Fitochrom i transdukcja sygnału świetlnego. Phytochrome mediated light signal transduction

Fitochrom i transdukcja sygnału świetlnego Phytochrome mediated light signal transduction KAMIL FRANKOWSKI1, JACEK KĘSY2, JAN KOPCEWICZ3 Spis treści: I. Wprowadzenie II. Budowa i właściwości fitochromu III. Mechanizm działania fitochromu III-l. Fitochrom jako kinaza III-2.Drobnocząsteczkowe elementy szlaku sygnałowego III-3. Białkowe elementy szlaku sygnałowego III-3.1. Czynnik oddziałujący z fitochromem PIF3 III-3.2. Substrat aktywności kinazowej fitochromu PKS1 III-3.3. Kinaza dwufosforanów nukleotydów NDPK2 III-3.4. Białko supresorowe fitochromu A - SPA1 III-3.5. Białko FAR1 IV. Podsumowanie Contents: I. Introduction II. Structure and properties of phytochrome III. Mode of action of phytochrome III-l. Phytochrome as kinase III-2.Low molecular weight components of signal transduction pathway III-3. Protein components of light signaling III-3.1. Phytochrome Interacting Factor PIF3 III-3.2. Phytochrome Kinase Substrate PKS1 III-3.3. Nucleoside Diphosphate Kinase NDPK2 III-3.4. Suppressor of Phytochrome A SPA1 III-3.5. FAR1 Protein IV. Summary Wykaz stosowanych skrótów: bhlh zasadowy motyw helisa-pętla-helisa, CaM kalmodulina, cphl fitochrom sinic, cp hlr/fr fitochrom sinic w formie absorbującej światło czerwone lub daleką czerwień, FR-HIR reakcje wysokoenergetyczne wywołane światłem dalekiej czerwieni, GFP ang. Green Fluorescent Protein, HKLD domena podobna do kinazy histydynowej, LFR reakcje niskoenergetyczne, NLS Sekwencja Lokalizacji Jądrowej, PhyA PhyE geny fitochromowe, PhyA PhyE typy fitochromów, Pfr forma fitochromu absorbująca światło dalekiej czerwieni (FR), Pr forma fitochromu absorbująca światło czerwone (R), rcpl regulator odpowiedzi dwuskładnikowego systemu sinic, R-HIR reakcje wysokoenergetyczne wywołane światłem czerwonym, Ser/Thr aktywność kinazy serynowo-treoninowej, Ser/Thr/ Tyr aktywność kinazy serynowo-treoninowo-tyrozynowej, VLFR reakcje bardzo nisko energetyczne. I. W prow adzenie Rośliny wykształciły szereg mechanizmów, które pozw alają im przystosować się do zmian, jakie zachodzą w środowisku naturalnym. Jednym z najw a żniejszych czynników środowiskowych jest światło. W pływ energii świetlnej na rośliny jest wielokierun- Mgr, 2 dr, 3 prof. dr hab., Zakład Fizjologii i Morfogenezy Roślin, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 9, 87-100 Toruń; e-mail: kesy@biol.uni.torun.pl ko wy. Z jednej strony światło warunkuje syntezę związków organicznych w procesie fotosyntezy, z drugiej zaś, wpływa na wzrost i rozwój roślin w procesach fotomorfogenezy. Procesy fotomorfogenetyczne zachodzą podczas całego cyklu życiowego i obejmują dojrzewanie, kiełkowanie nasion, wzrost łodygi, powiększanie się liści, rozwój chloroplastów, syntezę chlorofilu oraz całego szeregu w a żnych związków organicznych, jak również kw itnienie, owocowanie i starzenie się roślin. Zakres fotomorfogenetycznie aktywnego światła znajduje się między 320 a 800 nm. Odbiornikami sygnałów świetlnych są w yspecjalizow ane fotoreceptory roślinne tzw. barwniki fotomorfogenetyczne, jak fitochromy, receptory światła niebieskiego (kryptochromy) oraz receptory bliskiego (UV-A) oraz dalekiego (UV-B) ultrafioletu. Za pom ocą tych fotoreceptorów rośliny odbierają informacje o ilościowych i jakościowych zmianach składu widma świetlnego oraz o czasie ekspozycji. N ajważniejszym i i najlepiej poznanymi fotoreceptoram i są fitochrom y absorbujące światło czerwone i dalekiej czerwieni. Obecność fitochromów stwierdzono w komórkach roślin niższych i wyższych, nie stwierdzono u grzybów. M orfogenezę roślin niższych i grzybów indukuje przede wszystkim światło niebieskie i ultrafioletowe. U roślin wyższych zasadniczą rolę w proce 184 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

