Część V: Przekazywanie sygnałów. DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski

Transkrypt

1 MATERIAŁY PMCNICZE D WYKŁADÓW Z PDSTAW BIFIZYKI IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski PRZEKAZYWANIE SYGNAŁÓW Cechą charakterystyczną układów żywych jest zdolność do zachowywania wewnętrznej homeostazy układu (komórki, organizmu) w zmieniającym się otoczeniu. Nawet najprostsza komórka zawiera dziesiątki systemów, których współdziałanie niezbędne jest dla utrzymania homeostazy komórki. Sytuacja komplikuje się jeszcze dodatkowo w przypadku organizmów wielokomórkowych, w których zapewniona być musi koordynacja działania: - poszczególnych komórek w ramach tkanek - poszczególnych tkanek w ramach narządów i układów - poszczególnych układów w ramach całego organizmu. Utrzymywanie współdziałania poszczególnych systemów wymaga wymiany informacji pomiędzy nimi. Nośnik sygnału Wzmacniacz... Nadajnik dbiornik Efektor Zgodnie z teorią przekazu informacji każdy układ sygnalizacyjny musi składać się z: nadajnika sygnału czynnika przenoszącego sygnał odbiornika i wzmacniacza sygnału efektora, czyli systemu reagującego na obecność lub brak sygnału. dbiór sygnałów ł zewnątrzkomórkowych Niezbędnym warunkiem zachowania homeostazy jest odizolowanie się komórki od otaczającego ją środowiska. Funkcję tą spełnia przede wszystkim błona komórkowa stanowiąca barierę transportową dla prawie wszystkich składników środowiska. Jednakże całkowita izolacja komórki od otoczenia nie jest możliwa. Komórka pobiera ze środowiska składniki odżywcze niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania i rozwoju i usuwa do środowiska zbędne i często szkodliwe produkty przemiany materii. 1

2 Z punktu widzenia optymalnej strategii przetrwania w zmieniającym się środowisku komórka powinna mieć możliwość uzyskiwania informacji o stanie tego środowiska. Informacja ta powinna mieć charakter wyprzedzający (ostrzegawczy), czyli pojawić się w komórce wcześniej niż stan środowiska wpłynie (zwykle niekorzystnie) na stan samej komórki. Cząsteczka sygnałowa Większość informacji o stanie środowiska odbieranych przez pojedynczą komórkę ma charakter chemiczny: nośnikiem sygnału jest stężenie określonego związku chemicznego pełniącego rolę cząsteczki Hormon sterydowy Receptory błonowe sygnałowej. Jest przy tym charakterystyczne, że zdecydowana większość znanych cząsteczek sygnałowych nie wnika do wnętrza komórki. Wyjątkiem są hormony sterydowe, które na drodze biernej dyfuzji przenikają przez błonę komórkową i docierają do jądra wpływając na profil ekspresji genów. Cząsteczka sygnałowa Na powierzchni komórki znajdują się białka pełniące funkcję receptora sygnału. Po związaniu cząsteczki sygnałowej (liganda) receptor zmienia swoją strukturę III- i IV-rzędową, również po wewnętrznej stronie błony. Błona Błona Cząsteczka sygnałowa Receptor Receptor W ten sposób, poprzez zmianę konformacji białka transbłonowego, do wnętrza komórki przekazywana jest informacja o pojawieniu się cząsteczki sygnałowej. Receptory błonowe mają duże powinowactwo do ligandu i mogą reagować na stężenia nanomolowe (10-9 mola/l). Wzmacniacze sygnału Jednakże aby komórka zareagowała na pobudzenie receptora sygnał musi ulec wzmocnieniu (multiplikacji). Receptor stanowi zwykle część kompleksu białkowego w skład którego wchodzi 2

3 ponadto układ wzmacniający sygnał. Wzmocnienie sygnału polega na wygenerowaniu odpowiednio dużej liczby cząsteczek lub jonów stanowiących wtórną cząsteczkę sygnałową. Znanych jest wiele wtórnych cząsteczek sygnałowych i wiele sposobów ich wytwarzania w odpowiedzi na zmianę konformacyjną białka receptorowego. Układy wzmacniające można z grubsza zaliczyć do jednej z dwóch klas: wzmacniaczy enzymatycznych, lub wzmacniaczy kanałowych. Zasada działania wzmacniaczy enzymatycznych polega na uaktywnieniu enzymu lub układu enzymatycznego na skutek zmiany konformacji wewnątrzkomórkowej domeny białka receptorowego. Uaktywniony enzym wytwarza szereg wtórnych cząsteczek sygnałowych w odpowiedzi na związanie z receptorem pojedynczej zewnątrzkomórkowej cząsteczki sygnałowej. Błona Błona Cząsteczka sygnałowa Wtórna cząsteczka sygnałowa Receptor Wtórna cząsteczka sygnałowa Receptor Wzmacniacz enzymatyczny Cząsteczka sygnałowa Wzmacniacz kanałowy Receptory błonowe korzystające ze wzmacniaczy kanałowych są w istocie kanałami jonowymi bramkowanymi zewnątrzkomórkową cząsteczką sygnałową. Związanie jednej lub kilku cząsteczek sygnałowych wywołuje otwarcie kanału i napływ określonych jonów, np. Ca 2+, do wnętrza komórki. W przypadku wzmacniaczy kanałowych stopień wzmocnienia jest zwykle bardzo duży, gdyż wtórną cząsteczką sygnałową są w tym przypadku jony napływające do komórki. Wygaszenie sygnału Związanie cząsteczki sygnałowej z receptorem uruchamia szlak przekazu sygnału. Jednakże, aby komórka mogła reagować na aktualny stan środowiska sygnał z receptora musi zostać wygaszony. W przeciwnym razie komórka utraci zdolność reagowania na nowe sygnały. Proces sygnalizacyjny, którego nie udało się zakończyć we właściwy sposób, może być przyczyną wielu poważnych chorób, w tym nowotworów. Wygaszanie sygnału odbywać się może na trzech poziomach: 1. receptora 2. wzmacniacza 3

