ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII WYKŁAD I PODSTAWY SPEKTROMETRII MAS Prof. dr hab. Witold Danikiewicz Instytut Chemii Organicznej PAN Warszawa
ZAKRESY PROMIENIOWANIA ELEKTROMAGNETYCZNEGO, WYKORZYSTYWANEGO WNAJWAŻNIEJSZYCH METODACH SPEKTRALNYCH 10 4 10 6 10 8 10 10 10 12 10 14 10 16 10 18 10 20 10 22 Hz fale radiowe mikrofale IR VIS UV X γ NMR IR UV-VIS Rtg 10 4 10 2 1 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10 10-12 10-14 m
WIDMO EI KWASU OCTOWEGO Jony fragmentacyjne 100 43 45 O Intensywność względna 50 15 C H 3 C O M = 60 H Jon molekularny 60 0 29 18 31 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 m/z
Abundance WIDMO EI CHOLESTEROLU 9500 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 #229209: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth HO 386 5000 4500 43 275 368 4000 81 107 3500 3000 145 301 2500 2000 161 213 255 1500 231 1000 123 178 m/z--> 500 0 326 65 197 342 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380
DWA SPOSOBY PREZENTACJI WIDM MASOWYCH 14 208.2 raw data 14 208.2 centroid 12 207.2 12 10 199.2 10 199.2 Intensity (%age) 8 6 194.2 198.2 200.2 201.2 209.2 Intensity (%age) 8 6 194.2 201.2 209.2 4 2 190.2 191.2 192.2 193.1 195.2 196.2 197.1 206.1 203.2 205.1 202.2 204.2 210.1 211.2 212.2 216.1 213.1214.1 215.2 217.2 218.1219.2 4 2 192.2 203.2 212.2 216.1 217.2 0 0 190 195 200 205 210 215 220 Low Resolution M/z 195 200 205 210 215 220 Low Resolution M/z widmo nieprzetworzone (raw data spectrum) widmo po procedurze centroidowania (centroid spectrum)
PYTANIA, NA KTÓRE MOŻE ODPOWIEDZIEĆ SPEKTROMETRIA MAS 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego lub braku zgodności widm (+) i (-). 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa.
H, 2 DOKŁADNE MASY ATOMOWE I SKŁADY IZOTOPOWE NAJLŻEJSZYCH PIERWIASTKÓW 1.00782504, 99.985 2.01410179, 0.015 He, 2 3.01602930, 0.00013 4.00260325, 99.99987 Li, 2 6.01512320, 7.52 7.01600450, 92.48 Be, 1 9.01218250, 100.0 B, 2 10.01293800, 18.98 11.00930530, 81.02 C, 2 12.00000000, 98.892 13.00335484, 1.108 N, 2 14.00307401, 99.635 15.00010898, 0.365 O, 3 15.99491464, 99.759 16.99913060, 0.037 17.99915939, 0.204 F, 1 18.99840325, 100.0 Ne, 3 19.99243910, 90.92 20.99384530, 0.257 21.99138370, 8.82 Na, 1 22.98976970, 100.0 Mg, 3 23.98504500, 78.60 24.98583920, 10.11 25.98259540, 11.29 Al, 1 26.98154130, 100.0 Si, 3 27.97692840, 92.18 28.97649640, 4.71 29.97377170, 3.12 P, 1 30.97376340, 100.0 S, 4 31.97207180, 95.018 32.97145910, 0.750 33.96786774, 4.215 35.96707900, 0.107 Cl, 2 34.96885273, 75.4 36.96590262, 24.6
PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 30 H 68 N 10 O 19 C 60 H 138 N 20 O 39 C 150 H 348 N 50 O 99 89 160 427 872 1762 4432 89.05 160.09 427.23 872.47 1762.94 4434.37 89.09 160.17 427.43 89.93 1763.87 4436.69 Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia
Przykład widma związku cynoorganicznego
SCHEMAT BLOKOWY SPEKTROMETRU MAS Analizator masy Źródło jonów Detektor Komputer Układ wprowadzania próbki Rejestracja i przetwarzanie wyników
ŚREDNIA DROGA SWOBODNA CZĄSTKI W GAZIE L [ cm] 0.005 P [ mmhg] P [mmhg] L 760 0.00065 mm 1 0.05 mm 0.1 0.5 mm 1 10-2 5 mm 1 10-3 5 cm 1 10-4 50 cm 1 10-5 5 m 1 10-6 50 m 1 10-7 500 m
WPROWADZANIE PRÓBEK DO SPEKTROMETRU MASOWEGO Ciśnienie atmosferyczne Ciało stałe lotne Ciało stałe nielotne Ciecz czysta lotna Ciecz czysta nielotna Roztwór niezjonizowany Źródło jonów Jony Wysoka próżnia ( < 10-5 mm Hg) Analizator masy Roztwór zjonizowany Gaz
