Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych"

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 4 Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych Wojciech Garczorz Diagnostyka molekularna jest obecnie najszybciej rozwijającym się działem diagnostyki medycznej. W wielu dziedzinach medycyny jak mikrobiologia, medycyna sądowa czy diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie ma już ugruntowaną pozycję. W innych specjalizacjach jak onkologia czy farmakogenetyka jej rola stale rośnie. Pierwszym i najistotniejszym etapem badania jest prawidłowe pobranie próbki i izolacja materiału genetycznego. W zależności od celu badania i dostępnego materiału stosuje się różne metody izolacji kwasów nukleinowych, odrębne dla DNA i RNA. W każdym przypadku obowiązuje zachowanie szczególnej ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek, co może prowadzić do uzyskania fałszywych wyników. Zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce medycznej Techniki molekularne na czele z metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) stosowane są w: 1. Wykrywaniu patogenów infekcyjnych (bakterii, wirusów, pasożytów). 2. Wykrywaniu zmian w genomowym i mitochondrialnym DNA w chorobach uwarunkowanych genetycznie. 3. Diagnostyce mutacji prowadzących do powstawania nowotworów. 4. Wykrywaniu polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej ustalanie pokrewieństwa, w szczególności ojcostwa. 17

2 5. Ustalaniu zgodności tkankowej. 6. Określaniu typów polimorficznych genów powiązanych z cechami fenotypowymi (aktywność enzymów, podtyp receptora). Obecnie ponad 100 szczepów bakteryjnych można wykrywać i różnicować metodą PCR. Dotyczy to szczególnie takich przypadków, w których hodowla in vitro jest długotrwała i trudna. Przykładem może być opracowanie testów diagnostycznych dla Mycobacterium tuberculosis. Metodą PCR można wykryć antygen B i MPB64 prątka gruźlicy po kilku godzinach, podczas gdy klasyczna metoda hodowlana trwa około 6 tygodni. Metodą PCR można wykrywać zarówno DNA jak i RNA wirusy. Najczęściej ma to miejsce w diagnostyce wirusa HIV (RNA wirus) oraz wirusów zapalenia wątroby HBV (DNA wirus) i HCV (RNA wirus). Badane są również inne wirusy, które są czynnikami etiologicznymi w białaczkach, chłoniakach, mięsakach i rakach. Dla infekcji retrowirusowych charakterystyczny jest okres latencji. Zakażenie wykrywa się przed wystąpieniem objawów klinicznych. Dla przykładu, wirus HIV może być wykryty na kilka lat przed pojawieniem się objawów AIDS. Identyfikacja wirusa typu B zapalenia wątroby metodami klasycznymi (RIA, ELISA) bywa czasem nieskuteczna ze względu na zbyt niski poziom wirusa w surowicy. Metoda PCR zwiększa czułość około 10 razy. Diagnostyka chorób dziedzicznych metodą analizy DNA w Polsce prowadzona jest w kilku ośrodkach, z których każdy specjalizuje się w kilku chorobach. Próbki pobrane od pacjentów, u których podejrzewa się wystąpienie danej choroby wysyła się do takiego ośrodka, otrzymując zwrotnie wyniki analizy. W centrach krwiodawstwa coraz częściej korzysta się z metod molekularnych zarówno do określenia układów grupowych krwi jak i do detekcji patogenów, głównie wirusów. Opracowano testy diagnostyczne dla kilkudziesięciu genów uczestniczących w onkogenezie. Badania genetyczne stosuje się do identyfikacji osób zagrożonych zachorowaniem na określony typ nowotworu, w prognozowaniu przebiegu choroby oraz w celu wyboru terapii. Przykładem są testy wykrywające mutacje w genach BRCA1 i BRCA2. Są to geny supresorowe, które biorą udział w naprawie uszkodzeń DNA. Mutacje w ich obrębie prowadzą do znacznego zwiększenia ryzyka wystapienia nowotworów w szczególności sutka i jajnika. Pobieranie materiału do badań Do izolacji DNA nadają się wszystkie komórki zawierające jądro. Dla każdego typu komórek opracowana jest optymalna metoda. Najczęściej wykorzystywany do izolowania DNA materiał biologiczny to: pełna krew obwodowa, komórki nabłonka (szczególnie nabłonek 18

3 policzka), szpik kostny, komórki płynu owodniowego i kosmówki, cebulki włosowe. Rzadziej używane są: plamy krwi i nasienia, fragmenty tkanek, bioptaty z biopsji cienkoigłowej. W przypadku diagnostyki bakteriologicznej lub wirusologicznej DNA lub RNA izolowany jest z płynów ustrojowych (np. osocza) pozbawionych ludzkich komórek. Ze względu na techniki badań molekularnych, szczególnie istotne jest unikanie możliwości zanieczyszczenia pobieranego materiału innym DNA. Nawet śladowe zanieczyszczenia innymi kwasami nukleinowymi może być przyczyną błędnego wyniku badania. Ilość materiału Do wykonania pełnych badań diagnostycznych wystarczy: 1 ml krwi obwodowej pobranej na wersenian disodowy (EDTA). Inne antykoagulanty mogą być stosowane pod warunkiem, że nie będą zakłócały dalszej analizy (np. heparyna hamuje aktywność niektórych enzymów restrykcyjnych), mg tkanki, 10 ml płynu owodniowego. Do wykonania pełnej diagnostyki potrzebne są powyższe ilości materiału biologicznego, natomiast do pojedynczej reakcji PCR niezbędna jest znacznie mniejsza ilość materiału. W praktyce wystarczy 50 l krwi lub 10 l nasienia. Przechowywanie materiału Izolowanie DNA może być rozpoczęte zaraz po pobraniu próbki. Gdy nie ma takiej możliwości, materiał można przechowywać zamrożony. Próbki przechowuje się w następujących warunkach: zamrożona tkanka, lizat umieszczony w buforze do lizy w temperaturze 4 C przez kilka miesięcy, a do przesyłki w temperaturze pokojowej. Etapy izolacji DNA z krwi: liza komórek, które nie zawierają jąder (erytrocyty), odwirowanie leukocytów; uzyskanie osadu, liza osadu leukocytów buforem do lizy, odbiałczenie przez wytrącenie białka mocznikiem, NaCl lub LiCl, odwirowanie osadu białka i przeniesienie supernatantu do nowej probówki, wytrącenie DNA rozpuszczalnikiem organicznym izopropanolem, przemycie osadu 70% etanolem i wysuszenie, 19

