(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206975 (21) Numer zgłoszenia: 369741 (22) Data zgłoszenia: 04.12.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 04.12.2002, PCT/US02/038780 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 12.06.2003, WO03/48334 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/62 (2006.01) C07K 14/55 (2006.01) C07K 16/18 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie (30) Pierwszeństwo: 04.12.2001, US, 60/337,113 12.04.2002, US, 60/371,966 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.05.2005 BUP 09/05 (73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH, Darmstadt, DE (72) Twórca(y) wynalazku: STEPHEN D. GILLIES, Carlisle, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.10.2010 WUP 10/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Łukaszyk Szymon Kancelaria Patentowa Łukaszyk PL 206975 B1

2 PL 206 975 B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy ogólnie białek fuzyjnych zawierających cytokinę oraz sposobów zwiększania wydajności terapeutycznej takich białek fuzyjnych, a w szczególności białek fuzyjnych cytokiny, które wykazują dłuższy okres półtrwania w krążeniu w organizmie pacjenta niż odpowiednia naturalnie występująca cytokina i które posiadają ulepszone właściwości lecznicze. Przedmiotem wynalazku jest zwłaszcza białko fuzyjne IL-2 o ulepszonych właściwościach leczniczych. lnterleukina-2 (IL-2) jest silną cytokiną, która działa na układ odpornościowy generując w pierwszej kolejności odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem komórek. We właściwych warunkach IL-2 wytwarzana jest miejscowo w wysokich stężeniach w pobliżu miejsca występowania antygenu w celu zapewnienia koniecznych współ-sygnałów do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej na ten antygen. Ze względu na jej rolę we wzroście i różnicowaniu limfocytów T, IL-2 uważa się ją za potencjalnie korzystną w immunoterapeutycznych podejściach do leczenia nowotworów. Poza stymulacją limfocytów T, wykazano także, że IL-2 stymuluje limfocyty B, komórki NK, aktywowane limfokiną komórki zabójcze (ang. lymphokine activated killer cells- LAK), monocyty, makrofagi i komórki dendryczne. IL-2 jest zatwierdzonym czynnikiem terapeutycznym w leczeniu złośliwego raka nerki oraz czerniaka złośliwego ale jej zastosowanie jest ograniczone ze względu na toksyczne działanie uboczne, które obejmuje gorączkę, nudności, krwotoki naczyniowe oraz obniżone ciśnienie. Spośród różnych działań ubocznych obserwowanych w przypadku podania IL-2, efektem toksycznym, który jest najmniej pożądany i który, jak się uważa, zasadniczo koliduje z leczeniem IL-2 jest zespół nieszczelności naczyń (ang. vascular leak syndrome) oraz związane z nim komplikacje. Istnieje zatem potrzeba dalszego ulepszenia terapeutycznej użyteczności białek IL-2. Wynalazek opiera się częściowo na identyfikacji mutacji w jednostce IL-2 białka fuzyjnego IL-2 w celu zwiększenia maksymalnej tolerowanej dawki białka w powiązaniu z dawką o maksymalnej efektywności dla tego białka podczas podawania pacjentowi. Korzystne białka fuzyjne są zdolne do wiązania w wyniku bezpośrednich oddziaływań z więcej niż jednym rodzajem receptora wytwarzanego na tej samej komórce w organizmie pacjenta. Korzystne białka fuzyjne cytokiny obejmują cytokinę, która jest zdolna do wiązania więcej niż jednego typu kompleksu receptora cytokiny i więcej niż jednego typu komórek. Wynalazek dostarcza także sposobów do identyfikacji odmian danego białka fuzyjnego cytokiny o użytecznych właściwościach. Istotą wynalazku jest białko fuzyjne zawierające jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej IL-2, charakteryzujące się tym, że jednostka zmutowanej IL-2 zawiera substytucję aminokwasową zmieniającą kwas asparaginowy na treoninę na pozycji odpowiadającej pozycji 20 (D20T) sekwencji aminokwasowej dojrzałego, ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3, rzeczona jednostka nie będąca IL-2 zawiera domenę przeciwciała przy białko fuzyjne wykazuje większą selektywność niż białko odniesienia względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie, gdzie czym białko odniesienia zawiera jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką niezmutowanej IL-2, a rzeczoną selektywność wyznacza się jako stosunek aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2Rαβγ do aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2Rβγ. Mutacje w białku fuzyjnym według wynalazku zmieniają selektywność białek fuzyjnych względem fuzyjnego białka odniesienia i mogą także skutkować różnicującymi zmianami w powinowactwie białka fuzyjnego do receptora IL-2Rβγ względem powinowactwa białka fuzyjnego do receptora IL-2Rαβγ. Korzystne mutacje lub zmiany zmniejszają aktywację przez białko fuzyjne komórek wyrażających receptor IL-2Rαβγ względem aktywacji przez białko fuzyjne komórek wyrażających receptor IL-2Rαβγ. Korzystne białka fuzyjne według wynalazku wykazują ogólnie efekt różnicujący, który jest około 2-krotnie większy. Pod jednym względem efekt różnicujący mierzony jest poprzez odpowiedź proliferacyjną komórek lub linii komórkowych, których wzrost zależy od IL-2. Taką odpowiedź na białko fuzyjne określa się poprzez wartość ED50, którą otrzymuje się kreśląc wykres zależności dawki i odpowiedzi oraz określając stężenie białka, które skutkuje połową maksymalnej odpowiedzi. Stosunek wartości ED50 otrzymanych dla komórek wyrażających receptor IL-2Rβγ do komórek wyrażających receptor IL-2Rαβγ przypadku białka fuzyjnego do stosunku wartości ED50 dla fuzyjnego białka odniesienia daje pomiar efektu różnicującego dla tego białka fuzyjnego. Korzystne jest, aby selektywność względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie wynosiła od około 0,1% do około 100% selektywności fuzyjnego białka odniesienia zawierającego jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej ludzkiej IL-2, która zawiera

