RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202951 (21) Numer zgłoszenia: 364077 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 27.03.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 27.03.2002, PCT/CA02/00413 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 03.10.2002, WO02/77210 PCT Gazette nr 40/02 (51) Int.Cl. C12N 15/86 (2006.01) C12N 15/34 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) C12N 7/00 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C07K 14/075 (2006.01) (54) Sposoby hodowli wirusów rodzaju cirkowirus (30) Pierwszeństwo: 27.03.2001,US,60/279,173 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.12.2004 BUP 25/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2009 WUP 08/09 (73) Uprawniony z patentu: UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN, Saskatoon,CA (72) Twórca(y) wynalazku: Qiang Liu,Calgary,CA Suresh K. Tikoo,Saskatoon,CA Philip Willson,Saskatchewan,CA Lorne A. Babiuk,Saskatchewan,CA (74) Pełnomocnik: Szymon Łukaszyk, Kancelaria Patentowa Ł & P PL 202951 B1
2 PL 202 951 B1 Opis wynalazku DZIEDZINA WYNALAZKU Wynalazek dotyczy cirkowirusów (rodzaj: Circovirus) i dostarcza kompozycji i sposobów hodowli cirkowirusów, a w szczególności cirkowirusa świń (gatunek: porcine circovirus). Przedmiotem wynalazku są zwłaszcza sposoby hodowli cirkowirusa świń w komórkach ssaków, wywołującego ekspresję genowego białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1. STAN TECHNIKI Rodzina wirusów zwana Circoviridae, powszechnie określanych jako cirkowirusy, którą można odnaleźć w wielu gatunkach roślin i zwierząt, jest opisywana jako okrągłe, bezotoczkowe winiony o średniej średnicy od 17 do 23,5 nm, zawierające pierścieniowy jednoniciowy kwas DNA (ang. single strain DNA - ssdna). Genomowy ssdna cirkowirusów odpowiada najmniejszym znanym replikonom wirusowego DNA. Jak ujawniono w publikacji WO 99/45956 przynajmniej sześć wirusów zidentyfikowano jako członków tej rodziny zgodnie z szóstym raportem Międzynarodowego Komitetu Taksonomii Wirusów (Lukert, P.D. et al. 1995, The Circoviridae, strony 166-168. W F.A. Murphy, et al. (red.) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Comittee for the Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Suppl.). Zwierzęcymi wirusami należącymi do tej rodziny są: wirus anemii kurczaków (ang. chicken anemia virus - CAV); wirus choroby dzioba i opierzenia (ang. beak and feather disease virus - BFDV); cirkowirus świń (ang. porcine circovirus - PCV) oraz cirkowirus gołębi (ang. pigeon circovirus). PCV był oryginalnie wyizolowany z hodowli komórek świńskiej nerki. PCV ulega replikacji w jądrze komórkowym i wytwarza ogromne wewnątrzjądrowe ciałka inkluzyjne. Patrz Murphy et al. (1999, Circoviridae strony 357-361, Veterinary Virology, Edycja 3, Academic Press, San Diego). Obecnie znane są dwa typy PCV, PCV typu 1 (PCV1) i PCV typu 2 (PCV2). PCV1 wyizolowany jako stałe zanieczyszczenie ciągłej linii świńskich komórek nerkowych PK-15 (ATCC CCL31), nie wywołuje wykrywalnych cytopatologicznych efektów w hodowli komórkowej i nie powoduje choroby u świń po doświadczalnym zakażeniu (patrz Allan, G., 1995, Vet. Microbiol. 44: 49-64; Tischer, I. et al. 1982, Nature 295: 64-66; oraz Tischer, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91: 271-276). PCV2, w przeciwieństwie do PCV1, jest blisko związany z wieloukładowym syndromem wyniszczenia po odstawieniu od mleka matki (ang. post weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) występującym u świń odstawionych od mleka matki (patrz Allan G. et al., 1998, Europe J. Vet. Diagn. Investig. 10: 3-10; Ellis, J. et al., 1998, Can. Vel J. 39: 44- -51 oraz Morozov, I. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541). Sekwencje nukleotydowe dla PCV1 ujawnili Mankertz, A., et al. (1997, J. Virol. 71: 2562-2566) oraz Meehan, B.M., et al. (1997, J. Gen. Virol. 78: 221-227) a sekwencje nukleotydowe dla PCV2 ujawnili Hamel, A.L. et al. (1998, J. Virol. 72: 5262-5267); Mankertz, A. et al. (2000, Virus Res. 66: 65-77) oraz Meehan, B.M. et al. (1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179). Szczepy PCV2 są ujawnione w opisie patentowym WO 00/01409 i zostały zdeponowane w European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbilogy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Wielka Brytania i obejmują: akcesję No. V97100219; akcesję No. N/9700218; akcesję No. V97100217; akcesję No. V98011608; oraz akcesję No. V98011609. PCV2 ujawniono także w opisie patentowym WO 00/77216. W opublikowanych dotąd badaniach nad PCV2 stosowano albo homogenaty tkankowe albo hodowane wirusy pochodzące z izolatów ciała komórkowego. Tischer et al. (1987, Arch Virol. 