RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 208762 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 380695 (22) Data zgłoszenia: 26.09.2006 (51) Int.Cl. C12N 9/88 (2006.01) C12Q 1/527 (2006.01) C07K 16/42 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) G06N 99/00 (2010.01) (54) Sposób otrzymywania peptydów o charakterze epitopów wiążących immunoglobuliny IgE (43) Zgłoszenie ogłoszono: 31.03.2008 BUP 07/08 (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2011 WUP 06/11 (72) Twórca(y) wynalazku: MICHAŁ PIAST, Wrocław, PL IRENA KUSTRZEBA-WÓJCICKA, Wrocław, PL TERESA BANAŚ, Wrocław, PL HUBERT BARTOSZ-BECHOWSKI, Wrocław, PL PL 208762 B1
2 PL 208 762 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania peptydów o charakterze epitopów wiążących immunoglobuliny IgE, znajdujących zastosowanie w diagnostyce grzybic i alergii na grzyby pleśniowe, w produkcji szczepionek odczulających oraz w testach mykologicznych w budownictwie. Wieloletnie badania nad strukturą i funkcją białek dowiodły, że podczas odpowiedzi immunologicznej tylko niewielki fragment białka uczestniczy w reakcji z przeciwciałem. Te obszary, obecne na powierzchni cząsteczki białka, nazwano epitopami bądź determinantami antygenowymi. Epitopy mogą przyjmować postać liniowej sekwencji aminokwasowej lub powstawać w wyniku interakcji aminokwasów leżących w różnych miejscach łańcucha polipeptydowego. Złożona struktura białka powoduje, że doświadczalne wyznaczanie domen antygenowych wymaga kosztownych i czasochłonnych metod laboratoryjnych. Z uwagi na powyższe fakty zaistniała potrzeba teoretycznego przewidywania miejsc antygenowych. W ostatnich latach nastąpił niespotykany dotąd rozwój nauk bioinformatycznych, który umożliwia podejście do problemu jakim jest teoretyczne wyznaczanie epitopów i zaproponowanie nowych rozwiązań, bazujących na nowoczesnych technikach obliczeniowych. Wyznaczenie epitopów wiążących immunoglobuliny IgE metodami laboratoryjnymi jest czynnością złożoną. W publikacji: Kurup V.P., Vijay H.M., Kumar V., Castillo L., Elms N. (2003), IgE binding synthetic peptides of Alt a 1, a major allergen of Alternaria alternata. Peptides, 24:179-185. (Syntetyczne peptydy Alt a 1, głównego alergenu Alternaria alternata, wiążące IgE) opisano wieloetapową procedurę ustalania epitopów IgE w obrębie cząsteczki białka na przykładzie grzyba pleśniowego Alternaria alternata, którą można przedstawić w następujących punktach : 1. Uzyskanie surowicy pacjentów wykazujących reaktywność w testach skórnych na komercyjnie dostępne antygeny Alternaria alternata. Surowicę otrzymuje się z pobranych od pacjentów próbek krwi. Uzyskane serum przechowuje się w temperaturze -20 C. 2. Hodowla Alternaria alternata, prowadzona w inkubatorze do czasu otrzymania komórek w ilości wystarczającej do prowadzenia dalszych badań (17 dni). 3. Przygotowanie ekstraktu komórkowego. Komórki pleśniowe poddawane są dezintegracji mechanicznej, najczęściej w młynku Browna. Otrzymany homogenat jest odwirowywany, a do dalszych analiz stosuje się czysty supernatant, który jest sprawdzany na zawartość białka poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). 4. Uzyskany tą drogą antygen jest oczyszczany na drodze filtracji żelowej na kolumnie Sephadex i chromatografii jonowymiennej, a jego reaktywność z przeciwciałami IgE w surowicy pacjentów uczulonych na Alternaria alternata sprawdza się za pomocą metody Western blotting. 