PL 206 975 B1 3 substytucję aminokwasową asparaginy na argininę na pozycji odpowiadającej pozycji 88 (N88R) sekwencji aminokwasowej dojrzałego ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3. W korzystnej realizacji aminokwas aspargina w pozycji 88 ulega substytucji argininą (N88R). W innej korzystnej realizacji aminokwas kwas asparginowy w pozycji 20 ulega substytucji treoniną (D20T). W innej korzystnej realizacji glutamina w pozycji 126 ulega substytucji kwasem asparginowym (Q126D). Substytucje różnych aminokwasów skutkują selektywnością w działaniu białek fuzyjnych według wynalazku na komórki posiadające receptor IL-2Rαβγ względem komórek posiadających receptor IL-2Rβγ, która znajduje odzwierciedlenie w powinowactwie białka fuzyjnego do receptora IL-2Rβγ względem powinowactwa białka fuzyjnego do receptora IL-2Rαβγ. Rzeczona selektywność wynosi korzystnie od około 0,1% do około 30%, korzystniej od około 1% do około 20%, a najkorzystniej od około 2% do około 20% selektywności rzeczonego fuzyjnego białka odniesienia. Korzystne jest, aby komórki wyrażające receptor IL-2Rαβγ wybrane były spośród komórek CTLL-2, Kit 225 i dojrzałych limfocytów T. Korzystne jest, aby komórki wyrażające receptor IL-2Rαβγ wybrane były spośród komórek TF-1β i komórek NK. Korzystne jest, aby jednostka IL-2 była zmutowana na więcej niż jednej pozycji aminokwasowej. Korzystne jest ponadto, aby jednostka nie będącą IL-2 była zmutowana. Korzystne jest również, aby jednostka nie będącą IL-2 zawierała zmutowaną domenę przeciwciała. Korzystne jest, aby jednostka nie będącą IL-2 zawierała domenę przeciwciała wybraną z grupy obejmującej KS-1/4, dl-ks, dl-ks(γ4h)(fn>aq), huks, huks(n na Q), dl-nhs76(γ2h), dl-nhs(γ4h), dl-nhs76(γ2h)(fn>aq), dl-nhs76(γ4h)(fn>aq) oraz 14.18. Białko fuzyjne według wynalazku stanowi korzystnie białko fuzyjne typu przeciwciało-il-2 wybrane z grupy obejmującej KS-ala-IL2(D20T) KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) NHS76(γ2h)-ala-IL2(D20T) NHS76(γ2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) NHS76(γ2)-ala-IL2-(D20T). Białko fuzyjne według wynalazku ma korzystnie zastosowanie do leczenia nowotworów. Istotą wynalazku jest ponadto zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworów. Białka fuzyjne z mutacjami w jednej lub większej liczbie pozycji opisanych powyżej wykazują efekt różnicujący, który jest ponad 2-krotnie większy. Korzystnie, efekt różnicujący jest pomiędzy 5-krotny a 10-krotny a bardziej korzystnie pomiędzy około 10-krotny a około 1000-krotny. Oprócz mutowania aminokwasów w jednostce IL-2, można zmutować aminokwasy w jednostce nie będącej IL-2. W korzystnej realizacji jednostką nie będącą IL-2 jest domena przeciwciała. Domena przeciwciała może zostać wybrana spośród różnych immunoglobulinowych (Ig) przeciwciał, korzystnie przeciwciał IgG, w tym na przykład domen przeciwciał IgG gamma 1, IgG gamma 2, IgG gamma 4 lub dowolnej kombinacji tych domen przeciwciała. Termin przeciwciało" i immunoglobulina" według wynalazku oznacza (i) całe przeciwciało (na przykład monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało), (ii) ich fragmenty wiążące antygen, w tym na przykład fragment Fab, fragment Fab', fragment (Fab') 2, fragment Fv, jednołańcuchowe miejsce wiążące antygen, sfv, (iii) przeciwciała o podwójnej specyficzności i ich fragmenty wiążące antygen, oraz (iv) przeciwciała o wielokrotnej specyficzności oraz ich fragmenty wiążące antygen. W białkach według wynalazku region Fc immunoglobuliny może także obejmować przynajmniej jeden stały ciężki region immunoglobuliny, na przykład domenę stałą ciężką 2 (ang. constant heavy 2 - CH2) immunoglobuliny, domenę stałą ciężką 3 (CH3) immunoglobuliny, oraz w zależności od typu immunoglobulin zastosowanych do wygenerowania regionu Fc, opcjonalnie domenę stałą ciężką immunoglobuliny (CH4), lub połączenia powyższych. W szczególnych realizacjach w regionie Fc immunoglobuliny może brakować domeny stałej ciężkiej 1 (CH1) immunoglobuliny. Chociaż regiony Fc immunoglobuliny mogą być oparte na dowolnej klasie immunoglobulin, na przykład IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM, korzystne są regiony Fc immunoglobuliny oparte na IgG. Jednostka przeciwciała zawarta w białku fuzyjnym według wynalazku jest korzystnie ludzka, ale może pochodzić z przeciwciała mysiego, lub immunoglobuliny innego ssaka lub zwierzęcia nie będącego ssakiem. Uwzględnia się fakt, że region Fc zastosowany w białku fuzyjnym według wynalazku może zostać

4 PL 206 975 B1 wykorzystany do konkretnego zastosowania takiej cząsteczki. W jednej z realizacji region Fc pochodzi z izotypu γ1 immunoglobuliny lub jego odmiany. W innej realizacji region Fc pochodzi z izotypu γ2 immunoglobuliny lub jego odmiany. W kolejnej realizacji region Fc może pochodzić z izotypu γ3 immunoglobuliny lub jego odmiany. Region Fc może zawierać region zawiasowy, który pochodzi z innych izotypów immunoglobulin niż sam region Fc. Na przykład region Fc może pochodzić z izotypu γ2 immunoglobuliny i zawierać region zawiasowy pochodzący z izotypu γ1 lub jego odmiany. W innej korzystnej realizacji wynalazku region Fc pochodzi z izotypu γ4 immunoglobuliny. Szczególnie korzystne są izotypy γ4, które zostały zmodyfikowane w ten sposób, że zawierają region zawiasowy pochodzący od izotypu γ1 immunoglobuliny lub jego odmiany. W jednej z realizacji białka fuzyjne według wynalazku zawierają mutacje w jednostce Ig. Użyteczną mutacją jest mutacja w sekwencji QYNSTYR (SEQ ID NO: 1) IgG gamma 1 zmieniająca N na Q; szczególnie użyteczną jest mutacja w sekwencji QFNST (SEQ ID NO: 2) gamma 2 lub 4 zmieniająca motyw dipeptydowy FN na AQ. Wynalazek obejmuje także konstrukcje DNA kodujące różne białka fuzyjne według wynalazku. Białka fuzyjne według wynalazku są szczególnie użyteczne w leczeniu raka, infekcji wirusowych i zaburzeń odpornościowych. Te i inne cele, zalety i cechy ujawnionego staną się bardziej klarowne na podstawie następującego opisu i rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia połączenie cytokiny z drugą jednostką białkową, które zmienia naturalne właściwości wiązania cytokiny. Rysunek fig. 1A przedstawia przyłączaną część do IL-2 jako dimeryczną cząsteczkę, taką jak przeciwciało lub fragment Fc białka fuzyjnego zawierającego Fc, i dlatego dwie cząsteczki IL-2 są transportowane na powierzchnię komórki gdy jednostka IL-2 białka fuzyjnego oddziałuje z jego receptorem. Rysunek fig. 1B przedstawia drugi mechanizm, który powoduje ten sam efekt, a fig. 2 przedstawia typowy profil farmakokinetyczny białka fuzyjnego immunocytokiny huks-il2 (przedstawiony za pomocą trójkątów) i dwóch odmian huks-ala-il2 (przedstawionego za pomocą kółek) oraz