PODSTAWY PODSTAWY ZMIENNOŚĆ

Transkrypt

1 PODSTAWY Populacja Próba Zmienne ilościowe - ciągłe (poziom cholesterolu) - dyskretne (l. bakterii) Zmienne jakościowe - nominalne (płeć) - porządkowe/rangi/ (zaawansowanie choroby) PODSTAWY Zmienne Zależne (niekontrolowane przez eksperymentatora - genotyp- wada; - zawartość tłuszczu- zawartość białka w mleku Niezależne (kontrolowane przez eksperymentatora) - czynniki wprowadzane podczas eksperymentu (temperatura, pokarm itp.) ZMIENNOŚĆ osobnicza środowiska, w którym bytują osobniki pomiędzy badanymi ośrodkami pomiaru oceny stanu chorobowego odpowiedzi immunologicznej czynnika Zmienność powoduje, że to co odnotowujemy może być złudne i może zabraknąć nam prawdziwych wzorców. Zmienność powoduje, że nasze wnioski zawsze będą niepewne. Zmienność powoduje, że będziemy mieć do czynienia z niepewnością. 1

2 TYPY BADAŃ Randomizacja- losowy rozdział badanych obiektów do grup porównawczych TYPY BADAŃ Przekrojowe - oszacowanie rozpowszechnienia; testy diagnostyczne Powtarzane przekrojowe - zmiany w czasie Kohortowe - etiologia, prognoza Przypadek- kontrola - etiologia- wpływ czynników Eksperyment - badania kliniczne; miara skuteczności szczepionki itp. Metoda obserwacyjna jedna z najstarszych metod badawczych do końca XIX wieku była główną metodą badawczą nauk przyrodniczych posiada cykliczny charakter (fakty kończące jeden cykl rozpoczynają następny) musi być obiektywna 2

3 Metoda obserwacyjna Obserwacja zjawisk staje się metodą badawczą w momencie, gdy: - obserwacje organizuje się świadomie i celowo, - uzyskane informacje gromadzi i interpretuje jako zjawiska oddziałujące na elementy i procesy danego systemu, - wnioski utrwala w publikacjach Metoda eksperymentalna polega na celowym wprowadzeniu do procesu poznania czynnika eksperymentalnego (zmienna niezależna) należy wyodrębnić badane zjawisko od niekontrolowanych czynników ubocznych stworzenie układu wyizolowanego stosowana przy badaniu zjawisk powtarzających się w warunkach przynajmniej częściowo takich samych Metoda eksperymentalna Eksperymenty naukowe: eksperymenty naturalne (obserwacja procesu w warunkach rzeczywistych) eksperymenty laboratoryjne (w warunkach sztucznych- swobodne manipulowanie zmiennymi biorącymi udział w badaniu) 3

4 Metoda badania dokumentów dokumenty opracowywane i przechowywane przez firmy czy instytucje dotyczą przeważnie szeroko pojętego systemu organizacyjnosprawozdawczego; obejmują zakres zadań, organizację, strukturę, efekty finansowe, realizację i sprawozdawczość z działalności odzwierciedlają rzeczywistą działalność i osiągnięcia danej jednostki Metoda badania dokumentów dokument badany - każdy przedmiot materialny (w formie dokumentu) zawierający myśli, wizje, osiągnięcia, propozycje i służący do odtworzenia rzeczywistej działalności lub stanu badanej struktury cenne źródło dotarcia do przyczyn, skutków i warunków leżących u podstaw zachowań ludzkich zaleta: możliwość analizy porównawczej Metoda indywidualnych przypadków analiza konkretnych, wyodrębnionych zdarzeń, zjawisk i osób pomocne techniki: wywiad, badanie dokumentów oraz badania środowiskowe 4

5 BŁĘDY BŁĘDY BŁĘDY systematyczny obserwatora błąd systematyczny związany z odmiennym traktowaniem pacjentów (performance bias) błąd systematyczny z diagnozowania, wypaczenie diagnostyki (detection bias) ; systematyczna różnica pomiedzy grupami w sposobie oceny punktów końcowych systematyczny uwikłania (błąd dopasowania czynników wpływających na wystąpienie ryzyka lub będących wynikiem wystąpienia choroby) systematyczny doboru (selection bias) (brak losowości i/lub reprezentatywności próby) systematyczny informacyjny (najczęściej błąd pomiaru) błąd systematyczny związany z wybiórczym raportowaniem wyników (outcome reporting bias) (publikacja tylko wyników pozytywnych lub odnoszących się do jednej wybranej grupy) 5

