Izolowanie DNA i RNA z komórek hodowlanych. Ocena jakości uzyskanego materiału

Transkrypt

1 II ROK KIERUNEK WETERYNARIA UJCM INSTRUKCJA DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH VIII Izolowanie DNA i RNA z komórek hodowlanych. Ocena jakości uzyskanego materiału 2013/2014

2 2 ĆWICZENIE VIII Preparatyka całkowitego RNA i DNA z dwu linii hodowlanych nowotworowych komórek ludzkich Wymagane przygotowanie teoretyczne : a. Struktura i właściwości cząsteczki DNA (wielkość cząsteczki, wiązania stabilizujące strukturę, widmo absorbcyjne DNA) b. Budowa cząsteczki RNA i jej funkcja biologiczna. Rodzaje cząsteczek RNA w komórkach Eucariota, ich właściwości i udział procentowy. c. Porównanie stabilności cząsteczki DNA i RNA. Enzymy hydrolizujące RNA i DNA. Hodowle komórkowe prowadzi się w specjalnym inkubatorze, w temperaturze 37 0 C, w atmosferze zawierającej 5% dwutlenek węgla. Komórki obu linii hoduje się przez 7 dni w szalkach firmy Corning, w medium hodowlanym RPMI 1640 (firmy Sigma), z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (firmy Gibco). Przed zebraniem komórki przemywa się zimnym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym o ph 7.4 (PBS). Izolacja RNA prowadzona jest zmodyfikowaną metodą Chomczyńskiego i Sacchi., która pozwala również na równoczesne wyizolowanie DNA. Preparatykę przeprowadza się za pomocą roztworu, który zawiera fenol i izotiocyjanian guanidyny, w proporcjach objętych tajemnicą producenta. Firmowa nazwa tego roztworu to TRIzol (firma Gibco). Preparatykę genomowego DNA z komórek hodowlanych, studenci przeprowadzają wykorzystując technikę izolacji DNA z zastosowaniem kolumienek NucleoSpin Tissue isolation kit (Macherey-Nagel). Lizę komórek przeprowadza się poprzez ich inkubację w roztworze SDS (detergent sól sodowa siarczanu dodecylu) zawierającym proteinazę K. (Proteinaza K jest niespecyficzną proteinazą serynową, stosowaną do izolacji genomowego DNA i RNA ponieważ szybko inaktywuje DNazy i RNazy. Posiada wysoką aktywność i nie podlega deaktywacji przez SDS.) Odpowiednie warunki konieczne do wiązania się DNA do silikonowej membrany w kolumnie NucleoSpin Tissue są tworzone poprzez dodanie chlorowodorku guanidyny i etanolu. Proces wiązania kwasów nukleinowych do kolumny jest procesem odwracalnym. W trakcie izolacji DNA ewentualne zanieczyszczenia są odmywane przy pomocy odpowiednich buforów. Czysty genomowy DNA jest wymywany z kolumny lekko alkalicznym buforem o niskiej sile jonowej. Uwaga! Szkło, probówki, końcówki pipet itp. używane w trakcie ćwiczenia są wysterylizowane w autoklawie. Ponadto, roztwory stosowane w preparatyce, zawierają inhibitory rybonukleaz i deoksyrybonukleaz. Wszystkie czynności związane z preparatyką DNA i RNA należy wykonywać w rękawiczkach! Probówki - dokładnie opisywać! Ze względu na ograniczoną ilość wirówek z chłodzeniem, wszystkie grupy studenckie, które pracują w czterech salach laboratoryjnych, powinny rozpocząć preparatykę RNA i DNA w tym samym czasie! Grupa studentów (8 osób) przeprowadza preparatykę RNA i DNA z dwu linii komórek nowotworowych NR1 i NR2. Zalecany jest następujący podział pracy wśród osób wykonujących ćwiczenie: Linie komórkowe: NR 1 NR 2 RNA DNA RNA DNA Studenci: 1 i 2 3 i 4 5 i 6 7 i 8 Studenci pracują dwójkami. Dwa zespoły dwuosobowe preparują RNA i DNA z komórek NR 1. Dwa inne zespoły przeprowadzają preparatykę RNA i DNA z linii komórek

