Nowoczesne metody analityczne wykorzystujące detektor mas Zastosowanie ICP MS do badania specjacji ICP MS : Spektrometria mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (analiza ultra-śladowa) LA ICP MS : połączenie z odparowaniem laserowym (rozmieszczenie powierzchniowe) HPLC ICP MS : połączenie z wysokosprawną chromatografią cieczową (badanie specjacji) Rozdział Chromatografia gazowa HPLC Elektroforeza kapilarna Metody sprzężone/łączone SEC IEC IPC RPLC Oznaczanie F-AAS G-AAS ICP-AES MIP-AES ICP-MS Identyfikacja NMR MALDI TOF MS ESI MS/MS Połączenie HPLC z ICP-MS Prędkość przepływu przez kolumnę prędkość przepływu próbki w ICP-MS,5 ml/min Eluat kapilara rozpylacz Możliwość stosowania różnych rozpylaczy <,5mlL (ultradźwiękowy) 3 4 Schemat układu HPLC ICP-MS Powielacz Analizator mas Soczewki ogniskujące jony Plazma Ar Procesy rozdzielania Procesy rozdzielania -oddzielenie analitu od przeszkadzających składników (interferentów) Palnik Rozpylacz Ar Kolumna HPLC -rozdzielenie poszczególnych składników mieszaniny wielu indywiduów chemicznych 5 6
Procesy rozdzielania Procesy rozdzielania Metoda Podstawy fizyko-chemiczne Metoda Podstawy fizyko-chemiczne Rozdzielanie mechaniczne strącanie / sączenie destylacja ekstrakcja wymiana jonowa różnica rozpuszczalności różnica lotności różnica rozpuszczalności (w dwóch niemieszających się cieczach) różnice w oddziaływaniu (substancja z jonitem) Chromatografia Elektroforeza różnica w szybkości poruszania się substancji rozpuszczonej przez fazę stacjonarną różnica w szybkości poruszania się naładowanych cząstek w polu elektrycznym 7 8 Chromatografia: Składniki mieszaniny są rozdzielane na podstawie różnic szybkości, z jakimi są przenoszone w gazowej lub ciekłej fazie ruchomej przez nieruchomą fazę stacjonarną. Elucja: Proces, w którym substancje rozpuszczone przemieszczają się przez fazę stacjonarną. Eluent: faza ruchoma przed zmieszaniem z próbką Eluat: Faza ruchoma, która opuszcza kolumnę (składnik próbki + eluent). 9 Chromatografia bibułowa ekstraktu roślinnego Początki - chromatografia cieczowa Historia Metody chromatograficzne zostały prawdopodobnie po raz pierwszy zastosowane przez Davida Talbota Davapod koniec XIX w. do rozdziału węglowodorów z ropy naftowej. W tym samym czasie na rosyjski chemik i biolog Michaił Cwiet rozdzielał barwniki z zielonych liści na kolumnie wypełnionej kredą. Ponieważ Cwiet rozpoznał i prawidłowo zinterpretował proces rozdziału, jest on powszechnie uważany za wynalazcę tej techniki. Jest on także autorem nazwy chromatografia, którego terminu użył ze względu na barwne strefy obserwowane na kredowej kolumnie podczas rozdziałów. Pierwszego chromatograficznego rozdziału mieszaniny barwników organicznych dokonał w Warszawie profesor Michaił Cwiet. W oryginalnym opisie doświadczenia datowanym na 3 kwietnia 95 r. znajdujemy informację: -użyto kolumny szklanej wypełnionej sproszkowanym węglanem wapnia (kredy); - chloroformowy roztwór barwników organicznych, nanoszony na wierzchołek kolumny, w miarę przechodzenia przez warstwę kredy ulegał rozdziałowi i poszczególne składniki były widoczne w postaci barwnych stref; - po wyjęciu słupka kredy z kolumny można było go podzielić i wyodrębnić poszczególne składniki.