5. Przygotowanie rekombinowanego Alt a 1. Z 7 dniowej hodowli Alternaria alternata wyizolowuje się i oczyszcza kwas rybonukleinowy mrna i otrzymuje bibliotekę cdna. Uzyskuje się sklonowane cdna kodujące Alt a 1 i dokonuje ekspresji antygenu. 6. Metoda Western blotting (immunoblotting). Polega ona na przeniesieniu białek z żelu poliakrylamidowego na membranę i wykryciu poszukiwanego białka za pomocą swoistych przeciwciał. Przeciwciała poliklonalne przeciwko antygenowi Alt a 1 pochodzą z surowicy królika. 7. Synteza dekapeptydów z użyciem grupy osłonowej Fmoc dla grup α-aminowych. Bazując na znanej sekwencji aminokwasowej antygenu Alt a 1 syntezowane są dekapeptydy zachodzące na siebie pięcioma aminokwasami, pokrywając w ten sposób całą długość cząsteczki. Po zidentyfikowaniu regionów wiązania IgE w reakcjach z surowicami pacjentów peptydy syntetyzowane są ponownie w celu ustalenia specyficznego miejsca występowania epitopu. Opisana powyżej metoda wymaga zaangażowania dużych środków finansowych, z powodu konieczności użycia drogich odczynników chemicznych do izolacji białka z komórek grzybów, skomplikowanych procedur takich jak elektroforeza, filtracja żelowa i chromatografia jonowymienna, klonowanie i ekspresja cdna oraz stosowania kosztownej aparatury niezbędnej do analiz. Jest ona także czasochłonna, ponieważ hodowla komórek trwa z reguły 7-14 dni, a następnie konieczne jest jeszcze wielogodzinne oczyszczanie białka w wymienionych procesach filtracji żelowej i chromatografii jonowymiennej. Nie bez znaczenia pozostaje fakt, iż antygeny pochodzące z hodowli komórkowych mogą być zanieczyszczone niepożądanym materiałem biologicznym.
PL 208 762 B1 3 Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania peptydów o charakterze epitopów wiążących immunoglobuliny IgE, zwłaszcza enolaz o właściwościach alergennych, w oparciu o znane standardy programów komputerowych, z zastosowaniem do syntezy chemicznej metody sprzęgania i wyboru grup osłonowych. Istota wynalazku polega na tym, że najpierw wykonuje się progresywne porównanie sekwencji wybranych enolaz z co najmniej jedną enolazą o znanych sekwencjach epitopów wiążących IgE, za pomocą programu Clustal X, po czym dokonuje się manualnej korekcji ewentualnych błędów na podstawie podobieństw w pierwszorzędowej sekwencji porównywanych peptydów za pomocą programu GeneDoc i tworzy się listę peptydów homologicznych o największym podobieństwie do wyznaczonego wstępnie epitopu, obliczając podobieństwo między sekwencjami A i B o długości N reszt aminokwasowych według wzoru : gdzie α i jest wartością własną j-ego składnika E, E j (A i jest wartością E j dla aminokwasu w pozycji i w sekwencji A, E j (B i ) jest wartością E j dla aminokwasu w pozycji i w sekwencji B, zaś po uzyskaniu sekwencji aminokwasowej wyznaczanego epitopu dokonuje się syntezy chemicznej zwłaszcza z zastosowaniem osłony grup N- α-aminowych aminokwasów, szczególnie grupy fluorenylooksykarbonylowej (Fmoc) lub grupy butylooksykarbonylowej (Boc) oraz osłanianiem grup bocznych aminokwasów takich jak estry butylowe, estry benzylowe, etery butylowe, etery benzylowe i etery trytylowe, przy czym stosuje się osłanianie grupy karboksylowej aminokwasu estrem lub przyłącza do nośnika stałego. Jako czynnika sprzęgającego używa się związków aktywujących grupę karboksylową aminokwasów takich jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC), sole uroniowe, zwłaszcza fosforan 2-(1H-benzotriazolilo-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (HBTU) czy tetrafluoroboran 0-(1H-6-chlorobenzotriazolilo)- -1,1,3,3-tetrametylouroniowy (TCTU). Zsyntetyzowany peptyd uwalnia się działaniem odpowiadającej składowi peptydu mieszaniny, zwłaszcza zawierającej kwas trifluorooctowy. Korzystne jest, gdy surowy peptyd oczyszcza się metodą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), stosując zwłaszcza jako eluent narastający gradient rozpuszczalnika organicznego, szczególnie acetonitryl lub metanol, zaś zebrane frakcje po sprawdzeniu czystości i jednorodności łączy się i liofilizuje. Korzystne jest także, gdy poprawność syntezy potwierdza się doświadczalnie, zwłaszcza metodą spektroskopii mas oraz gdy dokonuje się sprawdzenia właściwości immunologicznych czynnika alergogennego metodą immunoblotingu. Sposób zgodny z wynalazkiem w porównaniu do tradycyjnej metody opisanej w stanie techniki, jest znacznie tańszy, ponieważ potrzebuje znacznie mniejszej gamy drogich odczynników chemicznych. Ponadto jest sposobem szybkim, gdyż nie wymaga kilkunastodniowej hodowli komórek grzybów, nie wymaga także skomplikowanej aparatury laboratoryjnej na etapie wyznaczania peptydu o charakterze epitopu. Z uwagi na całkowicie syntetyczne pochodzenie końcowego produktu gwarantuje brak zanieczyszczeń biologicznych w otrzymywanym materiale, co ma niebagatelne znaczenie w diagnostyce laboratoryjnej, produkcji szczepionek i testach mykologicznych. Ponadto charakteryzuje się szerokim zakresem stosowania w odniesieniu do różnych białek. Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania. Przykład dotyczy sposobu syntezy peptydu o charakterze epitopu dla przeciwciała IgE cząsteczki enolazy z grzyba pleśniowego Alteraría alternata. Etap 1. Porównanie sekwencji aminokwasowych siedmiu analizowanych enolaz Penicilium citrinum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Alternaría alternata, Rhodotorula rubra, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae o znanych sekwencjach z sekwencją enolazy Cladosporium herbarum o znanych strukturach dwóch epitopów wiążących IgE. Wykonuje się progresywne porównanie wielu sekwencji jednocześnie, przy użyciu programu Clustal X, przy zastosowaniu następujących parametów: macierz Blosum 30, G (kara za otwarcie przerwy) = 10, L (kara za wydłużenie przerwy) = 1. Wynik porównania pozwala na wyznaczenie prawdopodobnej struktury epitopów wiążących IgE w enolazie Alternaría alternata.
4 PL 208 762 B1 Etap 2. Manualna korekcja ewentualnych błędów powstałych w sporządzonym porównaniu, z użyciem programu GeneDoc oraz wyznaczenia epitopów wiążących IgE, na podstawie podobieństw w pierwszorzędowej sekwencji porównywanych białek, ze zmianą matrycy na PAM 20, w celu optymalnego dopasowania. Porównania dokonuje się w trybie cieniowania konserwatywnego. Stopień podobieństwa wyraża się kolorami: czarnym, ciemno szarym, jasno szarym i białym. Oznaczają one konserwatywność odpowiednio rzędu: 100%, 80%, 60% i mniej niż 60. W oparciu o otrzymany wynik wyznacza się wiążące epitopy IgE z podobieństwem wynoszącym ponad 90%. Etap 3. Sporządzenie narzędziem Peptide Similarity Search, które korzysta z procedury przeszukiwania 237 właściwości fizykochemicznych aminokwasów, listy peptydów o największej homologii do wyznaczonego w punkcie drugim epitopu. Podobieństwo