęk wskutek niedrożności naczyń chłonnych, np. indukowany przez operację, terapię promieniowaniem, lub infekcję; stany skórne, np. oddzielanie się naskórka spowodowane starzeniem lub nadmierną ekspozycją na światło ultrafioletowe. Dodatkowo, przerzuty nowotworowe pojawiają się głównie przez układ limfatyczny, i 21

23 5 stopień zaangażowania węzłów chłonnych jest kluczowym czynnikiem prognostycznym ciężkości choroby. Limfangiogeneza i ilość wewnątrzoguzowych naczyń chłonnych w głównych nowotworach skorelowano z przerzutami nowotworowymi w eksperymentach na zwierzętach, przykładowo, w roku piersi. (skobe i in., Nature Medicine 7(2): (01). Wewnątrzguzowy limfatyczny układ naczyniowy może odgrywać ważna rolę w przerzutach wielu rodzajów raka takich jak rak piersi, okrężnicy, płuca, tarczycy, żołądka, łuskowe komórki raka, międzybłoniaki, kostniako-mięsaki, i nerwiaki niedojrzałe. G. Podawanie Modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR) lub inny środek może być podawany pacjentowi, np. pacjentowi człowiekowi, różnymi sposobami. Dla wielu zastosowań, droga podawania jest jedną spośród: zastrzyk lub infuzja dożylna (IV), zastrzyk podskórny (S.C.), śródotrzewnowo (IP), lub zastrzyk domięśniowy. Modulator HGF/HGFR może być podawany jako stała dawka, lub dawka dostosowana do wagi pacjenta (np. dawka mg/kg). Dawka może być także wybrana dla zmniejszenia lub uniknięcia wytwarzania przeciwciał przeciw modulatorowi HGF/HGFR. Droga i/lub tryb podawania może być także dostosowany do indywidualnego przypadku, np. przez monitorowanie pacjenta, np., przy użyciu obrazowania tomograficznego, limfangiografii, oraz standardowych parametrów związanych z konkretną chorobą, np. kryteria do oceny zaburzeń układu chłonnego i związanych z układem chłonnym. Tryby dawkowania są ustawiane dla zapewnienia pożądanej odpowiedzi, np. odpowiedzi terapeutycznej lub kombinatoryjnego efektu terapeutycznego. Ogólnie, jakakolwiek kombinacja dawek (albo oddzielnych albo współsformułowanych) modulatora HGF/HGFR (np. przeciwciała) (i opcjonalnie drugiego środka) może być zastosowana celem dostarczenia pacjentowi środka w ilościach biodostępnych. Przykładowo, dawki w zakresie 1 mg/kg-0mg/kg, 0.5- mg/kg, lub 1- mg/kg mogą być podawane. Jednostkowa postać dawkowania lub stała dawka jak tu zastosowano, dotyczy fizycznie oddzielnych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawki dla leczonych pacjentów; każda jednostka zawiera predeterminowaną ilość związku aktywnego obliczoną dla wytworzenia pożądanego efektu terapeutycznego w związku z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym i opcjonalnie w związku z innym środkiem. Modulator HGF/HGFR może być podawany co najmniej raz pomiędzy około minut do około 48 godzin, korzystniej pomiędzy około minut i 24 godziny, korzystniej w przeciągu 3 godzin, po wystąpieniu objawów lub manifestacji zaburzenia układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym. Przykładowo, środek może być podawany pacjentowi cierpiącemu lub zagrożonemu obrzękiem wskutek niedrożności naczyń chłonnych. Mogą być podane pojedyncze lub wielokrotne dawki. Alternatywnie, lub dodatkowo, środek modulator HGF/HGFR może być podawany poprzez ciągłą infuzję. Terapia może trwać dni, tygodnie, miesiące lub nawet lata celem adekwatnego modulowania limfangiogenezy w zaburzeniach układu chłonnego lub dotyczących układu chłonnego. Modulator HGF/HGFR może być podawany jeden raz na tydzień przez pomiędzy około 1 do tygodni, korzystnie pomiędzy 2 do 8 tygodni, korzystniej pomiędzy około 3 do 7 tygodni, i jeszcze korzystniej przez około 4, 5, lub 6 tygodni. Specjalista doceni, że pewne czynniki mogą wpływać na dawkę i czas wymagane dla efektywnego leczenia pacjenta, w tym, choć bez ograniczania się do tego, ciężkość choroby lub zaburzenia, poprzednie terapie, ogólny stan zdrowia i/lub wiek pacjenta, oraz inne obecne choroby. Co więcej, leczenie pacjenta terapeutycznie skuteczną ilością związku może obejmować pojedynczą terapię lub, korzystnie, może obejmować serię terapii. 22

24 5 45 Jeśli pacjent jest zagrożony ryzykiem rozwoju zaburzenia tu opisanego (np. filariozą) lub innym zaburzeniem dotyczącym układu chłonnego, modulator HGF/HGFR może być podawany przed rozpoczęciem stanu jako środek zapobiegawczy. Długość takiej terapii profilaktycznej może być jedną dawką modulatora HGF/HGFR lub terapia może trwać (np. wiele dawek), przykładowo, pacjent o ryzyku zaburzenia tu opisanym może być leczony modulatorem HGF/HGFR przez dni, tygodnie, miesiące lub nawet lata celem zapobieżenia pojawieniu się urazu. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać terapeutycznie skuteczną ilość środka tu opisanego. Takie skuteczne ilości mogą być określone na bazie efektu podawanego środka, lub efektu kombinatoryjnego środków, jeśli użyto więcej niż jeden środek. Terapeutycznie skuteczna ilość środka może się także różnić zgodnie z czynnikami taki jak stan choroby, wiek, płeć, oraz waga osobnika, oraz zdolność związku do powodowania pożądanej odpowiedzi u osobnika, np. poprawę co najmniej jednego parametru schorzenia lub poprawę co najmniej jednego objawu zaburzenia. Terapeutycznie skuteczna ilość to także taka, w której wszelkie toksyczne lub szkodliwe wpływy kompozycji są przeważone przez terapeutycznie korzystne efekty. Antagonista HGF/HGFR może być użyty do leczenia raka. Przykłady chorób nowotworowych obejmują, choć bez ograniczania się do tego, guzy lite, guzy tkanek miękkich, przerzuty rakowe. Przykłady guzów litych obejmują nowotwory złośliwe, np. mięsaki, gruczolakoraki, i raki różnych układów narządów, takich jak te dotykające płuc, piersi, tkanki limfoidalnej, przewodu żołądkowo-jelitowego (np. okrężnicy), i przewodu moczowo-płciowego (np. komórki nerkowe i nabłonka dróg moczowych), gardła, prostaty, jajników jak również gruczolakoraki, które obejmują nowotwory złośliwe takie jak większość raków okrężnicy, rak odbytnicy, rak nerkowokomórkowy, rak wątroby, niedrobnokomórkowy rak płuc, rak jelita cienkiego i tak dalej. Przerzuty nowotworowe wyżej wymienionych raków, a zwłaszcza przerzutowe formy tych raków, mogą być także leczone lub można im zapobiegać przy użyciu opisanych tu sposobów i kompozycji. Sposób może być stosowany do leczenia nowotworów złośliwych różnych układów narządów, jak te dotykające płuc, piersi, tkanki limfoidalnej, przewodu żołądkowo-jelitowego (np. okrężnicy), i przewodu moczowo-płciowego, prostaty, jajników, gardła jak również gruczolakoraki, które obejmują nowotwory złośliwe takie jak większość raków okrężnicy, rak nerkowokomórkowy, rak prostaty i/lub rak jądra, niedrobnokomórkowy rak płuc, rak jelita cienkiego oraz rak przełyku. Przykładowe guzy lite, które mogą być leczone obejmują: włókniakomięsaka, śluzakomięsaka, tłuszczakomięsaka, chrzęstniakomięsaka, kostniakomięsaka, struniaka, naczyniakomięsaka, mięsaka Kaposiego, naczyniakomięsaka limfatycznego, śródbłoniaka chłonnego, maziówczaka, międzybłoniaka, guza Ewinga, mięsaka gładkomórkowego, mięśniakomięsaka prążkowanego, raka okrężnicy, raka trzustki, raka piersi, raka jajników, raka prostaty, raka kolczystokomórkowego skóry, raka podstawnokomórkowego skóry, gruczolakoraka, raka gruczołów potowych, raka gruczołów łojowych, raka brodawkowatego, gruczolakoraka brodawkowatego, torbielakogruczolakoraka, raka rdzeniastego, raka oskrzeli, raka nerkowokomórkowego, wątrobiaka, raka przewodów żółciowych, nabłoniaka kosmówkowego złośliwego, nasieniaka, raka zarodkowego, guza Wilmsa, raka szyjki macicy, guz jądra, raka płuc, drobnokomórkowego raka płuc, niedrobnokomórkowego raka płuc, raka pęcherza moczowego, raka nabłonkowego, glejaka, gwiaździaka, rdzeniaka zarodkowego, czaszkogardlaka, wyściółczaka, szyszynczaka, naczyniaka krwionośnego zarodkowego, nerwiaka nerwu słuchowego, skąpodrzewiaka, oponiaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, oraz glejaka siatkówki. Termin rak jest rozpoznawany przez specjalistów i dotyczy złośliwych nowotworów tkanek nabłonkowych lub wewnątrzwydzielniczych w tym raki układu oddechowego, raki układu pokarmowego, raki układu moczowo-płciowego, raki jądra, raki piersi, raki prostaty, raki układu hormonalnego, oraz czerniaki. Przykłady raków obejmują te tworzące się z tkanki szyjki macicy, płuca, prostaty, piersi, głowy i szui, okrężnicy i jajnika. Termin obejmuje także mięsoraki, np. te które obejmują guzy złośliwe złożone z tkanek rakowych i mięsakowatych. Gruczolakorak dotyczy raka pochodzącego z tkanki gruczołowej lub 23