4 3. wtórnej cząsteczki sygnałowej Ad.1: Ponieważ oddziaływanie liganda z receptorem ma charakter równowagowy, więc spadek stężenia liganda w otoczeniu powoduje jego oddysocjowanie od receptora. W efekcie w receptorze dochodzi do zmian konformacyjnych przywracających geometrię początkową. Prowadzi to do zatrzymania pracy wzmacniacza i zaprzestania wytwarzania wtórnej cząsteczki sygnałowej. Dysocjacja Kinaza receptorowa Fosforylacja Ad.2: W przypadku niektórych szlaków sygnalizacyjnych wykryto mechanizm wygaszania sygnału poprzez oddziaływanie na efektywność pracy wzmacniacza. Ten mechanizm regulacyjny zapobiega nadmiernemu gromadzeniu się wtórnych cząsteczek sygnałowych w przypadku długotrwałego działania ligandu. Ad.3: Przerwanie procesu sygnalizacyjnego na poziomie receptora lub wzmacniacza nie jest równoznaczne z wygaśnięciem sygnału: w dalszym ciągu w komórce obecne jest duże stężenie wtórnej cząsteczki sygnałowej. Dlatego każdy proces sygnalizacyjny musi być wyposażony w mechanizm wygaszania działający na poziomie wtórnej cząsteczki sygnałowej. Wtórne cząsteczki sygnałowe wytwarzane przez wzmacniacz enzymatyczny są zwykle rozkładane przez inny układ enzymatyczny działający niezależnie od procesu sygnalizacyjnego. Wtórne cząsteczki sygnałowe o charakterze jonów są usuwane z komórki na zewnątrz lub gromadzone w odpowiednich organellach komórkowych do ponownego wykorzystania. 4

5 Receptory 7TM Największą rodzinę receptorów błonowych stanowią tzw. receptory o siedmiu helisach transbłonowych, czyli receptory7tm. Białka należące do tej rodziny odpowiedzialne są za przekazywanie sygnałów zapoczątkowanych przez tak zróżnicowane sygnały jak: hormony, neurotransmitery, bodźce zapachowe i smakowe, oraz fotony. Znanych jest kilka tysięcy takich receptorów. Prawie 50% stosowanych leków działa na receptory tej klasy. Tak jak wskazuje ich nazwa receptory 7TM zawierają siedem helis przebijających biwarstwę lipidową błony. Receptory te nazywane są też receptorami wężykowatymi (serpentynowymi), gdyż łańcuch polipeptydowy wije się jak wąż w poprzek błony. Pierwszym białkiem z tej rodziny, dla którego określono strukturę 3D była rodopsyna białko odgrywające kluczową rolę w procesie widzenia. Wszystkie poznane dotychczas receptory tej klasy mają bardzo podobny schemat budowy różniąc się jedynie w szczegółach. Nadrodzinę receptorów 7TM dzieli się na klasy ze względu na budowę cząsteczki sygnałowej. Wyróżniamy więc receptory: adrenergiczne Miejsce wiązania dopaminowe liganda histaminowe opioidowe serotoninowe muskarynowe melotaninowe i szereg innych. Każdy z typów receptorów dzieli się jeszcze na szereg podklas ze względu na efekt biologiczny jaki wywołuje jego aktywacja. Działanie receptora 7TM omówimy na przykładzie receptora β-adrenergicznego (β-ar) i receptora α 1 -adrenergicznego (α 1 -AR). Związanie liganda przez receptor 7TM wywołuje zmiany konformacyjne w pętlach cytoplazmatycznych i na C-końcu łańcucha peptydowego. Szczegóły tych zmian nie są jeszcze w pełni poznane. 5