huks-ala-il2(n88r) (przedstawionego za pomocą gwiazdek). Wynalazek dostarcza sposobów i kompozycji, które polepszają indeks terapeutyczny białek fuzyjnych IL-2 oraz w szczególności immunocytokin IL-2. Według wynalazku indeks terapeutyczny leczniczej cząsteczki mierzony jest stosunkiem maksymalnej tolerowanej dawki tej cząsteczki do dawki, przy której występuje maksymalna efektywność tej cząsteczki. Wynalazek obejmuje ulepszone odmiany IL-2 immunocytokin, które wykazują znacząco dłuższy okres półtrwania w krwiobiegu w porównaniu do wolnej IL-2. Wynalazek dostarcza także białek fuzyjnych IL-2, a szczególnie immunocytokin IL-2, które wykazują odpowiedź selektywną dla IL-2, która odzwierciedla się obniżoną aktywacją komórek o różnych funkcjach efektorowych przez białka fuzyjne według wynalazku, która jest wiodącą przyczyną działań toksycznych) IL-2. Ponadto wynalazek dostarcza białek fuzyjnych IL-2 o ulepszonej aktywności. Białko fuzyjne IL-2 według wynalazku zawiera zmiany w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów, które zmieniają względne powinowactwo białka fuzyjnego IL-2 do różnych receptorów IL-2, co skutkuje zmianą biologicznych właściwości białka fuzyjnego IL-2. Wynalazek jest przydatny do obniżenia lub zminimalizowania jakiejkolwiek toksyczności związanej z leczeniem IL-2. Nie wnikając w zarysowany mechanizm jakiejkolwiek toksyczności IL-2, takiej jak VLS, toksyczność ta wynika w części z faktu, że IL-2 jest podawana dożylnie i dlatego działa ogólnoustrojowo w całym organizmie, nawet jeśli efekt działania IL-2 pożądany jest w konkretnym miejscu. Problem ten ulega zaostrzeniu ze względu na fakt, że podanie ustrojowe IL-2 wymaga o wiele wyższej dawki niż wymagałoby podanie miejscowe, które z kolei może powodować toksyczność, nie zaobserwowaną przy niższych dawkach. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych IL-2 o obniżonej toksyczności. Wynalazek dostarcza także sposobów do sporządzania białek fuzyjnych IL-2 o obniżonej toksyczności. Ogólnie wynalazek ma zastosowanie do białek fuzyjnych zawierających jednostkę IL-2 połączoną z jednostką nie będącą IL-2. Według wynalazku jednostka nie będąca IL-2 może być syntetycznym lub naturalnym białkiem lub jego fragmentem lub odmianą (w tym odmianami gatunkowymi, allelowymi i mutacyjnymi). Korzystne jednostki nie będące IL-2 obejmują jednostki Fc i albuminy. Według wynalazku jednostka IL-2 może być naturalną cząsteczką IL-2 lub jej fragmentem lub odmianą (w tym odmianami gatunkowymi, allelowymi i mutacyjnymi), które zachowują przynajmniej jedną aktywność lub funkcję IL-2 (jednostka IL-2 może być jednostką IL-2, która jest tak zmodyfikowana, że posiada inne powinowactwo wiązania receptora IL-2 według wynalazku).

PL 206 975 B1 5 Według wynalazku komórki odpowiadają na IL-2 za pośrednictwem specyficznych receptorów na powierzchni komórki (IL-2R), które występują w dwóch formach. Ten receptor o wysokim powinowactwie jest heterotrimeryczny i składa się z podjednostek α, β i y; receptor o pośrednim powinowactwie jest heterodimeryczny i składa się z podjednostek β i γ. Stałe wiązania IL-2 przez te dwie formy IL-2R różnią się o dwa rzędy wielkości. Przenoszenie sygnału odbywa się po cytoplazmatycznej stronie receptora za pośrednictwem oddziaływań pomiędzy kompleksem βγ. Różne typy komórek wytwarzają podjednostki α, β i γ w różnych ilościach. Na przykład aktywowane limfocyty T wyrażają wszystkie podjednostki w celu wytworzenia IL-2Rαβγ o wysokim powinowactwie, podczas gdy dojrzałe spoczynkowe limfocyty T i komórki NK wytwarzają podjednostki β i γ w celu otrzymania IL-2Rβγ o pośredniej aktywności. Zatem komórki wymagają różnych poziomów narażenia na IL-2 do pobudzenia, i odwrotnie, poprzez regulowanie aktywnością IL-2 przez specyficzny komórkowy mechanizm, rodzaj odpowiedzi immunologicznej może być kontrolowany. Sposoby i kompozycje według wynalazku są szczególnie użyteczne w znaczeniu białek fuzyjnych IL-2 takich jak immunocytokiny niosące IL-2. Według wynalazku immunocytokiny niosące IL-2 są syntetycznymi cząsteczkami, które jak wykazano znacząco zwiększają wydajność leczenia IL-2 przez bezpośrednie ukierunkowanie IL-2 do mikrośrodowiska nowotworu. Immunocytokiny są białkami składającymi się z jednostki przeciwciała i jednostki cytokiny, takiej jak jednostka IL-2. Według wynalazku jednostką przeciwciała może być całe przeciwciało lub immunoglobulina lub ich fragment lub odmiana (w tym odmiany gatunkowe, allelowe i mutacyjne), które mają funkcję biologiczną taką jak powinowactwo specyficznego wiązania antygenu. Podobnie jednostka cytokiny według wynalazku może być naturalną cytokiną lub jej fragmentem lub odmianą (w tym odmianą gatunkową, allelową i mutacyjną), która zachowuje przynajmniej pewną aktywność cytokiny. Korzyści z terapii immunocytokiną są oczywiste. Na przykład jednostka przeciwciała immunocytokiny rozpoznaje specyficzny dla nowotworu epitop co skutkuje umieszczeniem cząsteczki immunocytokiny w miejscu nowotworu. Dlatego też wysokie stężenia IL-2 mogą zostać dostarczone do mikrośrodowiska nowotworu, i w ten sposób skutkować aktywacją i proliferacją różnych odpornościowych komórek efektorowych wymienionych powyżej, stosując o wiele niższą dawkę immunocytokiny niż byłaby wymagana dla wolnej IL-2. Ponadto zwiększony czas półtrwania w krwiobiegu immunocytokiny w porównaniu z wolną IL-2 przyczynia się do efektywności tej immunocytokiny. I w końcu naturalne funkcje efektorowe przeciwciała także mogą być wykorzystane, na przykład poprzez aktywowanie cytotoksyczności zależnej od przeciwciała (ang. antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) w komórkach NK posiadających FcγRIII. Immunocytokiną IL-2 posiada większą wydajność względem wolnej IL-2. Jednakże pewne cechy immunocytokin IL-2 mogą pogorszyć potencjalne efekty uboczne cząsteczki IL-2. Z powodu znacząco dłuższego czasu półtrwania immunocytokin IL-2 w krwiobiegu w porównaniu do wolnej IL-2, prawdopodobieństwo aktywowania przez IL-2 lub inne fragmenty cząsteczki białka fuzyjnego składników powszechnie występujących w naczyniach zostaje zwiększone. To samo podejście stosuje się do innych białek fuzyjnych, które zawierają IL-2 połączoną z inną jednostką taką jak Fc lub albuminą, co skutkuje zwiększonym okresem półtrwania IL-2 w krwiobiegu. Wynalazek