25 w której komórki guza tworzą rozpoznawalne struktury gruczołowe. Termin mięsak jest rozpoznawany przez specjalistów i dotyczy guzów złośliwych o mezenchymalnym pochodzeniu. H. Urządzenia i Zestawy 5 45 Kompozycje farmaceutyczne, które zawierają modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne HGFR) może być podawane za pomocą urządzenia medycznego. Urządzenie może być zaprojektowane by posiadać takie cechy jak przenośność, przechowywanie w temperaturze pokojowej, oraz łatwość używania, tak, że może być stosowane w sytuacjach nagłych, np. przez niewyszkolonego pacjenta lub przez personel ratunkowy na zewnątrz, przeniesione do zakładów medycznych i innego sprzętu medycznego. Urządzenie może zawierać, np. jedną lub więcej obudów do przechowywania preparatów farmaceutycznych, które zawierają modulator HGF/HGFR, i może być skonfigurowane by dostarczać jedną lub więcej dawek jednostkowych modulatora HGF/HGFR. Przykładowo, kompozycja farmaceutyczna może być podawana za pomocą bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania, takiego jak urządzenia ujawnione w patentach US nr 5,399,163; 5,383,851; 5,312,3; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; lub 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i modułów obejmują: patent US nr 4,487,603, który ujawnia implantowalną pompę mikroinfuzyjną do wydawania leku o kontrolowanej dawce; patent US nr 4,486,194,który ujawnia urządzenie terapeutyczne do podawania leków przez skórę; patent US nr 4,447,233, który ujawnia pompę do infuzji leków dla dostarczania leków z dokładną dawką infuzji; patent US nr 4,447,224, który ujawnia implantowalne urządzenie do infuzji o zmiennym przepływie do ciągłego podawania leku; patent US nr 4,439,196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leku posiadający wielokomorowe przedziały; oraz patent US nr 4,475,196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leku. Wiele innych urządzeń, implantów, systemów dostarczania, oraz modułów jest także znanych. Modulator HGF/HGFR (np. przeciwciało lub rozpuszczalne białko HGFR) może znajdować się w zestawie. W jednym aspekcie, zestaw zawiera (a) pojemnik, który zawiera kompozycję, która zawiera modulator HGF/HGFR, oraz opcjonalnie (b) materiał informacyjny. Materiał informacyjny może być opisującym, instruktażowym, marketingowym, lub innym materiałem, który dotyczy sposobów tu opisanych i/lub zastosowania środków dla korzyści terapeutycznej. W jednym aspekcie, zestaw zawiera także drugi środek do leczenia zaburzeń układu chłonnego lub dotyczących układu chłonnego. Przykładowo, zestaw zawiera pierwszy pojemnik, który zawiera kompozycję zawierającą modulator HGF/HGFR, oraz drugi pojemnik zawierający drugi środek. Materiał informacyjny zestawów nie jest ograniczony w swej formie. W jednym aspekcie, materiał informacyjny może zawierać informację o produkcji związku, masie cząsteczkowej związku, stężeniu, dacie przydatności, informacje o serii lub miejscu produkcji, i tak dalej. W jednym aspekcie, materiał informacyjny dotyczy sposobów podawania modulatora HGF/HGFR (np. przeciwciała lub rozpuszczalnego białka HGFR), np. w odpowiednich dawkach, postaci dawkowania, lub trybie podawania (np. opisana tu dawka, postać dawkowania, lub tryb podawania), do leczenia pacjenta, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzenia układu chłonnego lub dotyczącego układu chłonnego. Informacja może być dostarczona w różnych formatach, w tym tekście drukowanym, materiale do odczytu przez komputer, nagraniu video, lub nagraniu audio, lub jako informacja, która zapewnia link lub adres do zasadniczego materiału. Prócz modulatora HGF/HGFR, kompozycja w zestawie może zawierać inne składniki, takie jak rozpuszczalnik lub bufor, stabilizator, lub konserwant. Modulator HGF/HGFR może być dostarczony w dowolnej postaci, np. postaci ciekłej, suchej lub liofilizowanej, korzystnie zasadniczo czystej i/lub jałowej. Gdy środki znajdują się w roztworze ciekłym, roztwór ciekły jest korzystnie roztworem wodnym. Gdy środki są w postaci suchej, odtworzenie ogólnie jest osiągane przez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik, np. woda wyjałowiona lub bufor, może opcjonalnie znajdować się w zestawie. 24