6 Białko G Z receptorem 7TM związane jest od strony cytoplazmatycznej białko zwane białkiem G. Jego nazwa pochodzi od tego, że z białkiem tym wiążą się nukleotydy guanylowe GDP i GTP. Białko G w stanie nieaktywnym jest heterotrimerem zbudowanym z podjednostek α, β i γ. Podjednostka α jest GTPazą i w stanie nieaktywnym związany jest z nią nukleotyd GDP. Podjednostki α i γ są zakotwiczone w błonie komórkowej poprzez kowalencyjnie związane z nimi kwasy tłuszczowe. Stwierdzono, że białko G występować może w wielu izoformach. becnie znamy 20 podjednostek α, 6 podjednostek β i 12 podjednostek γ. Poznano też strukturę krystalograficzną niektórych białek G lub ich podjednostek. Wydaje się, że największe znaczenie dla specyficzności przekazu sygnału ma rodzaj podjednostki α. Ma ona wpływ zarówno na typ receptora z którym wiąże się dane białko G jak i na rodzaj białka enzymatycznego odbierającego i przekazującego dalej sygnał. Dlatego białka G dzieli się na klasy właśnie ze względu na rodzaj podjednostki α. Poniższa tabela przedstawia główne rodziny białek G. Podjednostka Typ receptora Pierwotna cząsteczka α sygnałowa (ligand) G αs β adrenergiczny adrenalina i noradrenalina, G αi hormony tarczycy, glukagon, substancje zapachowe α 2 adrenergiczny acetylocholina, aminy α adrenergiczne, neuroprzekaźniki Efekt komórkowy stymulacja cyklazy adenylanowej, wzrost poziomu camp inhibicja cyklazy adenylanowej G αt rodopsyna foton stymulacja fosfodiesterazy cgmp G αq α 1 adrenergiczny acetylocholina, aminy α adrenergiczne, neuroprzekaźniki G α12 trombina, peptydy chemotaktyczne, interleukiny aktywacja fosfolipazy C, wzrost poziomu IP 3 i wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ regulacja wzrostu komórki, rozwój embrionalny, aktywacja wymiany Na + /H +, aktywacja fosfolipazy D, apoptoza 6

7 Zmiany konformacyjne w cytoplazmatycznej domenie receptora 7TM powodują aktywację białka G. Kompleks ligand-receptor oddziałuje z podjednostką α katalizując wymianę GDP na pochodzący z roztworu GTP. Podjednostka α związana z GTP odłącza się od dimeru βγ tworząc odpowiedniego typu białko G α. Pojawienie się w komórce białka G α jest równoznaczne z przekazem informacji, że receptor związał się z pierwotną cząsteczką sygnałową. Przez długi czas uważano, że dimer βγ nie odgrywa żadnej roli w przekazywaniu sygnału. becnie wykazano, że może on wpływać na aktywność enzymów wytwarzających wtórne cząsteczki sygnałowe. Wpływ ten może być bardzo zróżnicowany w zależności od konkretnego zestawu izoform. Wydaje się, że pewne zestawy izoform podjednostek β i γ są nieaktywne, niektóre wpływają na aktywność innego enzymu niż białko G α, a jeszcze inne na ten sam enzym. Aktywacja GTP + Pojedynczy kompleks ligand-receptor może wywołać wymianę nukleotydów i dysocjację setek heterotrimerów białka G. Zatem już na tym etapie dochodzi do wzmocnienia sygnału. Receptor β-adrenergiczny (β-ar) Jest to poza rodopsyną najlepiej poznany receptor 7TM. Jego podstawową cząsteczką sygnałową jest adrenalina. Białko G wiążące się z tym receptorem zawiera podjednostkę α typu s. Po aktywacji receptora uwalniane jest więc białko G αs. Białko G αs stymuluje działanie kolejnego enzymu: cyklazy adenylanowej. Enzym ten przekształca ATP w camp. Białko G αs i cyklaza adenylanowa są związane z błoną podczas gdy camp może przemieszczać się po całej komórce przekazując sygnał zapoczątkowany związaniem adrenaliny. Tak więc wtórną cząsteczką sygnałową jest w tym układzie camp, a nie białko G αs. P H A H 7

8 ATP camp Na etapie cyklazy adenylanowej dochodzi do ponownego wzmocnienia sygnału: jedna zaktywowana cząsteczka AC może wyprodukować w zasadzie dowolną liczbę cząsteczek camp. Na szczęście w układ ten wbudowany jest wyłącznik czasowy. Białko G αs ma aktywność GTPazy i po pewnym czasie hydrolizuje związany z nią GTP do GDP. Cyklaza adenylanowa Białko G αs zawierające GDP nie ma już powinowactwa do cyklazy i odłącza się od niej. Cyklaza pozbawiona białka G αs podlega zmianom konformacyjnym, które powodują przejście w stan nieaktywny i utratę aktywności enzymatycznej. Białko G αs (GDP) wiąże się z dimerem βγ odtwarzając kompletne białko G. Wiąże się ono następnie z receptorem β-ar i komórka gotowa jest na odbiór kolejnego sygnału. Przedstawione powyżej losy białka G noszą nazwę cyklu białka G. Cyklaza adenylanowa 8

