Chromatogramy Załącznik do instrukcji z Technik Rozdzielania Mieszanin

Chromatogramy Załącznik do instrukcji z Technik Rozdzielania Mieszanin

Badania dotyczące dobrania wypełnienia o odpowiednim zakresie wielkości porów, zapewniających wnikanie wszystkich molekuł warunki niestosowane na ćwiczeniach Chromatogram UV-DAD serwatki (200-350nm) Kolumna DIOL 1000, 4µm, 250x4,6mm Albumina - monomer Chromatogram UV-DAD serwatki (205-330nm) Kolumna DIOL 100, 4µm, 250x4,6mm Monomeryczne formy wnikają takŝe do porów 100A; Sorbent o porach 1000A ma zbyt małą powierzchnię sorpcyjną.

Chromatogram UV-DAD serwatki (220-700nm) Wniosek główny!!! Widać, Ŝe, spolimeryzowana forma albuminy nie wnika do porów 60A, (ani do 100A); Do preparatywnej separacji zastosowano warunki wykluczania. (Nie jest to optymalne rozwiązanie). Kolumna: Si 60 Superspher, 5µm, 250x4mm Eluent: woda NatęŜenie przepływu: 0,8 ml/min. Dozowano: 50 µl serwatki otrzymanej z uŝyciem kwasu mlekowego, ph=4.6 Wniosek dodatkowy : Układ mało selektywny i mało sprawny - nie osiągnięto warunków pozwalających na rozdzielenie składników serwatki, a takŝe spolimeryzowanej formy albuminy.

chromatogram UV-DAD serwatki(230-660 nm) Kolumna: SI 60 Superspher, 5µm, 250x4mm Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3; ph = 4,6 NatęŜenie przepływu: 0,6 ml/min. Dozowano: 50 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4.6) Przykład wniosku: Zakwaszenie eluentu i zmniejszenie przepływu spowodowało poprawę symetrii i wzrost sprawności kolumny - spadek szerokości pików - wzrost rozdzielczości

chromatogram UV-DAD serwatki (220-650 nm) Kolumna Si 60 Superspher, 5µm, 250x4mm Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3 dwa razy rozcieńczony ph = 4,6 NatęŜenie przepływu: 0,6 ml/min. Dozowano: 50 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6) Przykład wniosku: Zmniejszenie siły elucyjnej eluentu spowodowało wzrost retencji składników serwatki i poprawę rozdzielczości

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400 nm) A Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm Eluent 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3 dwa razy rozcieńczony ph = 4,6 NatęŜenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400 nm) B Kolumna Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3 dwa razy rozcieńczony ph = 4,6 NatęŜenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400 nm) C Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm Eluent: woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400nm) D Kolumna Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm Eluent: woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

I n t e n s i t y [AU] Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla róŝnych kolumn i układów separacyjnych A B C D Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6) NatęŜenie przepływu:0,5 ml/min. Kolumna: A, C - Si 60 Lichrosorb B, D - Si 100 Lichrospher Eluent: A, B - bufor fosforanowy C, D woda + 20% EtOH + 0,05% kwasu mlekowego

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400nm) X Kolumna: Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm Eluent: woda+20% EtOH+0,1% kwasu mlekowego NatęŜenie Przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6) Przykład wniosku: Zwiększenie dodatku kwasu mlekowego w eluencie wpływa korzystnie w przypadku substancji X, lecz nie wpływa na retencję albuminy (białko jest nadal wykluczane)

Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla kolumny Si60 i róŝny skład eluentów A B Nastrzyk 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6) NatęŜenie przepływu:0,5ml/min. Kolumna Si 60 Lichrosorb 5µm, 250x4mm Eluent A woda + 20% EtOH + 0,05% kwasu mlekowego B woda + 20% EtOH + 0,1% kwasu mlekowego

chromatogram UV-DAD serwatki (220-420 nm) Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent: woda NatęŜenie przepływu: 0,8 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

chromatogram UV-DAD serwatki (220-410 nm) Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent woda NatęŜenie przepływu: 0,3 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

chromatogram UV-DAD serwatki (220-410 nm) Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent: woda + 10% alkoholu etylowego + 0,05% kw. mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,3 ml/min. Dozowano: 20 µl serwatki (kwas mlekowy, ph=4,6)

Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla kolumny DIOL250 - zmienne natęŝenie przepływu i skład eluentu A B C Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Dozowano: 20µL serwatki (kwas mlekowy ph=4,6) Eluent A woda B woda C woda + 10%EtOH + 0,05% kw. mlekowego NatęŜenie przepływu A 0,8 ml/min. B 0,3 ml/min. C 0,3 ml/min.