26 5 Zestaw może zawierać jeden lub więcej pojemników dla tej kompozycji lub kompozycji zawierających środki. W pewnych aspektach, zestaw zawiera oddzielne pojemniki, przegrody lub przedziały dla kompozycji i materiału informacyjnego. Przykładowo, kompozycja może być zawarta w butelce, fiolce lub strzykawce, a materiał informacyjny może być w plastikowym rękawie lub pakiecie. W innych aspektach, oddzielne elementy zestawu znajdują się w jednym, niepodzielonym pojemniku. Przykładowo, kompozycja mieści się w butelce, fiolce lub strzykawce, która posiada przymocowany do siebie materiał informacyjny w postaci etykiety. W pewnych aspektach, zestaw zawiera wiele (np. paczkę) poszczególnych pojemników, z których każdy zawiera jedną lub więcej jednostkowych postaci dawkowania (np. opisanej tu postaci dawkowania) środków. Pojemniki mogą zawierać kombinowaną dawkę jednostkową, np. jednostkę, która zawiera zarówno modulator HGF/HGFR jak i drugi środek, np. w pożądanym stosunku. Przykładowo, zestaw zawiera wiele strzykawek, ampułek, pakietów foliowych, blistrów, lub urządzeń medycznych, np. każde zawierające jedną kombinowaną dawkę jednostkową. Pojemniki zestawów mogą być szczelne, wodoodporne (np. nieprzenikalne na zmiany w wilgoci lub parowanie), i/lub nieprzezroczyste. Zestaw opcjonalnie zawiera urządzenie nadające się do podawania kompozycji, np. strzykawkę lub inne odpowiednie urządzenie do dostarczania. Urządzenie może być zapewnione wstępnie załadowane jednym lub obydwoma środkami lub może być puste, lecz nadające się do załadowania. III. Sposoby Skriningowe dla Modulatorów Aktywności Ścieżki HGF/HGFR Skrining domniemanych modulatorów ekspresji ścieżki HGF/HGFR (np. HGF, HGFR, integryny α9 i stanniokalcyny 1) może być przeprowadzony przez określenie efektu modulatorów na aktywność promotora HGF lub HGFR in vitro lub in vivo. Przykładowo, kwas nukleinowy, który zawiera promotor HGFR (np. gen HGFR człowieka, małpy lub myszy) lub jego obszar regulacyjny, np. Gambarotta i in. (1994), J. Biol. Chem., 269 (17): lub np. promotor HGF ((np. gen HGF człowieka, małpy lub myszy) lub jego obszar regulacyjny, np. Bell i in. (1998), J. Biol. Chem., 273 (12): może być operatywnie połączony do kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd reporterowy, np. jeden z polipeptydów reporterowych opisanych poniżej (np. białko wzmocnionej zielonej fluorescencji). Inne promotory, które mogą być zastosowane obejmują promotory innych genów modulowanych przez aktywność ścieżki HGF/HGFR, np. integryny α9 i stanniokalcyny 1. Kwas nukleinowy zawierający docelowy promotor operatywnie połączony z kwasem nukleinowym reportera może być wprowadzony do komórek w hodowli i/lub może być zastosowany do wytworzenia zwierzęcia transgenicznego, pozwalając na ocenę aktywności promotora in vivo. W pewnych aspektach, transgeniczne zwierzę może być także oceniane pod kątem innych fenotypów (np. indukcji lub tłumienia ekspresji genów w skórze), na które wpływa podawanie modulatora HGF/HGFR. A. Ocena Efektów Domniemanych Modulatorów HGF/HGFR na Skórę 45 Sposoby tu opisane pozwalają na ocenę związku pod kątem jego wpływu na ekspresję HGF lub HGFR lub innego docelowego genu u osobnika objętego eksperymentem. W pewnych aspektach, wpływ związku na skórę (np. związku terapeutycznego na stan skóry) może być oceniony u tego samego osobnika objętego eksperymentem, u którego ekspresja jest określana. Wpływ na skórę jest zwykle determinowany jako wpływ na ekspresję genu pod kontrolą promotora związanego z metabolizmem skóry. Takie promotory obejmują te, które kontrolują ekspresję i/lub syntezę: produktu, który jest składnikiem skóry, np. skóra właściwa lub naskórek; produktu, który wpływa na nawodnienie lub odżywienie skóry; produktu, który promuje syntezę, lub degradację składników skóry; produktu, który wpływa na układ naczyniowy skóry; produktu, który wpływa na metabolizm mieszków włosowych; produktu, który wpływa na struktury gruczołowe skóry; produktu, który wpływa na podskórną muskulaturę; produktu, który wpływa na tkankę tłuszczową; lub produktu, który wpływa na nerwy skórne. Sposoby według wynalazku są przydatne do oceny związku pod kątem wpływu na parametr związany z wyglądem lub zdrowiem skóry, przykładowo, elastyczność skóry, skłonność skóry do

27 5 zmarszczek, zdolność skóry do zatrzymywania płynów, np. wody lub oleju, zdolność skóry do odporności lub odbudowy uszkodzenia, np. powodowanego przez światło lub UV uszkodzenia, metabolizm mieszków włosowych w tym cykle wzrostu lub osadzanie pigmentu, lub napięcie i funkcja mięśnia podskórnego. Ogólnie efekty na te parametry będą oceniane pośrednio, np. przez wpływ na ekspresje genu reporterowego pod kontrolą promotora, który jest normalnie sprzężony z genem, który koduje produkt, który wpływa na którykolwiek z tych parametrów. Zwierzęta transgeniczne Zwierzęta transgeniczne, które mogą być stosowane w opisanych tu sposobach obejmują ssaki nie-ludzi, takie jak świnie, np. mini-świnie; lub gryzonie, np. myszy, szczury, lub świnki morskie, np. bezwłose myszy (opisane, przykładowo, w Begona M. i in. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: ), nagie myszy, myszy szybko starzejące się (opisane, przykładowo, w Takeda i in. (1991) L. Am. Geriatr. 39:911-19), lub transgeniczne myszy mutanty, które wykazują fenotyp przyspieszonego starzenia. Jedna lub więcej, i korzystnie zasadniczo wszystkie, komórki zwierzęcia zawierają transgen. Zwierzęta transgeniczne mogą homozygotyczne lub heterozygotyczne pod względem transgenu. Myszy są preferowanymi zwierzęcymi obiektami. W sztuce znanych jest wiele sposobów czynienia zwierząt transgenicznych, np. myszy. Przykładowe podejście jest opisane poniżej. Procedury do manipulacji embrionami i mikroiniekcji są opisane, przykładowo, w Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986). Zygoty myszy mogą być pobrane od sześciotygodniowych samic, które poddano super owulacji za pomocą surowicy ciężarnych klaczy (PMS) a 48 godzin później ludzką gonatropiną kosmówkową. Samice po zastrzyku umieszczono z samcami i sprawdzano pod kątem czopu spermy w pochwie po stosunku następnego dnia. Pseudociężarne samice są wybierane pod kątem rui, umieszczane z bezpłodnymi samcami po wazektomii i stosowane jako biorcy. Zbierane są zygoty i usuwane komórki oocytów. Dalej, mogą być zebrane blastocysty. Pronuklearne embriony są odzyskiwane od samic myszy sparowanych z samcami. Samice są traktowane surowicą ciężarnych klaczy, PMS, dla wzbudzenia wzrostu pęcherzykowego i ludzką gonatropiną kosmówkową, hcg, dla indukowania owulacji. Embriony są odzyskiwane w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej Dulbeco (DPBS) i utrzymywane w zmodyfikowanej zasadniczej pożywce Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o % płodową surowicę bydlęcą. Mikroiniekcja transgenicznego tworu może być wykonana przy użyciu standardowych mikro manipulatorów przymocowanych do mikroskopu. Przykładowo, embriony są zazwyczaj trzymane w 0 mikrolitrowych kroplach DPBS pod olejem przy mikroiniekcji. Roztwór DNA jest mikrowstrzykiwany do przedjądrza samców. Udane wstrzyknięcie jest monitorowane przez nabrzmienie nadjądrzy. Rekombinacyjne komórki ES mogą być wstrzyknięte do blastocystów, przy użyciu podobnych technik. Tuż po wstrzyknięciu embriony są przenoszone do samic- biorców np. dojrzałych myszy sparowanych z mysimi samcami po wazektomii. W protokole ogólnym, samice-biorcy są znieczulane, wykonuje się nacięcia okolicy lędźwiowej dla odsłonięcia jajowodów, i embriony są transformowane do regionu bańkowego jajowodów. Ściana ciała jest zszywana i skóra zamykana klipsami do ran. Skrining pod kątem Obecności Kierującej Konstrukcji 45 Transgeniczne zwierzęta mogą być zidentyfikowane po narodzeniu przy użyciu standardowych protokołów. DNA z tkanki ogona pod katem obecności konstrukcji kierującej przy użyciu techniki southern blots i/lub PCR. Potomstwo, które wygląda na mozaikę jest krzyżowane ze sobą jeśli jest uważane za przenoszące konstrukcję kierującą w jej linii zarodkowej dla wytworzenia homozygotycznych zwierząt transgenicznych. Jeśli nie jest jasne czy potomstwo będzie posiadać transmisję linii genetycznej, to może być skrzyżowane z macierzystym lub innym szczepem i potomstwo badano pod kątem 26

