Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej na przykładzie metody dyfuzyjnej oraz wyznaczania wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost.

Transkrypt

1 Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej na przykładzie metody dyfuzyjnej oraz wyznaczania wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost. Opracowanie: dr inż. Roland Wakieć Wprowadzenie. Najważniejszym etapem rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej jest oznaczanie wrażliwości mikroorganizmów na leki. Potrzeba przeprowadzania w sposób powtarzalny testów związków chemicznych pod względem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej jest wynikiem kilku czynników. Po pierwsze jest to związane z ciągle rosnącą ilością odnotowanych zakażeń drobnoustrojami, w tym organizmami wykazującymi różnego rodzaju oporność na dotychczas całkowicie skuteczne i powszechnie stosowane antybiotyki. Kolejną przyczyną jest konieczność tworzenia wiarygodnych baz danych pozwalających na określanie relacji pomiędzy aktywnością leku względem danego mikroorganizmu w warunkach in vitro a jego skuteczną dawką podawaną pacjentowi in vivo w momencie zakażenia tym organizmem. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności, od prostych testów fenotypowych do bardziej skomplikowanych metod, wykorzystujących techniki biologii molekularnej. W celu uzyskania jak najdokładniejszych informacji dotyczących identyfikacji mechanizmu oporności często konieczne jest łączenie kliku różnych metod. Podstawowym i najbardziej rozpowszechnionym testem w oznaczaniu wrażliwości na działanie leków i związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, jest opracowany na początku lat sześćdziesiątych test oparty o dyfuzję antybiotyku z krążka bibułowego w żelu agarowym. Większość norm oznaczania wrażliwości na leki jest pochodnymi tej techniki. Sama metoda jest niezwykle prosta i szybka w wykonaniu. Ogólnie rzecz ujmując, metoda polega na umieszczeniu krążka bibułowego nasączonego badanym związkiem na odpowiednim podłożu agarowym zaszczepionym badanym szczepem drobnoustroju, którego lekowrażliwość chcemy poznać. Związek umieszczony w odpowiedniej ilości na krążku dyfunduje w agarze. Stężenie związku jest najwyższe w pobliżu krążka i spada w miarę wzrostu odległości od jego środka. Miarą wrażliwości badanego szczepu jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka nasyconego antybiotykiem. Organizmy bardziej oporne na działanie leku są w stanie rosnąc w mniejszej odległości od krążka (w niektórych przypadkach w ogóle nie dając strefy zahamowania wzrostu), a te mniej oporne, wytrzymujące jedynie niższe stężenia, zaczynają rosnąc w nieco większej odległości od krążka niż organizmy oporne. Odczytu dokonuje się w świetle przechodzącym, zwracając 1