96: 39-57) odnotowali, że komórki nerki świni są pobudzane do wejścia w fazę S w cyklu komórkowym przez potraktowanie D-glukozaminą. Jednakże reakcja taka musi być przeprowadzona z zachowaniem ostrożności, ponieważ D-glukozamina jest toksyczna dla hodowli komórkowych (patrz Allan et al., (2000) J. Vet. Diagn. lnvestigation. 12: 3-14). Istnieje zatem zapotrzebowanie na sposoby hodowli cirkowirusów, takich jak na przykład PCV1 i PCV2 i innych, w taki sposób, aby otrzymać cirkowirusy czyste. Takie sposoby mogłyby mieć przewagę w szczególności w przygotowywaniu antygenów PCV2 jako szczepionek przeciwko PMWS. Celem wynalazku jest sprostanie tej potrzebie. Wszystkie opisy patentowe i publikacje są niniejszym włączone do opisu w całości. ISTOTA WYNALAZKU Istotą wynalazku są sposoby hodowli cirkowirusów ssaków obejmujące: a) otrzymanie komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1, przy czym rzeczone komórki pozwalają na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa ssaków; b) wprowadzenie genomu rzeczonego cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji do rzeczonych komórek ssaków; oraz c) hodowlę rzeczonych komórek ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczo-
PL 202 951 B1 3 nego cirkowirusa ssaków. W przypadku niektórych realizacji, sposób ponadto obejmuje odzyskiwanie rzeczonych cirkowirusów z rzeczonych komórek hodowanych. W niektórych realizacjach wynalazku, cirkowirusem ssaków jest cirkowirus świń, taki jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W jeszcze innych realizacjach cirkowirus świń składa się z chimerycznej sekwencji nukleotydowej. W innych realizacjach, komórki ssaków pochodzą od świni. W kolejnych realizacjach, tymi komórkami ssaków są komórki siatkówki świni. W pewnych realizacjach wynalazku białkiem funkcjonalnym adenowirusa E1 ssaków jest białko funkcjonalne ludzkiego adenowirusa E1. W jeszcze innych realizacjach białkiem funkcjonalnym adenowirusa E1 ssaków jest białko funkcjonalne adenowirusa świń E1. W kolejnych realizacjach białkiem funkcjonalnym E1 jest białko funkcjonalne E1A i/lub E1B. W kolejnych realizacjach komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 ssaków ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych E1 ssaków. W innych realizacjach, sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków. Istotą wynalazku są także rekombinowane komórki ssaków o aktywności adenowirusa E1 ssaków i zawierające genom cirkowirusa ssaków lub jego fragment zdolny do replikacji, przy czym rzeczone komórki są zdolne do replikacji rzeczonego cirkowirusa ssaków. W niektórych realizacjach cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń, takim jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W kolejnych dodatkowych realizacjach, cirkowirus świń posiada chimeryczną sekwencję nukleotydową. W niektórych realizacjach białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1. W innych realizacjach białkiem funkcjonalnym E1 jest białko funkcjonalne adenowirusa świń E1. W innych realizacjach komórką ssaków pochodzi od świni. W kolejnych realizacjach komórką ssaków jest świńska komórka siatkówki. W innych kolejnych realizacjach komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 ssaków ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1 ssaków. W innych realizacjach sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonych komórek ssaków. Istotą wynalazku są także sposoby otrzymywania rekombinowanych komórek ssaków posiadających właściwości adenowirusa E1 ssaków i zawierających genom cirkowirusa ssaków, obejmujące etapy: a) otrzymania komórki ssaków posiadającej właściwości adenowirusa E1 ssaków; oraz b) wprowadzenia genomu rzeczonego cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do rzeczonej komórki ssaków. W dodatkowych realizacjach sposób ten obejmuje dodatkowy etap hodowania tej rekombinowanej komórki ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonych cirkowirusów ssaków. W kolejnych realizacjach sposób ten obejmuje odzyskanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych hodowanych komórek. W niektórych realizacjach cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń, takim jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W kolejnych dodatkowych realizacjach, cirkowirus świń posiada chimeryczną sekwencję nukleotydową. W innych realizacjach komórka ssaków pochodzi od świni. W kolejnych realizacjach komórką ssaków jest świńska komórka siatkówki. W niektórych realizacjach aktywność adenowirusa E1 jest aktywnością ludzkiego adenowirusa E1 albo adenowirusa świń E1. W innych kolejnych realizacjach komórką ssaków posiadającą właściwości adenowirusa E1 ssaków jest trwale transformowana z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1 ssaków. W innych realizacjach sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonych komórek ssaków. OPIS FIGUR RYSUNKU Rysunek fig. 1A-1B przedstawia charakterystykę i miareczkowanie wirusa PCV2 wytworzonego na drodze