między sekwencjami A i B o długości N reszt aminokwasowych oblicza się według wzoru: Wyniki przeszukiwania w znacznym stopniu optymalizują przewidywane w etapie 2 położenie epitopów w analizowanym białku. Uzyskuje się następującą sekwencję aminokwasową epitopu: HISDLAGTKK. Etap 4. Syntezy peptydu o charakterze epitopu wiążącego IgE o wyznaczonej sekwencji aminokwasowej HISDLAGTKK, dokonuje się zgodnie z przyjętymi standardami, w oparciu o metodę polegającą na sprzęganiu i wyborze grup osłonowych, która jest metodą nieracemizującą i stosunkowo łagodną, pozwalającą na otrzymanie peptydu z wysoką wydajnością. Spośród wielu metod tego rodzaju wybrano metodę opartą na grupach osłonowych fluorenylooksykarbonylowej (Fmoc) dla grup α-aminowych oraz grupach t-butyloksykarbonylowej (Boc) i trytylowej (Trt) jako osłony grup bocznych aminokwasów. Reszta β-karboksylowa kwasu asparginowego osłaniana była jako ester t-butylowy (O-t-Bu). Użyto następujące pochodne aminokwasowe : Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(Bu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc Asp(Bu)-OH, Fmoc-Ser(Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-His(Trt)-OH. Jako czynnik sprzęgający odpowiednio zabezpieczony aminokwas zastosowano 1 ekwiwalent tetrafluoroboranu O-(1-H-6-chlorobenzotriazoloilo-1)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego (TCTU) w obecności 1 ekwiwalentu N-hydroksybenzotriazolu (HOBt), jako czynnika zapobiegającego race-mizacji w obecności 2 ekwiwalentów diizopropyloetyloaminy (DIPEA). Do syntezy zastosowano żywicę Wanga z przyłączonym aminokwasem (Fmoc-Lys(Boc)-Wang). Grupę osłonową Fmoc usuwano dwukrotnym działaniem 25% roztworu DIPEA w dimetyloformamidzie (DMF) przez okres 3 20 minut. Aminokwasy sprzęgano używając 3x nadmiaru w N-metylopirolidonie jako rozpuszczalniku. Skuteczność przyłączenia aminokwasu sprawdzano testem Kaisera. Po każdym etapie żywicę intensywnie myto (6xDMF, 2xDCM). Po zakończonym procesie elongacji ostatnią grupę Fmoc usunięto, żywicę intensywnie zmyto stosując dodatkowe przemywania metanolem. Żywicę suszono pod zmniejszonym ciśnieniem około 0.1.Torr w czasie 24 godzin. Peptyd uwolniono jednocześnie, usuwając wszystkie grupy osłonowe działaniem mieszaniny kwasu trifluorooctowego (TFA) z wodą i triizopropylsilanem, jako zmiataczami karbokationów, w stosunku 95:2,5:2,5 przez 3 godziny, początkowo w temperaturze około 0 C, a następnie doprowadzono do temperatury pokojowej. Żywicę odsączono, przemyto 3 x TFA, a przesącze wlano do zimnego eteru t-butylowo-metylowego o temperaturze 4 C i wstawiono na 12 godzin do lodówki. Wydzielony peptyd odsączono, przemyto i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem dla pozbycia się resztek TFA i eteru, a następnie liofilizowano z wody. W tym etapie otrzymuje się surowy nieoczyszczony peptyd o określonej w etapie 3 sekwencji. Etap 5. Oczyszczenie surowego peptydu dokonuje się metodą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na odwróconej fazie. Jako eluent stosuje się narastający gradient rozpuszczalnika organicznego (80% acetonitryl w wodzie z dodatkiem 0.1% TFA) od 0 do 100% z monitorowaniem dwukanałowym, przy 215 i 254 nm. Zebrane frakcje, po sprawdzeniu czystości i jednorodności łączy się i liofilizuje. Poprawność syntezy potwierdza się metodą spektroskopii mas. Uzyskuje się oczyszczony peptyd o czystości co najmniej 99%.