Chromatografia: Chromato-polarografia; prof. Wikotr Kemula, 95 Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) kolumna Kroplowa elektroda rtęciowa Komora przepływowa ścieki Michaił Cwiet : ur. 87 w Asti (Włochy) Doktorat: Genewa (893) Od 9 praca w UW 93 odkrycie chromatografii 3 4 Podział chromatografii : mechanizm procesu rozdziału Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą rozdzielanie mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź ich grupy (frakcje), dzięki różnicom w zachowaniu się tych składników w układzie dwóch faz: - jedna nie zmienia swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna); - druga zaś porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający). Adsorpcyjna - faza ruchoma : ciecz lub gaz / nieruchom : ciało stałe (np. żel krzemionkowy, tlenek glinowy, węgiel aktywny itp.). Rozdział jest powodowany różnicami współczynników adsorpcji. Podziałowa - faza ruchoma : ciecz lub gaz / stacjonarna : ciecz zatrzymana na odpowiednim nośniku (bibuła, ziemia okrzemkowa, kulki szklane itp.). Rozdział jest wynikiem różnic współczynników podziału. Jonowymienna - faza ruchoma : ciecz / stacjonarna : wymieniacz jonowy. Rozdział zależy od różnic w sile wiązania składników przez wymieniacz. Żelowa - faza ruchoma : ciecz / nieruchom : żel. Rozdział jest powodowany różnicami w zdolnościach dyfundowania do cząsteczek żelu, a więc różnicami w wielkości cząsteczek składników. 5 6 Podział chromatografii : sposób przeprowadzania rozdziału Bibułowa (PC) : bibuła chromatograficzna pocięta na arkusze, paski lub krążki. -przy krawędzi nanosi się na tzw. punkt startowy, krople roztworu, a następnie powoduje się przepływ fazy ruchomej, co prowadzi do rozdzielenia składników mieszaniny (tzw. rozwijanie chromatogramu). - proces odbywa się w odpowiednim szczelnym naczyniu tzw. komorze chromatograficznej. - po zakończeniu rozwijania otrzymuje się plamy (lub pasma) chromatograficzne poszczególnych składników (lub frakcji), które uwidacznia się, np. przez przeprowadzenie reakcji barwnych (tzw. wywoływanie chromatogramu), obserwację w świetle nadfioletowym itp. - przez porównanie z chromatogramem mieszaniny substancji wzorcowych identyfikuje się poszczególne składniki, a przez porównanie wielkości intensywności plam uzyskuje się wyniki ilościowe. 7 Podział chromatografii : sposób przeprowadzania rozdziału Cienkowarstwowa(TLC) - fazę nieruchomą nanosi się w postaci cienkiej równomiernej warstewki na płytkę szklaną, arkusik folii aluminiowej czy tworzywa sztucznego. Dalsze postępowanie jest podobne jak w chromatografii bibułowej Kolumnowa - kolumnę (najczęściej szklaną) wypełnia się fazą nieruchomą (adsorbentem, nośnikiem nasyconym ciekłą fazą nieruchomą, jonitem, granulowanym żelem) i na jej szczyt wprowadza badany roztwór, a następnie fazę ruchomą (eluent). Zachodzi rozdzielanie składników, które bądź pozostają w kolumnie (tworząc oddzielne pasma) lub są kolejno wymywane (elucja). W poszczególnych porcjach wycieku (eluatu) przeprowadza się oznaczenia rozdzielanych składników, np. przez miareczkowanie, pomiar refrakcji itd. 8 3
