PCR. Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA: - RFLP - VNTR - RAPD

Transkrypt

1 Marker genetyczny- polimorficzna cecha jakościowa organizmu, którą charakteryzuje proste dziedziczenie (mendlowskie) oraz którą można dokładnie identyfikować metodami analitycznymi. Markery klasy I - Antygeny erytrocytarne - Allotypy - Białka polimorficzne - Antygeny głównego układu zgodności tkankowej- MHC Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA: - RFLP - VNTR - RAPD Markery klasy I -Są identyfikowane badaniami serologicznym. Badania serologiczne wykrywają obecność reakcji odpornościowej organizmu (przeciwciał) we krwi, w surowicy lub na powierzchni tkanek. Badanie polega na pobraniu tkanki, w której oznacza się obecność przeciwciał. Markery klasy II -Są identyfikowane metodą elektroforetyczną. Elektroforeza to proces wykorzystujący polarność cząsteczek. Cząsteczki DNA (lub białka) umieszczone w nośniku, w polu elektrycznym migrują dokatodowo (od ładunku (-) do (+)) PCR 1950 opisanie pierwszej polimerazy (Kornberg) 1960 synteza pierwszych oligonukleotydów (Khorana) 1970 odkrycie termostabilnej polimerazy Taq otrzymanie pierwszej polimerazy, która nie ma właściwości nukleazy (buduje lecz nie niszczy)- (Klenow) 1980 opracowanie reakcji PCR (1984) i rozpowszechnienie jej przydatności 1993 Nagroda Nobla Brock & Freeze,

2 MARKERY RAPD RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA) wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów; pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości; w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter. długość około 10 nukleotydów, zawartość par G/C musi być w granicach 50-80% nie może zawierać sekwencji palindromowych* 5 CAATCGCCGT 3 RAPD PCR Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' RAPD PCR starter A-11 DNA starter A-11 2

3 RAPD PCR SM Po amplifikacji z wybranym starterem otrzymujemy od kilku do kilkunastu fragmentów różnej długości dla danego osobnika (charakterystyczny wzór prążkowy) zastosowanie: diagnostyka PCR-RFLP wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja musi być znana* odpowiednie dobranie enzymu restrykcyjnego, rozpoznającego miejsce mutacji dowolna długość produktu PCR czułość metody: wykrywanie mutacji 100% PCR-RFLP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Trawienie specyficzną endonukleazą 3

4 SSCP polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA- Single Strand Conformation Polymorphism wykorzystuje zmienną ruchliwość elktroforetyczną drugorzędowej struktury DNA konformery: niestabilne fragmenty jednoniciowego DNA, szybko ulegające renaturacji aby zachować różnice w migracji konformerów elektroforeza powinna być prowadzona w warunkach natywnych PCR-SSCP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Denaturacja 90 o C; 5min SSCP zastosowanie: wstępna analiza polimorfizmu badania przesiewowe wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja nie musi być znana długość produktu PCR nie dłuższa niż 300pz temperatura rozdziału elektroforetycznego10-20 o C dobranie odpowiednich parametrów żelu czułość metody: wykrywanie mutacji 80% 4

5 różne układy konformerów A B C D różne układy konformerów AB A B DNA MIKROSATELITARNY VNTR (ang. Variable Number of Tandem Repeats) sekwencje o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń. STR (ang. Short Tandem Repeats) - krótkie tandemowe powtórzenia SSR (ang. Simple Sequence Repeats) - proste sekwencje powtarzalne znajdują się w części niekodującej (w intronach) sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się krótkimi (1-6pz) powtarzanymi motywami motyw powtarzany jest do 30 razy Cała sekwencja tworzy kompleks kilkuset par zasad JAK WYGLĄDA MIKROSATELITA? długość powtarzanego motywu sekwencje jednonukleotydowe 5 AAAAAAAAAAAAAAAA 3 (A)n sekwencje dwunukleotydowe 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n struktura powtarzanego motywu sekwencje proste/zupełne 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n sekwencje proste przerwane 5 ACACACCTTACACAC 3 (AC)nCTT(AC)n sekwencje złożone 5 ACACACACGTGTGTGT 3 (AC)n(GT)n sekwencje złożone przerywane 5 ACACACCTTGTGTGT 3 (AC)nCTT(GT)n 5