4 rozpuszczenie w buforze. W części praktycznej jest opisana dokładnie jedna z metod izolowania DNA z krwi, oparta na gotowym zestawie odczynników. W przypadku izolowania DNA z tkanek niezbędne jest ich dokładne rozdrobnienie przez sonifikację (działanie ultradźwiękami) lub rozcieranie w moździerzu zamrożonej próbki. W przypadku niektórych tkanek rozbicie błony komórkowej i jądrowej następuje w obecności detergentu i proteinazy K trawiącej białka w tych warunkach. Do izolowania DNA z plemników, plam nasienia lub wymazów z narządów płciowych stosuje się specjalne techniki, które umożliwiają rozdzielenie DNA wyizolowanego z dróg rodnych badanej kobiety i plemników, tzw. metodę preferencyjnej lizy. Wykorzystuje się oporność chromatyny plemników na lizę z udziałem soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem, i proteinazy K oraz stosunkowo łatwą lizę chromatyny somatycznej. Chromatyna plemników ssaków w miejsce histonów zawiera liczne cysteinowe protaminy. Reszty cysteinowe tworzą dużą liczbę wiązań dwusiarczkowych, co zapewnia oporność na detergenty i egzogenne proteinazy. DNA z plemników izoluje się za pomocą ditiotreitolu, który redukuje (specyficznie) wiązania dwusiarczkowe. Izolowanie DNA z materiału biologicznego Celem jest uzyskanie wysokocząsteczkowego DNA, oczyszczonego z białek i inhibitorów enzymów. Izolowanie kwasów nukleinowych z materiału biologicznego zasadniczo opiera się na następujących etapach: liza komórek, denaturacja białka, usunięcie białek i innych zanieczyszczeń i zagęszczeniu kwasu nukleinowego. Metody izolowania DNA różnią się sposobem ekstrakcji DNA, usuwania białek oraz wytrącania DNA. Istnieje wiele metod izolowania DNA: zastosowanie ekstrakcji DNA fenolem i chloroformem, z odsalaniem białek, zastosowanie mocznika, izotiocyjanianu guanidyny lub proteinazy K. Większość gotowych zestawów przeznaczonych do izolowania DNA oparta jest na jednej z tych metod. Badając liczne, niewielkie próby, np. w badaniach populacyjnych, stosuje się inną technikę. Wykorzystuje ona detergenty do rozbicia błon komórkowych i inaktywacji nukleaz oraz sole chaotropowe, takie jak chlorowodorek lub izotiocyjanian guanidyny. W obecności chlorowodorku lub izotiocyjanianu guanidyny DNA ulega absorbcji na cząstkach szkła lub krzemionki. Następnie DNA odpłukuje się z tych cząstek buforem i wiruje otrzymując czysty izolat. 20

5 Izolowanie RNA z materiału biologicznego RNA w porównaniu do DNA jest mniej stabilny termodynamicznie, łatwiej ulega rozpadowi i trawieniu przez rybonukleazy. Warunkiem uzyskania czystego, nie zdegradowanego preparatu RNA jest szybkie i skuteczne zahamowanie aktywności rybonukleaz, które są wyjątkowo stabilnymi i aktywnymi enzymami, występującymi we wszystkich komórkach i bardzo szybko degradują RNA. Do izolowania RNA konieczne jest posiadanie odczynników i naczyń wolnych od rybonukleaz. Wszystkie odczynniki powinny być inaktywowane dietylopirowęglanem (DEPC), który hamuje aktywność rybonukleaz. DEPC jest silnym mutagenem, dlatego wymagana jest duża ostrożność przy pracy z tym związkiem (należy pracować pod wyciągiem i w rękawiczkach). Techniki izolacji RNA Techniki izolacji RNA różnią się w zależności od materiału badanego, jak i od rodzaju RNA, który ma zostać wyizolowany. Najczęściej izoluje się następujące frakcje RNA: informacyjne RNA (mrna) z wykorzystaniem sekwencji poli(a) w celu oddzielenia od innych frakcji RNA, całkowite RNA, rybosomalne RNA. Obecnie w licznych badaniach określa się wpływ różnych czynników na ekspresję genów. W tym celu izoluje się z komórek lub tkanek mrna, następnie przy pomocy odwrotnej transkryptazy następuje przepisanie informacji na komplementarne DNA (cdna). Klasyczne metody izolacji RNA wykorzystują mieszaninę fenolu i chloroformu, jednak ze względu na toksyczność tych składników opracowano nowe metody wykorzystujące selektywne wiązanie RNA do żelu krzemionkowego w środowisku specyficznego wysokojonowego buforu. Metoda ta zapewnia selektywność wiązania RNA a nawet jego określonego typu (np. mrna czy trna). Próbki biologiczne (bakterie, komórki, tkanki roślinne i zwierzęce) są lizowane i homogenizowane w buforze, który jednocześnie inaktywuje rybonukleazy. Lizat pełny lub rozfrakcjonowany (po dodaniu etanolu) nanosi się na mini kolumnę, gdzie następuje selektywna i specyficzna absorbcja RNA do filtru krzemionkowego. Poprzez przemywanie kolumny różnymi buforami usuwa się zanieczyszczenia (białko, DNA) i ostatecznie wypłukuje czysty RNA wodą. Podobnie jak w przypadku izolowania DNA można kupić gotowe zestawy odczynników. Wyizolowany RNA można przechowywać w temperaturze -70 C przez okres 1 roku. 21

6 Wybrane właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych Ich wodne roztwory mają odczyn kwaśny dzięki zawartości dużej ilości reszt kwasu fosforowego. Rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonych roztworach kwasu octowego. W roztworach wodnych tworzą układy koloidowe, z których można je łatwo wytrącić za pomocą środków odwadniających, np. etanolu. W środowisku kwaśnym wiążą zasadowe barwniki (błękit toluidynowy, zieleń metylowa), co wykorzystano w badaniach histochemicznych do barwienia jąder komórkowych. Występują w kompleksach z białkami, tworząc nukleoproteiny. Polinukleotydy wykazują tzw. efekt hiperchromowy, czyli wzrost absorbcji światła UV, gdy nukleotydy są wolne lub przypadkowo zorientowane, w porównaniu do absorbcji przez uporządkowaną strukturę kwasu nukleinowego. Spowodowane temperaturą rozsunięcie podwójnego heliksu, powoduje gwałtowny wzrost pochłaniania promieniowania przy długości fali 260 nm w pobliżu temperatury denaturacji DNA w roztworze. Spada także lepkość roztworu. Stabilność dwuniciowej struktury DNA zależy w dużym stopniu od siły jonowej roztworu i jego ph oraz od składu zasad. Pary G-C (3 wiązania wodorowe) są stabilniejsze niż pary A-T (2 wiązania wodorowe). Wzrost ph, temperatury lub silne obniżenie siły jonowej roztworu powoduje denaturację podwójnej helisy DNA. DNA zdenaturowany występuje w postaci wolnych, pojedynczych nici. Przy powolnym oziębianiu zdenaturowanego termicznie roztworu DNA następuje rekombinacja obydwu nici i zostaje przywrócona struktura podwójnego heliksu (renaturacja). Gdy roztwór gwałtownie się ochłodzi, obie nici pozostają oddzielone. Zjawisko to wykorzystano do otrzymywania jednoniciowego DNA w technice PCR (termocyklery). Jeżeli do próbki zdenaturowanego DNA doda się inny preparat jednoniciowego DNA lub RNA i przeprowadzi renaturację to takie zjawisko nazywa się hybrydyzacją. Hybrydyzacja pozwala na wykrywanie określonych sekwencji nukleotydowych w DNA lub RNA. Połączona z elektroforezą jest wykorzystywana w metodzie Southern blot (dla DNA) i 22