transfekcji DNA i ekstrakcji z zainfekowanych komórek VIDO R1 metodą Hirt a. (A) przedstawia PCR z zastosowaniem primerów specyficznych dla PCV2 i DNA z komórek zainfekowanych PCV2 (linia 1) i pozornie zainfekowanych komórek (linia 2). Plazmid zawierający genom PCV2 został zastosowany jako kontrola (linia 3). Drabinka DNA 1-kb z GIBCO BRL została nałożona na linii M. (B) przedstawia wirusowy DNA z komórek zainfekowanych PCV2 (linie 1, 3 i 5) oraz komórek pozornie zainfekowanych (linie 2, 4 i 6), które były poddane trawieniu z użyciem Ncol i Stul (linie 1 i 2), EcoRI i Stul (linie 3 i 4), EcoRI i EcoRV (linie 5 i 6). Drabinka DNA 1-kb-plus z GIBCO BRL została nałożona na linii M. Rysunek fig. 2A-2B obrazuje miareczkowanie PCV2 za pomocą wybarwiania immunoperoksydazowego. W 72 h.p.l, pozornie zainfekowane (A) i zainfekowane PCV2 (B) komórki VIDO R1 były inkubowane z króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko ORF2 i drugim biotynowanym przeciwciałem. Po wprowadzeniu kompleksu awidyny i biotynowanej peroksydazy chrzanowej, pojedyncza
4 PL 202 951 B1 warstwa była rozwijana z zastosowaniem tetrahydrochlorku diaminobenzydyny (DAB). Jedna ciemna komórka wynikała z infekcji jednej cząsteczki wirusa. Rysunek fig. 3A-3C przedstawia sekwencję nukleotydową oznaczoną jako (A) i sekwencję aminokwasów dla ORF1 oznaczoną jako (B) oraz ORF 2 oznaczoną jako (C) cirkowirusa świń typu 2 (PCV2) jak opisano w akcesji do Genbanku (Genetyczny bank danych Narodowego Instytutu Zdrowia USA) numer AF086834. KORZYSTNY SPOSÓB REALIZACJI WYNALAZKU Przedmiotem wynalazku są kompozycje i sposoby hodowli cirkowirusów ssaków, w szczególności cirkowirusa świń. Wynalazek opiera się o odkrycie, że można przeprowadzić transfekcję świńskiej komórki posiadającej właściwości ludzkiego E1 z zastosowaniem genomu wirusa PCV2 i wytworzyć wirus PCV2 o wysokim mianie tego wirusa. Linia komórkowa VIDO R1, zdeponowana z ATCC i posiadająca numer akcesji ATCC PTA-155, jest linią świńskich komórek siatkówki, w których przeprowadzono transformację z zastosowaniem ludzkiego adenowirusa-5 (HAV5) E1, w przypadku której wykazano, że pobudza fazę S cyklu komórkowego i transaktywną transkrypcję. Patrz Shenk, T. (1996). Adenoviridae: the viruses and their replication" W Field Virology. Edycja III. B.N. Fields, D.M. Knipe i P.M. Howley (red.) Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, Nowy Jork, strony 2111-2148. Jak zostało to opisane w Przykładzie 3, komórki VIDO R1 poddano transfekcji stosując genom PCV2 i wytworzono wirus na poziomie 2x10 7 lu/ml. Realizacja wynalazku wymaga, jeśli nie zaznaczono inaczej, konwencjonalnej mikrobiologii, immunologii, wirusologii, biologii molekularnej oraz technik rekombinacji DNA, które mieszczą się w obrębie stanu techniki. Techniki te są całkowicie omówione w literaturze. Patrz na przykład, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (red. D. Glover); Oligonucleotide Synthesis (red. N. Gait (1984)); Nucleic Acid Hybridization (red. B. Hames & S. Higgins (1985)); Transcription and Translation (red. B. Hames & S. Higgins (1984)); Animal Cell Culture (red. R. Freshney (1986)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); oraz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Druga Edycja); vol. I, II & III (1989). Circoviridae, rodzina wirusów posiadających okrągłe nie otoczkowane wiriony o średniej średnicy od 17 do 23,5 nm zawierające pojedyncze pierścieniowe jednołańcuchowe DNA (ssdna), jest opisana w The Sixth Report of the International Commitee for Taxonomy of Viruses, supra. Członkowie tej grupy obejmują cirkowirusy świń PCV1 i PCV2. Wiadomo, że niektóre wirusy PCV są patogenne, tak jak PCV2, skojarzone z występowaniem PMWS. Sekwencje nukleotydowe dla PCV1 są przedstawione przez Mankertz, A., et al. 1997, J. Virol. 71: 2562-2566 oraz Meehan, B.M. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78: 221-227. Sekwencje nukleotydowe dla PCV2 są przedstawione przez Hamel, A.L. et al., 1998, J. Virol. 72: 5262-5267; Mankertz, A. et al., 2000, Virus Res. 66: 65-67 oraz Meehan, B.M. et al., 1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179. Wzorcowe szczepy PCV2 zostały zdeponowane w Europejskim Zbiorze Hodowli Komórkowych (ang. European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbilogy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Wielka Brytania i zawarte w akcesji No. V97100219; akcesji No. V9700218; akcesji No. V97100217; akcesji No. V98011608 oraz akcesji No. V98011609. Także Opis patentowy WO 00/77216 ujawnia również PCV2. Sekwencje nukleotydowe PCV2 zostały opublikowane także przez Hamel et al., (1998), J. Virol. Vol. 