2 uwagę na obecność mikrokolonii w strefie zahamowania wzrostu mogących świadczyć o oporności badanego szczepu, lub zanieczyszczeniu szczepem opornym. Ograniczeniem tej metody jest szybkość dyfuzji badanego związku w podłożu. Często obserwowane jest zafałszowanie wyniku wynikające z niskiej rozpuszczalności związku w roztworach wodnych i niskiej szybkości dyfuzji w agarze. W takich przypadkach, od pewnej wartości krytycznej, zwiększanie ilości badanego związku na krążku nie przekłada się już na zwiększanie stref zahamowania wzrostu. Fakt ten nie wynika jednak z oporności badanego szczepu na jego działanie, ale z ograniczeń związanych z dyfuzją. Z tego względu, w przypadku diagnostyki mikrobiologicznej wykorzystywanej do doboru odpowiednich leków w przypadku zakażeń, niezbędna jest ciągła kontrola jakości, standaryzacja stosowanych metod oraz umiejętność interpretacji otrzymanych wyników. Coraz częściej przyjmuje się jednak, że w przypadku identyfikacji mechanizmów oporności szczególnie groźnych z punktu widzenia terapeutycznego bądź epidemiologicznego, niezbędne jest także rutynowe stosowanie metod przeglądowych takich jak oznaczanie najmniejszego stężenia leku hamującego wzrost ( tzw. MIC) lub wręcz identyfikacja genu warunkującego oporność. Kolejną z dość powszechnie stosowanych metod jest metoda rozcieńczeń w pożywce. Wykonywana może ona być w probówkach (metoda makrorozcieńczeń minimalna objętość bulionu wynosi 2ml) lub w płytkach titracyjnych (metoda mikrorozcieńczeń - objętość pożywki w każdej studzience wynosi 100 lub 200 µl). Pożywka zawierająca antybiotyk o znanych malejących stężeniach (zazwyczaj stosuje się podwójne, seryjne rozcieńczenia) jest zaszczepiana określoną liczbą komórek bakteryjnych lub grzybowych. Celem tej metody jest określenie najmniejszego stężenia leku, hamującego wzrost organizmu (tzw. wartość MIC od ang. Minimal Inhibitory Concentration). Wartość MIC określa najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii lub grzybów przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Odczyt polega na obserwacji zmętnienia podłoża po określonym czasie inkubacji i może być dokonywany wizualnie lub spektrometrycznie (z użyciem tzw. czytnika mikropłytek). Aby wyniki uzyskane w badaniach mikrobiologicznych in vitro mogły znaleźć zastosowanie w leczeniu klinicznym muszą one być porównywalne względem siebie niezależnie od laboratorium w którym zostały wykonane. Wyznaczone standardy postępowania znajdują się w odpowiednich normach i dyrektywach. Standardy te są opracowywane przez specjalne, wyspecjalizowane instytucje zbierające informacje dotyczące 2

3 przełożenia wyników badań in vitro na ich zastosowanie w warunkach in vivo. W europie wiodącym tego typu ośrodkiem jest European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, lub amerykański NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Cel ćwiczenia. Zapoznanie się z technikami oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na działanie antybiotyków i związków przeciwgrzybowych: metoda dyfuzyjna i wyznaczanie wartości MIC. Zapoznanie się techniką pracy z wykorzystaniem wielokanałowej pipety automatycznej i czytnikiem mikropłytek. Wykonanie ćwiczenia. UWAGA! W PRZYPADKU OBYDWU PONIŻEJ OPISANYCH METOD, PRACUJEMY Z ORGANIZMAMI POTENCJALNIE PATOGENNYMI. PROSZĘ O ZACHOWANIE SZCZEGÓLNEJ OSTROŻNOŚCI!!! Badanie stopnia hamowania wzrostu Staphylococcus aureus w podłożu stałym metodą dyfuzyjną z wykorzystaniem krążków bibułowych (ang. filter disc assay). 1. Przygotowanie inoculum do zaszczepienia podłoża stałego. Do jałowej kolbki 50 ml wlać około 20 ml podłoża płynnego Czapek Broth i przy pomocy pipety 1000 µl z jałową końcówką dodać µl całonocnej hodowli Staphylococcus aureus. Przy pomocy spektrofotometru ustalić transmitancję (długości fali λ = 660 nm) uzyskanej zawiesiny komórek w przedziale 25-30% w odniesieniu do pożywki. W miarę potrzeb zawiesinę rozcieńczyć pożywką bądź dodać więcej komórek. (zlewki wylewać do pojemnika z płynem dezynfekującym!!!) 2. Zaszczepienie stałego podłoża Czapek Agar. Rozgrzać w łaźni wodnej (bądź mikrofalówce) zestalone podłoże Czapek. Po upłynnieniu ostudzić do temperatury ok. 50ºC (sprawdzamy dotykając kolbkę wierzchem dłoni) i dodać 750 µl przygotowanego inoculum (na 75 ml upłynnionego agaru). Rozmieszać przesuwając kolbkę ruchem okrężnym po blacie stołu i natychmiast wylać płytki (3 duże płytki Petriego). 3