7 northern blot (dla RNA) oraz w technice amplifikacji DNA (przyłączanie starterów) łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Analiza chemiczna preparatów DNA i RNA W praktyce wykorzystywane są dwie metody analizy określające zarówno stężenie jak i czystość izolatów DNA i RNA. Każda z nich wykorzystuje inne zjawiska fizyczne. Poniżej zostaną omówione metody: spektrofotometryczna i elektroforetyczna. Metoda spektrofotometryczna Metoda spektrofotometryczna wykorzystuje fakt, że kwasy nukleinowe oraz produkty ich metabolizmu i hydrolizy pochłaniają światło ultrafioletowe. Właściwość taką posiadają wszystkie związki zawierające układ purynowy i pirymidynowy. Grupa fosforanowa oraz cukrowa nie wpływają na intensywność i charakter pochłaniania. Charakterystyki spektralne DNA i RNA są podobne. Maksimum pochłaniania występuje przy długości fali 260 nm. Metoda ta polega na pomiarze absorbancji punktowo przy 260, 280 i 320 nm lub wykonaniu pomiar widma w zakresie nm. Pomiary prowadzi się w kwarcowych kuwetach wymagających 100 µl roztworu lub przy użyciu specjalnych czytników, wymagających jedynie 1 2 µl roztworu. Absorbancja przy 260 nm = 1,000: dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50 µg/ml; dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33 µg/ml; dla RNA o stężeniu 40 µg/ml. Wartość absorbancji przy 320 nm należy odjąć od absorbancji przy 260 nm w celu korekcji rozproszenia światła. Na pomiar stężenia DNA czy RNA mają wpływ inne substancje, dlatego niekiedy zaleca się wykonanie odczytu przy kilku długościach fali. Przy 280 nm maksimum absorbancji wykazują zanieczyszczające izolat białka. Stężenie dwuniciowego DNA oblicza się ze wzoru: C( g / ml) ( A260 A280) 50 23

8 Długość fali (nm) Substancje absorbujące 230 EDTA, polisacharydy, etanol 260 DNA, RNA 280 Białka 320 Drobiny komórkowe (zanieczyszczenia mechaniczne) Dla oceny stopnia czystości preparatów DNA stosuje się oznaczenie stosunku A 260 /A 280. Gdy stosunek absorbancji A 260 /A 280 wynosi 1,8-2,0 - to preparaty są dobrze oczyszczone, jeśli jednak A 260 /A 280 =1,5 świadczy to, że preparat zawiera 50% białek i 50% RNA lub DNA. Metoda elektroforetyczna Metoda elektroforetyczna jest rzadziej stosowana, ale w odróżnieniu od pomiaru w UV pozwala także ocenić jakość preparatu. Polega ona na porównaniu podczas elektroforezy w żelu agarozowym preparatu badanego z preparatem o znanym stężeniu. Jest to metoda z wyboru w przypadku niewielkiej ilości preparatu, ponieważ po analizie można wyciąć kawałek agarozy i wyekstrahować z niego DNA. Po elektroforezie i wybarwieniu bromkiem etydyny żel ocenia się w transiluminatorze. Prawidłowo wyizolowany DNA w porównaniu z markerem wielkości widoczny jest w postaci zwartego prążka o wielkości około 50 kb, bez widocznych smug. Obecność smug oznacza degradację DNA. Metody rozdziału i barwienia DNA Podstawową techniką służącą do rozdziału, analizy i oczyszczania kwasów nukleinowych jest elektroforeza. DNA i RNA posiadają ujemny ładunek, spowodowany obecnością reszt fosforanowych. Dlatego też w polu elektrycznym przesuwają się w kierunku anody, czyli elektrody dodatniej. Szybkość wędrowania cząsteczek w polu elektrycznym zależy od ich wielkości i kształtu. Minimalna ilość DNA, która jest widoczna w kształcie prążków po wybarwieniu bromkiem etydyny to kilka nanogramów. 24

9 W żelu agarozowym ruchliwość elektroforetyczna DNA jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy cząsteczkowej, wyrażonej w daltonach (Da) lub tysiącach par zasad (kb). Wielkość fragmentu można obliczyć, stosując wzorcowe fragmenty DNA o znanej wielkości. Następnie wykreśla się wykres zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy od logarytmu masy cząsteczkowej. Elektroforezę kwasów nukleinowych przeprowadza się w żelach (agarozowym lub poliakrylamidowym) natywnych lub denaturujących. Żel agarozowy wykorzystuje się do rozdziału DNA o wielkości od około 200 pz (par zasad). Krótsze fragmenty DNA lepiej rozdzielają się w żelu poliakrylamidowym. Szybkość migracji (ruchliwość elektroforetyczna) cząsteczek DNA w żelu agarozowym/poliakrylamidowym zależy od: masy cząsteczkowej DNA; ruchliwość elektroforetyczna jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego liczby par zasad, struktury (konformacji) DNA forma liniowa wędruje najwolniej, forma kolista, zamknięta najszybciej, stężenia agarozy/poliakrylamidu wzrost stężenia zwalania migrację, natężenia pola elektrycznego, temperatury (standardowo jest to temperatura pokojowa), składu i siły jonowej buforu. 1. Elektroforeza na żelu agarozowym Żele agarozowe pozwalają na stosunkowo szybki rozdział produktów reakcji PCR, co w połączeniu z jednoetapowym barwieniem stanowi o popularności tej metody. Zdolność rozdzielcza żelu zależy od wielkości oczek (porów) sita w żelu, których rozmiary można kształtować przez zmianę stężenia agarozy. Do prowadzenia rozdziałów stosuje się żele o stężeniach od 0,5% do 2%. Krótsze produkty rozdziela się przy użyciu bardziej stężonych żeli, natomiast dla dłuższych produktów stosuje się żele o mniejszych stężeniach. Wadą żeli agarozowych jest brak możliwości ich wysuszenia i zarchiwizowania, oraz w stosunku do żeli poliakrylamidowych gorsza zdolność rozdzielcza. 2. Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych Żele poliakrylamidowe są trudniejsze w obróbce i barwieniu od żeli agarozowych, ale ze względu na lepsze właściwości rozdzielcze ich zastosowanie jest często konieczne. Żele te otrzymuje się przez polimeryzację akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań 25

