Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Morfologia komórki apoptotycznej 1.Wstęp PrzeŜycie wielokomórkowego organizmu zaleŝy nie tylko od namnaŝania się i róŝnicowania odpowiedniej liczby komórek, ale takŝe od ich obumierania. Utrzymanie równowagi pomiędzy powstawaniem nowych, a eliminacją niepotrzebnych komórek jest niezwykle istotne dla funkcjonowania organizmu. Samobójcza śmierć komórki jako naturalny element Ŝycia długo pozostawała tajemnicą. O tym, Ŝe kaŝda komórka organizmu jest zaprogramowana tak, aby popełnić samobójstwo po otrzymaniu odpowiednich sygnałów, przekonano się dopiero na początku lat siedemdziesiątych. Wtedy teŝ po raz pierwszy uŝyto terminu apoptoza (w języku greckim oznacza on opadanie liści z drzew lub płatków kwiatów). Apoptoza jako śmierć czynna, wymagająca w swym przebiegu syntezy RNA i białek, jest alternatywną formą śmierci w stosunku do martwicy (nekrozy), która jest śmiercią przypadkową bierną. Apoptoza zwana teŝ fizjologiczną lub programowaną śmiercią komórki, występuje podczas całego rozwoju organizmu. Za jej pomocą organizm pozbywa się nadmiaru niepotrzebnych komórek, a takŝe eliminuje zainfekowane, uszkodzone lub zmutowane komórki. Ostatecznie zatem o liczbie komórek w organizmie decyduje równowaga pomiędzy ich proliferacją i śmiercią, regulowana przede wszystkim przez gospodarkę hormonalną ustroju, dostępność czynników wzrostowych oraz substancji odŝywczych. Apoptoza leŝy u podstaw procesu nowotworzenia. Obecnie uwaŝa się, Ŝe powstawanie i rozwój nowotworu to nie tylko wynik nagromadzenia się mutacji w poszczególnych klasach genów komórki. Równie istotnym czynnikiem w tych procesach jest równieŝ zdolność komórek nowotworowych do wyłączenia mechanizmu samozniszczenia. MoŜe to prowadzić do nieprawidłowego zwiększenia Ŝywotności komórek, wydłuŝania ich Ŝycia, utrwalania juŝ zaistniałych mutacji, zakłóceń w przebiegu cyklu komórkowego oraz wystąpienia oporności komórek na działanie cytostatyków. Ograniczenie zjawiska apoptozy prowadzi równieŝ do powstania szeregu złośliwych chorób proliferacyjnych oraz autoagresji układu odpornościowego [Arends M. J., 1991]. 2. Zmiany w morfologii komórki umierającej na drodze apoptozy Komórki umierające w wyniku apoptozy wykazują szereg charakterystycznych, morfologicznych zmian. Komórka apoptotyczna z reguły oddziela się od pozostałych. Na skutek utraty wewnątrzkomórkowej wody i elektrolitów dochodzi do jej obkurczenia, zmiany kształtu, wielkości oraz zagęszczenia cytoplazmy. Powierzchnia takiej komórki ulega charakterystycznemu pofałdowaniu. Jednocześnie dochodzi do zmian w chromatynie jądrowej. Ulega ona zagęszczeniu i początkowo gromadzi się w pobliŝu błony jądrowej. Następnie wypełnia ona całe jądro, które staje się pyknotyczne. Organella są gęsto upakowane w cytoplazmie i nie wykazują znaczących zmian morfologicznych. Cechą
charakterystyczną dla apoptozy jest równieŝ fragmentacja jądra komórkowego oraz powstawanie tzw. ciałek apoptotycznych w późniejszych stadiach tego procesu. W przypadku apoptozy zawartość komórki nie wydostaje się na zewnątrz i nie dochodzi do powstania odczynów zapalnych. Dzieje się tak dzięki tworzeniu się nierozpuszczalnej osłony stabilizującej integralność całej komórki apoptotycznej, a w późniejszym etapie równieŝ ciałek apoptotycznych. Jest to efekt tworzenia się dodatkowych wiązań pomiędzy białkami błonowymi. W warunkach fizjologicznych, komórki podlegające apoptozie są fagocytowane przez makrofagi lub sąsiadujące komórki. W hodowli zaś, wobec braku komórek fagocytujących, komórki apoptotyczne ulegają wtórnej martwicy [Sikora E., 1994]. Rys. 1. Zmiany morfologiczne zachodzące w komórce apoptotycznej. A - kondensacja chromatyny, której towarzyszy obkurczenie komórki i zagęszczenie cytoplazmy; B - fragmentacja jądra komórkowego; C fagocytoza [na podstawie www.mol.uj.edu.pl - zmienione]. 3. Zmiany biochemiczne zachodzące w komórce umierającej na drodze apoptozy Zmiany zachodzące w błonie plazmatycznej komórki podczas procesu apoptozy Cechą charakterystyczną procesu apoptozy są zmiany zachodzące w budowie błony komórkowej. Dochodzi wówczas do zaburzenia asymetrii w rozmieszczeniu fosfolipidów błonowych. W normalnej komórce na powierzchni błony przewaŝają fosfolipidy obojętne, do których zalicza się: sfingomielinę i fosfatydylocholinę. W warstwie wewnętrznej zaś dominują fosfolipidy anionowe, takie jak fosfatydyloseryna. W komórkach apoptotycznych fosfatydyloseryna jest eksponowana w zewnętrznej warstwie błony komórkowej. Zjawisko to wykorzystuje się do znakowania komórek apoptotycznych za pośrednictwem aneksyny V, która ma zdolność do preferencyjnego wiązania się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak fosfatydyloseryna [DarŜynkiewicz Z. i wsp., 1996].