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) i przez Morozov et al., (1998), J. Clinical Microb. vol. 36, 9: 2535-2541, jak również w GenBank AF086834; AF086835 oraz AF086836. Porównanie opublikowanych sekwencji nukleotydowych dla PCV1 i PCV2 ujawnia < 80% zgodności, choć organizacja genomu jest podobna, szczególnie w rozmieszczeniu dwóch największych otwartych ramek odczytu (ang. open reading frames - ORF), wynikających z procesu replikacji DNA. Wynalazek obejmuje sposoby hodowli cirkowirusów ssaków a w szczególności cirkowirusa świń (PCV). Wynalazek obejmuje sposoby hodowli PCV zawierające sekwencję ujawnione tutaj albo znane ze stanu techniki, ich ORF albo ich fragmenty, które są zdolne do replikacji. Wynalazek obejmuje także sposoby hodowli PCV posiadających sekwencje nukleotydowe PCV różniące się pod względem degeneracji kodu genetycznego od ujawnionych tutaj albo znanych ze stanu techniki albo ich ORF, albo ich fragmentów zdolnych do replikacji. Wynalazek ponadto obejmuje sposoby hodowli PCV zawierających odmiany sekwencji nukleotydowych PCV, które nie zmieniają funkcji albo specyficzności szczepu sekwencji nukleotydowej, albo jej ORF, albo ich fragmentów zdolnych do replikacji. Wynalazek także obejmuje sposoby hodowli PCV zawierających sekwencję nukleotydową PCV zdolną do
PL 202 951 B1 5 hybrydyzacji do tych sekwencji ujawnionych tutaj w warunkach, w których reakcja jest umiarkowanie albo w wysokim stopniu łańcuchowa, oraz sposoby hodowli PCV zawierających mutacje sekwencji nukleotydowej ujawnionej tutaj albo znanej ze stanu techniki, takie jak delecje albo mutacje miejscowe, albo ich ORF, albo ich fragmenty zdolne do replikacji. Wynalazek obejmuje także sposoby hodowli PCV zawierających heterologiczne sekwencje nukleotydowe. Wynalazek obejmuje sposoby hodowli PCV, które zawierają sekwencje nukleotydowe chimerycznego cirkowirusa, takie jak, na przykład, sekwencje z cirkowirusa świń w połączeniu z sekwencjami nukleotydowymi pochodzącymi od innych patogennych wirusów, takich jak patogenny wirus świń, w tym parwowirus. Według wynalazku heterologiczna sekwencja nukleotydowa, w odniesieniu do cirkowirusa albo komórki ssaków, jest taką sekwencją, która normalnie nie jest związana z sekwencjami cirkowirusa jako część genomu, albo odpowiednio, taką sekwencją, która normalnie nie jest związana z komórką ssaków. Heterologiczne sekwencje nukleotydowe obejmują syntetyczne sekwencje. Reakcje hybrydyzacji mogą być przeprowadzone w warunkach o różnym stopniu łańcuchowości". Warunki, które powodują, że reakcja hybrydyzacji zachodzi w większym stopniu łańcuchowo, są powszechnie znane i znane ze stanu techniki. Patrz, na przykład, Sambrook et al. (1989) na stronie 7.52. Przykłady pokrewnych warunków obejmują (w kierunku zwiększającego się stopnia przebiegu reakcji łańcuchowej): inkubację w temperaturze 25 C, 37 C, 50 C i 68 C, stężenia buforu 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (gdzie SSC oznacza 0,15 M NaCI i 15 mm bufor cytrynowy) i ich odpowiedniki stosując inne układy buforujące; stężenia formamidu 0%, 25%, 50% i 75%; czasy inkubacji od 5 minut do 24 godzin; jeden, dwa lub więcej etapów płukania; czas inkubacji płukania 1, 2 albo 15 minut; oraz stężenie roztworu do płukania 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC, albo woda dejonizowana. Przykładowy zestaw warunków łańcuchowej hybrydyzacji jest następujący: temperatura 68 C oraz stężenie roztworu do płukania 0,1 X SSC. Średni rozmiar genomów PCV kodujących kilka sekwencji polipeptydowych waha się od 8 do 35 kd. Rutynowo określa się otwarte ramki odczytu (ORF) dla cirkowirusa świń stosując standardowe oprogramowanie takie jak na przykład MacVector (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030). Największe ORF, ORF1, z dwóch typów PCV wykazuje tylko nieznaczne odchylenia pod względem zgodności 85% (zmierzonej z zastosowaniem programu clustal") i wykazano, że jest ono białkiem Rep w PCV1 (Mankertz, A., et al., 1998, J. Gen. Virol. 79: 381-384). Bez wnikania w teorię, wyższy stopień odchylenia występujący w przypadku sekwencji ORF2 w PCV1 i PCV2 (zgodność około 65%) mógłby sugerować, cechy PCV specyficzne dla typu PCV mogą być zdeterminowane poprzez odpowiednie białko ORF2. Kilka epitopów specyficznych dla typu PCV zostało zlokalizowanych na sekwencjach ORF2 PCV2. Patrz Mahe, D. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81 : 1815-24. W innym z ostatnich badań, zidentyfikowano ORF2 PCV2 jako główne białko strukturalne, które może tworzyć cząsteczki zbliżone do otoczki wirusowej w komórkach owadów zainfekowanych rekombinowanym baculowirusem wytwarzającym ORF2. Patrz Nawagitgul, P. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81: 2281-2287. W przypadku niektórych realizacji ilustrujących wynalazek ujawnionych tutaj, wektor rekombinacji zawierający genom PCV lub jego ORF lub jego fragment, taki jak region antygenowy, został stworzony metodą rekombinacji in vitro pomiędzy plazmidem a genomem PCV. W niektórych realizacjach, genom PCV jest genomem PCV2. W innych realizacjach, wektor rekombinacji zawierający genom PCV albo jego ORF lub jego fragment, taki jak region antygenowy, został stworzony metodą rekombinacji in vivo. Sposoby rekombinacji in vivo są znane w praktyce ze stanu techniki i obejmują, na przykład sposoby ujawnione przez Chartier, et al. (1996, J. Virol. 