6 allel zerowy (ang. null allele) jest zmutowaną kopią genu, która całkowicie utraciła swoje funkcje. Rezultatem utraty funkcji jest całkowity brak białka (RNA), albo wytworzenie produktu niefunkcjonalnego. Efekt fenotypowy jest identyczny z wystąpieniem delecji. W przypadku neutralnych markerów molekularnych, allele zerowe stanowią niewykrywalne diagnostycznie formy. Wystąpienie mutacji w rejonie wiązania starterów uniemożliwia ich amplifikację W analizie zmienności genetycznej, istnienie alleli zerowych objawia się nieproporcjonalnym stosunkiem homo- do heterozygot MARKERY SNP Allelo-specyficzny PCR (Allele Specific PCR) wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP; pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w zależności od sekwencji matrycy w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane fluorescencyjnie Taqman Genotyping 6

7 Odczyt kolejności nukleotydów na nici DNA/RNA Metody klasyczne: - chemicznej degradacji łańcucha (1977r, met. Maxama i Gilberta) - terminacji łańcucha/met. Enzymatyczna (1977r; met. Sangera) Metody nowoczesne: - Pirosekwencjonowanie - NGS SEKWENCJONOWANIE Sekwencjonowanie Sangera 1994: H. Influenzae 1.8 Mbp (Fleischmann et al.) 2007: Global Ocean Sampling Expedition ~3,000 organisms, 7Gbp (Venter et al.) : lambda virus DNA stretches up to 30-40Kbp (Sanger et al.) 2001: H. Sapiens, D. Melanogaster 3 Gbp (Venter et al.) 20 7

8 SEKWENCJONOWANIE NASTĘPNEJ GENERACJI- NGS Losowa fragmentacja nici DNA Dołączanie odpowiednich linkerów (konstrukcja biblioteki) Amplifikacja biblioteki na podłożu szklanym lub plastikowym biosensory Wielokrotnie przeprowadzone reakcje równocześnie odczytywane przez instrument parallel processing Odczyty ilościowe Nie wymagają elektroforezy Mikromacierze Zminiaturyzowane systemy hybrydyzacyjne służące do badania ekspresji genów lub wykrywania mutacji punktowych lub miejsc metylacji Główne różnice to: 1. Sposób wykonania mikromacierzy (rodzaj podłoża) 2. Rodzaj sond (DNA; RNA; oligonukleotydy) 3. Sposób uzyskiwania impulsu świetlnego (rodzaj, liczba i znaczników fluorescencyjnych oraz miejsce ich przyłączenia) Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże szklane najwcześniej opracowany rodzaj podłoża powierzchnia szkiełka ok 3,6cm 2 na szkiełku może się zmieścić od 10 do 20tys punktów. 1 punkt to sekwencja jednoniciowego kwasu nukleinowego odpowiadająca np. 1 genowi 1 punkt ma średnicę od 50 do 150μm i jest tworzony z produktu PCR (charakterystycznego dla danego genu) o stężeniu μg (objętość to kilka nano litrów) poszczególne punkty oddalone są od siebie o μm długość sondy może osiągać 2tys par zasad sonda przyłącza się do podłoża kowalencyjnie tanie w produkcji kwas nukleinowy musi być doskonałej jakości, co wiąże się z dużym nakładem pracy Affymetri x 8