6 OCENA WIARYGODNOŚCI ANALITYCZNYCH BADAŃ OBSERWACYJNYCH Czy nie popełniono błędu systematycznego?: Czy badane grupy były podobne pod względem wszystkich znanych czynników determinujących stan zdrowia oprócz badanego czynnika? Czy w analizie wyników wprowadzono poprawkę na nierównowagę znanych czynników zakłócających? Czy ekspozycję i punkty końcowe oceniano w sposób obiektywny i tak samo w obu grupach? Czy badany stan kliniczny oceniano u wszystkich pacjentów, których obserwację rozpoczęto? Czy wyniki badania spełniają kryteria wnioskowania przyczynowo skutkowego? ISTOTNOŚĆ STATYSTYCZNA A ISTOTNOŚĆ KLINICZNA Analiza w podgrupach, aby dawała wiarygodne wyniki musi spełniać następujące warunki: -Podział na podgrupy jest sensowny z biologicznego punktu widzenia np. vs, lub różne podgrupy wiekowe - Analizę zaplanowano przed rozpoczęciem badania - Różnica jest istotna i klinicznie i statystycznie - Różnicę taką zaobserwowano również w innych podobnych badaniach klinicznych Diagnostyka molekularna w medycynie Monitoring populacji Testy prenatalne Czy nasze dziecko jest zdrowe? Nosicielstwo chorób Na jakie choroby narażony jest pacjent? Wykrywanie chorób Czy pacjent jest chory? Dobieranie leków Jakiego typu leki będą najlepsze? Jaki zasięg ma choroba w populacji? 18 6

7 Diagnostyka molekularna wczoraj i dziś P: hodowle patogenów - wady: dużo materiału, długie terminy, kosztowne i specyficzne podłoża - zalety: przy specyficznym podłożu specyficzna diagnoza T: testy bezpośrednie - wady: kosztowne wdrożenie - zalety: duża specyficzność (?), automatyzacja, mało materiału, łatwe w wykonaniu (na ogół) MARKERY RAPD RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA) wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów; pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości; w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter. długość około 10 nukleotydów, zawartość par G/C musi być w granicach 50-80% nie może zawierać sekwencji palindromowych* 5 CAATCGCCGT 3 RAPD PCR Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' 7

8 RAPD PCR PCR-RFLP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Trawienie specyficzną endonukleazą zastosowanie: diagnostyka PCR-RFLP wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja musi być znana* odpowiednie dobranie enzymu restrykcyjnego, rozpoznającego miejsce mutacji dowolna długość produktu PCR czułość metody: wykrywanie mutacji 100% 8

9 PCR RFLP SSCP polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA- Single Strand Conformation Polymorphism wykorzystuje zmienną ruchliwość elktroforetyczną drugorzędowej struktury DNA konformery: niestabilne fragmenty jednoniciowego DNA, szybko ulegające renaturacji aby zachować różnice w migracji konformerów elektroforeza powinna być prowadzona w warunkach natywnych PCR-SSCP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Denaturacja 90 o C; 5min 9

10 SSCP zastosowanie: wstępna analiza polimorfizmu badania przesiewowe wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja nie musi być znana długość produktu PCR nie dłuższa niż 300pz temperatura rozdziału elektroforetycznego10-20 o C dobranie odpowiednich parametrów żelu czułość metody: wykrywanie mutacji 80% różne układy konformerów A B C D różne układy konformerów AB A B DNA MIKROSATELITARNY VNTR (ang. Variable Number of Tandem Repeats) sekwencje o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń. STR (ang. Short Tandem Repeats) - krótkie tandemowe powtórzenia SSR (ang. Simple Sequence Repeats) - proste sekwencje powtarzalne znajdują się w części niekodującej (w intronach) sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się krótkimi (1-6pz) powtarzanymi motywami motyw powtarzany jest do 30 razy Cała sekwencja tworzy kompleks kilkuset par zasad 10

11 JAK WYGLĄDA MIKROSATELITA? długość powtarzanego motywu sekwencje jednonukleotydowe 5 AAAAAAAAAAAAAAAA 3 (A)n sekwencje dwunukleotydowe 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n struktura powtarzanego motywu sekwencje proste/zupełne 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n sekwencje proste przerwane 5 ACACACCTTACACAC 3 (AC)nCTT(AC)n sekwencje złożone 5 ACACACACGTGTGTGT 3 (AC)n(GT)n sekwencje złożone przerywane 5 ACACACCTTGTGTGT 3 (AC)nCTT(GT)n (AC) 3 (AC) 5 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 23 (AC) 23 (AC) 18 (AC) 25 11