3 3 NR 2. Wszyscy studenci, po zakończeniu preparatyki, porównują ilość i jakość kwasów nukleinowych, które wyizolowali z obu linii komórkowych. Schemat postępowania wymaganego w trakcie izolowania RNA z hodowli komórkowej przedstawia Rys. 1. Komórki (około 10 6 ), odpowiednich linii nowotworowych zostały, wcześniej zawieszone i poddane homogenizacji w 0,6ml roztworu TRIZolu. Od tego momentu studenci przeprowadzają izolację RNA: I. a) Do homogenatu komórek dodać 0,12 ml chloroformu. b) Zamknąć probówkę Eppendorfa i intensywnie, ręcznie, wytrząsać przez 15 sekund. II. a) Probówkę inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, b) Zawartość probówki odwirować w temperaturze 4 0 C, przez 15 minut, przy x g. Podczas wirowania roztwór w probówce rozdziela się na dwie fazy: górną, którą stanowi wodny roztwór RNA oraz dolną, różową, zawierającą DNA w mieszaninie chloroformu i fenolu. Pomiędzy tymi dwiema fazami znajduje się zawiesina osadu wytrąconego białka. PREPARATYKA RNA: III. a) Górną, bezbarwną fazę wodną, która zawiera RNA, przenieść do czystej probówki Eppendorfa. Roztwór przenosić ostrożnie, porcjami po 200µl (pipetą o pojemności µl), aby uniknąć zanieczyszczenia preparatu RNA białkami. Istnieje możliwość wykorzystania dolnej, różowej fazy chloroformowo-fenolowej do izolowania DNA, ale z uwagi na czasochłonność tej procedury, studenci izoluja DNA z zastosowaniem kolumienek NucleoSpin Tissue isolation kit (Macherey-Nagel)do izolacji DNA. b) Do zebranego roztworu RNA dodać 0,3 ml izopropanolu. c) Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut. IV. Osad wytrąconego RNA odwirować przez 10 minut w temperaturze 4 0 C, przy 12000xg. V. a) Nadsącz zlać delikatnie przez odwrócenie probówki i odrzucić. b) Do osadu RNA dodać 0,6 ml 75% etanolu. Osad zawiesić w roztworze, za pomocą wytrząsarki Vortex. c) Zawartość probówki odwirować, przez 5 minut, w temperaturze 4 0 C, przy 7 500xg ( obr/min). Nadsącz ostrożnie zebrać za pomocą pipety o objętości 1 ml i odrzucić. d) Osad RNA, który znajduje się na dnie probówki, podsuszyć pod próżnią, w eksykatorze z bocznym tubusem. Uwaga! Nie wolno doprowadzić do całkowitego wysuszenia preparatu RNA. VI. a) Podsuszony osad RNA rozpuścić w 40 μl wody z inhibitorami rybonukleaz, wstrząsając na Vortexie. b) Roztwór RNA inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 0 C. c) Następnie roztwór RNA umieścić w lodzie. W sposób podany poniżej, pobrać próbkę roztworu do oznaczenia stężenia RNA. Pozostałość należy oddać asystentowi prowadzącemu ćwiczenia. Preparaty RNA przechowywane będą do następnych ćwiczeń w temperaturze 80 0 C. Oznaczenie stężenia RNA 1. Roztwór wyizolowanego RNA wymieszać, za pomocą wytrząsarki, a następnie szybko odwirować ( przez 10 sekund przy maksymalnych obrotach wirówki). 2. Do czystej probówki Eppendorfa odmierzyć 996 μl wody z dietylopirowęglanem (DEP-inhibitor rybonukleazy) i wprowadzić 4 μl roztworu uzyskanego preparatu RNA. Wymieszać dokładnie za pomocą wstrząsarki.

4 4 3. Sporządzić wykres widma absorpcyjnego mieszaniny w zakresie długości fali od 240 nm do 320 nm, wobec wody zawierającej DEP, jako próby odniesienia. 4. Odczytać wartość absorbancji roztworu w długościach fal 260 nm (maksimum dla kwasów nukleinowych) i 280 nm (maksimum dla białek). 5. Obliczyć stężenie RNA w uzyskanym preparacie. Stężenie kwasu rybonukleinowego określa się wg. zależności: stężenie roztworu RNA (μg/ml) = A 260 x rozcieńczenie x μg/ml gdzie wartość 44,19 jest doświadczalnie wyznaczonym współczynnikiem A to absorbancja badanego roztworu przy długości fali 260 nm. 6. Obliczyć ilość wyizolowanego RNA. Rysunek Dla określenia czystości otrzymanego preparatu RNA obliczyć iloraz absorbancji przy długości fali 260 nm i absorbancji przy długości fali 280 nm. Dla bardzo czystego preparatu RNA wartość ilorazu A 260 /A 280 wynosi 2. Jednak, za dobrej jakości preparaty można uznać również takie, dla których wartość ilorazu jest nie niższa niż 1,7.