sach fotomorfogenezy odgrywa czerwień i daleka czerwień. Fitochrom został odkryty na początku lat pięćdziesiątych przez B orthwicka, Hendricksa i współpracowników. W trakcie 48 lat, które upłynęły od tego czasu, badania koncentrowały się na poznaniu roli fizjologicznej, budowy m olekularnej, właściwości i subkomórkowej lokalizacji fitochromu [2-4]. Ostatnie lata przyniosły poznanie niektórych genów fitochromowych oraz rzuciły nowe światło na m olekularne m echanizm y funkcjonow a nia tego fotoreceptora. Aktualnie w centrum uwagi znajdują się mechanizmy przekazywania sygnału fitochromowego, prowadzące do zmian w ekspresji genów, co leży u podstaw obserwowanych efektów fotom orfogenetycznych. W procesach fotom orfogenezy istnieje więc pewna podstawowa sekwencja zdarzeń: FR Percepcja światła P rfr Transdukcja sygnału świetlnego Zm iana ekspresji genów Fotomorfogeneza Odpowiedź rośliny Opis biochemicznych mechanizmów transdukcji sygnału fitochrom owego jest głównym celem niniejszego opracowania. II. Budowa i właściwości fitochromu Fitochromy absorbują światło czerwone i dalekiej czerwieni dzięki fitochromobilinie (otwarta tetrapirolowa grupa chromoforowa), kowalencyjnie związanej z N-końcem apofitochrom u, a pochłaniana energia wywołuje odw racalne zm iany w chromocji o warunkach świetlnych do dalszych elementów szlaku transdukcji sygnałów, co prowadzi do zmian w ekspresji genów i pozwala roślinie odpowiednio dostosować się do środowiska. U Arabidopsis thaliana zidentyfikowano pięć genów kodujących białka fitochrom owe, które oznaczono PhyA-PhyE. U innych gatunków liczba genów kodujących apofitochrom jest różna, jednak uważa się, że wszystkie one są podobne do genów kodujących fitochrom A i B u Arabidopsis. Wyjątkiem jest tylko gen fitochromowy występujący u Ceratodon purpureus [5]. Ze względu na szybki proces degradacji fitochromu A w formie Pfr u roślin etiolowanych oraz na względnie dużą trwałość fitochromu B, C, D, E wyróżniono dwie pule tego fotoreceptora: lab iln ą kodowaną przez geny PhyA i stabilną kodowaną przez geny PhyB-PhyE. Fitochromy są rozpuszczalnymi w wodzie chromoproteinami o masie 120-130 kda, których cząsteczkę można podzielić na dwie części: N-końcową oraz C-końcową (Ryc. 1). N-końcowa część białka fitochromowego zawiera grupę chromoforow ą i odpowiada za właściwości spektralne fitochromu. C-koniec natom iast, dzięki obecności domen PAS (domeny PAS patrz ref. [6]), odpowiada za dimeryzację fotoreceptora i interakcje z innymi składnikami łańcucha transdukcji sygnałów. Powtórzenia PAS m ogą być też zaangażowane w oddziaływania wewnątrz pojedynczej cząsteczki fitochromu [7]. Natywny fitochrom występuje w formie dimeru. U owsa dwie 124 kda cząsteczki tej chromoproteiny łącząc się wiązaniami jonowymi i siłami elektrostatycznymi tw orzą dim er o m asie cząsteczkowej 253 Chromofor n h 2 [-... - r W t... PASA PASb HKLD \ COOH Ryc. 1. Schemat budowy fitochromu B, przedstawiający położenie grupy chromoforowej, domen PAS oraz przypuszczalnego miejsca występowania regionu o aktywności kinazy histydynowej HKLD [za 11, zmienione]. forze oraz konform ację białka. W kom órkach fitochromy syntetyzowane są w formie Pr wykazującej maksimum absorpcji światła przy 660 nm. Absorpcja światła czerwonego prowadzi do utworzenia formy fitochrom u pochłaniającej daleką czerwień, oznaczanej jako Pfr. Pochłonięciu św iatła dalekiej czerwieni przez formę Pfr towarzyszy natomiast fotokonwersja do Pr. Uważa się, że Pfr jest aktywną formą fitochrom u biorącą udział w przekazyw aniu informa- kda. M ogą istnieć homodimery Pr:Pr i Pfr:Pfr oraz heterodim ery Pr:Pfr. Dim eryzacja jest procesem niezbędnym dla uzyskania aktywności biologicznej fitochromu. Ostatnie badania z zastosowaniem białek fuzyjnych fitochrom-gfp dostarczają dowodów na to, że fitochromy mogą występować zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze [8, 9]. Możliwość występowania fitochrom u w jądrze potw ierdzają badania, w któ POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 185