ANALIZATORY MASY STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Analizator magnetyczny (magnet analyser, B) Analizator magnetyczny + analizator elektryczny i analizator elektryczny + analizator magnetyczny (BE i EB) Analizator kwadrupolowy (Quadrupole analyser, Q) Pułapka jonowa (Ion Trap lub Quadrupole Ion Trap, IT lub QIT) Analizator czasu przelotu (Time of Flight analyser, TOF) Jonowy rezonans cyklotronowy (Ion Cyclotron Resonance, ICR)
ANALIZATOR MAGNETYCZNY Elektromagnes r Źródło jonów Detektor V r = m z 2V eb 2 M W AMD 604: B = 1.7 T, r = 60 cm, V = 8000 V M max = 6000 u 2 2 3 B r = 4.83 10 W analizatorze magnetycznym V promień toru jonu zależy zarówno od jego masy (ściślej: m/z), jak i energii
SPEKTROMETR O PODWÓJNYM OGNISKOWANIU I GEOMETRII BE Analizator magnetyczny Szczelina pośrednia...... Analizator elektryczny...... Komory zderzeń Szczelina wyjściowa Źródło jonów Szczelina wejściowa Powielacz elektronów
SPEKTROMETR MAS TYPU AMD 604
ANALIZATOR KWADRUPOLOWY
wiązka światła lasera V Próbka na blaszce stalowej Spektrometr MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l t l 2eV 2 2eV m m Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)
Schemat spektrometru czasu przelotu (TOF) z reflektorem jonów źródło jonów elementy ogniskujące reflektor jonów detektor
SCHEMAT SPEKTROMETRU MASOWEGO Z ORTOGONALNYM ANALIZATOREM CZASU PRZELOTU SPEKTROMETR GCT FIRMY MICROMASS
PODSTAWOWE METODY JONIZACJI STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Jonizacja elektronowa (Electron Ionization, EI) Jonizacja chemiczna (Chemical Ionization, CI) Bombardowanie szybkimi atomami (Fast Atom Bombardment, FAB) oraz bombardowanie szybkimi jonami (Fast Ion Bombardment, FIB). Obie metody (chociaż druga częściej) określane są też mianem spektrometrii jonów wtórnych w ciekłej matrycy (Liquid Matrix Secondary Ion Mass Spectrometry, LSIMS) Jonizacja polem (Field Ionization, FI) i desorpcja polem (Field Desorption, FD) Termosprej (Thermospray, TS lub Thermospray Ionization, TSI) Elektrosprej, elektrorozpylanie (Electrospray, ES lub Electrospray Ionization, ESI) Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (Atmosferic Pressure Chemical Ionization, APCI) Desorpcja promieniowaniem laserowym z użyciem matrycy (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) Jonizacja plazmą wzbudzaną indukcyjnie (Inductively Coupled Plasma Ionization, ICP)
ŹRÓDŁO JONÓW DO EI I CI miejsce wprowadzania próbki (prostopadle do płaszczyzny rysunku) elektroda odpychająca katoda + obudowa komory jonizacyjnej (U A = 8000 V) magnes N S - magnes - soczewki ogniskujące elektroda przyspieszająca (U = 0 V) szczelina wejściowa wiązka jonów (do analizatora) E = zeu A Czas przebywania próbki w źródle jonów: ok. 10-6 s
ŹRÓDŁO JONÓW W SPEKTROMETRZE AMD 604
ŹRÓDŁO JONÓW W SPEKTROMETRZE AMD 604
SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO ogrzewanie i pomiar temperatury obudowa pręt szlifowany końcówka chłodzenie wodne lub powietrzne probówka (aluminiowa lub kwarcowa)
SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO
Abundance WIDMO EI CHOLESTEROLU 9500 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 #229209: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth HO 386 5000 4500 43 275 368 4000 81 107 3500 3000 145 301 2500 2000 161 213 255 1500 231 1000 123 178 m/z--> 500 0 326 65 197 342 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380
ELECTROSPRAY (ESI)
John B. Fenn ur. 1917 r. Nobel 2002
Nobel 2002 M. Mann, S. Shen i J. B. Fenn Electrospray Mass Spectrometry w: Mass Spectrometry in the Biological Sciences: A Tutorial, Ed. M. L. Gross, Kluver Academic Publishers, Dordrecht 1992.
MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 1 Tworzenie aerozolu podczas wypływu cieczy z kapilary w polu elektrycznym kapilara gaz rozpylający
MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 2 (powtarza się wielokrotnie) Odparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie ( eksplozja kulombowska ) po przekroczeniu bariery Raleigha + + + + + ++ + ++ + + + + odparowanie + + + + + + + + + rozpuszczalnika + + + + + "eksplozja kulombowska" po przekroczeniu bariery Raleigha + + + + + + + + + + + + + + + +
MECHANIZM PRZECHODZENIA JONÓW DO FAZY GAZOWEJ W TECHNICE ELECTROSPRAY ETAP 3 Desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania pola elektrycznego + + + + + + + + + (średnica kropli ok. 10 nm) desorpcja jonu w wyniku działania pola elektrycznego + + + + + + + + + +
SCHEMAT ŹRÓDŁA JONÓW ELECTROSPRAY W SPEKTROMETRZE API 365 Ciśnienie atmosferyczne Dysza Płytka osłonowa Zbierak Pierścień Q0 - -- - - - -- -- - - -- -- -- -- -- -- -- -- - --- - - - - - Kapilara stalowa ~ 2 Torr 8 x 10-3 Torr Tworzenie się jonów Pompa wstępna Pompa turbomolekularna Gaz osłonowy (N 2 )
100 90 41 57 Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 70 ev % Intensity 80 70 60 50 40 43 55 [M O 2 CH 3 ] + 127 M = 174 O O O CH 3 30 20 10 60 74 69 83 87 97 105 115 0 40 60 80 100 M/z 120 140 160 180 200 100 197.1 90 80 M+Na + ESI w MeOH 70 60 M+H + 175.1 % Intensity 50 40 30 2M+Na + 371.2 20 192.2 10 166.1 213.1 279.2 301.2 339.2 0 150 200 250 300 350 400 Mass (m/z)
WIDMO ESI ZWIĄZKU O MAŁEJ CZĄSTECZCE (MeOH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 2M + Na + 100 817.3 2132 90 Ph O 80 N O Ph % Intensity 70 60 50 M + H + M + Na + 420.2 398.2 OH M = 397 O 818.4 40 30 M + K + 436.2 20 10 616.3 623.7 819.4 0 0 300 420 540 660 780 900 Mass (m/z)
Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy OH i COOH % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 F? 149.0 201.0? 225.2 F 279.1? F? 301.1 239.2 367.1 205.1 Spec #1[BP = 201.0, 724] F 155.1 711.2 10 241.2 391.3 485.8 579.3 712.2 0 100 240 380 520 660 0 800 Mass (m/z) ESI (+) [2M + Na + ] + 724 100 90 80 70 60 343.1 COOH (OH) (OH) m n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M H + ] ESI (-) 2675 % Intensity 50 40 30 20 344.1 10 187.0 345.1 0 100 240 380 520 660 0 800 Mass (m/z)
JONIZACJA CHEMICZNA POD CIŚNIENIEM ATMOSFERYCZNYM (APCI)
Cechy charakterystyczne metod ESI i APCI zakres mas 10 100 000 (do 2000 dla APCI) związki polarne (ESI) i niepolarne (APCI) wprowadzane w roztworach lotnych rozpuszczalników współpraca z analizatorami magnetycznymi, kwadrupolowymi, pułapkami jonowymi i TOF: możliwość badania fragmentacji wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych oraz wykonywania dokładnych pomiarów masy możliwość bezpośredniej współpracy z HPLC mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki
MALDI - TOF
Koichi Tanaka ur. 1959 r. Nobel 2002
Spektrometr MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) wiązka światła lasera V Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l l 2eV t 2eV m 2 m Próbka na blaszce stalowej Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)
Mechanizm jonizacji w technice MALDI Impuls laserowy trafia w powierzchnię próbki (a) przekazując jej energię, która powoduje stopienie i odparowanie cząsteczek obojętnych i jonów z małego obszaru próbki (b). Po kilku nanosekundach cząsteczki obojętne zostają odpompowane, a cząstki naładowane (jony) są wciągane polem elektrycznym do analizatora spektrometru masowego (c).
Matryce stosowane w technice MALDI
Widmo MALDI-TOF β-galaktozydazy M+H + 116 336 Da
Widmo MALDI-TOF białka (M = 149 190 Da)
Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 COOAg ESI MALDI
Cechy charakterystyczne metody MALDI zakres mas 100 1 000 000 związki polarne, stałe lub nielotne ciecze mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki MALDI współpracuje praktycznie tylko z analizatorami TOF metody badania fragmentacji ciągle wymagają dopracowania możliwość pełnej automatyzacji wprowadzania próbek i rejestrowania widm