70: 4805-4810). Wektory do opracowania genomów cirkowirusa obejmują na przykład plazmidy bakteryjne, które pozwalają wytworzyć wielokrotne kopie skolonowanej sekwencji nukleotydowej cirkowirusa. W niektórych realizacjach, plazmid jest współ-transfekowany do odpowiedniej komórki gospodarza w celu rekombinacji. Odpowiednie do rekombinacji komórki gospodarza obejmują dowolną komórkę, która będzie wspomagała proces rekombinacji pomiędzy genomem PCV a plazmidem zawierającym sekwencję PCV, albo pomiędzy dwoma lub większą ilością plazmidów, przy czym każdy zawiera sekwencję PCV. Proces rekombinacji jest ogólnie przeprowadzany w komórkach prokariotycznych, takich jak na przykład E. coli, podczas gdy wytwarzanie cirkowirusów jest korzystnie przeprowadzane w komórkach ssaków dopuszczalnych do replikacji PCV, takich jak na przykład komórki świńskie, a w szczególności komórki świńskie zdolne do wywoływania ekspresji białka funkcjonalnego adenowirusa E1 ssaków. Wynalazek obejmuje komórki gospodarza ssaka pozwalające na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa, a w szczególności, zdolne do replikacji PCV, takich jak PCV1 i PCV2. Allan et al. (1995, Veterinary Microbiology 44: 49-64) donoszą, że PCV ulegają replikacji w hodowlach świńskich i by-
6 PL 202 951 B1 czych monocytów/makrofagów. Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96; 39-57) donoszą, że wiadomym jest fakt, iż PCV do replikacji w hodowlach komórkowych wymagają aktywnie dzielących się komórek. Przykłady komórek albo linii komórkowych użytecznych w celu przeprowadzenia replikacji PCV obejmują komórki ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego E1 i pozwalających na replikację PCV, w tym komórki świńskie, takie jak świńskie komórki monocytów/makrofagów i świńskie komórki siatkówki wywołujące ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa E1. W ujawnionej tutaj realizacji ilustrującej wynalazek, wykazano, iż świńskie komórki siatkówki o właściwościach ludzkiego adenowirusa E1 są dopuszczalne do replikacji PCV2 i wykazały poziom wytwarzania wirusa 2x10 7 lu/ml. Linie świńskich komórek są dostępne z powszechnych źródeł takich jak na przykład American Type Tissue Collection (ATCC). Wzrost hodowli komórek bakteryjnych, jak również hodowla i utrzymanie komórek eukariotycznych i linii komórkowych ssaka są procedurami dobrze znanymi ekspertom tej dziedziny. Wynalazek obejmuje sposoby hodowli cirkowirusów ssaków, w szczególności cirkowirusa świń, w komórkach gospodarza ssaka, transfekowanych z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa ssaków E1. W niektórych realizacjach, komórka ssaka ulega trwale transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1. W innych realizacjach sekwencje genowe E1 są włączone do genomu komórek ssaków. W jeszcze innych realizacjach sekwencje genowe E1 występują w replikującym plazmidzie. W jeszcze innych realizacjach, sekwencja genowa E1 jest heterologiczna względem komórki ssaków. W przedstawionej tutaj przykładowej realizacji wynalazku, świńska komórka ssaków ulega transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej ludzkiego adenowirusa E1. Wynalazek obejmuje zastosowanie komórki ssaków albo linii komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego E1, tak długo jak komórka ssaków lub linia komórek ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 jest dopuszczalna do przeprowadzenia replikacji cirkowirusów, w szczególności cirkowirusa świń, takiego jak na przykład cirkowirus świń typu 1 albo cirkowirus świń typu 2. W korzystnych realizacjach komórka ssaków oznacza komórkę świni albo linię komórkową. Wynalazek obejmuje dowolne białka funkcjonalne E1 ssaków, dopóki komórka nosiciela ssaka wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 jest dopuszczona do przeprowadzenia replikacji cirkowirusów, w szczególności PCV, takiego jak na przykład cirkowirusa świń typu 1 albo cirkowirusa świń typu 2. Genomy adenowirusów ssaków są znane ze stanu techniki i są ujawnione na przykład przez Reddy et al. (1998, Journal of Virology, 72: 1394), który ujawnił sekwencję nukleotydową, organizację genomu oraz mapę transkrypcji byczego adenowirusa 3 (BAV3); oraz przez Kleiboecker (1995, Virus Res. 36: 259-268), który ujawnił region PAV-4 E1. Wynalazek zawiera białko funkcjonalne E1 z dowolnego z różnych serotypów ludzkiego adenowirusa, takich jak Ad2, Ad5, Ad12 oraz Ad40. W ujawnionej tutaj w przykładzie 1 realizacji, która jest ilustracją wynalazku, białko funkcjonalne E1 jest białkiem funkcjonalnym E1 w ludzkim Ad5. Ludzki gen E1A ulega ekspresji niezwłocznie po infekcji wirusowej (0-2 godz.) i przed dowolnymi innymi genami wirusowymi. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651: 175-208; Flint (1986) Advances Virus Reasearch 31: 169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241: 25-38. Miejscem inicjacji transkrypcji Ad5 E1A jest nukleotyd 498 a miejscem inicjacji ATG białka E1A jest nukleotyd 560 w genomie wirusa. Białko E1B występuje w formie trans i jest niezbędne do transportu dojrzałego mrna z jądra do cytoplazmy. E1B promotor Ad5 składa się z pojedynczego miejsca rozpoznawania Spl o wysokim powinowactwie oraz sekwencji TATA box. W szczególności sekwencje genowe ludzkiego adenowirusa 5 E1A oraz E1B są zlokalizowane w nukleotydach od 505-4034 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej przez Chroboezek, J. et al. (1992, Virology. 186:280-285). W realizacji wynalazku ujawnionej tutaj w przykładach, komórką ssaka gospodarza jest świńska komórka gospodarza z sekwencjami genowymi ludzkiego adenowirusa 5 E1. Genom PCV może być izolowany z wirionów PCV, albo może obejmować genom PCV, który został wstawiony do plazmidu przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej i biotechnologii. Sklonowanie genomu PCV2 o pełnej długości do wektora pbluescript II KS(+) z Strategene metodą PCR jest opisane w Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol. Vol. 38: 3474-3477). DNA genom PCV2 o pełnej długości może zostać uwolniony z otrzymanego plazmidu w wyniku trawienia Sacll. Wprowadzenie sekwencji nukleotydowych cirkowirusa do dopuszczalnych komórek ssaka gospodarza można osiągnąć stosując dowolny sposób znany ze stanu techniki, w tym, ale nie ograniczając się tylko do niej, transfekcję oraz transformację obejmującą, ale nie ograniczając się tylko do poniższych przykładów, mikroiniekcję, elektroporację, precypitację z CaP04l DEAE-dekstran, liposomy, bombardowanie cząsteczkami itp. Przykładowy sposób transfekcji sekwencji nukleotydowych PCV2 do komórek VIDO R1 opisano w przykładzie 3.
PL 202 951 B1 7 Sposoby hodowania prokariotycznych komórek, takich jak komórki bakteryjne, oraz komórek eukaryotycznych, takich jak komórki nosiciela ssaka wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa E1 uważane są za rutynowe przez ekspertów danej dziedziny. Następujące przykłady przytoczono wyłącznie dla zilustrowania, a nie ograniczania zakresu wynalazku. Wszystkie odniesienia i publikacje patentowe, które zostały ujawnione tutaj, są załączone w całości poprzez odniesienia. PRZYKŁADY P r z y k ł a d 1: Przygotowanie świńskich komórek siatkówki, transfekowanych z zastosowaniem sekwencji genowych ludzkiego adenowirusa E1 (komórki VIDO R1). Pierwotnie kultury świńskich komórek siatkówki były transfekowane z użyciem 10 μg plazmidu ptg 4671 (Transgene, Strasbourg, Francja) techniką wykorzystującą fosforan wapnia. Plazmid ptg 4671 zawiera całe sekwencje E1A i E1B (nts 505-4034) z HAV-5, łącznie z genem acetylotransferazy puromycynowej jako łatwego do wyszukania markera. W plazmidzie tym region E1 znajduje się pod kontrolą wyznaczonego promotora z genu mysiej kinazy fosfoglicerynowej, a gen acetylotransferazy puromycynowej jest kontrolowany poprzez wyznaczony wczesny promotor SV40. Transformowane komórki zostały wyselekcjonowane w wyniku przeprowadzenia potrójnego pasażowania w pożywce zawierającej 7 μg/ml puromycyny, zidentyfikowane w oparciu o zmianę w ich morfologii z pojedynczych ognisk (na przykład utraty zahamowania kontaktu), oraz poddane klonowaniu pojedynczych komórek. Wybrana linia komórkowa była w pierwszej kolejności testowana na jej zdolność do wspomagania wzrostu E1 mutantów zawierających delecję HAV-5. Następnie linia komórkowa była badana na obecność sekwencji E1 w genomie metodą PCR, wytwarzanie białek E1A i E1B metodą Western blot, oraz wyznaczano czas podwojenia w warunkach hodowli komórkowej. Wykrywano sekwencje E1, a wytwarzanie białek E1A i E1B identyfikowano metodą immunoprecypitacji. Czas podwojenia był krótszy w porównaniu do wyjściowej linii komórkowej. Aby ocenić stabilność ekspresji E1, komórki VIDO R1 były hodowane przez ponad 50 pasaży (rozdzielenie 1:3 dwa razy w tygodniu) oraz badane na ich zdolność do wspomagania replikacji HAV-5 z usuniętym E1. Ekspresja białek E1A i E1B w czasie regularnych przerw była także monitorowana przy wykorzystaniu metody Western blot. Wyniki wskazywały, że linia VIDO R1 zachowuje zdolność do wspomagania wzrostu wirusa z usuniętym E1 i wykazywała podobne poziomy białek E1 podczas ponad 50 pasaży w hodowli. Dlatego komórki VIDO R1 można uważać za stabilną linię komórkową. Linia komórkowa VIDO R1 została zdeponowana w American Type Culture collection (ATCC) i posiada numer akcesji ATCC PTA-155. P r z y k ł a d 2 Przykład 2 przedstawia opis klonowania