dostarcza zmienionych białek fuzyjnych IL-2, takich jak IL-2 połączona z całym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, lub z albuminą, o obniżonej toksyczności w porównaniu z niezmienioną formą takich białek fuzyjnych. Wynalazek dostarcza także białek fuzyjnych z jedną lub większą liczbą zmian w jednostkach IL-2 i/lub jednostkach nie będących IL-2, które zmieniają względną reaktywność białka fuzyjnego w komórkach produkujących podjednostki α, β i γ receptora IL-2 w porównaniu z komórkami produkującymi podjednostki β i γ receptora IL-2. Wynalazek dostarcza także zmienionych białek fuzyjnych zawierających IL-2, które wykazują zmienione powinowactwo do podjednostki α, β lub y receptora IL-2 w porównaniu do niezmienionych form takich białek fuzyjnych. Wiele białek fuzyjnych IL-2 zawierających przeciwciało wykazuje aktywność IL-2, która jest ilościowo zmieniona w odniesieniu do wolnej IL-2, ale nie jest jakościowo optymalna dla zastosowań terapeutycznych. Wynalazek dostarcza zmodyfikowanych form białek fuzyjnych przeciwciała IL-2, w których IL-2 lub przeciwciało, lub obie jednostki, są zmienione w celu jakościowego polepszenia aktywności IL-2 dla danego zastosowania. Wynalazek dostarcza także strategii do określania typów modyfikacji, które są szczególnie przydatne w projektowaniu zmodyfikowanych białek fuzyjnych do leczenia chorób. Rysunek fig. 1 ilustruje możliwe mechanizmy w jakich białko fuzyjne może wiązać się z powierzchnią komórki, w taki sposób, że właściwości wiązania receptora dla jednostki w obrębie białka fuzyjnego zostają zmienione. Na przykład rysunek fig. 1A przedstawia partnera fuzyjnego dla IL-2 jako

6 PL 206 975 B1 cząsteczkę dimeryczną. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że druga cząsteczka IL-2 oddziałuje ze swoim receptorem, na przykład poprzez obniżenie współczynnika eliminacji, co prowadzi do zwiększenia wiązania. Rysunek fig. 1B przedstawia drugi mechanizm, który powoduje ten sam efekt. W komórkach, w których występują oba receptory dla IL-2 jak i dla partnera fuzyjnego IL-2 białka fuzyjnego (np. receptor Fc dla części Fc jednostki Ig), taki receptor dla partnera fuzyjnego (np. receptor Fc) może angażować białko fuzyjne i wiązać je na powierzchni komórki, gdzie ma teraz większe prawdopodobieństwo związania receptora IL-2. Faza l/ll próby białka fuzyjnego przeciwciała-cytokiny, nazwanego huks-il2 została niedawno zakończona. huks-il2 jest białkiem fuzyjnym składającym się z przeciwciała KS-1/4 połączonego z cytokiną, interleukiną 2. KS-1/4 rozpoznaje powierzchniowy antygen komórek nowotworowych EpCAM (ang. epithelial cell adhesion molecule) i wywiera efekt koncentrowania IL-2 w miejscu nowotworu. W trakcie tej próby mierzono odpowiedź pacjenta na leczenie. Pacjent, który wykazywał znaczącą odpowiedź na terapię doświadczył częściowej reakcji klinicznej, po której nastąpiła stabilizacja choroby i obniżenie zużycia leków znieczulających. Pacjent taki otrzymał wcześniej uprzednią standardową kurację, która zawiodła. Czas życia pacjenta wydłużył się znacząco poza czas oczekiwany w przypadku niezastosowania takiego leczenia. Zadziwiająco w skutek uprzedniej chemoterapii, populacja limfocytów T tego pacjenta była zasadniczo zniwelowana. Pacjent ten miał o wiele niższą liczbę limfocytów T niż inni pacjenci uczestniczący w próbie. Zakładając, że IL-2 jest znana z aktywacji limfocytów T oraz, że na przykład wiadomo, iż podnosi cytotoksyczność limfocytów T CD8(+) względem komórek nowotworowych, silna reakcja tego pacjenta, u którego w sposób oczywisty brakowało limfocytów T, była nieoczekiwana. Obserwacja ta skłoniła do dalszych badań nad nowymi białkami fuzyjnymi przeciwciała-il-2, w których jednostka IL-2 mogła wykazywać zmienioną specyficzność komórkową skutkując polepszeniem indeksu terapeutycznego białek fuzyjnych IL-2. Z badań struktury krystalicznej IL-2, porównania sekwencji pokrewnych cytokin oraz badań nad ukierunkowana mutagenezą, osiągnięto znaczący postęp w wyjaśnieniu, które aminokwasy w IL-2 wchodzą w kontakt z różnymi podjednostkami receptora IL-2 i ich znaczenia dla aktywności biologicznej. Na przykład reszta D20 konserwatywna w IL-2 u wszystkich gatunków ssaków, jest krytyczną resztą dla wiązania się z podjednostką β receptora IL-2 i różne substytucje w tej pozycji mają wyraźne działania. Na przykład odmiana IL-2(D20K) nie jest zdolna do wiązania jakiegokolwiek kompleksu IL-2R i jest ogólnie nieaktywna, podczas gdy warianty IL-2(D20E) lub IL-2(D20T) zachowują jej biologiczną aktywność. Pozycje aminokwasów R38 i F42 są krytyczne dla wiązania podjednostki α, a podczas gdy mutacje w tych miejscach zmniejszają oddziaływanie IL-2 z receptorem IL-2Rαβγ o wysokim powinowactwie, ciągle wiąże się to z receptorem IL-2Rβγ o pośrednim powinowactwie i stąd pewna bioaktywność jest zachowana. N88 jest kolejną resztą, która jest zaangażowana w oddziaływania pośredniczące z podjednostką β, podczas gdy odmiana IL-2 (N88R) ma znacząco obniżone powinowactwo do receptora o pośrednim powinowactwie, jej powinowactwo do receptora o wysokim powinowactwie pozostaje zasadniczo niezmienione. Forma zmutowana N88R IL-2 jest zatem nadal zdolna do aktywowania limfocytów T. Powinowactwo wiązania białek fuzyjnych według wynalazku dla różnych receptorów można określić wieloma sposobami znanymi w praktyce w tym, na przykład, metodami radioimmunologicznymi. Możliwe jest zatem zakłócenie struktury IL-2 w taki sposób, aby wykazywała większe powinowactwo w stosunku do jednego z kompleksu receptora IL-2 w porównaniu z innym kompleksem receptora IL-2 poprzez zmutowanie danego aminokwasu, który wchodzi w kontakt z jedną z podjednostek receptora albo poprzez zmianę kombinacji reszt aminokwasów. W konsekwencji cząsteczka ta wykazuje większą aktywność względem jednego typu komórek niż innych typów. Według wynalazku możliwe jest manipulowanie strukturą IL-2 w znaczeniu białka fuzyjnego lg-il2 w celu otrzymania pożądanego efektu. Ponadto w pewnych okolicznościach odmiana lg-il2 białka fuzyjnego posiada inne cechy biologiczne niż odpowiednie zmutowane białko wolnej IL-2. Ponadto możliwe jest, według wynalazku, manipulowanie jednostką IL-2 w białku fuzyjnym, w taki sposób aby wykazywało zmienione powinowactwo względem jednej lub większej liczby podjednostek receptora (α, β lub γ) i powodowało całkowite obniżenie bioaktywności białka fuzyjnego. Takie warianty zdolne są do aktywowania komórek odpowiadających na IL-2, ale wymagają wyższych stężeń niż wolna IL-2. Odpowiednio jeśli białko fuzyjne IL-2 ulega koncentracji w pożądanym miejscu