10 poprzecznych przez dodanie bis-akrylamidu. Do reakcji polimeryzacji konieczna jest obecność katalizatora (nadsiarczan amonowy lub potasowy), oraz związku inicjującego reakcję (TEMED N,N,N,N - tetrametyloetylenodiamina). W zależności od potrzeb, stosuje się żele poliakrylamidowe o stężeniach 3 20%. Żel poliakrylamidowy używany jest także do rozdziału jednoniciowego DNA, np. przy sekwencjonowaniu. 3. Żele denaturujące Ruchliwość elektroforetyczna w żelu, w trakcie elektroforezy jednoniciowych cząsteczek, zależy nie tylko od wielkości i ładunku cząsteczek, ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej. Aby dokładnie określić wielkość cząsteczek, należy wyeliminować różnice migracji wywołane ich różną konformacją. Szczególnie jest to ważne w przypadku elektroforezy jednoniciowego RNA, który tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. Czynnikami denaturującymi kwasy nukleinowe w żelach denaturujących są najczęściej: mocznik, formaldehyd, chlorowodorek guanidyny lub gradient temperatury. Czynniki te zapobiegają tworzeniu par przez zasady azotowe. Żele tego typu wykorzystywane są w technice PCR-DGGE, PCR-TGGE oraz sekwencjonowaniu (patrz: Przesiewowe techniki identyfikacji zmian sekwencji nukleotydów). Barwienie żeli Po rozdziale elektroforetycznym konieczne jest wybarwienie żelu, aby uwidocznić kwasy nukleinowe. Barwienie to przeprowadza się kilkoma metodami różniącymi się czułością i specyfiką zastosowania. Pierwszą z metod jest barwienie substancjami mającymi powinowactwo do kwasów nukleinowych i wykazującymi fluorescencję w zakresie światła widzialnego. Najpopularniejszym barwnikiem jest bromek etydyny, który łatwo interkaluje w cząsteczkę kwasów nukleinowych, a fluorescencja kompleksu bromek etydyny DNA jest dziesięć razy większa niż wolnego bromku. Bromek etydyny dodaje się bezpośrednio do żelu lub wybarwia się żel barwnikiem po ukończeniu elektroforezy. Bromek etydyny wykrywa kilka nanogramów DNA. Wbudowuje się znacznie wydajniej w dwuniciowy niż jednoniciowy DNA. Wybarwiony żel przenosi się na podświetlarkę UV (długość fali wzbudzenia około 300 nm). Kompleks bromek etydyny DNA posiada maksimum emisji w paśmie światła czerwonego o długości fali 590 nm. Barwienie srebrem jest czulsze i umożliwia wykrycie 1-10 pg DNA na 1 mm 2. Jest to technika fotochemiczna podobna do reakcji wykorzystywanych w fotografii. Do barwienia 26

11 stosuje się azotan srebra. Metaliczne srebro wiąże się z DNA tworząc nierozpuszczalne sole. Istotnym etapem jest bardzo dokładne odpłukanie niezwiązanych związków srebra. Następne etapy polegają na redukcji soli srebra formaldehydem lub tiosiarczanem sodu. Zredukowane srebro ma kolor brązowy i DNA widoczny jest w postaci brązowych prążków. Z tak wybarwionego żelu można ekstrahować DNA do dalszych analiz (np. sekwencjonowania), nawet po dłuższym przechowywaniu. Wadą metody jest duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne. Metodę srebrzenia wykorzystuje się głównie dla żelu poliakrylamidowego, ponieważ w przypadku żelu agarozowego czułość jest znacznie niższa. Do najczulszych metod detekcji kwasów nukleinowych należą metody wykorzystujące znakowanie radioizotopem lub znacznikiem fluorescencyjnym. Metody amplifikacji DNA Technika PCR (ang. polymerase chain reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy Ta rewolucyjna technika naśladuje zjawisko replikacji DNA i polega na enzymatycznej amplifikacji wybranych fragmentów DNA, za pomocą termostabilnej polimerazy. Zespół enzymów, które in vivo przygotowywują matrycę do replikacji DNA, zostaje zastąpiony termiczną denaturacją DNA, natomiast działanie primosomu i synteza starterów są zastąpione syntetycznym oligonukleotydem (18-25 nukleotydowym) komplementarnym do 3 -końca wybranego regionu matrycy. Reakcję PCR przeprowadza się w probówkach umieszczonych w termocyklerach. Po powieleniu DNA może być poddany elektroforezie, analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji lub sekwencjonowaniu. Metoda PCR: Służy do powielenia materiału genetycznego o wielkości do 2 kb (kilopar zasad), a czasem większych fragmentów, metodą enzymatyczną z pikogramowych ilości DNA. Umożliwia amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA lub RNA uprzednio przepisanego na cdna. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana do amplifikacji bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie, ale pod warunkiem, że znana jest sekwencja otaczająca powielany fragment. 27

12 Zaletą PCR jest możliwość wykorzystania do reakcji DNA w znacznym stopniu zdegradowanego, jeśli degradacja ta nie dotyczy amplifikowanej sekwencji. Przebieg reakcji PCR Mieszanina reakcyjna musi zawierać: wyizolowany DNA jako matrycę dla polimerazy, cztery rodzaje dntp (trifosforany deoksynukleotydów) jako substraty i dostarczyciele energii do reakcji, dwa primery (startery) syntetyczne oligonukleotydy o długości około 20 nukleotydów komplementarne do 3 - końców obu nici DNA, termostabilną polimerazę DNA, bufor reakcyjny. Metoda PCR polega na cyklicznym powtarzaniu denaturacji termicznej dwuniciowej cząsteczki DNA, przyłączaniu starterów do jednoniciowej matrycy DNA podczas obniżania temperatury i syntezie nowej nici pomiędzy tymi starterami przy udziale termostabilnej polimerazy DNA. Całą reakcje można podzielić na etapy: 1. DENATURACJA termiczna DNA w temperaturze C, obie nici kwasu nukleinowego są rozdzielane. 2. HYBRYDYZACJA polega na obniżeniu temperatury do C, co powoduje przyłączenie się primerów do komplementarnych odcinków DNA wyznaczając fragment, który ma być powielany. Startery dodawane są w dużym nadmiarze molowym w stosunku do zdenaturowanego DNA. Temperatura przyłączania starterów jest uzależniona od ich długości oraz rodzaju zasad wchodzących w ich skład. 3. ELONGACJA synteza nowej nici odbywa się w temperaturze 72 C przy udziale termostabilnej polimerazy DNA, np. Taq (polimeraza izolowana z bakterii Thermus aquaticus). 28

13 Denaturacja wstępna o C 7 10 min. Denaturacja o C 1 min. Hybrydyzacja o C 1 min. Elongacja 72 o C 1 min. Elongacja końcowa 72 o C 10 min. POWTARZANE RAZY Rysunek 4.1. Warunki termiczne prowadzenia reakcji PCR. Całość mieszaniny jest podgrzewana w celu denaturacji powstałych produktów, czyli ponownie wchodzi w pierwszy etap. Powtórzenie całego cyklu krotnie pozwala otrzymać powielony fragment DNA w ilości łatwej do identyfikacji metodą elektroforetyczną. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji między primerami rośnie wykładniczo i można ją opisać jak [(2 n -2n) x] (gdzie: n - liczba cykli; x - początkowa liczba kopii; 2n - produkty pierwszo- i drugorzędowego wydłużania primerów o nieokreślonej długości). 29