Przykładowy chromatogram testu kolumny modelowej A chromatogram UV-DAD acetonu (220-400 nm) aceton Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm Eluent woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego Natęrzenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20µL acetonu o stęŝeniu 50 µl/ml eluentu

Przykładowy chromatogram testu kolumny modelowej B chromatogram UV-DAD acetonu (220-400 nm) aceton Kolumna: Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm Eluent: woda+30% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 ml/min. Dozowano: 20µL acetonu o stęŝeniu 25µL/ml eluentu

Przykładowy chromatogram testu kolumny preparatywnej, λ=260 nm aceton Kolumna preparatywna Si 60, 10µm, 250x16 mm Eluent: woda+30% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 4,8 ml/min. Dozwano: 20 µl acetonu o stęŝeniu 25 µl/ml eluentu

Zestawienie chromatogramów acetonu przy λ= 260 nm, dla róŝnych kolumn A B C aceton aceton Test kolumny modelowej A Test kolumny modelowej B Test kolumny preparatywnej

chromatogram UV-DAD serwatki (250-400nm) Kolumna RP18 100, 5µm, 250x4mm Przepływ eluentu 1,5 ml/min. Program elucji: chromatogram UV-DAD serwatki (250-400nm) Kolumna WP300, 5µm, 250x4mm t[min.] H2O+ 0,05%TFA ACN+ 0,05%TFA 0 90 10 15 0 75 20 0 100 Dozowano: 20µL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6

chromatogram UV-DAD serwatki (200-400nm) Kolumna RP18 100, 5µm, 250x4mm chromatogram UV-DAD serwatki (250-400nm) Kolumna WP300, 5µm, 250x4mm Przepływ eluentu 1,5 ml/min. Program elucji: t[min.] H2O+ 0,05%TFA ACN+ 0,05%TFA 0 90 10 15 45 55 15,1 0 100 20 0 100 Dozowano: 20µL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6

Chromatogram serwatki (λ=280 nm) Kolumna WP 300, 5µm, 250x4 mm Program elucji t[min.] H2O+0,075% TFA ACN+0,075% TFA 0 95 5 Albumina 15 25 75 15,1 0 100 20 0 100 Przepływ 1,0 ml/min. Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6

Chromatogram serwatki (λ=280 nm) Kolumna RP-18 100, 5µm, 250x4 mm Program elucji t[min.] H2O+0,075% TFA ACN+0,075% TFA 0 95 5 Albumina 15 25 75 15,1 0 100 20 0 100 Przepływ 1,0 ml/min. Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6

Chromatogram serwatki (λ=280 nm) Kolumna Ph 3µm, 150x4mm Program elucji Albumina t[min.] H2O+0,075% TFA ACN+0,075% TFA 0 95 5 15 25 75 15,1 0 100 20 0 100 Przepływ 1,0 ml/min. Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6

Albumina Chromatografia preparatywna zebranie frakcji Kolumna 250x16,8mm Lichrospher Si 60-10µm; Eluent : woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego (v/v) Przepływ - 4,0 ml/min. Dozowano: 1-50uL roztworu wzorca albuminy 2-200uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6 Chromatograf preparatywny Zbieranie frakcji

Albumina - wzorzec 1 Chromatografia preparatywna zebranie frakcji Kolumna 250x16,8mm Lichrospher Si 60-10µm; Eluent : woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego (v/v) Przepływ - 4,8 ml/min. Dozowano: 1-50uL roztworu wzorca albuminy 2-200uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym ph=4,6 Chromatograf HP 1050 2

ZEBRANA FRAKCJA Kolumna RP-18 WP300, 5µm, 250x4mm Program elucji t[min.] H2O+0,075%T FA ACN+0,075% TFA Przepływ 1,0 ml/min. Dozowano 20uL frakcji 0 95 5 15 25 75 15,1 0 100 20 0 100 Albumina

Chromatogram frakcji eluatu - po wzbogaceniu z wykorzystaniem techniki membranowej Kolumna RP-18 WP300, 5 µm, 250x4mm Program elucji Przepływ 1,0 ml/min Dozowano 20uL frakcji Membrana typu PP t[min.] H2O+0,075% TFA ACN+0,075 %TFA 0 95 5 15 25 75 15,1 0 100 20 0 100 Albumina