28 heterozygotyczności. Heterozygoty są identyfikowane przez techniki southern blots i/lub wzmacniania DNA przez PCR. 5 Heterozygoty mogą być następnie krzyżowane ze sobą celem wytworzenia homozygotycznego transgenicznego potomstwa. Homozygoty mogą być zidentyfikowane przez southern blotting ekwiwalentnych ilości genomowego DNA od myszy, które są produktem tego krzyżowania, jak również myszy, które są znanymi heterozygotami oraz dzikimi myszami. Sondy do badania southern blots mogą być zaprojektowane jak wyżej podano. W sztuce znane są inne środki identyfikacji i charakteryzowania transgenicznego potomstwa. Przykładowo, northern blots może być stosowane do sondowania mrna pod kątem obecności lub braku obecności transkryptów kodujących gen reporterowy. Dodatkowo, western blots może być zastosowany do oceny poziomu ekspresji transgenu w różnych tkankach tego potomstwa przez sondowanie western blot przeciwciałem przeciw białku kodowanemu przez transgen, lub przeciwciałem przeciw produktowi z genem markerowym, gdzie ten gen jest wyrażony. W końcu, analiza in situ (taka jak mocowanie komórek i znakowanie przeciwciałem) i/lub analiza FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie) różnych komórek od potomstwa może być wykonywana przy użyciu odpowiednich przeciwciał, celem wyszukania obecności lub braku obecności produktu transgenowego. Mogą być wytworzone zwierzęta transgeniczne, które posiadają dwa oddzielne transgeny z dwoma różnymi transgenami operatywnie połączonymi iż wykrywalnie różnymi reporterami, np. przez krzyżowanie myszy transgenicznych pod kątem indywidualnych transgenów promotor-reporter. W sposobach według wynalazku mogą być stosowane inne transgeniczne zwierzęta. Sposoby wytwarzania wielu zwierząt są znane w sztuce. Protokół wytwarzania transgenicznej świni może być znaleziony w White i Yannoutsos, Current Topics in Complement Research; 64 Forum Immunologii, s ; patent US nr 5,523,226; patent US nr 5,573,933; zgłoszenie PCT WO93/071 oraz zgłoszenie PCT WO95/ Protokół wytwarzania transgenicznego szczura może być znaleziony w Bader i Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3: , Protokół wytwarzania transgenicznej krowy może być znaleziony w Transgenic Animal Technology, A Handbook, 994, red. Carl. A. Pinkert, Academic Press, Inc. Protokół wytwarzania transgenicznej owcy może być znaleziony w Transgenic Animal Technology, A Handbook, 994, red. Carl. A. Pinkert, Academic Press, Inc. Geny reporterowe Aktywność promotora może być oceniona przez sprzężenie genu reporterowego do promotora będącego w kręgu zainteresowania (np. promotora HGF, HGFR, integryny α9 lub stanniokalcyny 1). Gen reporterowy może być dowolnym genem, który koduje wykrywalny produkt, korzystnie taki, który może być względnie łatwo, np. produkt genowy, który jest fluorescencyjny, lub który katalizuje reakcję, która może być określona przez tworzenie barwnego, fluorescencyjnego lub luminescencyjnego produktu. Przykładowo, gen reporterowy może kodować enzym, np. enzym, który produkuje wykrywalny produkt, np. barwny, fluorescencyjny, luminescencyjny produkt. Geny reporterowe są znane w sztuce i obejmują gen β-galaktozydazy, gen lucyferazy, gen białka zielonej fluorescencji, gen białka cyjanowej fluorescencji, gen białka żółtej fluorescencji, gen białka czerwonej fluorescencji, gen fosfatazy alkalicznej, gen peroksydazy chrzanowej, gen β-laktamazy lub gen acetylotransferazy chloramfenikolu. Geny reporterowe są opisane, przykładowo, w Sambrook, J., Fritsh, E.F., i Mniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, IV. Testy Diagnostyczne A. Wykrywanie Kwasu Nukleinowego i Białka 45 Macierze są przydatnymi narzędziami molekularnymi do charakteryzowania próbki, np. próbki od obiektu. Przykładowo, macierz posiadająca sondy do chwytania wielu genów, w tym sondy dla kwasów 27

29 nukleinowych HGF, HGFR, integryny α9 i stanniokalcyny 1, lub wielu białek. Macierze mogą posiadać wiele adresów, np. dające się umiejscowić miejsca, na podłożu. Przedstawione macierze mogą być skonfigurowane w wielu formatach, których nieograniczające przykłady są opisane poniżej Podłoże może być nieprzezroczyste, półprzezroczyste lub przezroczyste. Adresy mogą być rozłożone na podłożu w jednym wymiarze, np. macierz liniowa; w dwóch wymiarach, np. planarna macierz lub w trzech wymiarach, np. trójwymiarowa macierz. Podłoże stałe może być o dowolnym dogodnym kształcie lub postaci, np. kwadratowe, prostokątne, obłe lub okrągłe. Macierze mogą być wytworzone różnymi sposobami, np. sposobami fotolitograficznymi (zob., np. patenty US nr 5,143,854; 5,5,270; i 5,527,681), sposobami mechanicznymi (np. sposobami kierowanego przepływu jak opisano w patencie US nr 5,384,261), sposobami na bazie szpilki (np. jak opisano w patencie US nr 5,288,514) i technikami na bazie perełek (np. jak opisano w PCT US/93/04145). Sondą chwytającą może być jednoniciowy kwas nukleinowy, dwuniciowy kwas nukleinowy (np. który jest denaturowanym przed lub podczas hybrydyzacji), lub kwasem nukleinowym posiadającym obszar jednoniciowy i obszar dwuniciowy. Korzystnie, sonda chwytająca jest jednoniciowa. Sonda chwytająca może być wybrana poprzez wiele kryteriów i korzystnie jest zaprojektowana przez program komputerowy z optymalnymi parametrami. Sonda chwytająca może być dobrana by hybrydyzować do bogatego w sekwencje regionu (np. nie-homopolimerowego) genu. T m sondy chwytającej może być zoptymalizowany przez ostrożną selekcję regionu komplementarności oraz długości. Idealnie, T m wszystkich sond chwytających na macierzy jest podobny, np. w,, 5, 3, lub 2 o C do siebie. Wyizolowany kwas nukleinowy jest korzystnie mrna, który może być wyizolowany sposobami rutynowymi, np. obróbka DNazą dla usunięcia genomowego DNA i hybrydyzacja do połączonego do oligodt podłoża stałego (np., jak opisano w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY). Podłoże jest przemywane i eluowane jest mrna. Wyizolowane mrna może być odwrotnie transkrybowane i opcjonalnie wzmacniane, np. metodą łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzoną odwrotną transkrypcją (RT-PCR), np. jak opisano w (patencie US nr 4,683,2). Kwas nukleinowy może być produktem wzmocnienia, np. z PCR (patenty US nr 4,683,196 oraz 4,683,2), wzmocnienie typu toczącego się koła ( RCA, patent US nr 5,714,3), wzmocnienie izotermiczne RNA lub NASBA (patenty US nr 5,1,238; 5,9,818; oraz 5,554,517), oraz wzmocnienie z przemieszczeniem nici (patent US nr 5,455,166). Kwas nukleinowy może być znakowany podczas amplifikacji, np. przez włączenie znakowanego nukleotydu. Przykłady preferowanych znaczników obejmują znaczniki fluorescencyjne, np. barwnik czerwonej fluorescencji Cy53 (Amersham) lub barwnik zielonej fluorescencji Cy33 (Amersham), oraz znaczniki chemiluminescencyjne, np. jak opisano w patencie US nr 4,277,437. Alternatywnie, kwas nukleinowy może być znakowany biotyną i wykrywany po hybrydyzacji za pomocą znakowanej streptawidyny, np. streptawidyny-fikoerytryny (Molecular Probes). Znakowany kwas nukleinowy może być zetknięty z macierzą. Dodatkowo, kontrolny kwas nukleinowy lub kwas nukleinowy odniesienia może być zetknięty z tą samą macierzą. Kontrolny kwas nukleinowy lub kwas nukleinowy odniesienia może być znakowany znacznikiem innym niż kwas nukleinowy próbki, np. takim o różnym maksimum emisji. Znakowane kwasy nukleinowe mogą być zetknięte z macierzą w warunkach hybrydyzacji. Macierz może być przemyta, a następnie zobrazowana dla wykrycia fluorescencji na każdym adresie macierzy. Poziom ekspresji białka HGF lub HGFR może być określony przy użyciu przeciwciała swoistego dla polipeptydu (np. przy użyciu western blot lub testu ELISA). Co więcej, poziomy ekspresji wielu białek, w tym HGF i HGFR, mogą być szybko określone równolegle przy użyciu macierzy polipeptydowej posiadającej sondy chwytające przeciwciała dla każdego z polipeptydów. Przeciwciała swoiste dla polipeptydu mogą być wytwarzane sposobem tu opisanym (zob. Antibody Generation ). 28