14 dwuniciowe DNA denaturacja CYKL 1 przyłączenie starterów i amplifikacja produkty 1 cyklu PCR denaturacja, przyłączenie starterów i amplifikacja CYKL 2 produkty 2 cyklu PCR CYKL 3 produkty 3 cyklu PCR Rysunek 4.2. Przebieg reakcji PCR. Dla cykli 2 i 3 pominięto poszczególne etapy reakcji. Startery reakcji zaznaczono kolorami zielonym i czerwonym. Techniki analizy kwasów nukleinowych Stosowane techniki analizy kwasów nukleinowych można podzielić na dwie grupy, w zależności od zastosowania do wykrywania określonych (znanych) lub nieokreślonych (nieznanych) mutacji. Do metod służących do wykrywania znanych mutacji należą: PCR (ang. polymerase chain reaction) PCR-RFLP (ang. PCR restriction fragment length polymorphism) LCR (ang. ligase chain reaction) PCR-ASA (ang. PCR allele specific amplification) 30

15 Metody przesiewowe służą do poszukiwania zmian w sekwencji DNA pozwalające zwykle tylko stwierdzić fakt wystąpienia mutacji, ale nie na czym ona polega. Zidentyfikowane próbki poddaje się sekwencjonowaniu celem ustalenia miejsca i rodzaju mutacji. Do metod przesiewowych zaliczamy: PCR-SSCP (ang. PCR single strand conformation polymorphism) PCR-DGGE (ang. PCR denaturating gradient gel electrophoresis) PCR-TGGE (ang. PCR temperature gradient gel electrophoresis) Metodą, która może służyć zarówno do wykrywania znanych i nieznanych mutacji jest sekwencjonowanie. Jest to najkosztowniejsza metoda, jednak z biegiem czasu będzie ona coraz tańsza i szerzej stosowana w diagnostyce. PCR-RFLP W technice tej produkt klasycznej reakcji PCR poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. Technika ta jest dokładnie opisana w rozdziale Metody molekularne w diagnostyce. LCR Techniką PCR nie można wykrywać mutacji punktowych. Jedną z metod, jakie do tego służą jest ligazowa reakcja łańcuchowa LCR. W metodzie tej stosuje się dwa dłuższe primery, które obejmują badany region, ale po hybrydyzacji do DNA nie ma między nimi żadnej przerwy. Podobnie jak PCR jest to reakcja cykliczna, ale nie ma etapu wydłużania starterów z udziałem polimerazy DNA, lecz łączenie ich za pomocą termostabilnej ligazy. Łączenie obu primerów przez ligazę ma miejsce jedynie, gdy prawidłowo zhybrydyzują z matrycą DNA. W przypadku mutacji w sekwencji matrycowej primery nie przyłączą się prawidłowo do DNA i nie ulegną połączeniu przez enzym. Metodę LCR i jej modyfikacje stosuje się w diagnostyce do wykrywania mutacji punktowych. Niesparowane zasady w miejscu mutacji uniemożliwiają przebieg reakcji LCR nie powstaje wówczas produkt reakcji. PCR-ASA Metoda PCR-ASA amplifikacji specyficznych alleli polega na wykonaniu tylu reakcji PCR, ile znamy odmian polimorficznych danego regionu genu. Wszystkie reakcje mają jeden starter wspólny (identyczny) natomiast każdy z pozostałych starterów jest komplementarny tylko do jednej z sekwencji polimorficznych. Wykrycie produktu reakcji tylko w jednym przypadku oznacza, że osoba badana jest homozygotą posiadającą wykrytą odmianę 31

16 polimorficzną w obu allelach. Wykrycie produktów w dwóch reakcjach świadczy o heterozygotyczności pod względem badanego genu. PCR-SSCP PCR-SSCP analiza polimorfizmu jednoniciowych fragmentów umożliwia wykrycie nieznanych mutacji. Analizę prowadzi się na produktach reakcji PCR, które przed elektroforezą denaturuje się termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem formamidu. Następnie jednoniciowe fragmenty DNA rozdziela się w natywnym żelu poliakrylamidowym. Podczas elektroforezy przyjmują one strukturę II i III rzędową zależną od ich sekwencji nukleotydowej. Nawet pojedyncze zmiany nukleotydów mogą odbić się na konformacji cząsteczki, a tym samym zmienić prędkość migracji w żelu. PCR-DGGE i PCR-TGGE PCR-DGGE analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika denaturującego. Powielone techniką PCR fragmenty DNA które są dwuniciowe nanosi się na żel poliakrylamidowy, w którym utworzony jest rosnący gradient czynnika denaturującego (mocznik, formamid dla DGGE lub temperatura dla TGGE). Fragment DNA, migrując w żelu natrafia na takie stężenie czynnika denaturującego, które powoduje dysocjację podwójnej nici na pojedyncze. W rezultacie, w obrazie elektroforetycznym jednakowe produkty PCR ulegają denaturacji w tych samych warunkach, a otrzymanie różnych prążków świadczy o zmianie w sekwencji DNA. Metoda ta umożliwia wykrycie nieznanych mutacji. RT-PCR RT-PCR (ang. reverse transcription PCR) technika połączona z odwrotną transkrypcją. Technika ta pozwala na analizę ekspresji genów oraz wykrywanie patogenów, których materiałem genetycznym jest RNA (np. wirusy HCV i HIV). Informacja z RNA zostaje przepisana na DNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Na matrycy RNA syntetyzowany jest komplementarny DNA tzw. cdna. Następnie amplifikuje się cdna za pomocą typowej reakcji PCR. Dla wykrycia mutacji analiza transkryptów ograniczona jest do tkanki, w której dany gen ulega ekspresji. Real Time PCR Techniki Real Time PCR PCR w czasie rzeczywistym, nie należy mylić z wcześniej omówiona metodą RT-PCR. W Real Time PCR wykorzystuje się specjalne urządzenia, pozwalające po każdym cyklu reakcji PCR zmierzyć fluorescencję próbki. 32