rych wykazano występowanie na C-końcu cząsteczki fitochromu B (reszty 898-1172) dwuczęściowej, złożonej z 275 reszt aminokwasowych, sekwencji sygnału lokalizacji jądrow ej NLS {Nuclear Localization Signal lub Sequence) [10]. Istnienie takich sekwencji postuluje się także u innych typów fitochromów (Ryc. 1). Uzyskane wyniki sugerują, że transport fitochrom u do jądra m oże stanowić kluczowy etap w reakcji roślin na światło. III. Mechanizm działania fitochromu W zależności od warunków świetlnych, a także od czynników środowiska, do roślin dociera zróżnicowana ilość światła czerwonego i dalekiej czerwieni. Absorpcja światła o odpowiedniej długości fali, prowadząca do zmian konform acyjnych fitochrom u powoduje indukcję, bądź inhibicję, szlaków sygnalizacji wewnątrzkom órkowej, poprzez które pośredniczy on w reakcjach rośliny na światło. Współczesne badania zmierzające do wyjaśnienia roli fitochrom u w przekazyw aniu sygnałów św ietlnych skupiają się na badaniach właściwości kinazowych tego fotoreceptora oraz poszukiw aniu potencjalnych składników łańcucha transdukcji, które są przez sygnał świetlny urucham iane. III-I. Fitochrom jako kinaza Od dawna zastanawiano się czy fitochrom może być enzymem, którego aktywność jest regulowana przez światło [12]. Niektóre doniesienia sugerowały, że fitochrom jest białkową kinazą serynowo-treoninową (Ser/Thr), której stymulatorami sąpolikationy a inhibitorem pirofosforan [13]. Jednak wobec braku w cząsteczce fitochrom u sekwencji odpow iedzialnych za w iązanie ATP, charakterystycznych dla kinaz serynowo-treoninowych i tyrozynowych (Ser/ Thr/Tyr), koncepcja ta w zbudziła wiele wątpliwości. W łaściw ościam i kinazow ym i fitochrom u zainteresowano się ponownie, kiedy zauważono, że C-końcowa dom ena fitochrom u roślin wyższych jest podobna do części przekaźnikowej dwuskładnikowych bakteryjnych kinaz histydynowych [14]. Ponadto u Fremyella diplosiphon i Synechocystis zidentyfikowano geny kodujące białka strukturalnie podobne do takich kinaz, a jednocześnie podobne do fitochromów roślin wyższych [15, 16]. Dwuskładnikowe kinazy histydynowe, w skład których wchodzi białko receptorowe i białko efektorowe, są układam i pozw alającym i reagować bakteriom na zmieniające się warunki środowiska [17]. N-końcowa domena białka receptorowego bierze udział w odbiorze sygnału ze środowiska, natomiast jego dom ena C-końcowa, posiadająca aktywność kinazy histydynowej, fosforyluje białko efektorowe (tzw. regulator odpowiedzi). Regulator odpowiedzi oddziałuje z kolejnym i elem entam i szlaku transdukcji sygnałów, bądź bezpośrednio z sekwencjami prom otorowymi odpowiednich genów. Zidentyfikowane u sinicy Synechocystis sp. białko cphl (ang. cyanobacterial phytochrome 1) i białko rcpl (ang. response regulator fo r cyanobacterial phytochrome) funkcjonują właśnie jako dwuskładnikowy układ fotoreceptorowy [16]. Białka cphl i rcpl zaw ierają dwie domeny, podobne do domen receptora i regulatora odpowiedzi dw uskładnikowych bakteryjnych kinaz białkowych. N-końcowa domena cphl jest związana z grupą chromoforową i przypomina N-końcową domenę fitochromu roślin wyższych, podczas gdy C-koniec podobny jest do kinazy histydynowej systemu dwuskładnikowego. Białko cphl uzyskane z komórek E. coli, do którego przyłączono fikocyjanobiliny, podobne do chromo-?? O dpowiedź Ryc. 2. Schemat przedstawiający działanie fitochromów sinic [za 20, zmienione]. Forma Pr fitochromu sinic cphl ulega autofosforylacji w miejscu reszty histydynowej i następnie przenosi grupę fosforanową na resztę asparaginianu regulatora odpowiedzi rcpl, który oddziałuje z kolejnymi elementami łańcucha transdukcji sygnałów. 186 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