molekularnego genomu PCV2 o pełnej długości. Początkowo DNA PCV2 był namnożony przy użyciu techniki PCR z całkowitego DNA ekstrahowanego z prosiąt cierpiących na PMWS. Klonowanie DNA genomu PCV2 o pełnej długości do wektora pbluescript II KS(+) (Stratagene) metodą łańcuchowej reakcji polimeryzacji (ang. polymerase chain reaction - PCR) zostało opisane przez Liu et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). Sekwencja PCV2 została zgłoszona do GenBanku (Akcesja no. AF086834). DNA genom PCV2 o pełnej długości jest uwalniany z otrzymanego plazmidu w wyniku trawienia Sacll. P r z y k ł a d 3 Przykład 3 przedstawia transfekcję komórek VIDO R1, jak opisano w przykładzie 1, z zastosowaniem plazmidu zawierającego genom PCV2 otrzymanego w przykładzie 2. Materiał i sposoby Hodowla komórkowa Linia komórkowa świńskich komórek siatkówki płodów świni, VIDO R1, jak opisano w przykładzie 1 oraz komórki Vero (ATCC) były utrzymywane w 37 C w atmosferze 5% CO 2 w nośniku MEM na bazie Eagles uzupełnionym o odpowiednio 10% albo 5% byczą surowicą płodową aktywowaną ciepłem (ang. fetal bovine serum - FBS). Transfekcja i infekowanie Pojedyncze warstwy komórek VIDO R1, które rosły w płytkach o sześciu studzienkach, poddano transfekcji ze sklonowanym DNA PCV2 z zastosowaniem Lipofektyny według wskazań wytwórcy (GIBCO BRL). Przed transfekcją, genom PCV2 o pełnej długości był uwalniany z plazmidu w wyniku trawienia Sacll (Liu, Q., et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38:2474-2477). W celu infekowania, transfekowane komórki VIDO R1 były poddane trzem cyklom wymrażania (-70 C) i odtajania (37 C). Lizat był następnie oczyszczany poprzez wirowanie i stosowany do infekowania świeżych komórek VIDO R1.
8 PL 202 951 B1 W opublikowanych raportach do hodowli wirusa PCV2 zastosowano linię świńskich komórek nerkowych wolnych od PCV1. W celu pobudzenia do wejścia w fazę S cyklu komórkowego, świńskie komórki nerkowe były każdorazowo zadane D-glukozaminą (patrz Tischer et al., (1987), Arch Virol. 96:39-57). Jednakże owo zadanie musi zostać przeprowadzone uważnie, ponieważ D-glukozamina jest toksyczna dla hodowli komórkowej (patrz Allan et al., (2000). J. Vet. Diagn. lnvestigation. 12:3-14). W przeciwieństwie, ponieważ linia komórkowa VIDO R1 stosowana w tych badaniach była poddana transformacji z użyciem HAV5-E1, który może indukować fazę S, nie było konieczne przeprowadzanie procedury z D-glukozaminą. P r z y k ł a d 4 Oczyszczanie wirusa i miareczkowanie W celu oczyszczenia wirusa PCV2, komórki VIDO R1 zainfekowane PCV2 były inkubowane z 0,5% Tritonem X-114 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze 37 C przez 45 minut a następnie ekstrahowane z zastosowaniem Freonu 113 (1,1,2-trichloro- -trifluoroetanu). Szczątki komórek i błony były oczyszczane poprzez wirowanie przy 2000 g przez 15 minut. Wirusy w supernatancie były zlepiane w płaty w wyniku wirowania przy 35000 g przez 3 godziny w 20% kleiku sacharozowym. Płaty wirusa były zawieszane w PBS i przechowywane w temperaturze -70 C. Miana wirusów były określane jako jednostki infekcji (ang. infectious units - IU) poprzez ilościowe immunowybarwianie białka ORF2 z zastosowaniem peroksydazy. W tym celu pojedyncze warstwy komórek w 12-studzienkowych płytkach były poddawane infekcji z serią rozcienczeń wirusów. Po 1-godzinnej adsorpcji wirusów, komórki były płukane i powlekane MEM zawierającym 2% FBS i 0,7% agarozy. Trzeciego dnia po infekcji (p.i. = ang. post infection) usuwano powłokę z agarozy i mieszano komórki oraz nasączano mieszaniną metanol/aceton (stosunek objętościowy 1:1) przez 20 minut w temperaturze -20 C. Po zablokowaniu z użyciem 1% byczej albuminy surowiczej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, komórki były inkubowane z króliczą surowicą anty-orf2 (Liu at al., 2001, Protein Expression and Purification. 21:115-120). Po 2 godzinach inkubacji płytki płukano przy użyciu PBS i następnie badano z użyciem zestawu VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories). Reakcja była przeprowadzona z użyciem tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i śledzona pod mikroskopem. Poprzez zliczenie pozytywnie wybarwionych komórek, wyrażano miano wirusa jako IU, gdzie 1 IU był określony jako jedna pozytywnie wybarwiona komórka/ognisko w 3 d.p.i (dzień po infekcji). Ekstrakcja wirusowego DNA i jego charakterystyka Wirusowy DNA ekstrahowany był z pojedynczych warstw komórek VIDO R1 zainfekowanych PCV2 według metody Hirta (1967, J. Mol. Biol. 26:365-369). Wirusowy DNA był następnie charakteryzowany poprzez analizę restrykcyjną i łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) w sposób opisany przez Liu et al., (2000). J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). Metodą PCR z zastosowaniem DNA ekstrahowanego z zainfekowanych komórek jako matrycy oraz primerów