PL 206 975 B1 7 docelowym, na przykład poprzez jednostkę kierującą, takie odmiany posiadają ulepszony indeks terapeutyczny. Wydaje się, że podjednostką α receptora IL-2R odgrywa funkcję wiążącą: ten receptor o niskim powinowactwie wiąże się z IL-2 i utrzymuje IL-2 w pobliżu powierzchni komórki w taki sposób, że efektywne stężenie w sąsiedztwie podjednostek receptora IL-2Rβ i IL-2Rγ na powierzchni komórki zostaje zwiększone. Łącznie podjednostka α i podjednostki β i γ receptora IL-2 tworzą kompleks IL-2R o wysokim powinowactwie. Wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu, że białka fuzyjne IL-2 mogą uczestniczyć w złożonych i bezpośrednich oddziaływaniach z receptorami na powierzchni komórki. Na przykład w przypadku białek fuzyjnych zawierających jednostkę przeciwciała, ta jednostka przeciwciała sama może promować wiązanie białka fuzyjnego do powierzchni komórki i ponadto, IL-2 może występować w wielu kopiach w białku fuzyjnym. W wyniku tego IL-2 może być wiązana do komórki wyrażającej tylko podjednostki β i γ IL-2R i posiadać zwiększoną zdolność do aktywowania takich komórek. Na przykład dimeryczna immunoglobulina (Ig) połączona z IL-2 posiada dwie kopie IL-2, w taki sposób, że wiązanie jednej jednostki IL-2 do jej receptora zwiększa prawdopodobieństwo oddziaływania drugiej jednostki IL-2 z cząsteczką receptora na powierzchni tej samej komórki. Diagram na rysunku fig. 1A przedstawia możliwe konfiguracje białka fuzyjnego lg-il2 na powierzchni komórki. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych lg-il2, w których jednostka IL-2 jest zmieniona w celu obniżenia wiązania z receptorem IL-2Rβγ. Drugim mechanizmem, w jaki białka fuzyjne Ig-IL2 mogą zmienić wiązanie na powierzchni pewnych komórek odpornościowych jest ten, w którym receptor Fc na powierzchni komórki może wiązać tę część Fc jednostki Ig i stąd wiązać IL-2 na powierzchni komórki posiadającej zarówno receptor Fc jak i receptor IL-2 (rysunek fig. 1B). Takie komórki obejmują komórki NK, limfocyty B oraz makrofagi. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych lg-il2, w których jednostka Ig jest zmieniona w celu obniżenia wiązania z receptorem Fc. Wynalazek ponadto dostarcza białek fuzyjnych, w których zarówno jednostka Ig oraz jednostka IL-2 zawierają zmiany o charakterze opisanym powyżej. W oparciu o pogląd, że białka fuzyjne lg-il2 mogą być sztucznie związane z komórkami posiadającymi podjednostki receptora IL-2, możliwe jest zaprojektowanie wariantów białek fuzyjnych, w których jednostka wiążąca jest zmieniona. Na przykład przydatna jest zmiana właściwości wiązania receptora Fc białka fuzyjnego lg-il2. Można to uczynić na przykład poprzez zmutowanie miejsc kontaktu znanych aminokwasów w obrębie jednostki Fc lub poprzez usunięcie N-przyłączonych miejsc glikozylacji, albo poprzez mutację lub przez enzymatyczne trawienie tego białka. Podobnie według wynalazku przydatne jest wprowadzenie mutacji w obrębie jednostki IL-2, która wykazuje efekt wiązania do podjednostek receptora IL-2. Szczególnie przydatnym jest zmutowanie aminokwasów w IL-2, które wchodzą w kontakt z podjednostką β receptora IL-2. Szczególnie użytecznym typem mutacji jest ta, która redukuje energie wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Rβ ale nie powstrzymuje sterycznie tych oddziaływań. Na przykład mutacje kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym są szczególnie przydatne. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa IL-2 do postaci β-γ receptora IL-2 w znaczącym stopniu a także aktywacja ścieżki sygnałowej, w której pośredniczą te receptory, ale przy zachowaniu relatywnie małego albo braku efektu wiązania z formą α-β-γ receptora IL-2 lub wpływ na aktywność wywołaną przez IL-2 w komórkach posiadających takie receptory IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacje redukują powinowactwo do formy β-γ receptora IL-2, ale nie eliminują go. Podobnie korzystnym jest wprowadzenie mutacji do aminokwasów na powierzchni IL-2, które oddziałują z podjednostką α receptora IL-2. Szczególnie korzystnym typem mutacji jest ten, który obniża energię wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Rα, ale sterycznie nie przeszkadza w tych oddziaływaniach. Na przykład mutacja kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym jest szczególnie przydatna. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa dla formy α-β-γ receptora IL-2 w znaczącym zakresie, ale ma ona relatywnie mały efekt lub nie wywiera efektu na wiązanie formy β-γ receptora IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacja obniża powinowactwo do formy α-β-γ-receptora IL-2, ale nie eliminuje go. Podobnie użytecznym jest wprowadzenie mutacji do aminokwasów na powierzchni IL-2, które oddziałują z podjednostką γ receptora IL-2. Tak jak w poprzednich przypadkach szczególnie przydatny typ mutacji obniża energię wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Rγ, ale sterycznie nie przeszkadza w tych oddziaływaniach. Na przykład mutacja kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym jest szczególnie korzystna. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa dla formy β-γ receptora IL-2 w znaczącym zakresie, ale ma ona relatywnie mały efekt lub nie wywiera