30 5 45 Opracowano macierz białek o niskiej gęstości (format 96 dołkowy), w której białka są kropkowane na membranę nitrocelulozową (Ge(00) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VIII). Macierz białek o wysokiej gęstości (np próbek o 222x222 mm) zastosowana do skrinowania przeciwciała może być wytworzona przez kropkowanie białek na polifluorek winylidenu (PVDF) (Leuking i in. (1999) Anal. Biochem. 270:3-111). Zob. także Mendoza i in. (1999), Biotechniques 27: ; MacBeath i Schreiber (00) Science 289: ; oraz De Wildt i in. (00), Nature Biotech. 18: Te sposoby znane w sztuce oraz inne mogą być zastosowane do wytwarzania macierzy przeciwciał do wykrywania bogactwa polipeptydów w próbce. Próbka może być znakowana, np. biotynylowana, dla dalszego wykrywania streptawidyną sprzężoną z znacznikiem fluorescencyjnym. Macierz może być wówczas skanowana dla zmierzenia wiązania na każdym adresie. Macierze kwasów nukleinowych i polipeptydów według wynalazku mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań. Przykładowo, macierze mogą być stosowane do analizowania próbki od pacjenta. Próbka jest porównywana do danych uprzednio uzyskanych, np. znanych okazów klinicznych lub próbek od innego pacjenta. Dalej, macierze mogą być zastosowane do charakteryzowania próbki z hodowli komórkowej, np. dla określenia stanu komórkowego po zmianie parametru, np. wystawienia hodowli komórkowej na antygen, transgen, lub związek testowy. Dane o ekspresji mogą być przechowywane w bazie danych, np. relacyjnej bazie danych takiej jak baza danych SQL (np. środowiska baz danych Oracle lub Sybase). Baza danych może posiadać wiele tabel. Przykładowo, surowe dane o ekspresji mogą być przechowywane w jednej tabeli, gdzie każda kolumna odpowiada testowanemu genowi, np. adres lub macierz, a każdy rząd odpowiada próbce. Oddzielna tabela może przechowywać identyfikatory i informacje o próbkach, np. numer serii użytej macierzy, data, oraz inne informacje kontrolujące jakość. Profile ekspresji zyskane z analizy ekspresji genu na macierzy mogą być użyte do porównania próbek i/lub komórek w wielu stanach jak opisano w Golub i in ((1999) Science 286:531). W jednym aspekcie, informacja o ekspresji (np. ekspresji mrna lub ekspresji białka) dla genu kodującego HGF i/lub genu kodującego HGFR są oceniane, np. przez porównanie wartości odniesienia np. wartości odniesienia. Wartości odniesienia mogą zostać uzyskane od pacjenta kontrolnego, pacjenta odniesienia. Wartości odniesienia mogą być także uzyskane z analizy statystycznej, np. dla dostarczenia wartości odniesienia dla kohorty osobników, np. osobnik o dopasowanym wieku i płci, np. normalne osobniki lub osobnik, który posiada lub jest zagrożony ryzykiem zaburzenia układu chłonnego lub dotyczącego układu chłonnego. Statystyczne podobieństwo do konkretnego odniesienia (np. do odniesienia dla kohorty związanej z ryzykiem) lub normalnej kohorty może być zastosowane dla dostarczenia oceny (np. wskazania ryzyka zaburzenia chłonnego) dla osobnika, np. osobnika, który nie posiadał wcześniej zaburzenia chłonnego, osobnika, który jest zagrożony ryzykiem zaburzenia chłonnego (np. predyspozycje genetyczne) lub osobnika, który posiada zaburzenie chłonne. Osobnicy nadający się do leczenia mogą być także oceniani pod kątem ekspresji i/lub aktywności ścieżki HGF/HGFR, np. ekspresji HGF, ekspresji HGFR, ekspresji integryny α9 i ekspresji stanniokalcyny 1, jak również stanów modyfikacji lub innych parametrów związanych z tymi czynnikami. W pewnych aspektach, osobnicy mogą być zidentyfikowani jako nadający się do leczenia jeśli ekspresja i/lub aktywność dla HGF i/lub HGFR jest zmieniona (np. podwyższona) względem odniesienia, np. wartości odniesienia, np. wartości odniesienia związanej z normą. Osoby, którym podaje się środek tu opisany lub inną terapię dla zaburzenia układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym, mogą być oceniane pod kątem ekspresji i/lub aktywności HGF i/lub HGFR. Osoba może być oceniana wiele razy, np. wiele razy podczas trwania terapii, np. podczas reżimu terapeutycznego. Leczenie osoby może być zmodyfikowane, w zależności od tego, jak odpowiada ona na leczenie. Przykładowo, zmniejszenie ekspresji lub aktywności HGF i/lub HGFR może wskazywać na odpowiadanie jeśli środkiem podawanym jest antagonista. 29

31 5 Konkretne efekty, w których pośredniczy środek, mogą wykazywać różnice (np. względem nieleczonej osoby, osoby kontrolnej, lub innego odniesienia), która jest statystycznie znacząca (np. wartość P < 0.05 lub 0.02). Statystyczne znaczenie może być określane dowolnym sposobem znanym w sztuce. Przykładowe testy statystyczne obejmują T-test Studenta, nieparametrowy U-test Mann a Whitney a oraz nieparametrowy statystyczny test Wilcoxon a. Pewne statycznie znaczące zależności posiadają wartość P mniejszą niż 0.05 lub B. Sposoby Oceny Materiału Genetycznego 45 Istnieje wiele sposobów oceny materiału genetycznego dla dostarczenia informacji genetycznej. Te sposoby mogą zostać zastosowane do oceny locusa genetycznego, który zawiera gen kodujący HGF lub gen kodujący HGFR, jak również inne locusy. Sposoby mogą zostać zastosowane do oceny jednego lub więcej nukleotydów, np. kodującego lub niekodującego obszaru genu, np. w regionie regulującym (np. promotor, region kodujący nietranslatowany region lub intron, i tak dalej). Próbki kwasów nukleinowych mogą być przeanalizowane przy użyciu technik biofizycznych (np. hybrydyzacja, elektrofereza, i tak dalej), sekwencjowanie, techniki na bazie enzymów, oraz ich kombinacje. Przykładowo, hybrydyzacja kwasów nukleinowych próbki do mikromacierzy kwasów nukleinowych może być zastosowana do oceny sekwencji w populacji mrna oraz do oceny polimorfizmów genetycznych. Inne techniki na bazie hybrydyzacji obejmują wiązanie sekwencji swoistych primerów (np. PCR lub LCR); analiza Southern DNA, np. genomowego DNA; analiza Northern RNA, np. mrna; techniki na bazie sondy fluorescencyjnej (zob., np. Beaudet i in. (01) Genome Res. 11(4):600-8); amplifikacja swoista alleli. Techniki enzymatyczne obejmują trawienie enzymem restrykcyjnym; sekwencjonowanie; oraz metoda wydłużania łańcucha o jedną zasadę (SBE). Te i inne techniki są dobrze znane specjalistom. Elektroferyczne techniki obejmują elektroferezę kapilarną i detekcję Polimorfizmu Konformacji Pojedynczych Nici (SSCP) (zob., np. Myers i in. (1985) Nature 313:495-8 oraz Ganguly (02) Hum. Mutat. 19 (4):334-42). Inne sposoby biofizyczne obejmują wysokosprawną denaturującą chromatografię cieczową (DHPLC). W jednym aspekcie, technologia amplifikacji swoistej alleli, która zależy od selektywnej amplifikacji PCR może być zastosowana do uzyskania informacji genetycznej. Oligonukleotydy zastosowane jako primery dla swoistej amplifikacji mogą przenosić interesującą mutację w środku cząsteczki (tak, że amplifikacja zależy od różnicowej hybrydyzacji) (Gibbs i in. (1989) (Nucl. Acids Res. 17: ) lub na końcu 3 jednego primera gdzie, w odpowiednich warunkach, niedopasowanie może zapobiec, lub zmniejszyć przedłużenie o polimerazę (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Dodatkowo, możliwe jest wprowadzenie miejsca restrykcyjnego w regionie mutacji dla utworzenia detekcji na bazie rozszczepiania (Gasparini i in. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). W innym aspekcie, amplifikacja może być wykonana przy użyciu Taq ligazy do amplifikacji (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). W takich przypadkach, ligacja pojawi się jedynie gdy występuje dokładne dopasowanie na końcu 3 sekwencji 5 umożliwiając wykrywanie obecności znanej mutacji na konkretnym miejscu przez szukanie obecności lub braku obecności amplifikacji. Sposoby enzymatyczne wykrywania sekwencji obejmują sposoby na bazie amplifikacji takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR; Saiki i in. (1985) Science 2:10-14) oraz reakcja łańcuchowa ligazy (LCR; Wu i in. (1989) Genomics 4: ; Barringer i in. (1990) Gene 1989: ; F. Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988: ): sposoby na bazie transkrypcji stosują syntezę RNA przez polimerazy RNA dla amplifikacji kwasu nukleinowego (patenty US nr 6,066,457; 6,132,997; oraz 5,716,785; Sarker i in. (1989) Science 244:331-34; Stofler i in. (1988) Science 239:491); NASBA (patenty US nr 5,1,38; 5,9,818; oraz 5,554,517); amplifikacja typu toczącego się koła (RCA; patenty US 5,854,033 oraz 6,143,495) oraz amplifikacja z przemieszczeniem nici (SDA; patenty US nr 5,455,166 oraz 5,624,8). Sposoby amplifikacji mogą być zastosowane w kombinacji z innymi technikami.