4 3. Ułożenie krążków z antybiotykami. Po zestaleniu, przy pomocy zdezynfekowanej pęsety, ułożyć na powierzchni agaru krążki z przygotowanymi antybiotykami: antybiotyki z tzw. antybiogramu podstawowego dla S. aureus: erytromycyna, linkomycyna, klindamycyna. wybrane antybiotyki z tzw. antybiogramu rozszerzonego dla S. aureus: wankomycyna, chloramfenikol, gentamycyna i rifampycyna. 4. Inkubacja i dokonanie odczytu. Płytki inkubować w 35ºC przez 18 godzin. Po upłynięciu czasu inkubacji dokonać odczytu, mierząc powstałe strefy zahamowania wzrostu. Ocenić wrażliwość badanego szczepu na poszczególne antybiotyki (poszukać danych literaturowych mówiących o wielkości stref w przypadku szczepów wrażliwych i opornych). Wyznaczanie wartości MIC amfoterycyny B i ketokonazolu wobec Candida albicans metodą podwójnych seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym. 1. Przygotowanie inoculum do zaszczepienia seryjnych rozcieńczeń związków przeciwgrzybowych wykonanych w mikropłytce. Do jałowej kolbki 50 ml wlać około 20 ml podłoża płynnego YNBG i przy pomocy pipety 1000 µl z jałową końcówką dodać µl całonocnej hodowli Candida albicans. Otrzymaną w ten sposób zawiesinę komórek rozcieńczać do uzyskania gęstości optycznej OD 660 = 0,1 (gęstość optyczna mierzona przy długości fali λ = 660 nm) co odpowiada 10 6 komórek na ml. Następnie uzyskaną zawiesinę o OD = 0,1 rozcieńczyć w stosunku 1:50, aby uzyskać komórek na ml (do nowej kolbki wlać 20 ml świeżego podłoża i dodać 400 µl zawiesiny o OD = 0,1). 2. Przygotowanie roztworów wyjściowych antybiotyków używanych w teście. Przygotować wyjściowe roztwory amfoterycyny B i ketokonazolu w DMSO w stężeniu 1mg/ml. Z roztworów wyjściowych przygotować po 600µl wodnych roztworów roboczych w stężeniach: 10 µg/ml i 2 µg/ml dla obydwu związków. 3. Wykonanie seryjnych rozcieńczeń związków przeciwgrzybowych w mikropłytce. Do wszystkich celek w mikropłytce dodać po 100 µl podłoża YNBG. Do kolumny 11 (we wszystkich rzędach) dodać dodatkowo 100µl podłoża kontrola pożywki. 4

5 Do pierwszej kolumny dodajemy po 100 µl przygotowanych roztworów roboczych do rzędów A i B 10µg/ml amfoterycynę B; C i D 2 µg/ml amfoterycynę; E i F 10µg/ml ketokonazol; G i H 2 µg/ml ketokonazol. Przy pomocy pipety wielokanałowej przenosimy z pierwszej kolumny mikropłytki 100µl roztworu do drugiej kolumny i tak aż do 10 kolumny. 100µl roztworu pobrane z 10 kolumny wyrzucamy wraz z tipsami. Kolumna 11 i 12 pozostają bez antybiotyków. 4. Zaszczepienie seryjnych rozcieńczeń związków przeciwgrzybowych uprzednio przygotowanym inoculum. Do wszystkich celek w kolumnach 1-10 i do kolumny 12 (kontrola wzrostu bez antybiotyku) dodajemy po 100 µl przygotowanego inoculum. Końcowa objętość w każdej studzience wynosić powinna 200 µl, a końcowa ilość komórek na ml w studzience wynosi Inkubacja i odczyt wyników. Płytki inkubować 24 godziny w 30ºC. Po tym czasie dokonać odczytu wizualnego. W razie problemów z odczytem dokonać z wykorzystaniem czytnika mikropłytek. Obliczyć stężenia związków w poszczególnych celkach. Podać wyznaczone wartości MIC dla AMB i ketokonazolu. 5