9 W komórkach występuje kilkanaście odmian cyklazy adenylanowej. Wszystkie one są białkami błonowymi zawierającymi 12 helis transbłonowych i dwie duże domeny cytoplazmatyczne. Poszczególne izoformy AC różnią się efektywnością katalityczną i wrażliwością na czynniki modulujące tą efektywność. Występuje ponadto duże zróżnicowanie tkankowe zawartości poszczególnych izoform cyklazy adenylanowej. Umożliwia to zróżnicowaną odpowiedź poszczególnych tkanek na pojawienie się tego samego liganda. CAMP jako wtórna cząsteczka sygnałowa Wywołany aktywnością enzymatyczną AC wzrost tężenia camp wywołuje w komórce wiele różnorodnych zmian. Rodzaj i zakres tych zmian zależy przede wszystkim od typu komórki (nabłonkowa, mięśniowa, nerwowa, itd.), ale również od aktualnego stanu komórki (etap cyklu komórkowego) oraz aktywności innych szlaków sygnałowych. Do typowych zmian wywołanych podwyższeniem wewnątrzkomórkowego stężenia camp należą np.: przyspieszenie rozpadu substancji zapasowych zwiększenie wydzielania soków żołądkowych zmniejszenie agregacji płytek krwi zmiana stopnia fosforylacji białek cytoszkieletu otwarcie niektórych kanałów jonowych i wiele innych. Jest przy tym charakterystyczne, że większość zmian (poza otwarciem kanałów jonowych) związana jest z fosforylacją określonych białek. Rodziną enzymów, których aktywność bezpośrednio zależy od poziomu camp okazały się kinazy białkowe typu A (PKA). Kinazy te są więc ostatnim, efektorowym etapem szlaku sygnałowego zapoczątkowanego związaniem się ligandu z receptorem β-ar. Kinazy białkowe typu A (PKA) Poszczególne enzymy z tej klasy fosforylują grupy hydroksylowe w łańcuchach bocznych seryny i treoniny wybranych białek. Specyficzność substratowa PKA nie jest zbyt duża, więc regulacja aktywności tych enzymów odbywa się m.in. przy pomocy tzw. białek kotwiczących PKA określanych terminem AKAP (ang. A Kinase Anchoring Proteins). Różne typy białek kotwiczących są przypisane do określonych kompartmentów komórki. AKAP mają zdolność wiązania się z PKA bez zmiany aktywności tej ostatniej. Można przypuszczać, że fosforylacji będą ulegały przede wszystkim białka znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie AKAP, a tym samym i PKA. Ufosforylowanie białek będących substratami PKA zmienia ich aktywność enzymatyczną lub powinowactwo do innych białek. Zmiana ta ma przy tym charakter trwały: jest wynikiem utworzenia wiązania kowalencyjnego a nie równowagowych oddziaływań fizykochemicznych. Z 9

10 punktu widzenia zasad teorii sterowania nie jest to rozwiązanie poprawne, gdyż uniemożliwia powrót do stanu wyjściowego. Tym samym układ nie byłby w stanie reagować poprawnie na kolejne sygnały docierające szlakiem sygnałowym. Układy żywe nie mogą sobie pozwolić na taką sytuację, gdyż grozi ona śmiercią komórki. W przypadku efektu działania kinaz białkowych A rolę strażnika przywracającego (a przynajmniej starającego się przywrócić) stan początkowy pełnią fosfatazy białkowe. Enzymy te odcinają hydrolitycznie grupy fosforanowe wprowadzone przez kinazy. Fosfatazy te są na tyle wydajne, że w przypadku braku aktywności szlaku sygałowego w krótkim czasie przywracają niski stopień fosforylacji. Zależność wielkości efektu końcowego pobudzenia receptora od wydajności dwóch przeciwstawnych reakcji enzymatycznych (fosforylacja defosforylacja) jest bardzo korzystna z punktu widzenia teorii sterowania. Regulowany układ znajduje się bowiem w stanie równowagi chwiejnej (jak waga szalkowa) i podobnie jak ona jest bardzo wrażliwy na niewielkie nawet zmiany obciążenia po każdej ze stron. Wygaszanie sygnału na poziomie camp Jeżeli dany szlak sygnałowy ma służyć do regulacji układu (np. komórki) w czasie rzeczywistym, to musi dysponować mechanizmami wygaszania sygnału na każdym etapie szlaku sygnałowego pomiędzy receptorem i efektorem. Dotyczy to również wtórnej cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku camp. AC PDE ATP camp + PP i 5 -AMP Za rozkład camp odpowiedzialne są w komórce fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów, PDE. Enzymy te hydrolizują cykliczny 3,5 -adenozynomonofosforam do 5 - adenozyno monofosforanu. Aktualny poziom camp zależy więc od szybkości dwóch przeciwstawnych procesów: cyklizacji i hydrolizy. Jest to kolejny przykład zastosowania w układzie regulacji zasad równowagi chwiejnej. Chociaż formalnie na aktualne stężenie camp ma wpływ szybkość obu konkurencyjnych reakcji, to jednak w większości znanych przypadków wykorzystania cyklicznych nukleotydów jako wtórnych cząsteczek sygnałowych decydującą rolę odgrywa szybkość biosyntezy. Jedynie w 10