32 Inne techniki enzymatyczne obejmują sekwencjonowanie przy użyciu polimeraz, np. polimeraz DNA i ich odmian takich jak technologia przedłużania o jedna zasadę. Zob., np. patenty US 6,294,336; 6,013,431; oraz 5,952, Detekcja na bazie fluorescencji może być także zastosowana do wykrywania polimorfizmów kwasów nukleinowych. Przykładowo, różne końcowe ddntp mogą być znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Primer może być wyżarzony blisko lub tuż przy polimorfizmie, i nukleotyd na miejscu polimorficznym może być wykryty przez rodzaj (np. kolor ) barwnika fluoroscencyjnego, który jest włączony. Hybrydyzacja do mikromacierzy może być także zastosowana do wykrywania polimorfizmów, w tym SNP. Przykładowo, zestaw różnych oligonukleotydów, nukleotydem polimorficznym na różnych pozycjach z oligonukleotydami może być umieszczony na macierzy kwasu nukleinowego. Rozmiar hybrydyzacji jako funkcja miejsca i hybrydyzacja do oligonukleotydów swoistych dla innego allela może być zastosowane do określenia czy występuje konkretny polimorfizm. Zob., np. patent US nr 6,066,454. W jednej implementacji, sondy hybrydyzacyjne mogą zawierać jedno lub więcej dodatkowych niedopasowań dla destabilizacji tworzenia dupleksu i sensytyzowania testu. Niedopasowanie może być bezpośrednio przyległe do sprawdzanej pozycji, lub w, 7, 5, 4, 3 lub 2 nukleotydy od pozycji sprawdzanej. Sondy hybrydyzacyjne mogą być także wybrane by posiadały konkretne T m, np. pomiędzy o C, o C, lub o C. W teście multipleks, T m mogą być wybrane w zakresie 5, 3 lub 2 o C od siebie. Możliwe jest także bezpośrednie sekwencjonowanie kwasu nukleinowego pod kątem konkretnego locusa genetycznego, np. przez amplifikację i sekwencjonowanie, lub amplifikację, klonowanie i sekwencjonowanie. Mogą być zastosowane automatyczne aparaty do sekwencjonowania wysokiej przepustowości (np. kapilarne lub mikroczipowe). W jeszcze innych aspektach, sekwencja danego białka jest analizowana dla dedukcji jego sekwencji genetycznej. Sposoby analizy sekwencji białka obejmują sekwencjonowanie białka, spektrometrię masową, immunoglobuliny swoiste epitopu/sekwencja, oraz trawienie proteazami. Dowolne połączenie powyższych sposobów może być także zastosowane. Powyższe sposoby mogą być zastosowane do oceny dowolnego locusa genetycznego, np. w sposobie analizowania informacji genetycznej od konkretnych grup osobników lub w sposobie analizowania polimorfizmu związanego z zaburzeniem układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym, np. genu kodującego HGF, HGFR, integrynę α9 lub stanniokalcynę 1. C. Obrazowanie In Vivo 45 Środki wiążące HGF/HGFR (np. przeciwciała) mogą być zastosowane do wykrywania obecności odpowiednio HGF i/lub HGFR in vivo (np. obrazowanie in vivo u pacjenta). Sposób może być także wykorzystany do oceny (np. diagnozy, lokalizacji, lub stadium) stanu tu opisanego, np. zaburzenia chłonnego lub ryzyka takiego zaburzenia. Sposób obejmuje: (i) podawanie pacjentowi (i opcjonalnie pacjentowi kontrolnemu) środka wiążącego HGF/HGFR (np. przeciwciała, które wiąże się do HGF lub HGFR), w warunkach, które pozwalają na pojawienie się interakcji środka wiążącego i HGF lub HGFR; oraz (ii) wykrywanie środka wiążącego, przykładowo, dla zlokalizowania lub zidentyfikowania winny sposób komórek wyrażających HGF lub HGFR. Statystycznie znaczący wzrost ilości kompleksu u pacjenta względem odniesienia, np. pacjenta kontrolnego lub linii bazowej pacjenta, może być czynnikiem, który może prowadzić do diagnozy zaburzenia układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym lub ryzyka takiego zaburzenia. Korzystnie, środek wiążący HGF/HGFR zastosowany w sposobach diagnozy in vivo (także in vitro) jest bezpośrednio lub pośrednio znakowany wykrywalną substancją dla ułatwienia wykrywania 31