forów fitochromów roślin wyższych, wykazywało fotoodwracalność i ulegało autofosforylacji na reszcie histydyny [18]. Proces ten zachodził intensyw niej po naświetleniu daleką czerwienią. Ponadto forma Pr cphl fosforylowała rcpl, podczas gdy forma Pfr nie wykazywała takiej aktyw ności (Ryc. 2). Nie wiadomo, czy fitochrom roślin wyższych w y kazuje podobne w łaściw ości, jednakże zarówno forma Pr, jak i Pfr fitochromu owsa może fosforylować białko rcpl [19]. W tej sytuacji fosforylacji ulegała jednak nie reszta asparaginy, jak to ma miejsce w przypadku kinaz histydynowych, a reszta seryny, co sugeruje, że fitochrom zachowuje się jak kinaza Ser/Thr. W związku z tym postuluje się, że fitochrom roślin wyższych zachował aktywność kinazy histydynowej, w której reszta fosforanow a jest intensyw nie przenoszona na serynę [21, 22], M ożliwość funkcjonow ania fitochrom u jako kinazy serynowo-treoninowej postulow ano już w cześniej, kiedy u m szaka Ceratodon purpureus zidenty- Skłoniło ich to do sugestii, że ufosforylow ana tyrozyna może służyć jako miejsce wiązania białek mających domeny SH2, rozpoznających jedną z dwóch specyficznych sekwencji aminokwasowych: ptyr-hydrofilowy-hydrofilowy-hydrofobowy lub ptyr-hydrofobow y-dow olny-hydrofobow y. A utorzy doliczyli się sześciu takich sekwencji w fitochromie A owsa. III-2. Drobnocząsteczkowe elementy szlaku sygnałowego P -P,r------ - GP Pr_Swiatto^ p(r---->qp Charakterystycznymi reakcjami rośliny na światło czerwone i daleką czerwień są: ekspresja genów białek PSI i PSII (fnr, cab) oraz genów odpowiedzialnych za biosyntezę antocyjanów (chs). Stosując m ikroiniekcje do subepiderm alnych komórek hipokotyla m utanta pom idora Aurea specyficznych agonistów i antoganistów białek G w ykazano, że jednym z pierwszych etapów przekazania sycgmp cgmp chs-gus fnr-gus Ryccab-GUS chs-gus fnr-gus cab-gus 3. Schemat przedstawiający udział substancji drobnocząsteczkowych w szlakach sygnałowych fitochromu [za 28, zmienione]. Szczegóły w tekście, ł. Represja łańcucha transdukcji sygnałów zależnego od cgmp przez szlak obejmujący Ca2+/CaM. 2. Represja szlaku sygnałowego zależnego od Ca2+/CaM oraz od cgmp i Ca2+/CaM przez kaskadę z udziałem cgmp. Oznaczenia strzałek: pełne fotokonwersja fitochromu; puste kolejne etapy przekazywania sygnałów, tępo zakończone negatywna regulacja jednego szlaku przez inny. GP białka G. fikowano białko fitochromowe, którego N-końcowa domena wykazywała cechy pośrednie pomiędzy fitochromem A i B Arabidopsis, a domena C-końcowa posiadała sekwencje aminokwasowe homologiczne do eukariotycznych kinaz Ser/Thr/Tyr [5, 23, 24]. Właściwości kinazy Ser/Thr wykazują także fitochromy uzyskane z owsa i z algi zielonej (Mesotaenium caldariorum), przy czym bardziej aktywną formą pod względem autofosforylacji jest Pfr. Formy Pr i Pfr w równym stopniu, fosfory luj ą histon H 1, który z kolei stymuluje autofosforylację głównie formy Pr [19]. Fosforylację reszt tyrozyny w fitochrom ie w badaniach in vitro wykazali Sommer i wsp. [25]. gnału fitochromowego jest aktywacja tych heterotrimerycznych białek (Ryc. 3) [26]. W doświadczeniach z wykorzystaniem Ca2+ i aktywowanej kalmoduliny stwierdzono, że cząsteczki te częściowo zastępują fitochrom A stymulując ekspresję cab-gus oraz syntezę białek kompleksu fotosyntetycznego PSII reakcje, których brakiem cechuje się mutant. Natom iast koiniekcje cgmp, jonów Ca2+, oraz inhibitorów i aktywatorów białek G wykazały, że cgmp aktywuje ekspresję chs-gus, a w połączeniu z wapniem fnr-g U S [27-29]. Na podstawie tych doświadczeń wyciągnięto wniosek, że cgmp działa jako wtórny przekaźnik na szlaku prowadzącym od fitochrom u do syntezy anto- POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 187