Rys. 2. Zmiany zachodzące w budowie błony komórkowej we wczesnych fazach apoptozy [DarŜynkiewicz Z. i wsp., 1996 - zmienione]. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów Apoptoza jest ściśle kontrolowana na poziomie mitochondriów. Jednym z kluczowych parametrów, określających zaburzenie funkcji tych organelli podczas apoptozy, jest spadek potencjału elektrochemicznego ( Ψm) na wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Następuje on przed pojawieniem się fragmentacji DNA i charakterystycznych dla apoptozy zmian w morfologii komórki. Spadek potencjału Ψm poniŝej krytycznej wartości tzw. potencjału bramkującego, sprzyja otwieraniu tzw. megakanałów mitochondrialnych, co nieodwracalnie prowadzi do apoptozy. W wyniku otwarcia tychŝe megakanałów dochodzi do uwolnienia z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów do cytoplazmy szeregu białek apoptogennych, takich jak cytochrom c, czynnik indukujący apoptozę (AIF) oraz prokaspazy 2, 3 i 9 [Green D. i Reed J. C., 1998]. Fragmentacja DNA Kolejnym, charakterystycznym znacznikiem procesu apoptozy jest degradacja DNA, przebiegająca w kilku następujących po sobie etapach. W pierwszym z nich powstają duŝe fragmenty DNA (HMW, ang. high molecular DNA), osiągające wielkość od 300 do 50 tysięcy par zasad. W kolejnym etapie, DNA moŝe ulec fragmentacji do krótkich odcinków, będących wielokrotnością około 200 par zasad. Stosując technikę elektroforezy w Ŝelu agarozowym moŝna rozdzielić DNA podegradowane na mono- i oligonukleosomy. Fragmenty te układają się na elektroforegramie w charakterystyczną drabinkę. Do fragmentacji DNA dochodzi w wyniku aktywacji specyficznych endonukleaz, takich jak DFF40/CAD oraz endonukleaza G, czy lizosomalna DNaza II [Peitsch M. C. i wsp., 1994]. Aktywacja specyficznych enzymów proteolitycznych kaspaz Kaspazy to specyficzna klasa enzymów będących protezami cysteinowymi, które przecinają łańcuch polipeptydowy na reszcie argininy w określonej sekwencji aminokwasowej. Enzymy te syntetyzowane są w postaci nieaktywnego zymogenu, a ich funkcje fizjologiczne w normalnej komórce nie są znane. Zostały one podzielone na dwie grupy: kaspazy inicjatorowe i kaspazy egzekutorowe. W początkowej fazie apoptozy aktywowane są kaspazy inicjatorowe, a dopiero później kaspazy egzekutorowe, których substratami są róŝne białka komórkowe (np. PARP, kinaza DNA PK, topoizomeraza II, aktyna, gelsolina, lamina B) [Grądzka I., 2000].