17 F W 5 F W Rysunek 4.3. Przebieg reakcji Real Time PCR. Podczas reakcji sonda posiadająca fluorochrom (F) i wyciszacz (W), komplementarnie przyłączona do badanej sekwencji jest degradowana. Uwolniony barwnik fluorescencyjny po wzbudzeniu emituje światło. W porównaniu z klasyczną reakcją PCR mieszanina reakcyjna zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową, komplementarną do badanej sekwencji i przyłączającą się pomiędzy starterami reakcji. Sonda posiada na jednym z końców przyłączony barwnik fluorescencyjny, na drugim końcu wyciszacz związek wygaszający fluorescencję barwnika. Podczas amplifikacji polimeraza DNA, posiadająca aktywność 5 -egzonukleazową degraduje sondę, uwalniając barwnik fluorescencyjny. Po każdym cyklu amplifikacji następuje pomiar fluorescencji, która jest proporcjonalna do ilości zdegradowanej sondy i powstałego produktu PCR. Szczególną zaletą metody Real Time PCR jest uzyskanie wyników, bez potrzeby rozdziału produktów PCR na żelu i jego barwienia. Metoda ta pozwala na określenie ilości kopii badanego fragmentu DNA, co jest niezwykle przydatne w diagnostyce mikrobiologicznej i wirusologicznej. Pozwala wówczas określić nie tylko obecność patogenów, ale również ich ilość. Możliwa jest również analiza ekspresji genów na poziomie mrna, po przepisaniu, przy użyciu odwrotnej transkryptazy na cdna. Pozwala to na porównanie ekspresji genów w różnych tkankach lub we fragmentach tej samej tkanki: zdrowym i objętym procesem nowotworzenia. 33

18 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 Izolowanie DNA z krwi pełnej za pomocą zestawu Master Pure DNA Purification Kit ODCZYNNIKI Zestaw Master Pure DNA Purification Kit Zestaw przeznaczony jest do izolowania dwuniciowego DNA ze świeżej lub zamrożonej krwi, z hodowli komórkowych, z różnych tkanek (ssaków lub roślin), bakterii Gramdodatnich i Gram-ujemnych. Czas izolowania wynosi około 60 minut. Metoda ta nie wymaga ekstrakcji chloroformem, fenolem ani trawienia proteinazami. Podstawą izolowania jest prowadzona etapami liza komórek, odbiałczanie a następnie selektywne wytrącenie DNA izopropanolem. W końcowym etapie DNA jest przemywany etanolem. DNA otrzymany tą metodą, może być używany we wszystkich technikach biologii molekularnej (PCR, trawienie restrykcyjne, klonowanie, analiza Southerna, sekwencjonowanie DNA itp.). Przygotowanie próbek 1. Krew Pobrana na EDTA lub cytrynian. DNA izolowane z krwi heparynizowanej nie może być użyte do PCR. Typowo używa się 200 l świeżej krwi. Jeżeli konieczna jest większa ilość DNA, to należy podwoić ilość krwi oraz wszystkich odczynników. Krew może być przechowywana w temp. 2-4 C nie dłużej niż 2 miesiące. W celu dłuższego przechowywania próbki powinny być rozdzielone na porcje po 200 l i umieszczone w temp. -20 C. 2. Surowica Polecane jest używanie surowicy świeżej. Gdy jest to niemożliwe, można zamrozić roztwór i przechowywać w temp. 20 C. 3. Hodowla komórkowa Komórki z hodowli należy odwirować i zawiesić w 200 l buforu TE. Dla skutecznej preparacji DNA zaleca się użycie około 10 6 komórek. Nie jest polecane stosowanie próbek wysuszonych. 4. Komórki nabłonka 34

19 Komórki nabłonka zebrać przez odwirowanie (5000 obr/min, 3 min), supernatant usunąć, osad komórek zawiesić w 200 l buforu TE. 5. Tkanki 1-5 mg tkanki ssaków (świeże lub zamrożone w temp. -70 C) bądź roślin (sproszkować w ciekłym azocie; proszek umieścić w probówce i zawiesić w 200 l buforu TE). 6. Hodowle bakteryjne Hodowlę bakterii odwirować przez 10 min przy 7500 obr/min mg hodowli bakterii (świeże lub zamrożone temp. -20 C) przenieść do probówek i zawiesić w 200 l buforu TE. Uwaga! Kilkukrotne zamrażanie i odmrażanie próbek nie jest wskazanie, ponieważ istotnie obniża wydajność izolacji DNA WYKONANIE 1. Do probówki zawierającej 200 l krwi dodać 600 l odczynnika Red Cell Lysis Solution, aby dokonać lizy erytrocytów. Wymieszać zawartość przez 3-krotne odwrócenie probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawartość ponownie wymieszać i inkubować przez kolejne 5 minut. 2. Wymieszać zawartość probówki, wirować przez 45 sekund przy obr/min. Usunąć pipetą automatyczną supernatant, pozostawiając na dnie osad leukocytów (około 25 l płynu). 3. Do osadu leukocytów dodać 300 l odczynnika Tissue and Cell Lysis Solution aby dokonać lizy pozostałych komórek. Dokładnie wymieszać zawartość przez kilkukrotne przepipetowanie zawartości. 4. Dodać 150 l odczynnika Protein Precipitation Reagent, mieszać energicznie przez 10 sekund i wirować 10 minut przy obr/min. 5. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać do niego 500 l izopropanolu. Wymieszać zawartość poprzez krotne odwrócenie probówki (powinna być widoczna cienka, poskręcana, biała nić DNA). 6. Odwirować zawartość probówki przez 10 minut przy obr/min. Na dnie powinna być widoczna biała plamka DNA. Zlać supernatant przez delikatne odwrócenie probówki, nie naruszając osadu. 35

20 7. Przepłukać dwukrotnie osad DNA używając każdorazowo 1 ml 75% etanolu, nie naruszyć osadu, nie wirować. Resztki etanolu usunąć pipetą. 8. Do osadu DNA dodać 35 l buforu TE. Probówkę pozostawić na 24 godziny celem rozpuszczenia i renaturacji DNA. 9. Oznaczyć stężenie i czystość DNA w próbce za pomocą aparatu GeneQuant. 36

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

PCR. Aleksandra Sałagacka

PCR. Aleksandra Sałagacka PCR Aleksandra Sałagacka Reakcja PCR naśladuje proces replikacji DNA in vitro pozwala na amplifikację określonego krótkiego (kilkadziesiąt kilka tys.pz) fragmentu DNA obecnie najważniejsze narzędzie biologii

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 100 ml, 250 ml, 500 ml Nr kat. 038-100, 038-250, 038-500 Nietosyczny roztwór wodny do przechowywania i zabezpieczania różnego rodzaju tkanek

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu Protokół pochodzi ze strony molekularnie.wordpress.com Kopiowanie i rozpowszechnianie wyłącznie w całości, z zachowaniem praw autorskich zgodnie z zasadami licencji GNU Dziękuję za uszanowanie mojej pracy,

Bardziej szczegółowo

AmpliTest TBEV (Real Time PCR)

AmpliTest TBEV (Real Time PCR) AmpliTest TBEV (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla TBEV (Tick-borne encephalitis virus) techniką Real Time PCR Nr kat.: RV03-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR

Biochemia: Ćw. 11 Metoda RT-PCR Ćwiczenie 11 METODA RT-PCR Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: bromek etydyny T+ EDTA Xi etanol, 96% F kwas octowy, 96% C -merkaptoetanol N, T Tris Xi UWAGI WSTĘPNE Praca z kwasami

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Specyfikacja zestawu 2 2.3

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9 Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 9 Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready metodą PCR M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Bardziej szczegółowo

Znaczenie genetyki. Opracował A. Podgórski

Znaczenie genetyki. Opracował A. Podgórski Znaczenie genetyki Opracował A. Podgórski InŜynieria genetyczna InŜynieria genetyczna ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Istota inŝynierii genetycznej

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA.