11 przypadku szlaku sygnałowego rodopsyny za szybkie zmiany poziomu cgmp odpowiada PDE bezpośrednio zależny od poziomu pobudzenia receptora (natężenia światła). Receptor α 1 -adrenergiczny (α 1 -AR) Jest to receptor pobudzający, który po związaniu liganda wywołuje nagłe zwiększenie stężenia jonów wapniowych w cytoplazmie. Receptory α 1 -AR biorą udział w regulacji wielu funkcji fizjologicznych, takich jak ciśnienie tętnicze krwi, skurcz mięśni gładkich, pobieranie pokarmów czy poprawa nastróju. Ten ostatni efekt związany jest z faktem, że receptory te występują w dużych ilościach w większości rejonów mózgu. Receptor α 1 -AR pobudzany być może przez wiele ligandów. Znajdują się wśród nich aminy adrenergiczne (adrenalina, noradrenalina), ale również acetylocholina i niektóre inne neuroprzekaźniki. Białka G związane z tym receptorem mają podjednostkę α należącą do typu q. Powstające po aktywacji receptora białko G αq, w odróżnieniu od białka G αs, oddziałuje z dwoma białkami wzmacniającymi sygnał: z fosfolipazą C (PLC) w wyniku czego uruchomiona zostaje tzw. kaskada fosfoinozytolowa, oraz z błonowym kanałem wapniowym uruchamiającym napływ Ca 2+ do cytoplazmy. Kaskada fosfoinozytolowa Substratami fosfolipazy C są fosfoinozytydy o różnym stopniu ufosforylowania: fosfatydyloinozytol (PI), fosfatydyloinozytylo(4)fosforan (PIP) oraz fosfatydyloinozytylo(4,5)bisfosforan (PIP 2 ). - H H H P H H P H H H H P 3 2- P H H H 2- P 3 2- P 3 PI PIP PIP 2 11

12 W wyniku hydrolizy wszystkich trzech lipidów powstaje ta sama wtórna cząsteczka sygnałowa: 1,2-diacyloglicerol (DAG). W odróżnieniu od wtórnej cząsteczki sygnałowej szlaku β-ar (camp) DAG nie dyfunduje w cytoplazmie, lecz pozostaje w biwarstwie lipidowej. H 2-3 P H H H 2- P 3 2- P 3 DAG IP 3 W szlaku sygnałowym receptora α 1 -AR istotne znaczenie mają procesy fosforylacjidefosforylacji lipidów inozytolowych. Jeżeli substratem PLC jest PIP 2, to poza DAG powstaje druga wtórna cząsteczka sygnałowa: inozytolo(1,4,5)trifosforan (IP 3 ). IP 3 jest klasyczną wtórną cząsteczką sygnałową i może swobodnie dyfundować w cytoplazmie. PIP 2 powstaje z PI w wyniku dwukrotnej fosforylacji: początkowo przez kinazę PI, a następnie przez kinazę PIP. Znany jest również katalizowany enzymatycznie proces defosforylacji prowadzący od PIP 2 do PI. Tak więc komórka może, kontrolując stężenia poszczególnych substratów fosfolipazy C, kontrolować relację pomiędzy ilością obu wtórnych cząsteczek sygnałowych. bydwie wtórne cząsteczki sygnałowe mają w szlaku przekazywania sygnału diametralnie różne cele molekularne. kazuje się jednak, że pomimo tego pomagają sobie wzajemnie w osiągnięciu celu końcowego: uaktywnieniu efektora tego szlaku którym jest kinaza białkowa C (PKC). Diacyloglicerol (DAG) DAG bierze udział w bezpośredniej aktywacji kinazy białkowej C (PKC) pozostając cały czas składnikiem wewnątrzkomórkowej części biwarstwy lipidowej. Jest to więc bardzo specyficzna wtórna cząsteczka sygnałowa. A jednak również ona podlega takim samym prawom jak wszystkie inne cząsteczki sygnałowe. Między innymi musi zostać wygaszony związany z nią szlak sygnałowy. 12

13 Kwas fosfatydylowy Diacyloglicerol (DAG) Kwas tłuszczowy Kwas tłuszczowy Glicerol Znamy dwie drogi modyfikacji diacylogliceroli prowadzące do utraty przez nie roli wtórnej cząsteczki sygnałowej. Pierwsza z nich polega na estryfikacji grupy hydroksylowej glicerolu resztą kwasu fosforowego z utworzeniem kwasu fosfatydylowego. Może on być następnie wykorzystywany jako substrat do biosyntezy fosfolipidów błon komórkowej. Druga droga jest przeciwstawna i polega na hydrolizie, w wyniku której powstają dwie cząsteczki kwasów tłuszczowych i glicerol. Stwierdzono, że czynnikiem aktywującym kinazę białkową C mogą być również niektóre silnie lipofilowe ksenobiotyki, czyli związki obce dla komórki. Ksenobiotykami takimi są np. estry forbolu znane od dawna silne związki rakotwórcze. becnie przypuszcza się, że wywołują one proces nowotworzenia na skutek niekontrolowanego, długotrwałego pobudzania PKC. Kinaza białkowa C (PKC) Dotychczas znaleziono kilkanaście izoform PKC rozmieszczonych w sposób zróżnicowany w określonych przedziałach (kompartmentach) komórkowych różnych tkanek. Również aktywacja i dezaktywacja izoform PKC zależna jest lokalizacji w komórce i od rodzaju komórki. Zaktywowana kinaza C fosforyluje grupy hydroksylowe reszt seryny i treoniny w różnorodnych białkach, najprawdopodobniej przede wszystkim tych które występują w tym samym kompartmencie. 13