4. Wykonanie ćwiczenia Zadaniem studentów będzie przygotowanie dwóch róŝnych preparatów komórkowych, pozwalających zaobserwować zmiany w morfologii komórek (w szczególności jądra komórkowego), wynikających z uruchomienia apoptozy w tychŝe komórkach. Barwienie róŝnicowe komórek z zastosowaniem jodku propidyny oraz di octanu fluoresceiny Jednym z podstawowych testów wykorzystywanych do odróŝnienia komórek martwych od Ŝywych jest tzw. barwienie róŝnicowe za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych, takich jak jodek propidyny (PI) oraz dioctan fluoresceiny (FDA). Dioctan fluoresceiny jest nie polarną i nie fluoryzującą pochodną fluoresceiny, która posiada zdolność do przenika przez błonę komórkową. Po wniknięciu do komórki, FDA jest hydrolizowany przez wewnątrzkomórkowe esterazy do fluoresceiny związku wykazującego właściwości fluoryzujące. Komórki Ŝywe, przejawiające duŝą aktywność esteraz, kumulują znaczne ilości fluoresceiny, co w konsekwencji powadzi do otrzymania intensywnej fluorescencji zielonej. Komórki apoptotyczne i martwe, cechujące się mniejszą aktywnością esteraz oraz słabiej zachowaną integralnością błony komórkowej, słabiej akumulują produkt hydrolizy FDA, co oznacza mniejsze wartości zielonej fluorescencji tychŝe komórek [Dębowska R. i inni, 2007]. Jodek propidyny, ze względu na posiadany ładunek elektryczny, nie przenika przez nieuszkodzoną błonę komórek Ŝywych i wczesnoapoptotycznych. Barwi on jednak na czerwono komórki z uszkodzoną błoną cytoplazmatyczną, a więc nekrotyczne lub znajdujące się w późnych fazach apoptozy. W celu wykonania tej części ćwiczenia naleŝy do 1 ml dostarczonej przez prowadzącego zawiesiny komórek (2 x 10 6 komórek) dodać 2 µl roztworu dioctanu fluoresceiny (roztwór FDA w acetonie o stęŝeniu 1 mg/ml), a następnie barwić całość przez 15 minut w temperaturze 37 C. W dalszej kolejności naleŝy dodać do zawiesiny komórek 20 µl roztworu jodku propidyny (roztwór PI w wodzie o stęŝeniu 1 mg/ml) i po upływie około 1 minuty przygotować preparat mikroskopowy. Przygotowany w ten sposób preparat oglądamy w mikroskopie fluorescencyjnym przy wzbudzeniu światłem niebieskim. Barwienie utrwalonego preparatu komórkowego Podstawowym i najprostszym sposobem identyfikacji procesu apoptozy jest zbadanie zmian w morfologii jąder komórkowych przy uŝyciu barwnika fluorescencyjnego DAPI, który silnie wiąŝe się do DNA (dwuniciowego) na zasadzie interkalacji. Utrwalone za pomocą etanolu komórki, ekstrahujemy w buforze fosforanowym z dodatkiem kwasu cytrynowego w celu usunięcia z komórek umierających na drodze apoptozy pofragmentowanego DNA (fragmenty DNA znajdujące się w cytoplazmie mogą przeszkadzać w odróŝnieniu komórek normalnych od apoptotycznych). Następnie komórki barwimy fluorochromem DAPI (wybarwia jądro komórkowe) oraz barwnikiem barwiącym białka w tym przypadku sulforodaminą 101 (wybarwia przede wszystkim cytoplazmę). W celu wykonania tej części ćwiczenia naleŝy do 1 ml zawiesiny komórek (1 x 10 6 komórek) dodać 5 ml 70%, zimnego etanolu i inkubować w lodzie przez 30 minut. Następnie całość wirować w następujących warunkach: 4 C/5 min./1000 rpm. Po wirowaniu zawiesić komórki w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (PBS) i ponownie odwirować w podanych
powyŝej warunkach. Nadsącz odrzucić, a osad komórek zawiesić w 1 ml PBS u z dodatkiem 1 ml buforu fosforanowego z dodatkiem kwasu cytrynowego (bufor otrzymujemy poprzez zmieszanie 60 µl 0,1 M kwasu cytrynowego i 1440 µl 0,2 M fosforanu sodu Na 2 HPO 4 ). Ekstrahować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. W dalszej kolejności zawiesinę komórek naleŝy zwirować i osad zawiesić w 1 ml buforu barwiącego, w skład którego wchodzą: 10 mm bufor PIPES (ph 6,8), 100 mm NaCl, 2 mm MgCl 2, 0,1% Triton X-100, 1 µg DAPI, 20 µg sulforodamina 101. Całość barwić przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Tak przygotowany preparat odwirować przy pomocy cytowirówki (CytoFuge 2) (4 min./700 rpm) w celu osadzenia komórek na szkiełku podstawowym, a następnie prowadzić obserwacje w mikroskopie fluorescencyjnym przy wzbudzeniu światłem UV. 4. Opracowanie wyników Sprawozdanie z wykonania ćwiczenia powinno zawierać: - zwięzły opis jego przebiegu wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania, - opisać róŝnice w morfologii komórek normalnych i apoptotycznych po zastosowaniu róŝnych metod barwienia, - napisać, która z zastosowanych podczas ćwiczenia metod barwienia bardziej nadaje się do odróŝnienia komórek normalnych od komórek apoptotycznych (wybór uzasadnić). 5. Literatura 1. Arends M.J., Wyllie A.H.: Apoptosis: mechanism and roles in pathology, Int. Rev. Exp. Path. 1991; 32: 223 254, 2. Sikora E.: Mechanizmy śmierci programowanej komórek (apoptozy), Post. Bioch. 1994; 40 (3): 150 159, 3. DarŜynkiewicz Z., Gorczyca W., Ardelt B., Halicka D., Juan G., Traganos F.: Cytometria apoptozy i martwicy, Central European J. Immunol. 1996; 21: 156 170, 4. Green D., Reed JC.: Mitochondria and apoptosis, Science 1998; 281: 1309 1311, 5. Peitsch MC., Mannherz HG., Tscgopp J.: The apoptosis endonukleases: cleaning up after cell death?, Trends Cell Biol. 1994; 4: 37-41, 6. Dębowska R., Bazela K., Eris I.: Apoptoza i ochronne działanie kwasu foliowego, Dermatologia estetyczna 2007; 9 (2): 83-90.