33 5 związanego lub niezwiązanego środka wiążącego. Odpowiednie wykrywalne substancje obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne oraz materiały radioaktywne. W jednym aspekcie, białko wiążące HGF lub HGFR jest sprzężone z jonem radioaktywnym, np. indem (111ln), jodem (131l lub 1l), itrem (90Y), aktynem (2Ac), bizmutem (212Bi lub 213Bi), siarką (S), węglem (14C), trytem (3H), rodem (188Rh), lub fosforem (32P). W innym aspekcie, białko wiążące HGF/HGFR jest znakowane środkiem kontrastowym NMR. W jednym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu obrazowania układu naczyniowego (np. limfatycznego układu naczyniowego) u pacjenta, który jest zagrożony ryzykiem zaburzenia układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym, lub posiada takie schorzenie, które postępuje. Sposób obejmuje: zapewnienie środka, który wiąże się do HGF lub HGFR, np. środka tu opisanego, gdzie białko jest zazwyczaj związane ze środkiem obrazującym, podawanie środka pacjentowi, np. o ryzyku zaburzenia układu chłonnego lub związanego z układem chłonnym; oraz lokalizowania środka w pacjencie, np. przez obrazowanie pacjenta, np. dla wykrycia komórek wyrażających HGF lub HGFR. PRZYKŁADY Przykład 1. HGFR Jest Wyrażone w Wyższym Poziomie w Komórkach Śródbłonka Chłonnego Niż w Komórkach Śródbłonka Naczyń Krwionośnych i Jest Funkcjonalne Ilościowe RT-PCR w czasie rzeczywistym (QPCR) potwierdziło, że trzy niezależnie ustanowione linie pierwotnych LEC wyrażały wysokie poziomy mrna głównych markerów linii limfatycznej Prox1 i LYVE-1 ale wyrażały niskie poziomy markera linii naczyń krwionośnych flt-1, względem komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (BVEC) (Fig. 1A-C). Poziomy mrna HGFR w LEC zmierzono przez QPCR i stwierdzono, że były więcej niż 2 razy większe niż poziomy w BVEC (Fig. 1D). Dodatkowo, immunoprecypitacja i analizy western blot pokazały, że ekspresja białka HGFR była wyższa w LEC niż w BVC (Fig. 1E). Ponieważ traktowanie LEC za pomocą ng/ml HGF skutkowała zwiększoną fosforylacją HGFR (Fig. 1F), HGFR jest funkcjonalne w LEC. W sumie, HGFR jest wyrażone w wyższym poziomie w LEC niż w BVEC i jest aktywowane gdy LEC jest traktowane HGF. Przykład 2. Ekspresja HGFR jest Wyrażona w Naczyniach Chłonnych Podczas Zapalenia i Naprawy Tkanek In Vivo Analizy dyferencyjną immunofluorescencją normalnej skóry myszy wykonano, przy użyciu przeciwciał przeciwko HGFR i przeciwko receptorowi hialuronowemu swoistemu dla układu chłonnego LYVE-1. Wykryto małą lub żadną ekspresje HGFR w nieaktywnych naczyniach chłonnych w normalnej skórze. W celu określenia, czy HGFR może być podregulowane wzwyż przez śródbłonek chłonny podczas procesów patologicznych, barwiono immunologicznie próbki skóry myszy z chronicznym zapaleniem uzyskanych od eksperymentalnie indukowanych opóźnionych reakcji nadwrażliwości u transgenicznych myszy VEGF-A (VEGF-TG), które cechują się powiększeniem i proliferacją naczyń chłonnych, Kunstfeld i in. (04), Blood, 4(4): Siedem dni po wywołaniu zapalenia skóry, powiększone LYVE-1 pozytywne naczynia chłonne wykryto u myszy VEGF-TG ale nie u myszy dzikich (Fig. 2A, D). LYVE-1 pozytywne naczynia chłonne silnie wyrażały HGFR, podczas gdy wykryto małą lub wcale ekspresję HGFR w normalnych naczyniach chłonnych myszy dzikich (Fig. 2A-F). Dwa do trzech tygodni po eksperymentalnie spowodowanych ranach skóry na całą grubość u myszy, wyraźna limfangiogeneza została wykryta w ziarninie. Podwójne analizy fluoroscencyjne tkanki rany w dniu 21 po zranieniu ujawniły kilka LYVE-1 pozytywnych naczyń chłonnych, które także wyrażały HGFR (Fig. 2G-L). By dalej scharakteryzować możliwą rolę HGFR podczas tworzenia embrionalnych naczyń chłonnych, embrionalne tkanki myszy zostały przebadane w dniach embrionalnych (E).5 do 14.5 gdy 32

34 pojawia się aktywne rozwijanie się i proliferacja progenitorów naczyń chłonnych. W E11.5 wykryto ekspresję LYVE-1 na komórkach śródbłonka przedniej żyły głównej. 5 Komórki te wyrażały mało lub wcale HGFR, podczas gdy ekspresja HGFR była już wykryta w obszarze gardłowym przedniej części prajelita i w komórkach mesenchymalnych (Fig. 3A-C). Jednakże, w E12.5, ekspresja HGFR była wyraźnie wykrywalna na LYVE-1 pozytywnych komórkach śródbłonka przedniej żyły głównej (Fig. 3F: ostrza strzałek), podczas gdy jedynie okazjonalna ekspresja HGFR była wykrywana na komórkach śródbłonka wyściełających prymitywne worki limfatyczne, pokrywając się z reaktywnością LYVE-1 (Fig. 3D-F). Do E14.5, wykryto silną ekspresję HGFR na ogromnej większości LYVE-1 pozytywnych komórkach śródbłonka chłonnego (Fig. 3G-I). Na tym etapie, HGFR było nadal słabo wyrażane przez komórki śródbłonka wyściełające żyłę i arterię szyjną, które były LYVE-1 negatywne. Przykład 3. HGF Bezpośrednio Promuje Proliferację i Migrację LEC HGF jest jedynym znanym ligandem HGFR i był przedstawiony jako wzbudzający proliferację i migrację ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego (HVEC), np. Bussolino i in. (1992), J. Cell Biol., 119: Celem zbadania czy dyferencyjne poziomy ekspresji HGFR przez LEC względem BVEC może skutkować ich dyferencyjną odpowiedzią w kierunku stymulacji HGF, zbadano następnie efekty HGF na LEC względem proliferacji BVEC in vitro. HGF potężnie indukowało proliferację LEC przy minimalnym skutecznym stężeniu 1 ng/ml (p < 0.01), w porównaniu do nietraktowanych hodowli kontrolnych. Chociaż HGF także indukowało proliferację BVEC przy tym stężeniu, rozmiar stymulacji wzrostu był wyższy w LEC niż w BVEC (Fig.4A). Dotychczas, VEGF-C i VEGF-D są jedynymi czynnikami wzrostu, które bezpośrednio promują proliferację LEC poprzez aktywację receptora VEGF-3 (VEGFR-3), np. Jussila i Alitalo (02), Physiol. Rev. 82: , i skutki FGF-2 na limfangiogenezę zaproponowano jako skutek podregulowania wzwyż ligandów VEGFR-3 ponieważ mogą być one hamowane przez blokadę ścieżki VEGFR-3, np. Chang i in. (04), PNAS, 1: ; Kubo i in. (02), PNAS, 99: Celem zbadania czy HGF bezpośrednio lub pośrednio stymuluje proliferację LEC, potraktowano LEC za pomocą HGF, w obecności lub braku obecności blokujących przeciwciał przeciw VEGFR-3 lub HGFR. Inkubacja LEC przeciwciałem blokującym HGFR mocno zablokowała stymulacje proliferacji LEC przez HGF (p < 0.001), podczas gdy inkubacja przeciwciałem blokującym VEGFR-3 w dawce, która skutecznie blokowała stymulację wzrostu przez VEGF-C (dane nie pokazane) lub kontrolną IgG nie wpłynęło na indukowaną przez HGF proliferację (Fig. 4B). Te wyniki wskazują, że indukowana przez HGF proliferacja LEC pojawia się niezależnie od aktywacji ścieżki VEGF-R3 i zależy od skutecznego wiązania się HGF do jego receptora. Traktowanie HGF również w zależności od dawki promowało migrację LEC i BVEC, z minimalnym skutecznym stężeniem 3 ng/ml (Fig. 4C). Celem zbadania, czy stymulacja HGF może także promować tworzenie rurek chłonnych in vitro, zbiegające się hodowle LEC pokryto kolagenem I typu jak uprzednio opisał Hirakawa i in. (03), Am. J. Pathol., 162: HGF silnie indukował tworzenie sznurów przez LEC z minimalną skuteczną dawką 3 ng/ml (p < 0.001), w porównaniu do nietraktowanych hodowli kontrolnych (Fig. 5A, B). Przykład 4. HGF Promuje Tworzenie Naczyń Chłonnych In Vivo Celem zbadania czy HGF może także indukować limfangiogenezę in vivo, implantowano matriżele z lub bez HGF podskórnie do myszy FVB jak opisano w Hirakawa i in. (03), Am. J. Pathol., 162: Immunobarwienie pod kątem swoistej dla naczyń chłonnych podoplaniny glikoproteinowej, np. Schacht i in. (03), EMBO J., 22:46-56, ujawniło wyraźne tworzenie nowych naczyń chłonnych w matriżelach zawierających HGF w dniu 7 po implantacji, podczas gdy żadnych naczyń chłonnych nie zaobserwowano w kontrolnych matriżelach (Fig. 5C, D)