14 Kinazy białkowe działają w dwóch skalach czasowych. Krótkotrwała stymulacja enzymów z tej klasy skutkuje przede wszystkim uaktywnieniem białek odpowiedzialnych za efekty krótkotrwałe: napływ jonów, sekrecja wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych). Jeżeli jednak stymulacja będzie długotrwała, to uruchomione zostaną mechanizmy regulujące procesy długookresowe: różnicowanie i proliferacja komórek, zmiany nowotworowe, itp. PKC może specyficznie regulować tak różnorodne procesy komórkowe wynika jak się zdaje z faktu, że poszczególne izoformy i ich specyficzne substraty (enzymy podlegające fosforylacji) występują w określonych przedziałach komórkowych. W stanie nieaktywnym PKC jest białkiem rozpuszczalnym występującym w cytoplazmie komórki. Aktywacja kinaz należących do tej rodziny połączona jest ze związaniem się enzymu z błoną komórkową. Wynika to z faktu, że podstawowa cząsteczka sygnałowa odpowiedzialna za aktywację PKC jest składnikiem błony jest nią diacyloglicerol (DAG). Dla uzyskania pełnej aktywności PKC wymaga ponadto odpowiednio wysokiego stężenia jonów wapnia. Jony te są niezbędne dla utworzenia kolejnego połączenia z błoną poprzez oddziaływanie z fosfatydyloseryną (PS). Wszystkie poznane dotychczas izoformy PKC są enzymami wielodomenowymi. We wszystkich wyróżnić można: domenę katalityczną, (K) 2 domeny wiążące DAG, (C1) domenę wiążącą PS i Ca 2+, (C2) domenę pseudosubstratu, (S) (S) (K) (C2) (C1A) (C1B) W cytoplazmie, w konformacji nieaktywnej, miejsce katalityczne enzymu jest zablokowane N-końcowym fragmentem łańcucha spełniającym rolę pseudosubstratu. Ma on sekwencję rozpoznawaną jako substrat: A-R-K-G-A-L-R-Q-K, jednak w miejscu seryny lub treoniny występuje alanina. Fragment taki łączy się z miejscem katalitycznym enzymu, jednak fosforylacja nie może zajść z powodu braku grupy hydroksylowej. Domeny C1 zawierają po dwa bogate w cysteinę palce cynkowe, które mogą wiązać się do znajdujących się w błonie dwóch cząsteczek diacyloglicerolu. Zn 2+ Miejsce wiążące DAG Domena C2 wiąże się z zawartą w błonie fosfatydyloseryną. Wiązanie to wymaga związania się z enzymem dwóch kationów wapniowych i zachodzi tylko w obecności dostatecznie wysokiego stężenia tych jonów. 14

15 Związanie domen C1 i C2 z błoną komórkową wywołuje globalną zmianę konformacyjną całego białka. W wyniku tej zmiany domena pseudosubstratu nie może już przesłaniać miejsca katalitycznego, co powoduje uczynnienie domeny katalitycznej: DAG Ca 2+ Inozytolo(1,4,5)trifosforan (IP 3 ) IP 3 uwolniony podczas hydrolizy PIP 2 łączy się z wewnątrzkomórkowym receptorem błonowym zlokalizowanym w błonie siateczki śródplazmatycznej (reticulum endoplazmatycznego). Receptor ten jest w zasadzie kanałem wapniowym bramkowanym IP 3. W wyniku tego połączenia kanał wapniowy zostaje otwarty i gwałtownie wzrasta cytoplazmatyczne stężenie jonów Ca 2+. becnie znanych jest kilka typów receptorów IP 3 i uważa się, że biorą one udział w rozwoju sieci połączeń neuronalnych i ich plastyczności. Pokazaliśmy już powyżej, przy omawianiu szlaku receptora β-adrenergicznego, że każdy etap przekazywania sygnału musi dysponować mechanizmem wygaszania. W przypadku IP 3 wygaszanie sygnału polega na stopniowej defosforylacji, aż do poziomu samego inozytolu. Inozytol wykorzystywany jest następnie do resyntezy fosfatydyloinozytolu (PI). Jony wapnia jako uniwersalna wtórna czasteczka sygnałowa Jony wapnia są w komórkach eukariotycznych bardzo często wykorzystywane jako wtórne cząsteczki sygnałowe. W niepobudzonych komórkach typowy poziom cytozolowego Ca 2+ wynosi ok. 100 nm podczas gdy w osoczu krwi ok. 5 mm. W niektórych organellach komórkowych jest nawet większy, np. w reticulum endoplazmatycznym. Ten stromy gradient transbłonowy stwarza możliwość gwałtownego podwyższenia lokalnego stężenia tych jonów. siągane to jest zwykle przez otwarcie kanałów wapniowych zlokalizowanych w błonie komórkowej lub błonie reticulum. Niskie cytozolowe stężenie jonów wapnia jest osiągane dzięki dwom bardzo wydajnym systemom usuwania Ca 2+ sodowo-wapniowy. z komórki. Jest to napędzana hydrolizą ATP pompa wapniowa oraz antyport 15