5 5 Preparatyka DNA Komórki (około 10 6 ) z odpowiedniej linii komórkowej nowotworu ludzkiego, zostały zawieszone i homogenizowane w 200 μl buforu T1. 1. Przygotowanie próbki. Dodać 25 μl roztworu proteinazy K i 200 μl buforu 3 do próbki z komórkami, wymieszać na Vorteksie i inkubować w 70 ºC przez minut. 2. Dodać 210 μl etanolu (96-100%) do próbki i energicznie wymieszać (vortex) Po dodaniu etanolu może pojawić precypitat. Nie będzie to mieć negatywnego wpływu na izolację DNA. Nanieś całą zawartość próbki na kolumnę. 3. Dla każdego typu komórek należy zastosować jedną kolumnę umieszczoną w plastikowej 2 ml probówce. Nałóż odpowiednią próbkę na kolumnę NucleoSpin Tissue. Próbkę wirować przez 1 minutę, w temperaturze pokojowej przy xg. Przesącz wylać z probówki. 4. Dodać 500 μl buforu BW. Próbkę wirować przez 1 minutę, w temperaturze pokojowej przy xg. Roztwór uzyskany po wirowaniu należy odrzucić, a kolumienkę ponownie umieścić w probówce. 1-sze mycie 5. Dodać 600 μl buforu B5. Próbkę wirować przez 1 minutę, w temperaturze pokojowej przy xg. Roztwór uzyskany po wirowaniu odrzucić, a kolumienkę ponownie umieścić w probówce. 2-gie mycie 6. Próbkę wirować przez 1 minutę, w temperaturze pokojowej przy xg (usuwanie z kolumny pozostałej części etanolu) Suszenie membrany

6 6 7. Umieścić kolumienkę NucleoSpin Tissue w nowej 1,5 ml probówce typu eppendorf i nałożyć na kolumienkę 50 μl podgrzanego wcześniej do temp. 70ºC (5 minut) roztworu buforu wymywającego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Następnie wirować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej przy xg. Elucja DNA z kolumny 1. Oznaczyć stężenie DNA w uzyskanym preparacie. Oznaczanie stężenia DNA 1. Do probówki Eppendorffa odmierzyć 990 μl wody z DEP i wprowadzić 10 μl roztworu wyizolowanego DNA. 2. Sporządzić wykres widma absorpcyjnego mieszaniny w zakresie długości fali od 240 nm do 320 nm, wobec wody zawierającej DEP, jako próby odniesienia. 3. Odczytać wartość absorbancji przy długości fali 260 nm. 4. Obliczyć stężenie DNA w roztworze wyizolowanego preparatu: stężenie DNA (μg/ml) = A 260 x rozcieńczenie x 53,22 μg/ml gdzie wartość 53,22 jest wyznaczonym doświadczalnie współczynnikiem, natomiast wartość A 260 jest wartością odczytanej absorbancji przy długości fali 260 nm. 5. Obliczyć ilość wyizolowanego DNA. Preparaty DNA przechowywane będą do następnych ćwiczeń w temperaturze 20 0 C.

7 7 SPRAWOZDANIE - ĆWICZENIE VIII Preparatyka DNA i RNA z ludzkich, nowotworowych komórek DATA 1. Omów najważniejsze cech (typ, wielkość, zawartość w komórce itp.) A. jądrowego DNA komórek człowieka... B. RNA (Eucariota) II. Porównanie stabilności cząsteczki DNA i RNA (wyjaśnij róznice) III. Oznaczenie stężenia RNA otrzymanego z linii komórek... Na podstawie sporządzonego wykresu absorbancji dla roztworu RNA, dołączonego do sprawozdania, a) Absorbancja przy 260 nm:...absorbancja przy 280 nm:... b) Iloraz A 260 /A c) Ocena czystości uzyskanego preparatu RNA:... d) Stężenie RNA ( g/ml) = A 260 x rozcieńczenie x 44,19 =... e) Ilość otrzymanego RNA:... f) Ilość otrzymanego RNA w 1µ wynosi... (przedstaw odpowiednie obliczenie) IV. Oznaczenie stężenia DNA otrzymanego z linii komórek... Wykres widma absorpcyjnego roztworu DNA (dołącz lub naszkicuj). a) Absorpcja przy 260 nm:... b) Stężenie DNA ( g/ml) = A 260 x rozcieńczenie x 53,22 =... c) Ilość wyizolowanego DNA:... d) Ilość otrzymanego DNA w 1µ wynosi... (przedstaw odpowiednie obliczenie) Liczba punktów Test Wykonanie SUMA: Data Podpis asystenta