35 Przykład 5. Układowa Blokada HGFR Hamuje Powiększanie Naczyń Chłonnych Podczas Eksperymentalnego Zapalenia Skóry 5 Ponieważ stwierdzono, że HGFR był silnie wyrażony przez powiększone naczynia chłonne podczas eksperymentalnego zapalenia skóry u myszy, następnie zbadano, czy HGF może bezpośrednio przyczyniać się do powiększania naczyń chłonnych in vivo. Opóźnione reakcje nadwrażliwości były indukowane przez naniesie miejscowe na uszy myszy jak opisał Kunstfeld i in. (04), Blood, 4(4): Dzień przed indukcją eksperymentalnego zapalenia, wstrzyknięto śródotrzewnowo 0 μg blokującego przeciwciała przeciw HGFR lub równą ilość kontrolnej immunoglobuliny G. Analiza immunofluorescencją 24 godziny po indukcji zapalenia ujawniła znacznie zmniejszoną wielkość naczyń chłonnych u myszy, które otrzymały leczenie blokującym przeciwciałem HGF-R w porównaniu do myszy, które otrzymały kontrolną IgG (Fig. 6A, B). Wspomagane komputerowo analizy morfometryczne fragmentów barwionych pod kątem LYVE-1 i CD31 wykazały, że przeciętna wielkość naczyń chłonnych, oraz procent obszaru tkanki pokrytego przez naczynia chłonne, były znacznie zmniejszone po wstrzyknięciu przeciwciała blokującego HGF-R (P < 0.01) w porównaniu z myszami traktowanymi kontrolną IgG (Fig. 6C, D). Gęstość naczyń chłonnych nie była znacząco różna pomiędzy grupami dwóch terapii (Fig.6E). Przykład 6. HGF Promuje Migrację LEC poprzez Integrynę α9 Dla określenia możliwych mechanizmów molekularnych, które mogą pośredniczyć we wpływie HGF na LEC, inkubowano dwie niezależne linie LEC z lub bez ng/ml HGF przez 6 godzin, a następnie przeprowadzono analizy mikromacierzy przy użyciu macierzy Affymetrix HU133v2 TM. Stwierdzono, że stanniokalcyna 1 była jednym z genów najbardziej podregulowanych do góry po potraktowaniu HGF. Co więcej, ekspresja integryny alfa 9 była także znacznie podregulowana wzwyż po potraktowaniu HGF. Wyniki te potwierdzono przez analizę QPCR (Fig. 7A). Ko-inkubacja LEC za pomocą HGF w obecności lub braku obecności swoistego przeciwciała blokującego integrynę alfa 9 ujawniła, że blokada integryny alfa 9 częściowo zablokowała indukowaną przez HGF migrację (p = ), podczas gdy inkubacja przeciwciałem blokującym HGF-R całkowicie hamowała wpływ HGF na migrację LEC (p = ) (Fig. 7B). Przykład 7. HGF Promuje Tworzenie Naczyń Limfatycznych In Vivo Niezależnie od VEGF 45 Dla określenia wpływu HGF nadekspresji in vivo, naczynia układu chłonnego zbadano uprzednio uzyskanych myszy transgenicznych HGF napędzanych promotorem melatotioneiny I (Takayama i in. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: ). Analiza skupiła się na skórze i jelicie cienkim gdzie naczynia chłonne są najbardziej liczne i gdzie nieprawidłowości układu chłonnego są najłatwiej wykrywane w genetycznych modelach myszy. Powiększenie naczyń wykryto w błonie śluzowej i warstwie podśluzówkowej jelita krętego u myszy transgenicznych HGF (Fig. 8B) w porównaniu z myszami dzikimi (Fig. 8A). Barwienie immunofluorescencyjne pod kątem markera podoplaniny swoistego dla naczyń chłonnych ujawniło wyraźne rozszerzenie naczyń mleczowych w środku kosmka jelitowego i powiększenie naczyń chłonnych w warstwie podśluzówkowej jelita krętego u myszy transgenicznych HGF (Fig. 8C, D). Barwienie podoplaniną ujawniło także podwyższoną liczbę i powiększenie naczyń chłonnych w skórze myszy transgenicznych HGF (Fig. 8G, H), podczas gdy nie zaobserwowano głównych histologicznych nieprawidłowości (Fig. 8E, F). Poprawione tworzenie naczyń chłonnych i powiększenie były także zaobserwowane w dwunastnicy i wątrobie myszy transgenicznych HGF. Celem zbadania czy HGF promuje tworzenie nowych naczyń chłonnych bezpośrednio lub pośrednio poprzez ścieżkę VEGFR-3, peletki o powolnym uwalnianiu (z lub bez HGF) zaimplantowano podskórnie do uszu myszy, i myszy traktowano systemowo przeciwciałem blokującym przeciw mysiemu VEGFR-3 lub kontrolną IgG. Po 14 dniach, barwienie immunofluorescencyjne pod katem CD31 i LYVE-1 ujawniło wyraźne tworzenie naczyń chłonnych w otoczeniu peletek zawierających HGF, ale nie w otoczeniu peletek kontrolnych (Fig. 9A-C). Jednakże, traktowanie przeciwciałem blokującym 34

36 anty-vegfr-3 nie zapobiegło tworzeniu naczyń chłonnych indukowanemu przez HGF (Fig. 9B, C). Myszy implantowane peletkami zawierającymi HGF wykazywały umiarkowanie poprawione tworzenie naczyń krwionośnych. 5 Wyniki przedstawione w tych przykładach wskazują, że HGF jest białkiem docelowym do kontrolowania limfangiogenezy. Pełnomocnik:

37 Zastrzeżenia patentowe 5 1. Terapeutycznie skuteczna ilość agonisty receptora czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) do zastosowania w leczeniu obrzęku spowodowanego niedrożnością naczyń chłonnych u pacjenta, gdzie agonista jest wybrany z grupy składającej się z polipeptydu HGF lub jego biologicznie aktywnego fragmentu, oraz kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd HGF lub jego biologicznie aktywny fragment. 2. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że obrzęk spowodowany niedrożnością naczyń chłonnych jest nabyty po operacji lub terapii promieniowaniem. 3. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że obrzęk spowodowany niedrożnością naczyń chłonnych jest spowodowany przez infekcję. 4. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że agonista jest polipeptydem HGF sformułowanym do podawania podskórnego. 5. Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienna tym, że agonista jest polipeptydem HGF lub jego biologicznie aktywnym fragmentem. 6. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 5, znamienna tym, że polipeptyd HGF jest ludzkim polipeptydem HGF lub biologicznie aktywny fragment polipeptydu HGF jest biologicznie aktywnym fragmentem ludzkiego polipeptydu HGF. 7. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 6, znamienna tym, że ludzki polipeptyd HGF jest przetworzonym, dojrzałym ludzkim polipeptydem HGF. 8. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 7, znamienna tym, że przetworzony, dojrzały ludzki polipeptyd HGF zawiera: podjednostkę α składającą się z aminokwasów 55 do 494 o NR ID SEKW.: 1; oraz podjednostkę β składającą się z aminokwasów o NR ID SEKW.: Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienna tym, że agonista jest kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd HGF lub jego biologicznie aktywny fragment.. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 8, znamienna tym, że agonista jest kwasem nukleinowym kodującym ludzkie HGF lub jego biologicznie aktywny fragment. 11. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 9, znamienna tym, że kwas nukleinowy koduje polipeptyd, który jest co najmniej 90%, co najmniej 92%, co najmniej 94%, co najmniej 96%, co najmniej 98%, lub co najmniej 99%, lub 0% identyczny do NR ID SEKW.: Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3 oraz 5-11, znamienna tym, że agonista jest sformułowany do dożylnego, podskórnego, domięśniowego, lub śródotrzewnowego wstrzykiwania. 13. Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3 oraz 5-11, znamienna tym, że agonista jest sformułowany do podawania miejscowego. 14. Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3 oraz 5-13, znamienna tym, że agonista jest sformułowany jako kompozycja farmaceutyczna, która zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik.. Kompozycja do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-3 oraz 5-14, znamienna tym, że pacjent jest człowiekiem. Pełnomocnik: 1

38

39

40

41

42

43

44

45