12 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 24 (AC) 24 PANEL SEKWENCJI MIKROSATELITARNYCH 35 allel zerowy (ang. null allele) jest zmutowaną kopią genu, która całkowicie utraciła swoje funkcje. Rezultatem utraty funkcji jest całkowity brak białka (RNA), albo wytworzenie produktu niefunkcjonalnego. Efekt fenotypowy jest identyczny z wystąpieniem delecji. W przypadku neutralnych markerów molekularnych, allele zerowe stanowią niewykrywalne diagnostycznie formy. Wystąpienie mutacji w rejonie wiązania starterów uniemożliwia ich amplifikację W analizie zmienności genetycznej, istnienie alleli zerowych objawia się nieproporcjonalnym stosunkiem homo- do heterozygot 12

13 Populacja: zmienność genetyczna- migracje UNIKALNY PROFIL GENETYCZNY- KAŻDY OSOBNIK MA SWÓJ KOD PASKOWY PODOBNY W POŁOWIE DO KAŻDEGO Z RODZICÓW Jeden gen w dwóch kopiach Jeden gen w dwóch kopiach Pula genetyczna osobnika 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Każdy z trzech osobników posiada te same geny lecz w różnych proporcjach (osobniki są do siebie podobne) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Każdy z trzech osobników posiada identyczne geny (osobniki są w 100% identyczne)

14 Mutacje dynamicznechoroba Huntingtona (CAG) (CAG) (CAG) (CAG) Normal At risk for expansion Variable penetrance Affected ATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTTC MARKERY SNP Allelo-specyficzny PCR (Allele Specific PCR) wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP; pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w zależności od sekwencji matrycy w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane fluorescencyjnie Taqman Genotyping 14

15 DNA Barcoding DNA BARCODE acgh- array Comparative Genomic Hybridization Porównawcza hybrydyzacja genomowa metoda pozwala na detekcję różnic w ilości kopii DNA pomiędzy kontrolnym (referencyjnym) i badanym 180 tys.- 1mln punktów pomiarowych możliwa jest analiza genomu z jednej komórki pobranej z pięciodniowego blastocytu amplifikacja materiału genetycznego z jednej komórki następuje przy użyciu metody MDA (Multiple Displacement Amplification) 15

16 Badania prenatalne- PGS Preimplantation Genetic Screening Badania prenatalne- PGD Preimplantation Genetic Diagnostic Testy genetyczne mukowiscydoza anemia sierpowata rdzeniowy zanik mięśni choroba Huntingtona hemofilia Testy cytogenetyczne zespół Patau zespół Downa zespół Edwardsa zespół Klinefeltera zespoł Turnera Badania genetyczne w diagnostyce zaburzeń ze spektrum autyzmu ASDs- Autism Spectrum Disorders Test subtelomerowy 22 genów metodą MLPA Metoda ilościowa- wykrywa głównie mikrodelecje w 15, 16 i 22 chromosomie Mikromacierz (acgh), ok 180 tysięcy sond genowych, w w tym 227 skierowanych na ASD Zespół łamliwego chromosomu X (FraX) - badanie przesiewowe mutacji w genie FMR1- PCR 16

17 Diagnostyka nowotworów NGS (172 geny) Pełna analiza regionów kodujących 94 genów 284 SNP występujące w 78 genach, skorelowane metodą GWAS z wystąpieniem nowotworów 27 typów nowotworów + jaskra, choroba wieńcowa i choroba Parkinsona Diagnostyka na wszelki wypadek Predyspozycja do cellulitu (gen ACE- odpowiedzialny za regulację ciśnienia krwi) Panel sportowy (38 genów związanych z wydajnością energetyczną komórek) Panel żywieniowy (13 genów odpowiedzialnych za główne procesy metaboliczne) - nietolerancja laktozy; fruktozy; glutenu - wrażliwość na sód; kofeinę - metabolizm tłuszczy mtdna M. dom STR/SNP Profile indywidualne NIE! (+) +++ Inbred NIE! Struktura populacji Hybrydyzacja Filogenetyka

18 Przykłady hipotez ekologicznych: behawior Allel po ojcu (homozygota) Allel po matce 2 allel po ojcu (heterozygotycznym) Matka Dziecko 1 Dziecko 2 Dziecko 3 Dziecko 4 Dziecko 5 Mikrosatelity- Nowak, Krysiuk, Borowski 2007 Bariery: otwarta przestrzeń pop1 pop8 pop2 pop6 pop3 pop4 pop7 pop5 2 Bariery: bieżący ciek wodny Rzeka Biebrza: samce wiosna lewy ! wiosna prawy !! lato lewy! lato prawy!! jesień lewy jesień prawy Rzeka Biebrza: samice wiosna lewy ! wiosna prawy !! lato lewy! lato prawy!! jesień lewy jesień prawy 18

19 samiec migracje ( ) PL SK Filogeneza i filogeografia identyfikacja metapopulacji zmienność geograficzna śledzenie zmienności w czasie weryfikacja specjacji form identyfikacja hybryd 19