specyficznych dla PCV-2 powielono produkt o specyficznym rozmiarze, podczas gdy nie uzyskano powielenia DNA z kontrolnych, niezainfekowanych komórek. Zgodnie z oczekiwanymi wzorami restrykcyjnymi, trawienie wirusowego DNA z zastosowaniem Ncol i Stul prowadziło do powstania dwóch fragmentów o rozmiarze, odpowiednio, 1291 bp i 477 bp; trawienie z zastosowaniem Ecol i Stul dawało dwa fragmenty o rozmiarze, odpowiednio, 1492 bp i 276 bp; a trawienie z użyciem EcoRI i EcoRV powodowało powstawanie dwóch fragmentów o rozmiarze, odpowiednio, 1094 bp i 674 bp. Dane te wskazują, iż otrzymanym wirusem jest wirus PCV2. Stosując metodę immunobarwienia oraz zliczając pozytywnie wybarwione komórki, określono miano tej obróbki na 2x10 7 lu/ml. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób hodowli cirkowirusa ssaków, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) otrzymania komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1, przy czym rzeczone komórki pozwalają na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa ssaków; b) wprowadzenia genomu cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do rzeczonych komórek ssaków; oraz c) hodowli rzeczonych komórek ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonego cirkowirusa ssaków.
PL 202 951 B1 9 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto odzyskiwanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych komórek hodowanych. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 2 (PCV2). 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 1 (PCV1). 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków pochodzą od świni. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków są świńskimi komórkami siatkówki. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa ssaków E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa ssaków E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków wywołujące ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulegają stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa E1 jest sekwencją genową ludzkiego adenowirusa E1. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne E1 jest białkiem funkcjonalnym E1A i/lub E1B. 14. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń zawiera chimeryczną sekwencję nukleotydową. 15. Rekombinowana komórka ssaków, znamienna tym, że wywołuje ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 i ma genom cirkowirusa świń lub jego fragment zdolny do replikacji, przy czym rzeczona komórka pozwala na przeprowadzenie replikacji rzeczonego cirkowirusa świń. 16. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1. 17. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1. 18. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczona komórka pochodzi od świni. 19. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 18, znamienna tym, że rzeczona komórka jest świńską komórką siatkówki. 20. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że komórka wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1. 21. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 20, znamienna tym, że rzeczona sekwencja genowa E1 jest sekwencją genową ludzkiego adenowirusa E1. 22. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 20, znamienna tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków. 23. Sposób otrzymywania rekombinowanej komórki ssaków wywołującej ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 i zawierającej genom cirkowirusa świń, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) otrzymania komórki ssaków wywołującej ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1; oraz b) wprowadzenia rzeczonego genomu cirkowirusa świń albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do tej komórki ssaków. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap hodowli rzeczonej rekombinowanej komórki ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonego cirkowirusa świń. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że obejmuje ponadto odzyskiwanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych komórek hodowanych. 26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 2 (PCV2).
10 PL 202 951 B1 27. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 1 (PCV2). 28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków pochodzą od świni. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków są świńskimi komórkami siatkówki. 30. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1. 31. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1. 32. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń zawiera chimeryczną sekwencję nukleotydową. 33. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczona komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków. Rysunki
PL 202 951 B1 11 Fig. 3A
12 PL 202 951 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.