cyjanów, a w połączeniu z Ca2+ i CaM do syntezy białek fotosystemu PSI, podczas gdy sam Ca2+ i CaM pośredniczą w biosyntezie białek fotosystem u PSII. Ostatecznie sugeruje się, że w szlaku transdukcji sygnału fitochromowego: 1. aktywacja kaskady reakcji zależnych od Ca2+/CaM hamuje szlak przemian metabolicznych zależny od cgmp i nie ma wpływu na przemiany zależne od cgmp i Ca2+/CaM, 2. aktywacja łańcucha sygnałowego zależnego od cgmp powoduje zaham owanie kaskady zależnej od Ca2+ i CaM, jak również od cgmp i Ca2+/CaM. III-3. Białkowe elementy szlaku sygnałowego Poszukiwania czynnika białkowego, który w chodziłby w bezpośrednie interakcje z fitochromem będącym zarazem pierwszym ogniwem łańcucha transdukcji sygnałów, wynikał z przyjętej w przeszłości koncepcji, że fitochrom jest kinazą białkową. W ostatnich latach można obserwować wyraźny postęp w badaniach, m ających na celu zidentyfikowanie dom niemanego białka. III-3.1. Czynnik oddziałujący z fitochrom em PIF3 Jednym z najwcześniej zidentyfikow anych czynników wchodzących w interakcję z fitochromem jest PIF3 (ang. Phytochrom e-interacting Factor 3), uzyskany z Arabidopsis thaliana za pom ocą drożdżoweświetlnych [30, 31]. Według A. G. v o n Arnim a [32], m ożliwe jest, że PIF3 m oduluje aktyw ność genów, których produkty kontrolują ekspresję niżej leżącej kaskady genowej, lub też może działać jako czynnik modulujący aktywność innych białek regulatorowych. W badaniach in vitro wykazano, że PhyB wiąże PIF3 tylko po indukowanej światłem konwersji do formy aktywnej, a wtórna fotokonwersja do formy nieaktywnej powoduje oddysocjowanie PIF3 [31]. Ustalono również, że naśw ietlanie daleką czerw ienią, bezpośrednio po czerwieni, powoduje brak wiązania PIF3, co wskazuje, że PIF3 przyłącza się głównie (jeśli nie w yłącznie) do formy Pfr fitochromu B. Nie wiadomo jednak czy przekazaniu sygnałów od PhyB do PIF3 towarzyszy transfosforylacja. Ponieważ C-końcowe dom eny PhyA i PhyB są podobne, uważa się, że PIF3 wiąże się z fitochromami obu typów. Tezę tę potwierdziły badania na roślinach transgenicznych, w których wykazano, że PIF3 jest niezbędny dla normalnego przekazywania sygnałów zarówno w przypadku fitochrom u A, jak i fitochromu B [30]. Występowanie wspólnego dla PhyA i PhyB białka sygnałowego sugeruje zbieżność łańcucha przem ian m etabolicznych obu fitochromów. Wydaje się zatem, że PIF3 jest poważnym kandydatem na uniwersalnego pośrednika, przekazującego sygnał od fitochromu. Dotychczas nie ustalono jed nak czy PIF3 jest substratem dla aktywności kinazo- T E z t Ryc. 4. Schemat budowy białkowego czynnika oddziałującego z fitochromem PIF3, z zaznaczeniem położenia domen: PAS, NLS oraz zasadowej domeny helisa-pętla-helisa (bhlh) [za 11, zmienione]. go systemu dwuhybrydowego [30]. Jest to białko złożone z 524 aminokwasów zawierające charakterystyczny dla czynników transkrypcyjnych zasadowy motyw helisa-pętla-helisa (bhlh) oraz domenę PAS odpowiedzialną prawdopodobnie za jego oddziaływanie z fitochromem (Ryc. 4). PIF3 zawiera również w swej cząsteczce klasyczną dwuczęściową sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS). Lokalizację jądrow ą tego białka wykazano eksperymentalnie [30]. Obecność domeny bhlh oraz sekwencji wiążących fitochrom w białku PIF3 sugeruje istnienie bezpośredniego szlaku sygnałowego prowadzącego od fitochrom ów do genów, które są uruchamiane w zależności od panujących warunków wej fitochromu. Niejasne jest również czy PIF3 i inne białka regulatorowe uczestniczące w fotomorfogenezie (np. COP1) regulują te same geny docelowe i czy możliwe są ich interakcje. III-3.2. Białko PKS1 Innym czynnikiem, wchodzącym w interakcje z fitochromami jest PKS1 (ang. Phytochrome Kinase Substrate 1) cytozolowe zasadowe białko złożone z 439 aminokwasów, nie posiadające żadnych charakterystycznych sekwencji czy motywów [33]. Badania wykazały, że PKS1 wiąże się zarówno z fitochromem A jak i B i jest przez obydwa fosforylowany. Fosforylacji ulegała seryna i treonina, przy czym 188 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