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SPIS TREŚCI: 1. Wprowadzenie. 2. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. 3. Karty pracy. 1. Karta

Bardziej szczegółowo

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp Określenie próbka biologiczna jest

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

Nanotechnologie w diagnostyce

Nanotechnologie w diagnostyce Nanotechnologie w diagnostyce Diagnostyka endoskopowa Nanotechnologie mogą być przydatne w diagnostyce niedostępnych miejsc w badaniach endoskopowych. Temu mogą służyć mikrokamery wielkości antybiotyku,

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu DNA) Jest to reakcja powielania (replikacji)

Bardziej szczegółowo

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Strona 1 z 7 Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Sosnowiec: Sukcesywna dostawa odczynników dla Instytutu Medycyny

Bardziej szczegółowo

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!) Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ======================================================== Ćwiczenie 2

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII ĆWICZENIA Z BIOCHEMII D U STUDENTfiW WYDZIAŁU LEKARSKIEGO Pod redakcją Piotra Laidlera, Barbary Piekarskiej, Marii Wróbel WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO ĆWICZENIA Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW WYDZIAŁU

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS Zagadnienia teoretyczne. Spektrofotometria jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące

Bardziej szczegółowo

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Metody amplifikacji kwasów nukleinowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej pj j w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Amplifikacja

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Załącznik nr 1 do SIWZ Nazwa i adres Wykonawcy Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Przedmiot zamówienia; automatyczny system do diagnostyki molekularnej:

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO

ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO CZĘŚĆ TEORETYCZNA Metody badań i cechy w oparciu o które przeprowadzana jest klasyfikacja i identyfikacja mikroorganizmówh Struktura

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu: 1.2012 www.dnagdansk.com Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego Przykładowe zadania z BIOLOGii przygotowujące do egzaminu maturalnego Prezentowane zadania są zgodne z podstawą programową kształcenia ogólnego w zakresie rozszerzonym i podstawowym. Prócz zadań, które

Bardziej szczegółowo

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało Mariusz Kaczmarek Antygeny Immunogenność - zdolność do wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej; Antygenowość - zdolność do reagowania

Bardziej szczegółowo

TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS

TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS Nowiny Lekarskie 2006, 75, 5, 486 490 ALINA LICZBAŃSKA, ANNA WOŹNIAK, ANNA WAWROCKA, MACIEJ R. KRAWCZYŃSKI TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR

Bardziej szczegółowo

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Dr Anna Linkiewicz Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB LAB-GMO Maj 2015

Dr Anna Linkiewicz Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB LAB-GMO Maj 2015 Genetycznie modyfikowana żywność i pasze Streszczenie zajęć Blisko 50 różnych GMO jest dopuszczonych do stosowania w Unii Europejskiej jako żywność lub pasza. Podczas zajęć wyizolowane zostanie DNA z produktów

Bardziej szczegółowo

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof.

Bardziej szczegółowo

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 20 izolacji Nr kat. 052-20M tel: +48 58 7351194, fax: +48 58 6228578 info@aabiot.com www.aabiot.com 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR ME Mini Kit Zestawy do oczyszczania DNA: - z żelu agarozowego - po reakcji PCR i innych reakcjach enzymatycznych - z żelu agarozowego z małą objętością elucji - po

Bardziej szczegółowo

Diagnostyka molekularna w OIT

Diagnostyka molekularna w OIT Diagnostyka molekularna w OIT B A R B A R A A D A M I K K A T E D R A I K L I N I K A A N E S T E Z J O L O G I I I I N T E N S Y W N E J T E R A P I I U N I W E R S Y T E T M E D Y C Z N Y W E W R O C

Bardziej szczegółowo

Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie. Pracownia genetyki

Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie. Pracownia genetyki Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie Zadbaliśmy o to, żeby wyposażenie w Klubie Młodego Wynalazcy było w pełni profesjonalne. Ważne jest, aby dzieci i młodzież, wykonując doświadczenia korzystały

Bardziej szczegółowo

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Wk Wykrywanie polimorfizmów i mutacji Badania przesiewowe mutacji Wykrywanie znanych mutacji punktowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej

Bardziej szczegółowo

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ Puławy 2013 Opracowanie: Prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, mgr inż. Kinga Urbaniak,

Bardziej szczegółowo

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. 1 Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i

Bardziej szczegółowo

Biotechnologia i inżynieria genetyczna

Biotechnologia i inżynieria genetyczna Wersja A Test podsumowujący rozdział II i inżynieria genetyczna..................................... Imię i nazwisko.............................. Data Klasa oniższy test składa się z 16 zadań. rzy każdym

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Klasyczna Analiza Jakościowa Organiczna, Ćw. 4 - Identyfikacja wybranych cukrów Ćwiczenie 4 Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Zagadnienia teoretyczne: 1. Budowa

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 4. Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu

ĆWICZENIE 4. Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu ĆWICZENIE 4 Oczyszczanie ścieków ze związków fosforu 1. Wprowadzenie Zbyt wysokie stężenia fosforu w wodach powierzchniowych stojących, spiętrzonych lub wolno płynących prowadzą do zwiększonego przyrostu

Bardziej szczegółowo

Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH

Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH 1. Rodzaj materiału klinicznego w zależności od kierunku i metodyki badań wykonywanych przez PZH Poz. Badanie Rodzaj

Bardziej szczegółowo

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab CZĄSTECZKA I RÓWNANIE REKCJI CHEMICZNEJ potrafi powiedzieć co to jest: wiązanie chemiczne, wiązanie jonowe, wiązanie

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Aparatura

Spis treści. Aparatura Spis treści Aparatura I. Podstawowe wyposażenie laboratoryjne... 13 I.I. Probówki i naczynia laboratoryjne... 13 I.II. Pipety... 17 I.II.I. Rodzaje pipet automatycznych... 17 I.II.II. Techniki pipetowania...

Bardziej szczegółowo

Kurs pt. " MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII "

Kurs pt.  MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII Warszawa, 6 lutego 2011 r. Szanowna Pani! Szanowny Panie! Niniejszym uprzejmie informuję, że organizowany jest Kurs pt. " MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII " Kurs odbędzie się w dniach

Bardziej szczegółowo

DNA musi współdziałać z białkami!

DNA musi współdziałać z białkami! DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji

Bardziej szczegółowo

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA

2015-11-18. DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA Fosfataza alkaliczna CIP Calf Intestine Phosphatase- pochodzenie: jelito cielęce BAP Bacterial Alcaline Phosphatase- pochodzenie: E. coli SAP Shrimp Alcaline Phosphatase- pochodzenie: krewetki Pandalus

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Salmonella species

Ampli-LAMP Salmonella species Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.

ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym,

Bardziej szczegółowo

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. Załącznik 4a Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. NAZWA WIELKOŚC OPAKOWANIA JEDNOSTK OWA VAT % RAZEM WARTOŚĆ 1 2 3 4 5 6 7 8=4*7 9 10 11 1. Zestaw do izolacji DNA - zestaw służący do izolacji

Bardziej szczegółowo

4. DNA podporządkowany człowiekowi manipulacje DNA

4. DNA podporządkowany człowiekowi manipulacje DNA . DN podporządkowany człowiekowi manipulacje DN Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i translacji oraz rozwój biochemii, genetyki i informatyki doprowadziły do wynalezienia metod pozwalających

Bardziej szczegółowo

Tematyka zajęć z biologii

Tematyka zajęć z biologii Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania

Bardziej szczegółowo

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. Załącznik 4a Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. NAZWA WIELKOŚC OPAKNIA RAZEM WARTOŚĆ 1 2 3 4 5 6 7 8=4*7 9 10 11 1. Zestaw do izolacji DNA - zestaw służący do izolacji DNA z surowego materiału

Bardziej szczegółowo

Syngen Viral Mini Kit. Syngen Viral

Syngen Viral Mini Kit. Syngen Viral Syngen Viral Mini Kit Syngen Viral Mini Kit PLUS Zestawy do izolacji materiału genetycznego wirusów (DNA i RNA) z próbek: - osocza - surowicy - płynów ustrojowych pozbawionych komórek - pożywki znad hodowli

Bardziej szczegółowo

PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT

PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT PRZYKŁADOWE ZADANIA ORGANICZNE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE AZOT Zadanie 1127 (1 pkt) Uszereguj podane związki według rosnącego ph w roztworze wodnym. Właściwy porządek podaj zapisując go wzorami półstrukturalnymi.

Bardziej szczegółowo

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624 Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008

Bardziej szczegółowo

Wirus HPV w ciąży. 1. Co to jest HPV?

Wirus HPV w ciąży. 1. Co to jest HPV? Wirus HPV w ciąży Czy zdajesz sobie sprawę z tego, że rak szyjki macicy jest drugą, najczęstszą chorobą nowotworową u kobiet na świecie a piąta wśród kobiet i mężczyzn łącznie? W samej Polsce, jak donosi

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału

Bardziej szczegółowo

Spis treści. spis treści. 2 syngen.pl. Polimerazy PCR i real-time PCR

Spis treści. spis treści. 2 syngen.pl. Polimerazy PCR i real-time PCR spis treści Spis treści Polimerazy PCR i real-time PCR 6 Klasyczny PCR Hot Start PCR Real-time PCR i analiza HRM Polimerazy specjalne (long range, proofreading) 6 8 10 13 Odwrotna transkrypcja 15 Izolacja

Bardziej szczegółowo

Replikacja DNA. Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Replikacja DNA. Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Replikacja DNA Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Replikacja DNA jest bardzo złożonym procesem, w którym biorą udział setki

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej.

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Wprowadzenie DNA i białka W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Białka: łańcuchy złożone z aminokwasów (kilkadziesiąt kilkadziesiąt

Bardziej szczegółowo

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System Załącznik nr 1A do SIWZ. PARAMETRY TECHNICZNE PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA Zadanie nr 1. TERMOSTAT CYRKULACYJNY Termostat cyrkulacyjny Z grzaniem i chłodzeniem Zakres temperatury roboczej 25 o C do + 200 o C

Bardziej szczegółowo

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Bardziej szczegółowo

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom

Bardziej szczegółowo

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Czas trwania lekcji: 2x 45 minut Cele lekcji: 1. Ogólny zapoznanie

Bardziej szczegółowo

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK WSTĘP Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach

Bardziej szczegółowo

Zakład Chorób Ryb. PIWet. Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy

Zakład Chorób Ryb. PIWet. Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy PIWet Zakład Chorób Ryb Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy łososiowatych o (VHS), wirusa zakaźnej a martwicy układu krwiotwórczego (IHN)

Bardziej szczegółowo

Inżynieria genetyczna i terapia genowa

Inżynieria genetyczna i terapia genowa Inżynieria genetyczna i terapia genowa Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne Pod redakcją Ilony Bednarek Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Inżynieria genetyczna i terapia genowa Autorzy Ilona

Bardziej szczegółowo

Immunologia komórkowa

Immunologia komórkowa Immunologia komórkowa ocena immunofenotypu komórek Mariusz Kaczmarek Immunofenotyp Definicja I Charakterystyczny zbiór antygenów stanowiących elementy różnych struktur komórki, związany z jej różnicowaniem,

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ WYDZIAŁ BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ dla studentów II roku biologii medycznej UMCS LUBLIN 2015 Wersja 1.0

Bardziej szczegółowo

CENNIK DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ

CENNIK DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ CENNIK DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ AZOOSPERMIA badanie wykrywa delecje w regionie długiego ramienia chromosomu Y w fragmencie zwanym AZF, będące często przyczyną azoospermii lub oligospermii o podłożu

Bardziej szczegółowo

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A...

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A... 1. Zadanie (0 2 p. ) Porównaj mitozę i mejozę, wpisując do tabeli podane określenia oraz cyfry. ta sama co w komórce macierzystej, o połowę mniejsza niż w komórce macierzystej, gamety, komórki budujące

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE I. ELEKTROFOREZA ŻELOWA BARWNIKÓW SPOŻYWCZYCH. µ = ν / E ELEKTROFOREZA

ĆWICZENIE I. ELEKTROFOREZA ŻELOWA BARWNIKÓW SPOŻYWCZYCH. µ = ν / E ELEKTROFOREZA ĆWICZENIE I. ELEKTROFOREZA ŻELOWA BARWNIKÓW SPOŻYWCZYCH ELEKTROFOREZA Elektroforeza jest ruchem fazy rozproszonej względem fazy rozpraszanej, zachodzącym pod wpływem przyłożonej zewnętrznie różnicy potencjałów

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O Test maturalny Chemia ogólna i nieorganiczna Zadanie 1. (1 pkt) Uzupełnij zdania. Pierwiastek chemiczny o liczbie atomowej 16 znajduje się w.... grupie i. okresie układu okresowego pierwiastków chemicznych,

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności

Bardziej szczegółowo

Pytania Egzamin Licencjacki. 1. Wyjaśnij pojęcie: szybkość reakcji enzymatycznej. Omów metodę wyznaczenia szybkości reakcji enzymatycznej.

Pytania Egzamin Licencjacki. 1. Wyjaśnij pojęcie: szybkość reakcji enzymatycznej. Omów metodę wyznaczenia szybkości reakcji enzymatycznej. Pytania Egzamin Licencjacki Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG i GUMed 1. Wyjaśnij pojęcie: szybkość reakcji enzymatycznej. Omów metodę wyznaczenia szybkości reakcji enzymatycznej. 2. Wyjaśnij

Bardziej szczegółowo

BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK

BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO-FAZOWYM;

Bardziej szczegółowo