16 W zrozumieniu roli jaką pełnią jony wapnia w procesach komórkowych bardzo pomogło zastosowanie odczynników specyficznie wiążących się z tym jonem. Znane są bardzo specyficzne jonofory wapniowe które po wniknięciu do błony komórkowej pozwalają szybko zwiększyć cytozolowe stężenie Ca 2+. bniżenie stężenia dostępnego Ca 2+, nawet do poziomu poniżej kilku nm, można z kolei uzyskać wprowadzając do komórki wybiórcze związki kompleksujące. Ich obecność w cytoplazmie zapobiega wzrostowi poziomu wolnego wapnia po otwarciu kanałów wapniowych. Do monitorowanie stężenia wolnego Ca 2+ w poszczególnych częściach komórki oraz jego zmian po zadziałaniu określonych bodźców wykorzystuje się fluorochromy będące jednocześnie kompleksonami jonów wapnia. W przypadku takich fluorochromów intensywność i barwa emitowanego światła zależy od stężenia jonów wapnia. Zakres monitorowanego stężenia rozciąga się od nanomolarnego do mikromolarnego. Zdjęcie obok pokazuje mikrofotografię komórki nerwowej wybarwionej fluorochromen wrażliwym na stężenie jonów Ca 2+ : kolor czerwony wysokie stężenie, kolor niebieski niskie. Jony wapnia łatwo i silnie oddziałują z wieloma białkami dzięki tworzeniu kompleksów. W kompleksach tych jon Ca 2+ jest kompleksowany przez 6 atomów tlenu pochodzących zarówno z wiązań amidowych jak i zdysocjowanych grup karboksylowych. Zdolność tego jonu do równoczesnego oddziaływania z wieloma atomami tlenu pozwala mu na sieciowanie różnych segmentów białka i indukowanie dużych zmian konformacyjnych. Pierwszym białkiem wiążącym jony wapnia którego strukturę 3D poznano była parwoalbumina. Zawiera ona dwa podobne miejsca wiążące Ca 2+ utworzone przez dwie helisy α i łączącą je pętlę. Każdy jon skoordynowany jest siedmioma atomami tlenu pochodzącymi z: grup karboksylowych 3 reszt asparaginianu grupy karboksylowej glutaminianu (obydwa atomy tlenu tej grupy) wiązania peptydowego cząsteczki wody związanej z jonem. 16

17 Jon wapnia wiąże się z pętlą łączącą helisy E i F tego białka ustawione tak jak palec wskazujący i kciuk prawej dłoni. Strukturę tą nazwano motywem dłoni EF. becnie wiadomo, że ten motyw strukturalny występuje w wielu białkach wiążących Ca 2+. dpowiada mu bardzo charakterystyczna sekwencja aminokwasowa. Wykryto ja dotychczas w ponad 100 białkach. Kalmodulina Prawie we wszystkich komórkach eukariotycznych funkcję podstawowego czujnika stężenia jonów wapniowych pełni kalmodulina, CaM. Należy ona do białek zawierających motyw dłoni EF i zawiera 4 takie miejsca wiązania. Gdy poziom jonów wapnia przekroczy 500 nm kalmodulina osiąga stan wysycenia i białko ulega znacznym zmianom konformacyjnym. Zmiany te powodują odsłonięcie powierzchni hydrofobowych poprzez które CaM może się teraz wiązać z innymi białkami. Kompleks Ca 2+ -CaM stymuluje szeroki wachlarz enzymów spośród których nas interesować będą przede wszystkim kinazy białkowe zależne od kalmoduliny (kinazy CaM). Kinazy te regulują: itp. metabolizm substratów energetycznych przepuszczalność jonową błon biologicznych syntezę i uwalnianie neurotransmiterów Kinazy białkowe jako efektory szlaków sygnałowych opartych na białku G Cechą charakterystyczną szlaków sygnałowych opartych na receptorach 7TM i białku G jest fakt, że efektorami tych szlaków są kinazy białkowe regulujące aktywność enzymów lub strukturę i funkcję białek strukturalnych i motorycznych. Widać to wyraźnie na przykładzie omówionych powyżej szlaków sygnałowych aktywowanych receptorami adrenergicznymi. W szlaku receptora β-ar wtórna cząsteczka sygnałowa (camp) aktywuje kinazy białkowe A. W szlaku receptora α 1 -AR dochodzi do aktywacji dwóch klas kinaz białkowych. Diacyloglicerol przy współudziale jonów wapnia aktywuje kinazy białkowe C, a związana z jonami wapnia kalmodulina aktywuje kinazy CaM zależne. Jest przy tym interesujące, że w kilku przypadkach wykazano, że substratem kinaz mogą być białka wchodzące w skład szlaków sygnałowych. Jeżeli dotyczy to tego samego szlaku, to 17

18 występuje zjawisko ujemnego sprzężenia zwrotnego. Sprzężenie takie stanowi swoisty bezpiecznik zapobiegający nadmiernej lub zbyt długotrwałej aktywacji danego szlaku. Jeżeli fosforylacja dotyczy białek innego szlaku, to dochodzi do sprzęgania szlaków sygnałowych: aktywność jednego szlaku zależy od stopnia pobudzenia innego szlaku. Powstaje w ten sposób skomplikowana sieć sprzęgniętych szlaków sygnałowych umożliwiająca bardzo precyzyjna regulację homeostazy komórki. sygnał Receptor 7TM Białko G Cyklaza adenylowa camp Kinaza białkowa A fosforylacja białek PIP2 Fosfolipaza Cβ IP3 [Ca +2 ] kalmodulina Kinaza CaM fosforylacja białek DAG Kinaza białkowa C fosforylacja białek Sprzęganie szlaków na etapie białek G (cross-talk) Poza sprzęganiem szlaków sygnałowych na poziomie efektorowym stwierdzono występowanie sprzężeń również na etapie pierwszego wzmocnienia, czyli białek G. Najlepiej poznano to zjawisko dla receptorów adrenergicznych, chociaż istnieją również dowody na istnienie podobnych sprzężeń pomiędzy innymi szlakami sygnałowymi. Aktualnie receptory adrenergiczne dzieli się na trzy duże rodziny: receptory α 1 -AR uruchamiające szlak sygnałowy prowadzący do aktywacji kinaz białkowych C oraz kinaz CaM receptory α 2 -AR hamujące aktywność cyklazy adenylanowej i dezaktywujące kinazy białkowe A receptory β-ar aktywujące cyklazy adenylanowe i kinazy białkowe A 18

