Sekwencje mikrosatelitarne. SNP Single Nucleotide Polymorphism (mutacje punktowe, polimorfizm jednonukleotydowy)

Transkrypt

1 Sekwencje mikrosatelitarne Próba nr 1 GGGGGGGGGGGG 4x GG Próba nr 2 GGGGGGGGGGGGGGGG 6x GG Próba nr 1 GGGGGGGGG Próba nr 2 GGG GGGG SNP Single Nucleotide Polymorphism (mutacje punktowe, polimorfizm jednonukleotydowy) Próba nr 1 GGGGGGGGGG Próba nr 2 GGGGGGGGG Sondy na bazie Genomowego DN cdn sondy o długości kilkuset kilku tys. pz Oligonukleotydowe: o sondach długich (50 70nt) o sondach krótkich (18 25nt) 1

2 statyczne sondy immobilozowane na płytce, np. chipy DN (ang. Genehips) Mikromacierze typu statycznego. Źródło: 2

3 przepływowe sondy zakotwiczone w ziarnach swobodnie pływających w roztworze (ang. bead arrays) Znakowanie i identyfikacja ziaren. Źródło: 3

4 Bead hip BovineSNP50 Beadhip v1 (54001 sond) i v2 (54609 sond) Schemat obrazujący budowę mikromacierzy Bead hip Dzień 1 mplifikacja DN podczas inkubacji izotermalnej Dzień 2 Dzień 3 Fragmentacja produktu amplifikacji podczas procesu kontrolowanego enzymatycznie Wytrącanie DN Zawieszanie DN w buforze do hybrydyzacji Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip Przemywanie Beadhip Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN oraz wybarwianie Skanowanie i odczyt wyników Dzień 1 mplifikacja DN podczas inkubacji izotermalnej Inkubacja 20-24h w temperaturze 37 w piecu hybrydyzacyjnym (Hybridization Oven, Illumina ). Dzień 2 Fragmentacja produktu amplifikacji podczas procesu kontrolowanego enzymatycznie Inkubacja 1h w temperaturze 37 w bloku grzejnym Hybex Microsample Incubator (SciGene, US) z wkładem MIDI Heat Block Insert (Illumina ) 4

5 Dzień 2 Wytrącanie DN Zawieszanie DN w buforze do hybrydyzacji Worteks (High Speed Microplate Shaker, Illumina) Wirówka do płytek z możliwością chłodzenia (entrifuge 5804R, Eppendorf) Odwrócona płytka zawierająca wytrącony DN (niebieski osad) w trakcie suszenia Zdjęcie pochodzi z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina ) Dzień 2 Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip Uszczelka do komory hybrydyzacyjnej (Hyb hamber Gaskets, Illumina ) Komora hybrydyzacyjna (Beadhip Hyb hamber, Illumina ) Inserty do komory hybrydyzacyjnej (Beadhip Hyb hamber inserts, Illumina ) Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina ) Dzień 2 Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip G G G G BovineSNP50 Beadhip Illumina 5

6 Dzień 3 Przemywanie Beadhip Przygotowanie mikromacierzy Beadhip do kolejnego etapu Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina ) Dzień 3 Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN e-flow, EN, Szwajcaria Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi- Sample Protocols (Illumina ) Znakowanie fluorescencyjne dobudowanych nukleotydów Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina ) Dzień 3 Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN oraz znakowanie go fluorescencyjnie G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G Sample 1 Sample 2 Sample 3 6

7 Dzień 3 Skanowanie i odczyt wyników Skanowanie mikromacierzy: HiScanSQ, Illumina Odczyt wyników: GenomeStudio M, Illumina Zdjęcia pochodzą ze strony Podstawowe informacje uzyskane po analizie mikromacierzy: Zdjęcia pochodzą z GenomeStudio M Genotyping Module v1.0 User Guide SNP Graph pokazujący prawidlowy podział na klatry. SNP Graphs pokazujące blędny podział na klastry. zarne kropki oznaczają próbki zaklasyfikowane "No alls" 7

8 Wykorzystanie mikromacierzy DN w badaniach populacji dzikich zwierząt Zastosowanie panelu sond opracowanego dla gatunków modelowych lub użytkowych: naliza zmienności genetycznej, określenie struktury populacji Wyszukiwanie różnic na poziomie molekularnym między gatunkami lub między populacjami w obrębie jednego gatunku Identyfikacja gatunków Badania asocjacyjne Zastosowano mikromacierz BovineSNP50 Beadhip ( SNPs) kozica alpejska (Rupicapra rupicapra rupicapra) Libor Hudík 4 osobniki (3 z obszarów wysokogórskich i 1 z obszarów Niżnych atr) P. Dubois 3 osobniki z pasma górskiego Wielka Fatra 3 osobniki z płaskowyżu Słowacki Raj Demontis i wsp ylko 505 markerów okazało się polimorficznych, wytypowano 48 SNPs do analizy struktury genetycznej badanej grupy zwierząt naliza struktury genetycznej wykonana w programie Structure. Każdy z osobników reprezentowany jest przez pionowy słupek. Kolory odpowiadają oszacowanym proporcjom udziału w konkretnej populacji. 8