Wybrane czynniki wpływające na jakość rozdzielania techniką HPLC / UPC

Transkrypt

1 Wybrane czynniki wpływające na jakość rozdzielania techniką HPLC / UPC PRBLEMY HPLC / UPC 1. ph 2. Czystość fazy stacjonarnej 3. Ciśnienie (backpressure) 4. Brak retencji na fazach odwróconych (RP) chromatografia HILIC 5. z zastosowaniem par jonowych 6. Zawartość węgla na powierzchni krzemionki 7. bjętość martwa 8. Czystość fazy ruchomej 9. Efekt czasu odpowiedzi i szybkości próbkowania detektorów dr Piotr Skibicki

2 ph ph gonowanie pików substancji o charakterze zasadowym na fazach odwróconych zazwyczaj spowodowane oddziaływaniami związków zasadowych z grupami silanolowymi. RZWIĄZANIA: - zastosowanie kolumn specjalnych, dedykowanych do rozdzielania zasadowych substancji organicch, np. LiChrospher (lub Aluspher ) RP-Select B - dodatek zasady organicznej, np. trójetyloaminy (GR). Lepsze rezultaty dają zasady o wyższej hydrofobowości (np. sole tetrabutyloamoniowe) - zamiana acetonitrylu na metanol (LiChrosolv ) gonowanie pików substancji o charakterze kwaśnym na fazach odwróconych. Zjawisko raczej rzadkie jeśli nie wchodzą w grę oddziaływania specyficzne (np. kompleksowanie). RZWIĄZANIA: - stosowanie kwaśnej fazy ruchomej i obniżanie jej ph może nie wpłynąć na asymetrię piku - istotne natomiast znaczenie ma prawidłowe buforowanie fazy ruchomej (pojemność buforowa, a co za tym idzie różnica między ph fazy i pka buforu - najlepiej ±1pH oraz stężenie buforu - zazwyczaj 2-5mM; dodatek rozpuszczalnika organicznego przesuwa wartość ph w kierunku wyższych wartości) - stosowanie faz wysokiej czystości Purospher, Chromolith Rozdział 6 zasad na fazie Aluspher RP-select B w warunkach obojętnych i alkalicznych aza ruchoma: A) acetonitryl/woda (33:67); B) acetonitryl/.25 M NaH (33:67); Przepływ: 1. ml/min; Detekcja: UV 25 nm; Próbka: 1. Pirydina, 2. Anilina, 3. o-toluidina, 4. N-Metyloanilina, 5. 2-Etyloanilina, 6. N,N-Dimethloanilina Zastosowanie fazy Purospher STAR RP-18e do rozdziału w warunkach lekko kwaśnych aza ruchoma: A) acetonitryl B) bufor ph 5; warunki gradientowe Przepływ: 1. ml/min; Detekcja: UV 227 nm; Próbka: 1. Acesulfam-K, 2. Sacharyna, 3. Kwas benzoesowy, 4. Kwas sorbowy, 5. Kofeina, 6. Aspartam

3 Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e gonowanie spowodowane oddziaływaniem analizowanej substancji z fazą stacjonarną PRPZYCJA: - zastosowanie wysokiej czystości sorbentów wolnych od metali ciężkich Purospher, Chromolith. Zanieczyszczenia jonami metalu Na + - H Grupy silanolowe wolne Zawartość metalu wyrażona w ppm Sód Wapń Magnez Żelazo Glin LiChrosorb H H H H M e - 2+ e H - H H H H geminalne wicynalne LiChrospher Purospher Purospher STAR