reakcja przebiegała intensywniej w przypadku formy Pfr [33]. Rośliny transgeniczne, w których PKS 1 ulegał nadekspresji charakteryzow ały się fenotypem podobnym do mutantów nie posiadających fitochromu były niewrażliwe na światło czerwone, ale wykazywały normalne reakcje na światło niebieskie i daleką czerwień [33]. Wobec faktu, że fitochrom B jest głównym receptorem światła czerwonego sugeruje się, że PKS 1 jest inhibitorem jego szlaku sygnałow e go. Prawdopodobnie PKS1 moduluje aktywność kinazową fitochromu B lub reguluje jego subkomórkową lokalizację. III-3.3. Kinaza dw ufosforanów nukleotydów NDPK2 Kolejnym prawdopodobnym ogniwem łańcucha trandsukcji sygnału fitochromowego jest NDPK2 (ang. Nucleoside DiPhosphate Kinase 2). Rekombinowany NDPK2 z Arabidopsis preferencyjnie wiązał się in vitro do formy Pfr fitochromu A izolowanego z owsa [34]. Związanie się do fitochromu Pfr owsa wzmagało aktywność NDPK2 o około 70% w stosunku do samego NDPK2, podczas gdy forma Pr nie wywoływała żadnego efektu [34], Inne białka z rodziny NDPK (np. NDPK1, NDPK3) nie oddziałują specyficznie z fitochrom em. Mutant ndpk2 Arabidopsis, który nie posiadał NDPK2, odznaczał się nieznacznym zmniejszeniem wrażliwości na indukowane światłem czerwonym wydłużanie się hypokotyla oraz silnym hamowaniem reakcji zazieleniania się i otwierania liścieni [35]. W skazuje to na udział białka NDPK2 w wysokoenergetycznych reakcjach (R-HIR) rośliny na światło pośredniczone przez fitochrom B. Brak reakcji otw ierania się liścieni i prostowania hypoktyla u tego mutanta w efekcie działania dalekiej czerwieni, świadczy także o udziale NDPK2 w w ysokoenergetycznych reakcjach pośredniczonych przez fitochrom A (FR-HIR). W komórce NDPK2 zlokalizowany jest na terenie jądra i cytoplazmy w regionach otaczających chloroplasty, czyli w przedziałach, w których w ystępuje również fitochrom. III-3.4. Białko supresorow e fitochrom u A SPA1 Białko SPA1 (ang. Suppressor o /P h y A -105) zostało zidentyfikowane dzięki m utantow i Arabidopsis, który ulegał deetiolacji na ciągłym świetle dalekiej czerwieni reakcji specyficznej dla fitochromu A [36]. Gen SPA1 koduje białko o masie 114 kda, posiadające cztery powtórzenia WD (Tryptofan Asparaginian) w C-końcowej części, charakterystyczne dla białek w chodzących w interakcje z innymi białkami [37]. Region, w którym występują posiada wysokie podobieństwo sekwencji do represora fotomorfogenezy COP1, który podobnie jak inne czynniki, np. DET lub FUS powoduje represję genów, których ekspresja jest indukowana światłem [35, 38]. Poza domeną zawierającą powtórzenia WD, SPA1 posiada również dom enę coiled-coil (solenoid) o podobnej funkcji leżącą po stronie N-końcowej. Białko SPA1 zawiera jednocześnie domeny, z których kilka jest charakterystycznych dla kinaz serynowo-treoninowych i tyrozynowych, w tym motyw wiążący mononukleotydy. Jednakże według Hoeck e r a i wsp. [37], SPA1 nie posiada kilku kluczowych reszt aminokwasowych, niezmiennych wśród członków superrodziny kinaz białkowych, co może podważać pogląd, że SPA1 jest klasyczną kinazą białkową. W cząsteczce SPA1 zidentyfikowano dwie sekwencje lokalizacji jądrowej (NLS), co jest zgodne z wynikami doświadczeń potwierdzających jądrową lokalizację tego białka [37]. Wynika z tego, że SPA1 może bezpośrednio kontrolować ekspresję genów. Poziom transkryptów SPA1 podnosi się, gdy rosnące w ciemności siewki poddaje się działaniu czerwieni lub dalekiej czerwieni [37]. U m utanta pozbawionego genu PhyA nie obserwowano pow iększenia się poziomu transkryptów. Doświadczenia na mutantach fitochromu B i mutantach podwójnych wskazują także na udział pozostałych fitochromów w kontroli transkrypcji SPA1 [37]. Na podstawie uzyskanych wyników proponuje się mechanizm, w którym kluczowym etapem regulacji