Podział chromatografii : sposób przeprowadzania rozdziału Gazowa - faza ruchoma : gaz / faza nieruchoma : wypełnienie kolumny Próbkę (gaz, ciecz) wstrzykuje się przed kolumną do strumienia przepływającego z określoną prędkością i pod określonym ciśnieniem gazu nośnego. Za kolumną znajduje się detektor czuły na zmiany składu gazu, którego sygnały są zapisywane w postaci chromatogramu. Cieczowa - faza ruchoma : ciecz przepływająca przez kolumnę sposób ciągły i pod ciśnieniem do kilkudziesięciu MPa. podziałowa; absorpcyjna; jonowymienna; wykluczania; powinowactwa 9 Chromatografia cieczowa : sposób przeprowadzania rozdziału Analit jest przenoszony tam i z powrotem między fazą stacjonarną i ruchomą w procesach sorpcji i desorpcji; mechanizm tego procesu stanowi podstawę różnych odmian chromatografii Podziałowa : podział między niemieszające się ciecze (faza stacjonarna : ciecz zaabsorbowana lub związana ze stałą powierzchnią) Absorpcyjna : absorpcja (faza stacjonarna : ciało stałe) Jonowymienna : wymiana jonowa (faza stacjonarna : kationit lub anionit) Wykluczania : podział (faza stacjonarna : ciecz w lukach stałego żelu) Powinowactwa : podział między cieczą na stałej powierzchni i cieczą fazy ruchomej (faza stacjonarna : ciecz specyficzna dla grupy analitów) Chromatografia cienkowarstwowa TLC i bibułowa PC Postępowanie : -przygotowania podłoża; - naniesienie próbki; - rozwijanie chromatogramu (proces rozdzielania);\ Substancje wędrują z różną szybkością (różnice w powinowactwie do fazy stacjonarnej), pokonują różne odległości od miejsca startu (naniesienia próbki) do miejsca zlokalizowania plamy podczas wywołania chromatogramu. Linia startu - wywołanie chromatogramu. uwidocznienie rozdzielonych składników mieszaniny, np. naświetlanie promieniowaniem UV (większość związków organicznych absorbuje promieniowanie UV) lub reakcję z parami jodu (związki organiczne nienasycone) lub stosowanie odczynników, z którymi składniki mieszaniny tworzą barwne związki. Chromatografia planarna znalazła zastosowanie w biochemii (analiza białek i aminokwasów), analizie klinicznej, farmaceutycznej i kryminologii. Chromatogram rozdziału barwników atramentu Elektroforeza żelowa Sprzężenie GE LA ICP MS Ośrodkiem, w którym przemieszczają się substancje, jest żel elektroforetyczny (np. agaroza) na płytce. Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Pasek żelu jest zanurzony w przewodzącym prąd buforze. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, umieszczone są elektrody, do których przykłada się napięcie (5-3 V) LA-ICP-MS D-GE 3 żelu poliakrylamidowego z oligonukleotydami 4 4
Identyfikacja żelaza w roztworach białkowych techniką GE LA ICP MS Intensywność [Liczba zliczeń/s] 9 8 7 6 5 4 3 5 5 5 3 35 4 45 Czas [s] Intensywność [Liczba zliczeń/s] 3 9 8 7 6 5 4 3 Apotransferyna 35 3 5 5 5 3 8 3 8 3 5 Bibuła Whatmana Apotransferyna niewzbogacana Apotransferyna +,4 g/l Fe(NTA) 6 czas retencji; stałe podziału; współczynnik retencji, współczynnik rozdzielenia; sprawność kolumny; liczba i wysokość półki kolumny Czas retencji czas potrzebny do przejścia przez kolumnę określonego składnika. Różnice wynikają z tego, że każdy związek chemiczny wykazuje zazwyczaj inne powinowactwo chemiczne lub inny stopień oddziaływań fizycznych. Im powinowactwo jest silniejsze tym dłuższy jest czas retencji. Rodzaje czasów retencji czas retencji całkowity: tr - jest to czas od wprowadzenia mieszaniny do rozdziału, do pojawienia się na chromatogramie maksimum piku, dla tej substancji czas retencji martwy (zerowy): tm - jest to czas retencji substancji obojętnej względem fazy rozdzielczej (brak oddziaływań); substancja ta pojawia się pierwsza czas retencji zredukowany: tr' - jest to różnica między całkowitym czasem retencji substancji a martwym czasem retencji, Tr' = Tr - Tm. E. Kurek, A. Ruszczyńska, M. Wojciechowski, M. Czuderna, E. Bulska, Chem. Anal., 54, 43 (9) 7 8 Stała podziału A (faza ruchoma) A (faza stacjonarna) Współczynnik retencji Określa szybkość, z jaką substancja A migruje przez kolumnę. Jest to czas, jaki substancja rozpuszczona spędza w fazie stacjonarnej, w stosunku do czasu jej przebywania w fazie ruchomej (a A ) S K c = ---------------------- (a A ) M (a A )S aktywność (stężenie) substancji A w fazie stacjonarnej S (a A )M aktywność (stężenie) substancji A w fazie ruchomej M 9 t R - t M t S K A = ---------------------- = ---------------- t M t M Zdolność rozdzielcza kolumny Rs: Wskazuje, jak oddalone są od siebie dwa pasma w stosunku do ich szerokości / pozwala na ilościowe określenie możliwości rozdzielenia dwóch substancji w kolumnie 3 5
Zdolność rozdzielcza kolumny Rs: Wskazuje, jak oddalone są od siebie dwa pasma w stosunku do ich szerokości / pozwala na ilościowe określenie możliwości rozdzielenia dwóch substancji w kolumnie Sprawność kolumny: wysokość półki (H) / liczba półek (N) / długość wypełnienia (L) L N = ----------------- H Półka teoretyczna (pojęcie umowne): najmniejsza objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem analitu w fazie ruchomej i stacjonarnej. 3 3 Terminy : półka i wysokość półki A.J.P. Martin i R.L.M. Synge (Nagroda Nobla w 95 roku) Opracowanie modelu teoretycznego opisu rozdzielania w kolumnach chromatograficznych (na wzór destylacji frakcjonowanej z półkami) Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC Najbardziej uniwersalna i najszerzej stosowana chromatografia elucyjna HPLC Kolumna chromatograficzna : układ wielu dzwonowych półek, wewnątrz których istnieją warunki równowagowe. adsorpcyjna podziałowa jonowymienna powinowactwa 33 wykluczania chiralna 34 Wzorce związków selenu identyfikacja próbek naturalnych 35 E. Kurek, A. Ruszczyńska, M. Wojciechowski, M. 36 Czuderna, E. Bulska, Chem. Anal., 54, 43 (9) 6
75 5 5 Chromatografia anionowymienna MeSeCys Wzorce SeMe Wzorce selenu 3 6 9 5 Czas, min. SeO 3 - E.Bulska et all, J Agric Food Chem, 3 SeO 4 - Counts number per second 75 5 5 3 6 9 5 Czas, min Ekstrakcja mikrofalowa cebula Se(IV) 9 6 3 Detekcja ICP-MS Ekstrakcja mikrofalowa, cebula Se(VI) 3 6 9 5 Czas, min. 37 Abundance, cps Absorbance, 8nm 4 3 5 5 a) 5 5 5 3 35 b) 7kDa 4.4kDa.35kDa.36kDa kda Time, min 5 5 5 5 5 3 35 Time, min 5 5 5 35 Chromatografia wykluczeniowa Liście; Ekstrakcja NaOH spektrofotometria λ 8 nm ICP-MS Se8 E.Bulska et all, J Agric Food Chem, 3 38 E. Kurek, A. Ruszczyńska, M. Wojciechowski, M. 39 Czuderna, E. Kurek, A. Ruszczyńska, M. Wojciechowski, M. 4 Czuderna, E. Bulska, Chem. Anal., 54, 43 (9) E. Bulska, Chem. Anal., 54, 43 (9) Wpływ dodatku metanolu na rozdzielanie związków selenu Wpływ mocy elucyjnej fazy ruchomej na rozdzielenie chromatograficzne Intensywność [zliczenia/s] Intensywność [zliczenia/s] Se(IV) Se(VI) Faza ruchoma z dodatkiem % metanolu Faza ruchoma z dodatkiem % metanolu 4 Chromatogram związków selenu Faza ruchoma [CH 3COONH 4] = mmol/l Wyższe stężenie anionów = niższe czasy retencji Chromatogram związków selenu Fazy ruchoma [CH 3COONH 4] =mmol/l 4 7