8 PL 206 975 B1 efektu na wiązanie formy α-β-γ receptora IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacja obniża powinowactwo do formy β-γ receptora IL-2, ale nie eliminuje go. Przydatnym jest także wprowadzenie kombinacji mutacji aminokwasów do IL-2, które oddziałują z powierzchniami różnych podjednostek receptora IL-2. Podczas gdy każda mutacja niezależnie może wywierać nieznaczny efekt bądź w ogóle nie wywierać efektu na wiązanie z IL-2 ani na formę α-β-γ ani na formę β-γ receptora IL-2, połączenie mutacji może przynieść pożądaną redukcję powinowactwa IL-2 do jej receptora lub bioaktywności IL-2. Według wynalazku mutacje w innych częściach IL-2 pośrednio przyczyniają się do zmian oddziaływania IL-2 albo z formą β-γ albo z formą α-β-γ receptora IL-2 i stąd skutkują cząsteczką IL-2 o zmodulowanej aktywności. Na przykład mutacja może nieznacznie zmienić budowę cząsteczki i zmienić jej właściwości wiązania. Według wynalazku korzystne jest także wytworzenie białek fuzyjnych, które zawierają mutacje w jednostce IL-2, które modulują wiązanie jednostki IL-2 do kompleksu receptora IL-2, a także mutacje w jednostce przeciwciała. Takie białka fuzyjne mogą być szczególnie przydatne, jeśli pożądana jest zmiana oddziaływania białka fuzyjnego lg-il2 z danymi receptorami Fc. Wolna jednostka IL-2 może wykazywać odmienne właściwości wiązania względem kompleksu IL-2R, niż w przypadku gdy jednostka IL-2 połączona jest z inną jednostką białkową jak Ig. Jeden z możliwych mechanizmów za pomocą którego następuje takie działanie jest przedstawiony powyżej. Innym możliwym mechanizmem jest taki, w którym IL-2 jest sterycznie lub konformacyjnie związana w immunocytokinie i że dane powiązanie odbija się na właściwościach wiązania jednostki IL-2 względem różnych typów receptora IL-2. Zatem przydatnym jest wprowadzenie zmian w białku fuzyjnym, które będą modulowały takie powiązanie. Na przykład zmiany w jednostce nie będącej IL-2 są przydatne w modulowaniu aktywności IL-2. Przydatność danego białka fuzyjnego IL-2, takiego jak połączenie lg-il2 lub białka fuzyjnego IL-2 zawierającego Fc lub albuminę, do konkretnego zastosowania, takiego jak leczenie chorób ludzi, jest badane na właściwym modelu komórkowym lub zwierzęcym. Jeśli jest to możliwe korzystne jest badanie na zwierzętach, ponieważ takie badania są bardziej zbliżone do złożoności reakcji układu odpornościowego w przypadku chorób ludzi. Na przykład szczególna równowaga pewnych komórek może być optymalna do zwalczania choroby leżącej z zakresie zainteresowania, takiej jak rak lub infekcja bakteryjna, wirusowa lub pasożytnicza. Na przykład relatywnie wysoki poziom aktywności limfocytów T może być przydatny przeciwko pewnym typom nowotworu, podczas gdy relatywnie wysoki poziom aktywności komórek NK może być przydatny przeciwko innym typom nowotworów. Inną cechą wynalazku są odmiany białka fuzyjnego IL-2, takiego jak połączeń lg-il2 lub połączeń IL-2 zawierających Fc lub albuminę, o lepszych profilach toksyczności. Na przykład białko fuzyjne lg-il2 zawierające mutację D20T wykazuje obniżoną toksyczność u zwierząt takich jak myszy w porównaniu z odpowiadającymi białkami fuzyjnymi lg-il2 z D w pozycji 20. W kolejnym przykładzie białko fuzyjne lg-il2 zawierające mutację N88R lub kombinację mutacji L85T, I86T, N88R w jednostce IL-2 wykazuje obniżoną toksyczność u zwierząt takich jak myszy w porównaniu z odpowiadającymi białkami fuzyjnymi z N w pozycji 88. Ponadto białko fuzyjne przeciwciała-il2 zawierające mutację D20T lub mutację N88R w jednostce IL-2 wykazuje porównywalną siłę z odpowiednim wyjściowym białkiem fuzyjnym przeciwciała-il2 podczas stosowania w leczeniu nowotworu, który wytwarza antygen docelowy dla tego przeciwciała. Właściwości odmiany D20T białek fuzyjnych lg-il2 są szczególnie nieoczekiwane w świetle odnotowanych właściwości mutacji D20T w wolnym białku IL-2. Konkretnie mutacja D20T w wolnym białku IL-2 nie wykazuje różnicy względem białka IL-2 dzikiego typu pod kątem aktywności względem komórek z receptorami IL-2Rαβγ lub komórek z receptorami IL2-R-βγ (Shanafelt et al. opis patentowy PCT WO99/60128). Jednakże białko fuzyjne lg-il2 zawierające mutację D20T ma drastycznie obniżony potencjał aktywowania komórek z receptorem IL2R-βγ, ale ma zasadniczo normalny potencjał aktywowania komórek z receptorem IL-2Rαβγ. Odpowiednio mutacja kilku aminokwasów w obrębie jednostki IL-2 białka fuzyjnego lg-il2 prowadzi do obniżenia toksyczności przy zachowaniu względnie nieznacznego działania na siłę białka fuzyjnego w leczeniu różnych chorób. Na przykład zakres do którego powinowactwo odmiany białka fuzyjnego IL-2 do jego receptorów można zmieniać w zależności od tego jak dobrze dane białko fuzyjne ulega koncentracji w zamierzonym dla niego miejscu docelowym. Jest szczególnie przydatnym zmutowanie jednego lub większej liczby następujących aminokwasów w obrębie jednostki IL-2: Lys8, Gln13, Glu15, His16, Leu19, Asp20, Gln22, Met23, Asn26, Arg38, Phe42, Lys43, Thr51, His79,

PL 206 975 B1 9 Leu80, Arg81, Asp84, Asn88, Val91, Ile92 oraz Glu95. Korzystne jest także zmutowanie jednej lub większej liczby następujących aminokwasów w obrębie jednostki IL-2: Leu25, Asn31, Leu40, Met46, Lys48, Lys49, Asp109, Glu110, Ala112, Thr113, Val115, Glu116, Asn119, Arg120, Ile122, Thr123, Gln126, Ser127, Ser130 oraz Thr131. Wynalazek ujawnia formy jednostki Ig połączonej z IL-2, na przykład połączenia przeciwciało-il2 takie jak huks-il2 lub dl-nhs76-il2, w których zmiany w jednostce Ig połączonej z IL-2 wpływają na właściwości wiązania białka fuzyjnego z kompleksem IL-2R. Zmiany takie mogą być substytucjami aminokwasu w sekwencji aminokwasów ciężkiego łańcucha lub chemicznymi modyfikacjami. Przydatne substytucje aminokwasów obejmują te, które wpływają na glikozylację białka fuzyjnego lub te, które bezpośrednio wpływają na oddziaływanie z receptorem Fc. Szczególnie przydatną substytucją może być ta, która hamuje glikozylację naturalnie występującą w pozycji N297 (nomenklatura EU) ciężkiego łańcucha IgG. Chemiczne i biochemiczne modyfikacje obejmują przyłączenie PEG (ang. PEGylation) do cząsteczki lub zadania N-glikonazą w celu usunięcia N-przyłączonych łańcuchów glikozylowych. Bez wnikania w teorię, można sobie wyobrazić, że pewne zmiany we fragmencie przeciwciała takiej cząsteczki mogłyby wpływać na konformację IL-2, na przykład w wyniku zmiany sprężystości cząsteczki przeciwciała. W przypadku huks-il2 takie zmiany mogą prowadzić do cząsteczki KS-IL2, która obecnie wykazuje zwiększoną selektywność względem limfocytów T w komórkowej analizie biologicznej. W przypadku białek fuzyjnych przeciwciała-il2 często przydatny jest wybór jednostki Ig, która wnosi inne pożądane właściwości do cząsteczki. Na przykład jednostka Ig podklasy gamma 1 może być korzystna w celu zapewnienia immunologicznych funkcji efektorowych takich jak ADCC. Alternatywnie jednostka IgG podklas gamma 2 lub gamma 4 może być korzystna na przykład w celu zredukowania interakcji z receptorem FcR. Jeśli stosuje się jednostki IgG podklas gamma 2 lub gamma 4, szczególnie