odpowiedzi rośliny na światło są specyficzne, indukowane przez PhyA, modyfikacje białka SPA1 w efekcie których aktywowana jest jego funkcja represorowa [37]. Alternatywnie, SPA1 może regulować aktywność PhyA lub pośredniczyć w specyficznym dla PhyA szlaku transdukcji sygnałów. Możliwe jest też, że indukowany czerw ienią wzrost poziom u transkryptów SPA1 odgrywa ważną rolę w wyłączaniu PhyA ze szlaku sygnałowego prowadzącego od czerwieni, a tym samym nadaje specyficzną czułość fitochromowi A na światło dalekiej czerwieni [37]. III-3.5. Białko FAR1 Na podstaw ie analizy zm utowanych roślin Arabidopsis thaliana zauważono, że niektóre z nich charakteryzowały się obniżoną wrażliwością na daleką czerwień, co nie było spowodowane niższym poziomem PhyA [39]. M utanty te nazwano f a r l (ang. POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 189

FAR-red-impaired response). Ich wrażliwość na czerwień była taka sama lub większa w porównaniu z roślinami dzikimi, co doprowadziło do przekonania, że są to mutanty szlaku sygnałowego fitochrom u A [39]. Znaleziony u Arabidopsis gen FAR1 jest członkiem wielogenowej rodziny, której hom ologi w ystępują u innych roślin. Locus FAR1 położony jest na chromosomie czwartym w pobliżu loci PhyD, PhyE, COP9 [39]. tego genu jest konstytutywna i nie zależy od długości fali świetlnej [39]. Otrzymane na bazie cdna białko FAR1 (827 reszt aminokwasowych, 95,4 kda), zawiera domenę coiled-coil i nie wykazuje znaczącej homologii ze znanymi białkami. U Arabidopsis występują trzy inne geny FRS1, FRS2, FRS3 (FAR1 -Related Sequence), charakteryzujące się dużym stopniem podobieństwa z FAR1. FAR1 orazfr S2 zaw ierają zasadowy region będący sygnałem lokalizacji jądrowej, co przemawia za jądrow ą lokalizacją tych dwóch białek. Natom iast FRS1 i FRS3, w ystępują praw dopodobnie w cytoplazmie. transkrypcję przez oddziaływanie z kompleksami wiążącymi DNA. W tym przypadku rodzina genów FAR1 byłaby now ą klasą regulatorów transkrypcji. IV. Podsumowanie W ostatnich latach jesteśm y świadkami ogrom nego postępu w rozum ieniu m olekularnych m echanizmów działania fitochrom u. Światło indukując zm iany konform acyjne tego białka wpływa na jego stabilność (w przypadku fitochrom u A), lokalizację komórkową [8, 9], aktywność kinazową [18,19, 21,22] i oddziaływania z innymi składnikami łańcucha transdukcji sygnału [30, 33, 34, 36, 39]. Przedstawione w niniejszej pracy dane sugerują, że fitochromy wchodzą w interakcje z różnymi cząsteczkami efektorow ym i i regulują ich funkcje. W jednym z możliwych mechanizmów zakłada się, że fitochrom Pr w cytoplazmie tworzy kompleks z PKS1 (Ryc. 5). Pod wpływem światła czerwonego fitochrom fosforyluje PKS1 w efekcie czego kom pleks ulega rozpadowi i fitochrom wędruje do jądra. Ryc. 5. Proponowany schemat przebiegu procesów transdukcji sygnałów fitochromowych [za 32, zmienione]. W aktywacji regulowanych światłem genów uczestniczy kompleks phyb PIF3. Geny znajdują się pod dodatkową kontrolą czynników specyficznych dla phya (SPA1, FAR1) lub też ogólnych regulatorów (COP/DET/FUS, COP1, HY5). Szczegółowy opis w tekście. Zakłada się, że FAR1 jest elementem (jednego lub wielu) szlaku sygnałowego fitochromu A (Ryc. 4), bądź też jego pozytywnie działającym regulatorem oraz że może działać powyżej lub poniżej, w spólnego dla fitochromu A i B, czynnika PIF3 i to zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze. Natomiast homologi FAR1 FRS1, FRS2 i FRS3 mogą mieć istotne znaczenie pod nieobecność FAR1 [39]. FAR1, podobnie jak SPA1, a w odróżnieniu od PIF3, nie zawiera motywów odpowiedzialnych za wiązanie DNA, takich jak bhlfi, nie wykazuje też homologii z białkami wiążącymi DNA. Uważa się więc, że FAR1 może jako koaktyw ator regulować W jądrze fitochrom może oddziaływać z białkami takimi jak PIF3, FAR1, SPA1 i NĘ)PK2 wpływając na aktywność tran skry pcyjną innych elem entów regulatorowych lub bezpośrednio na geny zaangażowane w odpowiedzi wzrostowe. Niektóre ze składników łańcucha w ydają się być wspólne dla szlaków sygnałowych fitochromu A i B (PIF3, PKS1, NDPK2), a część (SPA1, FAR1) jest charakterystyczna tylko dla fitochromu A. Zidentyfikow ane w ostatnich latach białka, oddziałujące z fitochrom am i, praw dopodobnie reprezentują tylko część możliwych jego partnerów, a przedstaw iony m echanizm jest zgodny jedynie z re 190 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