4 Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Związki chelatujące Purospher STAR RP-18 e 1. Purospher STAR RP-18 endcapped aza stacjonarna 1 aza stacjonarna 2 Warunki analizy: H H H 1. Purpuryna H H 2. Quinizaryna 5 1 Tradycyjna krzemionka RP-18 aza ruchoma:metanol / 2 mm bufor fosforanowy ph 3,; 75:25 (v/v) Przepływ: 1. ml/min Detekcja: UV 254 nm 2. Temperatura: 3 C Próbka: 1.) Purpuryna 2.) Quinizaryna Intensity (mv) ,55 4,5 5, ,54 3,38 Współczynnik asymetrii dla 4,8 Quinizaryny 1,7 Retention Time (min) aza stacjonarna 3 6,59 7,51 12,64 14, Intensity (mv) Współczynnik asymetrii dla Quinizaryny 1,36 Retention Time (min) ,6 4,14 5,3 Współczynnik asymetrii dla Quinizaryny 1,46 8,88 9,81 Intensity (mv) Retention Time (min) Retention Time (min) 1,65 5,17 6,64 Współczynnik asymetrii dla Quinizaryny 1,41 Kształt piku Quinizaryny odzwierciedla czystość krzemionki. Powyższe chromatogramy wskazują na najwyższą czysość krzemionki sorbentu Purospher STAR RP-18 e. 13,13 14,59 aza ruchoma: Metanol / Bufor ph 7, 8 / 2 (5 mmol KH2P4 i 5 mmol K2HP4); Przepływ: 1, ml/min; Detekcja: UV 254 nm; Temperatura: 22 C Próbka: 1. Uracyl; 2. Toluol; 3. Etylobenzol; 4. Quinizaryna; 5. Amitriptylina

5 Czystość krzemionki LiChrospher, Superspher Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e H H H H H X H CH 3 CH 3 H H CH 3 CH 3 H CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C 6H 13 CH 3 Endcapping CH 3 H CH 3 CH 3 CH 3 CH H 3 CH 3 H CH CH 3 3 CH3 Pomimo endcapping u wolne grupy silanolowe są wciąż dostępne nieporządane oddziaływania z próbką (asymetria) CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C 2 6 H 13 H CH 3 H CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C 6 H 13 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C 6 H 13 2 Purospher STAR RP-18 charakteryzuje się prawie całkowitym pokryciem powierzchni. Zapobiega to polarnym oddziaływaniom z próbką. CH 3

6 Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Trójcykliczne antydepresanty Bardzo wysoka symetria dla substancji zasadowych przy ph > 7 Kolumna: LiChroCART 25-4 Purospher STAR RP-18 e, 5 µm aza ruchoma: Metanol / bufor fosforanowy ph 7.6 8:2 (v/v) Przepływ: 1, ml/min Detekcja: UV 24 nm Próbka: 1.) Protriptylina 2.) Nortriptylina CHCH 2 CH 2 N(CH 3 ) 2 3.) Doxepina 4.) Imipramina 5.) Amitriptylina Amitryptylina Test Tanaka Pojemność wymiany jonowej (E,) A: k (Pentylobenzen) 9.59 B: α (Pentyl-/ Butylobenzen) 1.51 C: α (Trifenylene/ o-terfenyl) 1.63 D: α (Caffeine/ Phenol).44 E: α (Benzyloamina/enol; ph7.6).23 : α (Benzyloamina/enol; ph2.7).2,, E Pojemność (A),3,6,8,4 A 9, 6, 3, 1,4 1,2 1,,6,2 D B 1,6 1,5 1,8 2,4C Pojemność silanolowa (D) Hydrofobowość (B) Selektywność (C)

7 Czystość krzemionki Purospher STAR RP-18e Purospher STAR RP-18e Przykładowe aplikacje farmaceutyczne Purospher STAR RP-18 endcapped, 5µm A 9, Konkurent-Z A 1 Konkurent-S A 1 Konkurent-P A 1,,3,6 6, 3, 1,4 1,5 B 1,6 B B B, E,4,8 1,,6 1,2 1,8 2,4 C E D C E D C E D C D Konkurent-L A 1,2 Konkurent-N A 1 Konkurent-I A 1 konkurent-d A 1 B B B B E C E C E C E C D D D D

8 Purospher STAR RP-18e Przykładowe aplikacje farmaceutyczne Purospher STAR RP-18e Przykładowe aplikacje farmaceutyczne Cefazolin Dużo antybiotyków ulega chelatowaniu. Rozdział na konwencjonalnej krzemionce powoduje ogonowanie pików. Kitasamycyna R 3 CH 3 CH 2CH H 3C R 1 H H N R H 4 H 3C CH 3 CH 3 H H R 2 CH 3 H H CH 3 H H CH 3 Kolumna: LiChroCART Purospher STAR RP-18e (5µm) Eluent: Acetonitryl / Bufor fosf. Gradient Przepływ: 1,2 ml/min Detecja: UV 254 nm Temp.: 45 C Nastrzyk: 1 µl Próbka: 1) ctan 1H-Tetrazol-1-ylu 2) Hydrolizowany cefazolin 3) nieznana 4) Cefazolin 5) Kwas cefazolinowy Kolumna: LiChroCART Purospher STAR RP-18e (5µm) Eluent: Acetonitryl / Metanol / Bufor amonowo octanowy (5 / 55 / 4) Przepływ: 1, ml/min Detekcja: UV 231 nm Temp.: 6 C Nastrzyk: 1 µl Próbka: Produkty uboczne (A9, A8, A7, A6) Kitasamycyna (A5) Produkty uboczne (A4, A3, A1, A13)

9 Purospher STAR RP-18e Przykładowe aplikacje farmaceutyczne Czystość krzemionki Purospher RP-18e vers. Chromolith RP-18e 4 Profeny 1 3 Kolumna: LiChroCART 15-4,6 Purospher STAR RP-18e, 5µm Purospher RP-18e, 5 µm 125 x 4mm aza ruchoma: Acetonitryl /,1 % Kwas fosforowy 55: Przepływ: 1, ml/min 4 Detekcja: UV 22 nm Temperatura: 3 C bjętość: 1 µl Próbka: 1.) Ketoprofen min Ten sam materiał bazowy Ta sama bardzo dobra selektywność! 2.) enoprofen 3.) luorobiprofen 4.) Ibuprofen, 7,5 15, Chromolith Performance RP-18e 1 x 4.6mm 7 14 min

10 ph ph Kwasy Problemy z powtarzalnością czasów retencji substancji łatwo jonizujących (np.kwasy). Sytuacja taka ma miejsce, gdy pka np. kwasu ma wartość zbliżoną do ph fazy ruchomej (dwie formy: protonowana i zjonizowana). d wartości ph zależy stężenie każdej z form różniących się Rt. RZWIĄZANIA: - bardzo precyzyjna kontrola ph fazy ruchomej. Dobre rezultaty uzyskuje się kontrolując ph z rozrzutem ±,2 ph. Niedostateczna selektywność w chromatografii substancji łatwo jonizujących. RZWIĄZANIA: wzrost ph - zmiana wartości ph fazy zazwyczaj wpływa na zmianę kolejności elucji pików, a zatem na zmianę selektywności. Zmiana ph daje często lepsze rezultaty niż zmiana rozpuszczalnika organicznego fazy ruchomej. Zasady Substancje najczęściej stosowane do przygotowania buforów Substancja buforująca K 2 HP 4 x 3H 2 (nr ) LiChropur Na 2 HP 4 x 2H 2 (nr ) LiChropur Zakres buforowania (ph) Kwas cytrynowy monohydrat (nr ) GR 2,1 4,1 Kwas mrówkowy 98-1% (nr ) GR 2,8 4,8 Kwas octowy 1% (nr ) GR 3,8 5,8 4,8 Na 2 C 3 bzw. (nr ) GR pka 3,1 (pk 1 ) 3,8 5,4 7,4 6,4 (pk 1 ) 6,2 8,2 9,3 11,3 1,3 (pk 2 ) 7,2 (pk 2 ) KH 2 P 4 (nr ) GR Trietyloamina (nr CN ML) 1, 12, 11, (pk 2 )

11 ph ph Zakres ph kolumn RP-18 LiChrosorb RP-18 (5, 7, 1µm) 2 7,5 LiChrospher RP-18 (5, 1µm) 2 7,5 Superspher RP-18 (4µm) 2 7,5 Chromolith RP-18e (monolit) 2 7,5 Purospher RP-18 (5µm) 2 8 Purospher STAR RP-18e (5, 3 µm) 1,5 1,5 Zakres ph kolumn o szerokim zakresie ph Purospher STAR RP-18e 1,5 1,5 Aluspher RP- select B (5µm) 2 12 Kolumna: LiChroCART 25-4 Aluspher RP-select B, 5 µm aza: Metanol/.25M NaH 5/5 (v/v) Próbka: 1. Sotalol 2. Atenolol 3. Metoprolol 4. Bisoprolol

12 Ciśnienienie (backpressure) Ciśnienienie (backpressure) W chromatografii z zastosowaniem klasycznych kolumn i dużych wartości przepływu eluenta (szybkie analizy) lub eluentów o wysokiej lepkości znacznie wzrasta ciśnienie (backpressure). PRPZYCJE: - zastosowanie kolumn monolitycznych Chromolith umożliwia zaprogramowanie wysokich przepływów bez znaczącego wzrostu ciśnienia. Wykres Van Deemter a Ciśnienie (bar) Column X: 3.5µm Column S: 3.5µm Column Z: 3.5µm Column X: 5µm Column S: 5µm Column Z: 5µm Chromolith TM Performance Przepływ (ml/ min) - Równanie Kozeny-Carman p = f η L π r 2 d 2 H = Wysokość półki teoretycznej (HEPT) u = Wielkość przepływu fazy ruchomej Chromolith Performance Im mniejsze uziarnienie tym większa możliwość zwiększania wartości przepływu bez straty rozdzielczości (sprawności) kolumny

13 Ciśnienienie (backpressure) Ciśnienienie (backpressure) Zwiększanie przepływu ß-blokery Chromolith Performance RP-18e 1 mm x 4.6 mm 1 ml/min - 17 bar Makropory: 2 mµ Mezopory : 13Å 5 ml/min - 85 bar ) Całkowita porowatość > 81% (65 7% dla kolumn klasycznych) 9 ml/min bar 1,5 min

14 Ciśnienienie (backpressure) Łączenie kolumn Ciśnienienie (backpressure) Blokada kolumn zanieczyszczenia mechaniczne Podobnie łączenie szeregowo kolumn klasycznych w celu zwiększenia sprawności układu jest często niemożliwe ze względu na drastyczny wzrost ciśnienia. PRPZYCJA: - zastosowanie kolumn monolitycznych Chromolith Łączenie kolumn Chromolith TM Performance 14 x Chromolith TM Performance 1-4.6mm = 1.4 m 18 N/kolumnę!!! 117 bar 5µm / 6 <,8µm 3.5µm / 6 <,6µm 1,7µm / 6 <,3µm Wzrost ryzyka zablokowania kolumny ACN/ water (8/ 2; v/v) 1 ml/min thiourea, 2. benzene, 3. toluene, 4. ethyl-, 5. propyl-, 6. butyl-, 7. pentylbenzene Małe ryzyko zablokowania kolumny = duża większa żywotność kolumny Chromolith

15 Ciśnienienie (backpressure) Blokada kolumn zanieczyszczenia mechaniczne Ciśnienienie (backpressure) Blokada kolumn zanieczyszczenia mechaniczne Szybka chrom. Na kolumnach 1.7 µm Szybka chromatografia na kolumnach Chromolith : Kolumna 2,5 µm, 5 x 2. mm Ciśnienie: 117 bar Chromolith 5 x 2. mm Ciśnienie: 47 bar Kolumna z wypełnieniem 1.7µm może bardzo szybko ulegać zablokowaniu ponieważ przestrzenie pomiędzy ziarnami mają średnicę tylko.3 µm. Kosztowny system UPLC. Rozmiar makroporów 2µm. Możliwość szybkiej chromatografii bez dodatkowych inwestycji w sprzęt UPLC. Większa żywotność kolumny.

16 Ciśnienienie (backpressure) Analiza LC/MS leku i metabolitu w płynie ustrojowym bez przygotowania próby Ciśnienienie (backpressure) Gradient przepływu EIC 349 m/z EIC 44 m/z 1 sze dozowanie 1. Lek NH Chromolith Performance RP-18e 1 mm x 4.6 mm enole N H 1 dozowań EIC 349 m/z EIC 44 m/z Chromolith Speed RD RP-18e 2. Metabolit N H N N Gradient przepływu (brak konieczności równowagowania) -2 min 2 ml/min 2-3 min 2-5 ml/min 3-6 min 5 ml/min

17 NWŚĆ - Chromolith 2mm Chromolith 3mm Uniwersalna można stosować do UPLC, UHPLC i HPLC z małą obj. martwą!!! Kompatybilna z LC/MS przepływy,2 1 ml/min!!! Długa żywotność kolumny!!! Dłuższy czas życia uszczelek!!! Szybkie analizy z optymalna sprawnością dla przepływów,5 2 ml/min!!! Wysoka czułość przy mniejszym przepływie!!! Wysoka czułość w detekcji MS!!! szczędność 1 USD/rok!!! Rys. 2 Chromolith RP-18e 1-3 mm Przepływ: 1.7 ml/min Ciśnienie: 1 bar Rys. 1 Chromolith RP-18e 1-4,6 mm Przepływ: 4. ml/min Ciśnienie: 137 bar Warunki chromatograficzne: Acetonitryl/ Woda 6/ 4, UV 254 nm (celka 2.4 µl), temp. pokojowa, obj. nastrzyku 1 µl Próbka: 1) Bifenyl-4,4 -ol, 2) Bifenyl-2,2 -ol, 3) Bifenyl-4-ol, 4) Bifenyl-2-ol

18 Chromolith Chromolith Kolumna dostarczna jest w układzie acetonitryl/woda Materiał obudowy - PEEK ph: ciśnienie maksymalne: 2 bar temperatura: do 45 C Chromolith TM CapRD RP 18e (15mm x 1µm) znaczona wg USP 29 jako L Chromolith lash RP-18e ( 25 x 4.6 mm) Chromolith SpeedRD RP-18e ( 5 x 4.6 mm) Chromolith Performance RP-18e (1 x 4.6 mm) Chromolith Performance RP-18e (1 x 3 mm) Chromolith astgradient RP-18e (5 x 2 mm)

19 Chromolith - aplikacje Chromolith - publikacje - Alkaloidy - Barwniki żywności - Leki przeciwpadaczkowe - Substancje zasadowe - Carbidoba - Katecholaminy - Środki powierzcniowo cz. - Concor - Składniki napojów energ. - EMD - Euthyrox - lavonoidy - Ilvico - Melperon - enole - talany - Konserwanty - Profeny - ß-Blockery - Steroidy - Sulfonamidy - Słodziki - Tokoferole - Urone

20 Brak lub słaba retencja na fazach typu RP Brak lub słaba retencja na fazach typu RP Brak lub słaba retencja w chromatografii z fazami odwróconymi występuje często w przypadku analiz substancji silnie polarnych i hydrofilowych. PRPZYCJA: - zastosowanie kolumn do chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) HILIC jest uzupełnieniem istniejących technik chromatograficznych RP, NP oraz IC Mechanizm fazę stacjonarną stanowią jony obojniacze (zwitterion) związane z krzemionką (ZIC-HILIC) lub polimerem (ZIC-pHILIC). Efekt separcji uzyskiwany jest poprzez podział analizowanych substancji pomiędzy eluentem, a związaną przez jony obojniacze wodą. Kolejność wymywania w przypadku chromatografii HILIC jest odwrotna niż w klasycznej chromatografii z zastosowaniem faz odwróconych (np. RP-18). HILIC zatem zbliżona jest w tym zakresie do klasycznej chromatografii w fazach normalnych. Zasadniczą jednak różnicą jest stosowanie eluentów zawierających wodę podobnie jak w chromatografii RP.

21 Brak lub słaba retencja na fazach typu RP Pary jonowe HILIC - Klasyczna aparatura HPLC; standardowe uziarnienie 3,5 µm, 5 µm i 1µm - Typowe eluenty zawierają 4 97% acetonitrylu w wodzie lub buforze - Wyższa zawartość rozpuszczalnika organicznego zwiększa retencję - - aza ruchoma musi zawierać minimum 3% wody Niestabilna linia podstawowa w chromatografii na fazach odwróconych z zastosowaniem odczynników do tworzenia par jonowych w analizie substancji o charakterze jonowym. PRPZYCJA: - zastosowanie specjalnie selekcjonowanych odczynników LiChropur ` odczynników charakteryzujących się bardzo wysoką transmitancją UV przy niskich wartościach długości fali: - Próbki powinny być rozpuszczone w rozpuszczalniku organicznym lub fazie (mało wody) - Technika znakomicie sprawdza się w detekcji MS - Czułość analiz substancji hydrofilowych z zastosowaniem HILIC jest 1 1 wyższa niż w RP - Szeroki zakres ph dla kolumn opartych o krzemionkę 3 8; o polimer 2 1. Stężenia: - 5 mm/l dla odczynników o krótkim łańcuchu i,5 mm/l dla odczynników o długim łańcuchu. Dla wysokich stężeń odczynnika, w granicach 1 mm/l retencja substancji analizowanej (o ładunku przeciwnym niż ładunek odczynnika) zwykle nie zależy od zmiany stężenia tego odczynnika. Minimalna zawartość wody w fazie wynosi 1%.

22 Pary jonowe Zawartość węgla (%C) Niedostateczna selektywność rozdziału substancji jonowych i niejonowych. PRPZYCJA: - stosowanie niskich stężeń odczynnika (do 5 mm/l) umożliwia regulację retencji poprzez zmiany jego stężenia. Zazwyczaj wraz ze wzrostem stężenia odczynnika wzrasta retencja substancji jonowej, podczas gdy retencja związków niejonowych pozostaje praktycznie stała - zależność ta sprawdza się tylko dla kolumn będących w stanie równowagi z odczynnikiem par jonowych. Dla kolumn zawierających około 3 g adsorbentu (np. 25 x 4) i dla stężenia odczynnika w granicach 5 mm/l stan równowagi osiągamy po przepompowaniu około 15 ml fazy ruchomej (2,5h dla1 ml/min) Długi czas równoważenia kolumn. PRPZYCJA: - przechowywanie kolumn w fazie ruchomej. Wystarczy wówczas około 1 objętości kolumny do pełnego zrównoważenia - dla odczynników z długim łańcuchem (kwaśny siarczan cetylotrimetyloamoniowy lub sól sodowa kwasu 1- dodekanonosulfonowego) stosowanie kolumn dedykowanych do IPC. Wartości czasu retencji dla kolumn z fazami odwróconymi o różnej zawartości węgla. INRMACJA: - zawartość % węgla jest jedynym z parametrów branych pod uwagę przy porównaniu retencji kolumn. Dla kolumn różniących się znacznie porowatością (gęstością sorbentu) nie ma jednak bezpośredniej zależności retencji od zawartości %C. Zawartość % węgla podstawowych sorbentów RP-18 firmy MERCK: LiChrosorb RP-18 16,2% LiChrospher RP-18 21,% LiChrospher RP-18e 21,6% Purospher RP-18 18,5% Purospher STAR RP-18e 17,% Chromolith RP-18e 18,%

23 bjętość martwa bjętość martwa Wszystkie elementy połączeń kapilar (nakrętki, uszczelki stożkowe-ferrule, gniazda) muszą być ściśle dopasowane. Poprawnie zamontowana kapilara powinna powinna stykać się z dolną krawędzią gniazda. bjętość martwa wynikająca z nieprawidłowych połączeń może być przyczyną rozdwajania lub ogonowania pików. 1 nakrętka ustala pozycję feruli natomiast 2 pozycje kapilary. Korzyść: brak obj. martwej = symetryczne piki Inne korzyści: Możliwość szybkiej wymiany różnych kolumn Mocowanie kolumny bez użycia klucza; praca z ciśnieniem do 6 bar, Zerowa objętość martwa dla różnych kolumn Kapilara o śr. wew..13 mm redukuje możliwość zablokowania

24 Czystość fazy ruchomej Czystość fazy ruchomej Stosowanie rozpuszczalników o nieodpowiedniej czystości może skutkować obecnością pików duchów szczególnie w trakcie analizy gradientowej Stosujemy wyłącznie rozpuszczalniki dedykowane do HPLC LiChrosolv! Nie należy stosować przeterminowanych i niefiltrowanych buforów! Detekcja MS Hypersolv - dla najbardziej wymagających aplikacji z użyciem detektora fluoroscencyjnego i detektora MS Acetonitryl (1.29) pogłębiona specyfikacja w zakresie UV (19 i 195 nm) w porównaniu z gradientowym % 1% Transmitancja UV (%) 95% 9% 85% 1.3 czystość gradientowa 8% Długość fali (nm)

25 Efekt czasów odpowiedzi i szybkości próbkowania Efekt czasów odpowiedzi i szybkości próbkowania Wzorzec parabenu, czas próbkowania = 5 ms, A: 35% H 2, B: 65% Acetonitryl 3 ml/min, Kolumna Chromolith Performance (1 mm x 4.6 mm), 3 C TC = 8. s TC = 4. s TC = 2. s TC = 1. s Tylko detektor z najniższymi wartościami czasu odpowiedzi i dużą szybkością próbkowania 1 gwarantuje najlepszą rozdzielczość pików i wysoką dokładność oznaczania TC = 8. s mau Szybkość próbkowania: 1 ms (LaChrom Ultra 24U) 2 ms (LaChrom Ultra L-24U) 5 ms (LaChrom Ultra L-24U) mau 5 TC =.5 s TC =.1 s TC =.5 s Minutes min Liczba półek teoretycznych znacznie wzrasta dla częstości próbkowania 1 ms w porównaniu z 5 ms

26