korzystne jest włączenie zawiasowego regionu pochodzącego od gamma 1. Często przydatne jest zastosowanie mutacji i chemicznych lub biochemicznych modyfikacji białek fuzyjnych lg-il2 w połączeniu z innymi mutacjami mającymi wyraźne właściwości praktyczne, takie jak mutacja lizyny na końcu C pewnych regionów Fc na alaninę lub inną resztę hydrofobową. Na przykład szczególnie przydatne jest zastosowanie modyfikacji według wynalazku w przypadku białka fuzyjnego przeciwciała huks-ala-il2 lub dl-nhs(76)-ala-il2. Korzystnym jest także wprowadzenie dalszych mutacji do cząsteczki, które eliminują potencjalne epitopy limfocytu T. Jest szczególnie korzystne, gdy te mutacje zasadniczo nie zmieniają pożądanych właściwości cząsteczki. Wynalazek ponadto ujawnia formy jednostki Ig połączonej z IL-2, na przykład połączenia przeciwciało-il2 takiego jak huks-il2, w którym specyficzne zmiany sekwencji aminokwasów IL-2, na przykład IL2(D20T) lub IL2(N88R) zmieniają właściwości wiązania białka fuzyjnego z kompleksem IL-2R. Sekwencja aminokwasów dojrzałego białka ludzkiej IL-2 jest zobrazowana w SEQ ID NO: 3. Zmiany we właściwościach wiązania ulegają odzwierciedleniu w zwiększonej selektywności względem limfocytów T w komórkowej analizie biologicznej. Szczególna mutacja wpływa na stopień selektywności względem limfocytów T. Ponadto takie zmiany skutkują cząsteczką fuzyjną, na przykład huks-ala-il2(d20t) lub huks-ala-il2(n88r), o mniejszych efektach toksycznych podczas ogólnoustrojowego podawania myszom niż na przykład w przypadku huks-ala-il2. Także takie zmiany prowadzą do białka fuzyjnego, na przykład huks-ala-il2(n88r), które jest przynajmniej tak wydajne jak normalne huks-il2 lub huks-ala-il2 w leczeniu nowotworu w wielu mysich modelach nowotworu. Ponieważ reakcje immunologiczne wymagane do oczyszczenia nowotworu są różnorodne a także różnią się w zależności od rodzaju nowotworu, mogłoby nie być pożądane całkowite wyeliminowanie funkcjonalności cząsteczki gdy stosuje się cząsteczkę o obniżonej toksyczności. Na przykład w mysim modelu, przy wywołaniu przerzutów raka jelita do płuc, huks-il2 wykazało efektywne leczenie raka poprzez mechanizm za pośrednictwem limfocytów T, który nie wymaga komórek NK, podczas gdy w mysim modelu nerwiaka niedojrzałego, wykazano, że eliminacja nowotworu przez huks-il2 wymaga komórek NK a nie wymaga limfocytów T. Dlatego istnieją przypadki, w których profil selektywności może być w bardziej właściwy sposób modulowany aby nadal zapewnić odpowiedź za pośrednictwem NK. W jednej z realizacji wynalazku bardziej pożądanym podejściem jest subtelna zmiana profilu selektywności tej cząsteczki w taki sposób, aby ciągle osiągać odpowiedź wymagającą wielu typów receptorów, najbardziej korzystnie w miejscach gdzie cząsteczka ta ulega koncentracji. Na przykład wynalazek dostarcza zmian białka fuzyjnego lg-il2, w którym selektywność względem IL-2Rαβγ, w porównaniu do IL-2Rβγ, jest polepszona 2- do 10-krotnie, 10- do 100-krotnie, 100- do

10 PL 206 975 B1 1000-krotnie, lub więcej niż 1000-krotnie, w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem fuzyjnym lg-il2. Kolejnym celem wynalazku jest zapewnienie optymalnego zastosowania białek fuzyjnych lg-il2 o obniżonej toksyczności w leczeniu raka i chorób zakaźnych. Podczas gdy zmieniona selektywność może prowadzić do obniżonej toksyczności naczyniowej, może nie prowadzić do optymalnego wzrostu indeksu terapeutycznego po zwiększeniu dawki białka fuzyjnego. Na przykład takie wzrosty dawki mogą prowadzić do wywołania negatywnych mechanizmów regulujących, które regulują reakcje odpornościowe. Dlatego może być to przydatne do zastosowania modeli leczenia, które łączą białka fuzyjne lg-il2 o niskiej toksyczności z czynnikami, które powodują spadek takich efektów. Jednym z ostatnich zidentyfikowanych silnych inhibitorów komórkowej odpowiedzi odpornościowej jest klasa CD4 + CD25 + regulatorowych limfocytów T, która wykazuje wysokie powinowactwo do IL-2R (przegląd patrz: Maloy i Powrie, (2001) Nature Immunol. 2:816). Według wynalazku zwiększone dawki białek fuzyjnych o niskiej toksyczności mogą dodatkowo aktywować te komórki. Po pobudzeniu, komórki te regulują wstecznie (ang. up-regulate) CTLA-4 na powierzchni ich komórek, co angażuje powierzchniowe cząsteczki B7-1 i B7-2 na komórkach odpornościowych i z kolei wywołuje silny ujemny sygnał (Takahashi et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 303). Zatem inhibitory tych procesów mogłyby być przydatne w terapii skojarzonej z białkami fuzyjnymi według wynalazku. W jednej z realizacji można zastosować przeciwciała neutralizujące CTLA-4 i ich działanie. W kolejnej realizacji można stosować inne białka o podobnej aktywności, takie jak rozpuszczalne receptory B7 i ich białka fuzyjne (np. B7-lg). Kolejne realizacje obejmują zastosowanie przeciwciał, które niszczą lub hamują własne regulatorowe limfocyty T takie jak przeciwciała przeciwko CD4 i przeciwko CD25. W korzystnej realizacji te drugie przeciwciała są podawane raczej sekwencyjnie niż równocześnie. Według wynalazku kolejny przydatny mechanizm wykorzystuje nadmierne pobudzenie cyklooksygenazy 2 (C0X-2) prowadzące do wytwarzania prostaglandyn, które jak wiadomo hamują odpowiedzi immunologiczne (patrz opis patentowy PCT US99/08376). Dlatego kolejna realizacja łączy zastosowanie cząsteczek lg-il2 o niskiej toksyczności z inhibitorami COX-2 takimi jak indometacyna, lub bardziej specyficznymi inhibitorami Celecoxib (Pfizer) i Rofecoxib (Merck&Co). Zrozumiałym jest fakt, iż nadal inne mechanizmy odpornościowe mogą być aktywowane poprzez zwiększenie dawek białek fuzyjnych lg-il2 o niskiej toksyczności i, że można opracować terapie skojarzone pod kątem zastosowania w tych mechanizmach. Ponadto niskie dawki pewnych leków cytotoksycznych, takich jak cyklofosfamid, które wykazują efekt zwiększający odporność w warunkach in vivo mogą być przydatnymi czynnikami leczniczymi w terapii skojarzonej. Połączenia albuminy zostały opracowane w celu wytworzenia leczniczych białek fuzyjnych o zwiększonym okresie półtrwania w surowicy. Na przykład Yeh et al. (Yeh P, et al. Proc Natl. Acad Sci USA. [1992] 89:1904-8) skonstruowali białko fuzyjne albuminy-cd4, które miało znacznie dłuższy okres półtrwania w surowicy niż sama odpowiednia jednostka