akcjami typu VLFR i FFR. Nie uwzględnia on interakcji fitochromu z innymi fotoreceptorami oraz wielu bardzo szybkich reakcji rośliny na światło, takich jak zmiany potencjałów błonowych, pojawiających się w czasie znacznie krótszym niż czas translokacji fitochrom u do jądra i aktyw acja transkrypcji. P o d zięk o w a n ia Praca została zrealizowana w ramach grantu KBN nr 6P04C 056 16. Piśmiennictwo Artykuł otrzymano 27 stycznia 2001 r. Zaakceptowano do druku 13 marca 2001 r. 1. Borthwick H A, Hendries S B, Parker M (1952)Proc Natl Acad Sei 38: 929-934 2. TretynA,WiśniewskaJ (1996) Post Biochem 42: 57-104 3. Tretyn A, Wiśniewska J, Jaworski K (1997) Post Biot Kom 25: 225-250 4. Kopcewicz J, Tretyn A, Cymerski M (\992) Nt\ Fitochrom i Morfogeneza Roślin. PWN, Warszawa: 58-108 5. Thiimmler F, Algarra P, Fobo G M (1995) FEBS Lett 357: 149-155 6. Pomting C, Aravind L (1997) Curr Biol 7: 674-677 7. NeffM, Fankhauser C, Chory J (2000) Genes Dev 14: 257-271 8. Kircher S, Kozma-Bognar L, Kim L, Adam E, Harter K, Schäfer E, Nagy F (1999) Plant Celi 11: 1445-1456 9. Yamaguchi R, Nakamura M, Mochizuki N, Kay S A, Nagatani A (1999) J Celi Biol 145: 437-445 10. Sakamoto K, Nagatani A (1996) Plant J 10: 859-868 11. Whitelam G C, Halliday K J (1999) Curr Biol 9:225-227 12. Borthwick H A, Hendricks S B (1960) Science 132: 1223-1228 13.Wong Y S, Cheng H C, Walsh D A, Lagarias J C (1986) J Biol Chem 261: 12089-12097 14. Schneider-Poetsch H A (1992) Photochem Photobiol 56: 839-846 15. Kehoe D M, Grossman A R (1996) Science 273: 1409-1412 16. Yeh K C, Wu S H, Murphy J T, Lagarias J C (1997) Science 211: 1505-1508 17. Nixon B, Ronson C, Ausubel F (1986) Proc Natl Acad Sei 83: 7850-7854 18.Hughes J, Lamparter T, Mittmann F, Hartmann E, Gärtner W, Wilde A, Börner T (1997) Aaiwe 386: 663 19. Yeh K C, Lagarias J C (1998) Proc Natl Acad Sei 95: 13976-13981 20. Reed J W (1998) Trends Plant Sei 3: 43-44 21.Cashmore A R (1998) Proc Natl Acad Sei 95: 13358-13360 22. El ich T D, Chory J (1997) Cell 91: 713-716 23. Schneider-Poetch H A, Braun B, Marx S, Schaumburg A (1991) FEBS Lett 281: 245-249 24. Thümmler F, Beetz A, Rüdiger W (1990) FEBS Lett 275: 125-129 25. Sommer D, Wells T A, Song P S (1996) FEBS Lett 393: 161-166 26. Neuhaus G, Bowler C, Kern R, Chua N H (1993) Cell 73: 937-952 27. Bowler C, Neuhaus G, Yamagata H, Chua N H (1994) Cell 77: 73-81 28.Bowler C, Yamagata H, Neuhaus G, Chua N H (1994) Genes Dev 8 : 2188-2202 29. Neuhaus G, Bowler C, Hiratsuka K, Yamagata H, Chua N H (1997) EMBO J 16: 2554-2564 30. Ni M, Tepperman J M, Quail P H (1998) Cell 95: 657-667 31. Ni M, Tepperman J M, Quail P H (1999) Nature 400: 781-84 32. von Arnim A (1999) Trends Plant Sei 4: 465-466 33. Fankhauser C, Yeh K C, Lagarias J C, Zhang H, Elich T D, Chory J (1999) Science 284: 1539-1541 34. Choi G, Yi H, Lee J, Kwon Y K, Soh M S, Shin B, Luka Z, Hahn T R, Song P S (1999)Nature401:610-613 35.Batschauer A (1999) Cell Mol Life Sei 55: 153-165 36. HoeckerU, Xu Y, Quail P H (1998) Plant Cell 10: 19-33 37. Hoecker U, Tepperman J, Quail P H (1999) Science 284: 496-499 38.Deng X W, Matusi M, Wei N, Wagner D, Chu A M, Feldmann K A, Quail P H (1992) Cell 71: 791-801 39. Hudson M, Ringli C, Boylan M T, Quail P H (1999) Genes Dev 13: 2017-2027 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 191