9 Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże kwarcowe rodzaj podłoża opracowany w 1991r powierzchnia wafla kwarcowego ok 12,7cm 2 (chip) sondy umieszczane są techniką fotolitografii lub iniekcyjnie Agilent; Affymetrrix sekwencje sond są bezpośrednio syntetyzowane (de novo) na powierzchni chipa sonda przyłącza się do podłoża kowalencyjnie długość sondy to ok. 25 nukleotydów szybkie (zautomatyzowane przygotowywanie sond) wysoka komplementarność sond wysoki koszt mała specyficzność (bo krótkie sondy) Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże kwarcowe perełki krzemionkowe o średnicy 3μm (beadchip) sondy przytwierdzają się do perełek przez adresówki o długości 23nt Illumina każda perełka jest pokryta setkami tysięcy kopii określonego oligonukleotydu sondy mają długość 50nt (po zakotwiczeniu ) perełki trafiają losowo do dołka każda perełka z konkretną sondą na jednej macierzy jest kopiowana razy. Perełki oddalone są od pozostałych na odległość 5,7μm gęstość upakowania perełek: 40tys na 1mm 2 są bardzo drogie Mikromacierze- rodzaj sond 1. Sondy DNA Fragmenty genów (PCR) Próby- cdna od 2 porównywanych osobników (np. zdrowy/chory) znakowany różnymi fluorochromami Kolor zielony charakterystyczny dla jednej próby, czerwony dla drugiej, żółty oznacza hybrydyzację obu prób w tej samej plamce Metoda przestarzała! 9

10 Mikromacierze- rodzaj sond 1. Sondy DNA Oligonukleotydy DNA- Synteza na podłożu Próba- od pojedynczego osobnika RNA- cdnaarna znakowany biotyną. Intensywność świecenia w zależności od ilości hybrydyzujących kopii. TECHNIKI ANALIZY RNA Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego Jakościowa analiza RNA (wirusów i bakterii) TECHNIKI ANALIZY RNA Ilościowe oznaczanie RNA Northern Blot Geny reporterowe Mała- średnia informatywność PCR z odwrotną transkryptazą i badanie ekspresji metodą RealTime Mikromacierze RNA Sekwencjonowanie RNA Duża informatywność 10

11 TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Geny reporterowe służą badaniu aktywności innych genów złączone z badanym genem (najczęściej promotorem) produkują mrna (i białko), którego ilość jest mierzona (fluorymetrycznie) ilość wyprodukowanego białka będzie miernikiem aktywności badanego promotora o Produkt genów reporterowych powinien być łatwo wykrywalny o Ilość produkowanego białka powinna być mierzalna (odpowiedni dobór metody) o Produkt genów reporterowych nie może być toksyczny ani inwazyjny dla żywych komórek o Powinien dać się oznaczyć in situ TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Gen białka zielonej florescencji GFP (Green Fluorescent Protein) naturalnie występuje w genomie Aequorea victoria wprowadzenie i utrwalenie mutacji w tym genie pozwoliło na zmianę fluoroforu (pierwotnie kodowanego przez trzy aminokwasy: serynę, tyrozynę i glicynę) nowe mutanty genu pozwalają na produkcję białka emitującego niebieską (B), żółtą (Y), czerwoną (R) lub cyjanową (C) barwę światła TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Gen lucyferazy naturalnie występuje w genomie Photinus pyralis świecenie jest następstwem utleniania lucyferyny w obecności ATP Gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) naturalnie występuje w genomie Escherichia coli Acetylacja chloramfenikolu w środowisku komórki powoduje świecenie 11

12 TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Tygodni e Badanie aktywności promotorów nowotworowych raka mózgu TECHNIKI ANALIZY RNA- NORTHERN BLOT Elektroforetyczny rozdział fragmentów DNA (agaroza) Przeniesienie rozdzielonych fragmentów na membranę (nitrocelulozową) Hybrydyzacja z sondami ssdna - znana sekwencja - znakowanie: radioaktywne- aktywny węgiel, siarka Fluorescencyjne- biotyna Enzymatyczne- alkaliczna fosfataza Oznaczenie ilości konkretnej frakcji TECHNIKI ANALIZY RNA- NORTHERN BLOT Poly(A)+ RNA: from rat tissues Probe: G3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) From Dr. Yu 12