(13) B1 PL B1. (57) 1. Sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21)Numer zgłoszenia: (51) IntCl6: A 61K 3 9 /1 0 4 UrządPatentowyRzeczypospolitej Polskiej (2) Datazgłoszenia : (54) Sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/94 (73) Uprawniony z patentu: Akademia Medyczna, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/96 (72) Twórcy wynalazku: Grażyna Gościniak, Wrocław, PL Kryspina Grzybek-Hryncewicz, Wrocław, PL PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa 7 immunotypom według schematu Fishera, znamienny tym, że warianty śluzowe należące do immunotypów 1, 3, 5 lub 1, 2, 3 hoduje się oddzielnie na podłożu płynnym, poddając wytrząsaniu, następnie przesiewa na podłoże stałe lub płynne i inkubuje, zaś warianty nieśluzowe należące do immunotypów 2, 4, 6, 7 lub 4, 5, 6, 7 hoduje się na podłożu stałym, a następnie wszystkie immunotypy zmywa się z podłoży oddzielnie solą fizjologiczną, warianty śluzowe rozciera się i rozcieńcza tą solą, zaś zawiesiny bakteryjne wariantów śluzowych i nieśluzowych zabija się formaliną, wytrząsa, przepłukuje solą fizjologiczną, odwirowuje przy 800 g przez minut i osad zawiesza w dobranej ilości soli fizjologicznej, po czym równe objętości wariantów o gęstości 2 x x 109komórek/ml łączy się, tworząc kompleksy wariantów śluzowych 1, 3, 5 z nie śluzowymi 2, 4, 6, 7 lub wariantów śluzowych 1, 2, 3 z wariantami nieśluzowymi 4, 5, 6, 7.

2 Sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa 7 immunotypom według schematu Fishera, znamienny tym, że warianty śluzowe należące do immunotypów 1, 3, 5 lub 1, 2, 3 hoduje się oddzielnie na podłożu płynnym, poddając wytrząsaniu, następnie przesiewa na podłoże stałe lub płynne i inkubuje, zaś warianty nieśluzowe należące do immunotypów 2, 4, 6, 7 lub 4, 5, 6, 7 hoduje się na podłożu stałym, a następnie wszystkie immunotypy zmywa się z podłoży oddzielnie solą fizjologiczną, warianty śluzowe rozciera się i rozcieńcza tą solą, zaś zawiesiny bakteryjne wariantów śluzowych i nieśluzowych zabija się formaliną, wytrząsa, przepłukuje solą fizjologiczną, odwirowuje przy 800 g przez minut i osad zawiesza w dobranej ilości soli fizjologicznej, po czym równe objętości wariantów o gęstości 2 x x 109 komórek/ml łączy się, tworząc kompleksy wariantów śluzowych 1, 3, 5 z nieśluzowymi 2, 4, 6, 7 lub wariantów śluzowych 1, 2, 3 z wariantami nieśluzowymi 4, 5, 6, Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że warianty śluzowe na podłożu płynnym hoduje się przez czas 3-4 godzin, w temperaturze 37 C, na wytrząsarce przy wahnięciach /minutę, a następnie hoduje na podłożu stałym przez czas 48 godzin w temperaturze 37 C. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że warianty nieśluzowe hoduje się na podłożu stałym przez czas 48 godzin, w temperaturze 37 C. 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że po dodaniu do zawiesiny bakteryjnej formaliny wytrząsa się ją na wytrząsarce przy wahnięciach /minutę przez czas 3-4 godzin, w temperaturze C, a następnie odpłukuje się co najmniej 3 razy solą fizjologiczną. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa, stanowiącej preparat antygenowy przeciw zakażeniom nieśluzowymi i śluzowymi wariantami Pseudomonas aeruginosa, czyli wariantami pałeczki ropy błękitnej. Pseudomonas aeruginosa jest drobnoustrojem niebezpiecznym, zagrażającym życiu chorego, zwłaszcza w stanach immunosupresji i wyniszczających chorobach wieku dziecięcego i starczego. Stanowi ona duże zagrożenie dzięki swym małym wymaganiom wzrostowym. Równocześnie jest drobnoustrojem opornym na działanie przeważającej liczby leków antybakteryjnych. Immunoterapia swoistą szczepionką Pseudomonas aeruginosa jest sposobem leczenia dającym najkorzystniejsze efekty lecznicze. Pałeczki Pseudomonas aeruginosa podzielone zostały przez M.W. Fishera, według zaproponowanego przez niego schematu, zwanego odtąd schematem Fishera, na 7 różnych immunotypów, w oparciu o cechy antygenów somatycznych, to jest na podstawie różnic w strukturze chemicznej lipopolisacharydu ściany komórkowej oraz na podstawie krzyżowej ochrony myszy przed zakażeniem. Poszczególne immunotypy rozróżnia się metodą aglutynacji szkiełkowej z użyciem homologicznej surowicy dla każdego immunotypu. Praktyczne zastosowanie tego schematu omówione jest w publikacji: Fisher M.W., Devlin H.B., Gnabasik F.J.: New immunotype schema for Pseudomonas aeruginosa based on protective antigens. J.Bacteriol., 1969, 98, ; natomiast szersze omówienie zasad różnych schematów typowania serologicznego pałeczek Pseudomonas aeruginosa, w tym także według schematu Fishera zawarte jest w publikacji: Young L.S., Pollack M.: Immunologic approaches to the prophylaxis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infection. Sabath L.D. Pseudomonas aeruginosa the organism,

3 diseases it causes, and their treatment. Hans Huber Publishers, Bern, Stuttgart, Vienna. 1980, Znana jest szczepionka Pseudomonas aeruginosa o nazwie Pseudovac, zawierająca supernatanty 7 immunotypów Fishera, wytwarzana według polskiego patentu nr , według którego hodowle owych 7 immunotypów, uzyskane na podłożach syntetycznych, zakwasza się 2 molowym roztworem kwasu solnego do ph 5,0, ogrzewa przez 30 minut w 100 C, usuwa bakterie przez wirowanie, ustala się ph supematantu na 7,6 za pomocą 2 molowego roztworu wodorotlenku sodowego, a następnie supernatant ogrzewa się w 100 C przez 15 minut. Stosowanie opisanego sposobu zapobiega podczas ogrzewania, którego celem jest zabicie bakterii, zagęszczaniu się śluzu produkowanego podczas wzrostu bakterii, który to śluz jest substancją antygenową, odpowiedzialną za immunogenność i swoistość preparatu szczepionki, dzięki czemu śluz po odwirowaniu bakterii pozostaje w supernatancie. Jednakże szczepionka otrzymana sposobem według opisu patentowego nr zawiera tylko zewnątrzkomórkowe antygeny, zaś pozbawiona jest antygenów somatycznych. Znana jest, pod nazwą handlową Pseudogen, szczepionka Pseudomonas aeruginosa produkowana w USA. Jest to szczepionka bezkomórkowa zawierająca oczyszczone preparaty lipopolisacharydów wyizolowanych ze szczepów Pseudomonas aeruginosa należących do 7 immunotypów według Fishera. Nie zawiera ona natomiast antygenów śluzowych. Inna znana szczepionka zawiera antygeny w postaci ścian komórkowych 16 różnych, sklasyfikowanych według międzynarodowego antygenowego schematu (JATS), serotypów Pseudomonas aeruginosa. Znany jest także kompleks białkowo lipopolisacharydowy ścian komórkowych z toksoidem elastazy i proteazy. Jak wynika z literatury i praktyki w badaniach doświadczalnych i terapii anty-pseudomonas aeruginosa stosuje się głównie szczepionki, w skład których wchodzą części komórki bakteryjnej, np. izolowane lipopolisacharydy, białka błony zewnętrznej, kompleksy białkowo - wielocukrowe, ściany komórkowe lub też tylko produkty zewnątrzkomórkowe, takie jak śluz. Nie ma w zastosowaniu szczepionki, która zawierałaby cały zestaw antygenów ważnych dla uzyskania ochrony przed zakażeniem. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wieloważnej szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa 7 immunotypom według schematu Fishera. Istota wynalazku polega na tym, że warianty śluzowe należące do immunotypów 1, 3, 5 lub 1, 2, 3 hoduje się oddzielnie na podłożu płynnym, poddając wytrząsaniu, następnie przesiewa na podłoże stałe lub płynne i inkubuje, zaś warianty nieśluzowe należące do immunotypów 2, 4, 6, 7 lub 4, 5, 6, 7 hoduje się na podłożu stałym, a następnie wszystkie immunotypy zmywa się z podłoży oddzielnie solą fizjologiczną, warianty śluzowe rozciera się i rozcieńcza tą solą. Zawiesiny bakteryjne wariantów śluzowych i nieśluzowych zabija się formaliną, wytrząsa, przepłukuje solą fizjologiczną, odwirowuje przy 800 g przez minut i osad zawiesza w dobranej ilości soli fizjologicznej, po czym równe objętości wariantów o gęstości 2 x x 109 komórek/ml łączy się tworząc kompleksy wariantów śluzowych 1, 3, 5 z nieśluzowymi 2, 4, 6, 7 lub wariantów śluzowych 1, 2, 3 z wariantami nieśluzowymi 4, 5, 6, 7. Korzystne jest, gdy warianty śluzowe na podłożu płynnym hoduje się przez czas 3-4 godzin, w temperaturze 37 C, na wytrząsarce przy wahnięciach /minutę, a następnie hoduje na podłożu stałym, przez czas 48 godzin w temperaturze 37 C. Korzystne jest, gdy warianty nieśluzowe hoduje się na podłożu stałym przez czas 48 godzin w temperaturze 37 C. Korzystne jest także, gdy po dodaniu formaliny do zawiesiny bakteryjnej wariantów śluzowych i nieśluzowych wytrząsa się ją na wytrząsarce przy wahnięciach /minutę przez czas 3-4 godzin w temperaturze C, a następnie odpłukuje się co najmniej 3 razy solą fizjologiczną. Podczas badań dotyczących właściwości immunogennych wszystkich immunotypów Pseudomonas aeruginosa według Fishera okazało się, że śluzy niektórych immunotypów są serologicznie spokrewnione ze śluzami innych immunotypów i indukują odporność mieszaną w odczynie fagocytamym dla wszystkich wariantów śluzowych Pseudomonas aeruginosa, natomiast antygeny somatyczne wywołują powstanie odporności homologicznej dla wariantów

4 nieśluzowych. Zestawiając odpowiednio warianty śluzowe i nieśluzowe, czyli zabite formaliną bakterie, uzyskuje się szczepionkę, która indukuje wzrost aktywności fagocytarnej wobec wszystkich immunotypów wariantów śluzowych i nieśluzowych. Użyte warianty śluzowe immunotypów 1, 3, 5 indukują również krzyżową reakcję dla śluzowych immunotypów 2, 4, 6, 7, a warianty śluzowe immunotypów 1, 2, 3 dla śluzowych immunotypów 4, 5, 6, 7, co pozwala na wzbudzenie odporności dla śluzowych wariantów wszystkich immunotypów według Fishera. Z przeprowadzonych badań według testu ochrony biernej wynika, że skomponowana szczepionka w oparciu o wymienione kombinacje wariantów śluzowych i dodatkowo pozostałych czterech wariantów nieśluzowych powoduje powstanie wysokiego stopnia odporności dla wszystkich znanych immunotypów wariantów śluzowych i nieśluzowych, co daje podstawy do zastosowania tych zestawów antygenów do uodpornienia przeciwko infekcjom Pseudomonas aeruginosa. Wskazane właściwości uzyskano w oparciu o wyniki testów przeprowadzonych in vivo, a mianowicie wzrost aktywności fagocytarnej granulocytów uzyskano opsonizując pałeczki Pseudomonas aeruginosa surowicą immunizowanych królików według metody opisanej przez Edvards a i Ewinga, poziom przeciwciał wieloważnej surowicy odpornościowej i surowic normalnych badano metodą aglutynacji probówkowej, test ochrony biernej wykonano na myszach przez podanie dootrzewnowe, a obliczenie dawki 50% śmiertelności (LD50) i wartości ochronnej surowicy przeprowadzono według Reeda i Muencha, co wykazało, że ochrona przed zakażeniami użytymi w doświadczeniu szczepami zarówno klasycznymi jak i diagnostycznymi waha się w granicach LD50. Dla porównania należy nadmienić, że surowica normalna królicza pobrana przed szczepieniem chroni myszy przed 1-2 dawkami LD50. Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wykonania. Przykład I. Warianty śluzowe Pseudomonas aeruginosa należące do immunotypów 1, 2, 3 według schematu Fishera hoduje się, każdy oddzielnie, w 80 ml bulionu zwykłego przez 4 godziny w temperaturze 37 C na wytrząsarce przy 120 wahnięciach na minutę. Następnie tak odmłodzoną hodowlę posiewa się na płytki z podłożem stałym, pokryte sterylnym celafanowym krążkiem i inkubuje przez 48 godzin w temperaturze 37 C. Skład podłoża: Sól potasowa kwasu D-glukonowego - 20,0 g Mocznik - 1,0 g Na2HPO4 12 H2O - 1,0 g KH2PO4 7H2O - 1,0 g MgSO4 7H2O - 0,1 g Agar agar - 5,0 g Woda destylowana ,0 ml Po okresie inkubacji warianty śluzowe zmywa się z podłoży 0,15 M NaCl, każdy immunotyp osobno, a następnie rozciera się w moździerzu szklanym na jednolitą masę, wszystkie zawiesiny doprowadza się 0,15 M NaCl do gęstości 2 x 109 komórek/ml. Warianty nieśluzowe Pseudomonas aeruginosa należące do immunotypów 4, 5, 6, 7 według schematu Fishera hoduje się przez 48 godzin w temperaturze 37 C na podłożu stałym Tryptic Soya Agar, to jest agarze tryptozowo-sojowym. Po okresie inkubacji warianty nieśluzowe zmywa się z podłoży 0,15 M NaCl, każdy immunotyp osobno, doprowadzając do gęstości 2 x 109 komórek/ml. Do 10 ml każdej zawiesiny bakteryjnej dodaje się po 1 ml 5% formaliny i wytrząsa na wytrząsarce przy 120 wahnięciach na minutę przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Formalinę usuwa się przez trzykrotne przepłukanie 0,15 M NaCl, wirując przy 800 g przez 15 minut. W takich warunkach wirowania zewnątrzkomórkowy śluz pozostaje połączony z komórkami bakteryjnymi. Osad zawiesza się w 10 ml sterylnego 0,15 M NaCl. Warianty śluzowe immunotypów 1, 2, 3 miesza się w równych ilościach z wariantami nieśluzowymi immunotypów 4, 5, 6, 7 i otrzymuje wieloważną szczepionkę o gęstości 2 x 109 komórek/ml. Przykład II. Warianty śluzowe 1, 3, 5 immunotypów Pseudomonas aeruginosa hoduje się na bulionie zwykłym analogicznie jak w przykładzie I, po czym odmłodzoną hodowlę wysiewa się na pożywkę płynną syntetyczną o składzie: Sól potasowa kwasu D-glukonowego - 20,0 g

5 Mocznik - 1,0 g Na2HPO4. 12H2O - 1,0 g KH2PO4. 7H2O - 1,0 g MgSO4. 7H2O - 0,1 g Woda destylowana ,0 g Hodowlę przeprowadza się w 37 C przez 48 godzin na wytrząsarce przy 120 wahnięciach na minutę i doprowadza do gęstości 4 x 109 komórek/ml. Zawiesinę wariantów nieśluzowych Pseudomonas aeruginosa należących do immunotypów 2, 4, 6, 7 przygotowuje się analogicznie jak w przykładzie I. Łączy się w równych ilościach warianty śluzowe immunotypów 1, 3, 5 oraz warianty nieśluzowe immunotypów 2, 4, 6, 7, otrzymując wieloważną szczepionkę o gęstości 4 x 109 komórek/ml. Otrzymane oboma sposobami szczepionki poddano badaniom kontrolnym bakteriologicznym i kontroli biologicznej na zwierzętach laboratoryjnych. 1. Kontrola bakteriologiczna wykazała jałowość szczepionki, po wysianiu 0,1 ml szczepionki na agar zwykły. 2. Kontrola biologiczna wykazała że: - Preparat jest nieszkodliwy po podaniu 0,5 ml dootrzewnowo 5 myszom o masie około 20 g. - Stwierdza się wzrost krotny poziomu przeciwciał u królików, które immunizowano pięciokrotnie dawką: 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 4 ml, 4 ml. - Uzyskuje się ochronę bierną u myszy po podaniu 0,5 ml króliczej surowicy odpornościowej przed zakażeniem dawkami LD50 wszystkich immunotypów Fishera, wariantami śluzowymi i nieśluzowymi.

6 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł