Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================ Ćwiczenie 2 Izolacja plazmidowego DNA i elektroforeza agarozowa Każda osoba przynosi kalkulator. Metody izolacji DNA różnią się w zależności od rodzaju DNA (jednoniciowy, dwuniciowy, chromosomalny, plazmidowy) oraz od rodzaju materiału biologicznego, z którego DNA izolujemy (komórki roślinne, zwierzęce, bakteryjne bądź wirusy). Zastosowana metoda izolacji powinna zapewniać uzyskanie preparatu DNA o wysokiej czystości i niskim stopniu degradacji. Wszystkie metody cechują dwa podstawowe etapy: lizę komórek i oddzielenie DNA od pozostałych elementów komórki. W przypadku izolacji DNA z komórek roślinnych, głównym utrudnieniem jest obecność polisacharydów, będących inhibitorami wielu enzymów stosowanych w pracach z DNA, co utrudnia jego późniejsze wykorzystanie. Standardowe metody oczyszczania, takie jak ekstrakcja fenolem czy wytrącanie alkoholem, nie umożliwiają usunięcia polisacharydów z roztworu DNA. Problem ten rozwiązano poprzez użycie detergentu CTAB (ang. cetyltrimethylammonium bromide) bromku cetylotrimetyloaminowego. CTAB powoduje degradacje białek i błon komórkowych, a ponadto umożliwia oddzielenie DNA od polisacharydów. W obecności wysokiego stężenie NaCl (ponad 0,7M) CTAB tworzy kompleksy z DNA, które utrzymują się w roztworze. Po obniżeniu stężenia NaCl (poniżej 0,4M) kompleksy CTAB/DNA ulegają wytrąceniu tworząc zawiesinę. Jej odwirowanie umożliwia oddzielenie kompleksów DNA/CTAB (osad) od polisacharydów (roztwór). W przypadku izolacji DNA z komórek zwierzęcych, głównym problemem jest obecność znacznej ilości białek. W celu ich usunięcia często wykorzystuje się trawienie proteinazą K (enzym proteolityczny) oraz ekstrakcję fenolem i chloroformem. W wielu badaniach diagnostycznych, DNA izolowane jest z krwi pacjentów. W tym przypadku, w celu zwiększenia wydajności izolacji, we wstępnym etapie z preparatu często usuwa się erytrocyty, które pozbawione są jąder komórkowych. W przypadku izolacji DNA z konkretnej struktury subkomórkowej (np. jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty), konieczny jest dodatkowy etap wstępny, podczas którego wykonuje się frakcjonowanie materiału biologicznego w celu rozdzielenia poszczególnych organelli. Wykorzystanie odpowiednich buforów umożliwia lizę poszczególnych organelli (np. odpowiedni roztwór detergentu Triton X-100 może być wykorzystany do specyficznej lizy mitochondriów i chloroplastów, z pozostawieniem nienaruszonej struktury jąder komórkowych). Celem ćwiczenia jest izolacja plazmidowego DNA z komórek prokariotycznych. Plazmidy występujące w komórkach prokariotów są zwykle niewielkimi, kolistymi pozachromosomowymi cząsteczkami DNA, które replikują się niezależnie od chromosomu. Geny kodowane w plazmidowym DNA nie są niezbędne do życia komórki, mogą jednak być przydatne w określonych warunkach, np. geny kodujące białka warunkujące oporność bakterii na antybiotyki lub umożliwiające rozkład i asymilację różnych związków odżywczych. Plazmidy mogą być przekazywane pomiędzy komórkami bakteryjnymi na drodze horyzontalnego transferu genów (w procesach koniugacji lub transformacji) bądź wertykalnie (komórka macierzysta przekazuje plazmid komórkom potomnym podczas podziału). Plazmidy koliste są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte i negatywnie superzwinięte. W komórkach pewnych bakterii i drożdży stwierdzono również obecność plazmidów liniowych. Wielkość plazmidów wynosi od ok. 2 do 100 kbp (kilo par zasad z ang. kilo base pairs), dla porównania wielkość chromosomu bakteryjnego wynosi, zależnie od gatunku bakterii, od 1,8 do 2,5 Mbp (mega par zasad). Istnieje kilkanaście metod oczyszczania plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych. Wszystkie złożone są z podobnych etapów: 1
1. Hodowla komórek bakteryjnych (i ewentualna amplifikacja liczby plazmidów) Do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych, najczęściej wykorzystuje się hodowle płynne, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem (gen oporności na antybiotyk znajduje się na plazmidzie). Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. z serii puc) otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. zawierające origin ColE1) powinny być przed izolacją amplifikowane, np. poprzez dodanie do hodowli chloramfenikolu. Chloramfenikol jest antybiotykiem, który powoduje zahamowanie biosyntezy białek, co z kolei prowadzi do zahamowania replikacji nukleoidu. Replikacja plazmidów serii ColE1 jest natomiast niezależna od nowo syntetyzowanych białek, zatem substraty do syntezy DNA obecne w komórce są w tych warunkach niemalże w całości wykorzystane do replikacji DNA plazmidowego. 2. Liza komórek bakteryjnych. Komórki zawiesza się w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, co w konsekwencji prowadzi do ich lizy. Czynnikami prowadzącymi do lizy są detergenty (dodecylosiarczan sodu SDS, sarkozyl, Triton X-100), które niszczą błonę komórkową, rozpuszczalniki organiczne (fenol, chloroform), które powodują denaturację białek, roztwory alkaliczne lub wysoka temperatura. Często stosuje się też lizozym - enzym trawiący mureinę ściany komórkowej bakterii (nie działa w ph < 8.0). Podczas oczyszczania DNA należy zapobiegać jego degradacji przez nukleazy. Osiąga się to poprzez dodanie do buforu, w którym zawieszone są komórki, związków chelatujących dwuwartościowe kationy (np. EDTA), będące kofaktorami nukleaz. Również praca w warunkach jałowych oraz używanie jednorazowych rękawiczek znacznie minimalizują niebezpieczeństwo degradacji DNA przez nukleazy. 3. Oczyszczenie plazmidowego DNA. Kluczowym momentem jest tu oddzielenie DNA plazmidowego od chromosomalnego; aby to osiągnąć najczęściej wykorzystuje się różnice w fizycznych właściwościach nukleoidu i plazmidów (inna topologia i rozmiar cząsteczek). Większość plazmidów bakteryjnych występuje w formie negatywnie superzwiniętej (CCC- ang. covalently closed circle) oraz charakteryzuje się znacznie mniejszym niż chromosom bakteryjny rozmiarem. Podczas lizy alkalicznej roztwór NaOH o wysokim ph (12.0-12.5) powoduje całkowitą denaturację chromosomalnego DNA, natomiast plazmidowy DNA zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach (lokalnie). Fragmenty chromosomalnego DNA po neutralizacji ph w obecności wysokiego stężenia soli (np. octanu amonu) podlegają renaturacji niespecyficznej i tworzą nierozpuszczalną sieć, dzięki czemu można usunąć je przez wirowanie (osad), natomiast DNA plazmidowy ulega specyficznej renaturacji i pozostaje rozpuszczony (obecny w supernatancie). Mechanizm oddzielenia chromosomalnego i plazmidowego DNA podczas lizy termicznej jest podobny, przy czym czynnikiem denaturującym jest tu wysoka temperatura. Kolejnym etapem izolacji plazmidu jest oddzieleniu go od białek. Zwykle stosuje się w tym celu roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem. Białka można też usunąć poprzez trawienie proteazami (zwykle proteinazą K). Następnie z próbki usuwane jest RNA poprzez inkubację w obecności enzymu degradującego ten kwas nukleinowy (RNaza) bądź przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu. Ostatnim etapem jest precypitacja (wytrącanie) plazmidowego DNA poprzez zastosowanie alkoholu etylowego lub izopropanolu w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego. Pozostałości soli usuwa się poprzez przemycie osadu 70% etanolem. Czynności te przeprowadza się w celu zagęszczenia próbki DNA plazmidowego. Obecnie do izolacji DNA plazmidowego coraz częściej stosuje się gotowe zestawy, które zapewniają łatwy i wydajny proces izolacji. Zasada działania takich zestawów oparta jest zwykle o zdolność wiązania DNA do złoży krzemionkowych w obecności soli chaotropowych (np. tiocyjanian guanidyny). Sole 2
chaotropowe powodują zerwanie wiązań wodorowych pomiędzy makrocząsteczkami (np. DNA) i wodą, co z kolei umożliwia utworzenie takich wiązań między DNA a krzemionką obecną w złożu. Część praktyczna Szczepy i plazmidy: DH5α (fhua2 Δ(argF-lacZ)U169 phoa glnv44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17) puc18 Odczynniki: pożywka LB antybiotyk (ampicylina) roztwór L1 (0,2 M NaOH, > 1% SDS) Bufor GL3 (> 3M CH3COOH, >3M CH3COOK, >7 M chlorowodorku guanidyny) Roztwór A1 (izopropanol 70%) Bufor TE (1M Tris-HCl (ph 7,5), 0,5M EDTA (ph 8)) Odczynniki do elektroforezy agarozowej: 1% agaroza roztwór bromku etydyny (0,5 µg/ml) bufor TAE 0,5x stężony ( 20mM Tris-octan, 1mM EDTA ph 8.0) 6x stężony bufor obciążający ( 30% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% cyjanoksylen) Aparatura: wytrząsarka wodna, łaźnia wodna, worteks, mikrowirówka, aparat do poziomej elektroforezy agarozowej IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA: 1. Bakterie z wybranych kolonii bakteryjnych zaszczepić w 10 ml pożywki płynnej LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem i hodować przez noc w 37 C z wytrząsaniem. 2. Hodowlę bakteryjną (1,5ml) wirować 5 minut przy 6000 RPM. 3. Odrzucić supernatant, osad zawiesić w 200 µl roztworu L1. 4. Dodać 200 µl roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez 5-6-cio krotne odwracanie probówki (aby nie doprowadzić do fragmentacji chromosomalnego DNA) inkubować 3 min. w temperaturze pokojowej. Jeżeli po tej czynności lizat nie jest całkowicie klarowny należy ponownie odwrócić próbkę kilka razy i wydłużyć czas inkubacji o kolejne 3 min. 5. Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego (GL3) i wymieszać kilkukrotnie odwracając próbkę. 6. Wirować10 minut przy 10-15 tys. RPM. 7. Ostrożnie wlać supernatant do kolumienki do oczyszczania plazmidowego DNA. 8. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM. 9. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce. 10. Nanieść na kolumienkę 500 µl pierwszego roztworu płuczącego (W). 11. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM. 12. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce. 13. Nanieść na kolumienkę 600 µl drugiego roztworu płuczącego A1. 14. Wirować 2 minuty przy 10-15 tys. RPM 15. Osuszoną kolumienkę umieścić w nowej probówce 1,5 ml, a na złoże nanieść 60 µl roztworu TE. 16. Inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej. 17. Wirować 1 minutę przy 10-12 tys. RPM 3
18. Kolumnę usunąć. Oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce może być przechowywane krótkoterminowo w lodówce lub długoterminowo w temp. -20 C do czasu dalszych analiz. Elektroforeza agarozowa DNA: Elektroforeza w żelu agarozowym służy do fizycznego rozdziału kwasów nukleinowych w polu elektrycznym. W metodzie tej wykorzystywany jest fakt, że naładowane ujemnie cząsteczki DNA pod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego migrują w żelu agarozowym w kierunku elektrody dodatniej (katody). Ruchliwość elektroforetyczna liniowego dwuniciowego DNA jest w przybliżeniu odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z liczby par zasad. Należy jednak pamiętać, że cząsteczki DNA o tych samych masach, różniące się konformacją migrują w innym tempie. Szybkość wędrówki DNA w żelu zależy więc od: konformacji przestrzennej DNA (w przypadku plazmidów może to być forma liniowa L, kolista nacięta OC, superzwinięta CCC) wielkości DNA im większe, tym wolniej migruje w żelu; stężenia agarozy; wartości przyłożonego napięcia; rodzaju buforu użytego do elektroforezy. wartości elektroendoosmotycznej (EEO) agarozy (jest to miara ilości związanych anionów siarczanowych i pirogronianowych, a jej wartość jest odwrotnie proporcjonalna do prędkości migracji ujemnie naładowanych cząsteczek w żelu). DNA jest polianionem, zatem migruje w stronę dodatniej elektrody. Elektroforeza agarozowa, w zależności od stężenia żelu, pozwala na rozdział cząsteczek DNA o długości od 100 bp do 50 kbp. Kierunek przepływu prądu Prędkość migracji różnych form topologicznych plazmidowego DNA w żelu agarozowym. Przygotowanie żelu agarozowego: Część praktyczna Zawiesić 1 g agarozy w 100ml buforu TAE 0,5 x stężonego. Agarozę rozpuścić przez podgrzanie mieszaniny w kuchence mikrofalowej (do ok. 60 C). Po schłodzeniu płynnej agarozy do temp. ok. 40-45 C, wylać ją na płytkę aparatu do elektroforezy na grubość 3-5mm. Po całkowitym zastygnięciu ostrożnie wyjąć grzebień. Do aparatu wlać 0,5 x stężony bufor TAE tak, aby żel był nim przykryty na grubość ok. 1mm. 4
Elektroforeza agarozowa DNA: Roztwór zawierający DNA wymieszać z barwnikiem elektroforetycznym w proporcji: 2 µl barwnika na 10µl roztworu DNA. Przygotowane próby nanosić do studzienek żelu (10µl). Rozdział elektroforetyczny prowadzić w polu elektrycznym o napięciu 5V na 1 cm długości żelu Po zakończeniu rozdziału barwić żel w roztworze bromku etydyny przez 15 min. Żel oglądać w świetle UV o długości fali 320nm. Dokumentacja w postaci zdjęcia. Zagadnienia do przygotowania: 1. Budowa i cechy DNA plazmidowego oraz zastosowanie plazmidów w inżynierii genetycznej. 2. Pojęcia: marker selekcyjny, precypitacja, chelatacja jonów dwuwartościowych, denaturacja i renaturacja DNA, origin replikacji, MCS (miejsce wielokrotnego klonowania), promotor, przykłady wektorów genetycznych. 3. Rodzaje topologicznych form plazmidu i kolejność ich migracji w żelu agarozowym. 4. Metody izolacji plazmidowego DNA bakterii (liza alkaliczna, liza termiczna, izolacja z użyciem kolumienek). 5. Elektroforeza agarozowa DNA i metoda wybarwienia cząsteczek DNA w żelu w celu ich obserwacji Literatura: 1. Turner P.C., Mclennan A.G., Krótkie wykłady- biologia molekularna 2. Sęktas M., Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii 3. Sambrock J., Russell D.W., Molecular cloning 4. Włodarczyk M.(2002), Co to jest plasmid? Kosmos 51:231-240 5. Włodarczyk M. (2002), Różnorodność cech genotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy. Kosmos 51: 241-254 6. Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii 5