PL 208 762 B1 5 Etap 6. Sprawdzenie właściwości immunologicznych (Immunobloting) zsyntetyzowanego epitopu, w celu doświadczalnego potwierdzenia metodą bioinformatyczną, dokonuje się przeciwciałami poliklonalnymi skierowanymi przeciw enolazie z Alternaria alternata. Wytworzony dekapeptyd charakteryzuje się zmierzoną masą cząsteczkową 1069,73, co odpowiada wzorowi teoretycznemu: C 40 H 80 N 14 O 15. Wykaz literatury 1) Simon-Nobbe B, Kodzius R, Kajava AV, Ferreira F, Kungl A, Achatz G, Carmeri R, Ebner C, Breitenbach M. (2001) Structure of an IgE-binding peptide from fungal enolases. Int. Arch. Allergy Immunol; 124:93-94. 2) Simon-Nobbe B, Probst G, Kajava AV, Oberkofler H, Susani M, Crameri R, Ferreira F, Ebner C, Breitenbach M. (2000) IgE-binding epitopes of enolases, a class of highly conserved fungal allergens. J. Allergy Clin. Immunol; 106:887-95. 3) Nicholas KB, Nicholas HB Jr. (1997) GeneDoc: a tool for editingand annotating multiple sequence alignments. Distributed by the author. 4) Thompson, JD, Gibson, TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins, DG. (1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res.; 24:4876-4882. 5) Piast M, Kustrzeba-Wójcicka I, Banaś T: Molecular evolution of enolase. Acta Biochim. Polon. 2005, 52:507-513. 6) Patent polski nr 189883 pt : Sposób otrzymywania enolazy z Candida albicans, C12N 9/88, uprawniony: Akademia Medyczna, Wrocław, twórca: Irena Kustrzeba-Wójcicka Zastrzeżenia patentowe 1) Sposób otrzymywania peptydów o charakterze epitopów wiążących immunoglobuliny IgE, zwłaszcza enolaz o właściwościach alergennych, w oparciu o znane standardy programów komputerowych, z zastosowaniem do syntezy chemicznej metody sprzęgania i wyboru grup osłonowych, znamienny tym, że najpierw wykonuje się progresywne porównanie sekwencji wybranych enolaz z co najmniej jedną enolazą o znanych sekwencjach epitopów IgE, za pomocą programu Clustal X, po czym dokonuje się manualnej korekcji ewentualnych błędów na podstawie podobieństw w pierwszorzędowej sekwencji porównywanych peptydów za pomocą programu GeneDoc i tworzy się listę peptydów homologicznych o największym podobieństwie do wyznaczonego wstępnie epitopu, obliczając podobieństwo między sekwencjami A i B o długości N reszt aminokwasowych według wzoru: gdzie α i jest wartością własną j-ego składnika E, E j (A i jest wartością E j dla aminokwasu w pozycji i w sekwencji A, E j (B j ) jest wartością E j dla aminokwasu w pozycji i w sekwencji B, zaś po uzyskaniu sekwencji aminokwasowej wyznaczanego epitopu dokonuje się syntezy chemicznej zwłaszcza z zastosowaniem osłony grup N- α-aminowych aminokwasów, szczególnie grupy fluorenylooksykarbonylowej (Fmoc) lub grupy butylooksykarbonylowej (Boc) oraz osłanianiem grup bocznych aminokwasów takich jak estry butylowe, estry benzylowe, etery butylowe, etery benzylowe i etery trytylowe, przy czym stosuje się osłanianie grupy karboksylowej aminokwasu estrem lub przyłącza do nośnika stałego, natomiast jako czynnika sprzęgającego używa się związków aktywujących grupę karboksylową aminokwasów takich jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC), sole uroniowe, zwłaszcza fosforan 2-(1H-benzotriazolilo-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (HBTU) czy tetrafluoroboran O-(1H-6-chlorobenzotriazolilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (TCTU), a zsyntetyzowany peptyd uwalnia się działaniem odpowiadającej składowi peptydu mieszaniny, zwłaszcza zawierającej kwas trifluorooctowy.
6 PL 208 762 B1 2) Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowy peptyd oczyszcza się metodą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), stosując najkorzystniej jako eluent narastający gradient rozpuszczalnika organicznego, korzystnie acetonitryl lub metanol, zaś zebrane frakcje po sprawdzeniu czystości i jednorodności łączy się i liofilizuje. 3) Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poprawność syntezy potwierdza się doświadczalnie, korzystnie metodą spektroskopii mas. 4) Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dokonuje się sprawdzenia właściwości immunologicznych czynnika alergogennego metodą immunoblotingu. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)