19 Wszystkie te receptory są receptorami 7TM, lecz wykorzystują odmienne izoformy G α. Pobudzone receptory α 1 -AR uwalniają białko G αq, receptory α 2 -AR białko G αi, a receptory β-adrenergiczne białko G αs. Białko G αs aktywuje cyklazę adenylanową odpowiedzialną za wytwarzanie camp. Na cyklazę działa również białko G αi, jednakże działa hamująco. Tak więc cyklaza jest miejscem sprzężenia szlaków sygnałowych wywodzących się od receptorów β- i α 2 -adrenergicznych. Sprzężenie to pozwala bardzo precyzyjnie regulować cytozolowe stężenie camp. Tak starannie regulowany poziom camp reguluje z kolei aktywność kinaz białkowych typu A. β-ar α 2 -AR α 1 -AR G αs + βγ G αi + βγ G αq + βγ Cyklaza adenylanowa - Fosfolipaza C camp IP 3 PIP 2 DAG Kinaza białkowa A Szlak sygnałowy receptora α 1 -AR rozpoczyna się od aktywacji fosfolipazy C przez białko G αq. Fosfolipaza ta uwalnia dwie cząsteczki sygnałowe: diacyloglicerol (DAG) i inozytolotrifosforan (IP 3 ). Jej aktywność zależy jednak nie tylko od stężenia G αq. Wykazano, że białko to jest substratem niektórych kinaz białkowych typu A. Fosforylacja fosfolipazy C prowadzi do znacznego zmniejszenia jej powinowactwa do białka aktywującego G αq, a tym samym do jej dezaktywacji. Tak więc fosfolipaza C jest punktem sprzężenia wszystkich trzech szlaków sygnałowych receptorów adrenergicznych. W niektórych komórkach stwierdzono ponadto istnienie bezpośredniego sprzężenia szlaków inicjowanych przez receptory α 1 i α 2. Wykazano mianowicie, że dimer podjednostek βγ powstający po pobudzeniu receptora α 2 -AR aktywuje fosfolipazę C równie skutecznie jak białko G αq. Tym samym szlak receptora α 1 -AR sprzęgnięty jest dwukrotnie ze szlakiem receptora α 2 -AR. 19

20 Pierwsze sprzężenie, aktywujące - poprzez dimer βγ, jest bezpośrednie i przejawia się od razu. Drugie sprzężenie, hamujące - poprzez kinazę białkową A, przejawia swoje istnienie dopiero po pewnym czasie. Celem tego sprzężenia jest najprawdopodobniej wygaszenie zbyt długotrwałego pobudzenia szlaku receptora α 1. Szlaki sygnałowe z kaskadą fosforylacji Szlaki sygnałowe omówione powyżej prowadziły do aktywacji kinaz białkowych będących ostatnim, efektorowym etapem szlaku. Istnieją również szlaki które są inicjowane przez receptory zawierające kinazę białkową w swojej strukturze. Aktywacja takich receptorów uruchamia szereg następujących po sobie etapów fosforylacji, z których dopiero ostatni dotyczy fosforylacji cząsteczek wykonawczych. Typowe elementy takich szlaków i stosowane mechanizmy ich regulacji omówimy na kilku poniższych przykładach. Receptor ludzkiego hormonu wzrostu Jako pierwszy przykład rozważmy receptor ludzkiego hormonu wzrostu. Sam hormon wzrostu jest białkiem monomerycznym zawierającym 217 aminokwasów. Ma postać zwartej struktury zawierającej wiązkę 4 ściśle przylegających α helis. Receptor hormonu wzrostu składa się z 638 aminokwasów, które tworzą: domenę zewnatrzkomórkową (ok. 250 aminokwasów) pojedynczą helisę transbłonową domenę wewnątrzkomórkową (ok. 350 aminokwasów). W nieobecności hormonu receptor występuje w błonie w postaci monomeru. Hormon wiąże się początkowo z domeną zewnątrzkomórkową pojedynczej cząsteczki receptora. Powstały kompleks ma duże powinowactwo do kolejnej cząsteczki receptora. Powstaje dimer receptora zawierający pojedynczą cząsteczkę hormonu (pierwotnej cząsteczki sygnałowej). Dimeryzacja domen zewnątrzkomórkowych receptora prowadzi do zetknięcia się domen wewnątrzkomórkowych. W receptorach tego typu z każdą z domen wewnątrzkomórkowych zasocjowana jest czasteczka nieaktywnej kinazy białkowej. W przypadku receptora ludzkiego hormonu wzrostu jest to tzw. kinaza janus 2 (JAK 2). 20