CD4. Przydatne jest konstruowanie połączeń albuminy z IL-2, erytropoetyną, interferonem alfa i innymi ligandami. Te białka fuzyjne mają dłuższy okres półtrwania w surowicy niż sam odpowiadający ligand. Takie połączenia można stworzyć w kierunku od N do C końca, jako połączenia typu ligand - albumina lub typu albumina-ligand, stosując standardowe techniki inżynierii genetycznej i ekspresji białek. Alternatywnie albuminę i ligand można połączyć w wyniku chemicznego sprzęgania. Jednakże białka fuzyjne typu albumina-ligand często wykazują niepożądane właściwości. Bez wnikania w teorię, jednym z powodów dlaczego białka fuzyjne typu albumina-ligand mogą wykazywać niepożądane właściwości jest fakt, iż istnieją receptory dla albuminy na komórkach śródbłonka naczyniowego (Tiruppathi et al. Proc Natl Acad Sci USA. [1996] 93: 250-4). W wyniku tego, działanie ligandu na komórki śródbłonka naczyniowego może być zwiększone. Na przykład białko fuzyjne albuminy-il2 wykazuje zwiększony okres półtrwania w surowicy, ale także powoduje zwiększone wycieki naczyniowe. Bez wnikania w teorię, odnotowano, że aktywacja odpowiedzi za pośrednictwem IL2 w naczyniach jest zwiększona z powodu wiązania się białek fuzyjnych do receptorów albuminowych obecnych na komórkach śródbłonka naczyń. Wiązanie się białek fuzyjnych albuminy-il2 do komórek, które posiadają receptory zarówno dla albuminy jak i IL-2 jest zwiększone poprzez mechanizm analogiczny do tego przedstawionego na rysunku fig. 1b dla zwiększenia wiązania białka fuzyjnego typu Ig-ligand na powierzchni komórki. W celu zmniejszenia wycieków naczyniowych wywołanych przez albuminę-il2 przydatne jest wprowadzenie mutacji do jednostki IL-2, która specyficznie zredukuje powinowactwo IL-2 do receptorów IL2R-βγ. Na przykład zostało opracowane białko fuzyjne albuminy-il2(n88r) lub albuminy-il2(d20t) i następnie

PL 206 975 B1 11 odkryto, że posiada zredukowaną toksyczność i ulepszony indeks terapeutyczny w przypadku modelu choroby na zwierzętach takich jak mysz. Cząsteczki według wynalazku są przydatne do leczenia nowotworów złośliwych i guzów, szczególnie do leczenia guzów litych. Przykładami nowotworów, które mogą być leczone według wynalazku są nowotwory pochodzenia naskórkowego, takie jak występują w przypadku, ale nie ograniczają się do: raka jajników, raka prostaty, raka żołądka, raka wątroby, pęcherza moczowego, głowy i karku. Równorzędnie, według wynalazku, nowotwory złośliwe i pochodzenia neuroektodermalnego są odpowiednimi kandydatami do leczenia, w tym takie jak, ale nie ograniczając się do: czerniak, drobnokomórkowy rak płuc, mięsak tkanek miękkich oraz nerwiak niedojrzały. Według wynalazku przydatne jest dla czynników leczniczych, aby były ukierunkowane na lokalizacje nowotworowe lub lokalizacje nowotworów złośliwych lub przerzutów. Szczególnie przydatne są białka fuzyjne Ig zawierające przeciwciała skierowane przeciwko antygenom preferencyjnie prezentowanym przez komórki raka lub nowotworu złośliwego. Na przykład szczególnie przydatne są białka zawierające jednostkę przeciwciała o specyficzności względem EpCAM (np. KS1/4), lub embrionową Fibronecytynę (np. BC1), lub CEA, lub kompleksy chromatynowe (np. NHS76), lub GD2 (np. 14.18), lub CD19, lub CD20, lub CD52, lub HER2/neu/c-erbB-2, lub MUC-1, lub PSMA. Ponadto przeciwciała skierowane na różne antygeny wirusowe są szczególnie przydatne. PRZYKŁADY P r z y k ł a d 1: Konstruowanie genów połączenia lg-il2 z substytucjami w kodonie w sekwencji kodującej IL-2 lub w sekwencji kodującej przeciwciało: Wektor ekspresji dla immunocytokin został opisany w Gillies et al., (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203. Pewne modyfikacje w sekwencji nukleotydowej umożliwiły addycję sekwencji kodującej do końca 3' ludzkiego genu γ-1. W ludzkim genie γ-1 kodującym ciężki łańcuch zostało zniszczone miejsce restrykcyjne Xmal zlokalizowane 280 par zasad od kodonu zatrzymującego translację poprzez wprowadzenie cichej mutacji (TCC na TCA). Kolejną cichą mutację (TCT do TCC) wprowadzono do kodonu Ser trzy reszty ponad C-końcową lizyną ciężkiego łańcucha w celu utworzenia sekwencji TCC CCG GGT AAA (SEQ ID NO: 4), która zawiera nowe miejsce Xmal [Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500]. cdna IL-2 został skonstruowany w wyniku chemicznej syntezy i zawiera nowe i wyjątkowe miejsce restrykcyjne Pvull [Gillies et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432]. Zarówno miejsce Xmal jak i Pvull są unikalne w wektorze ekspresji, i umożliwiają konstrukcję odmian przeciwciała-il2, w tym następujących): 1) huks-ala-il2. Ta konstrukcja huks-ala-il2 została opisana uprzednio (np. opis patentowy WO 01/58957). Otrzymane białko zawiera substytucję aminokwasu w połączeniu pomiędzy stałym regionem ciężkiego łańcucha Ig a dojrzałą hull-2. Takie połączenie normalnie posiada sekwencję SPGK-APT (SEQ ID NO: 5), w której -SPGK- jest końcem C ciężkiego łańcucha a -APT- końcem N dojrzałego białka IL-2. W huks-ala-il2 wprowadzono substytucję K na A (oznaczona jako pozycja K[-1]) i połączenie ma teraz sekwencję SPGA-APT (SEQ ID NO: 6). W konsekwencji polepszył się czas półtrwania tego białka w surowicy (patrz przykład 5). 2) dl-ks-ala-il2. To białko fuzyjne zawiera substytucje w KS-ala-IL2 w celu wytworzenia odmiany białka fuzyjnego, w której wyeliminowano potencjalne epitopy limfocytu T (opisano w równoległych zgłoszeniach patentowych U.S.S.N. 10/112,582 i 10/138,727, których całkowite ujawnienie jest zawarte w odniesieniach). Stały region fragmentu Ig białka fuzyjnego według wynalazku może być wybrany spośród stałego regionu normalnie związanego ze zmiennym regionem, lub innych stałych regionów co prowadzi do białka fuzyjnego z fragmentem Ig zawierającym regiony zmienny i stały z różnych podklas cząsteczek IgG lub od różnych gatunków. Na przykład region stały gamma 4 z IgG (SEQ ID NO: 7) można zastosować zamiast regionu stałego gamma 1 (SEQ ID NO: 8). Zamiana taka ma przewagę w tym, że łańcuch gamma 4 powoduje dłuższy okres półtrwania w surowicy. Odpowiednio można także zastosować stały region gamma 2 IgG (SEQ ID NO: 9) zamiast stałego regionu gamma 1 IgG (SEQ ID NO: 8). Ponadto region zawiasowy pochodzący od gamma 1 IgG (SEQ ID NO: 10) można zastąpić regionem zawiasowym normalnie występującym w gamma 2 IgG (SEQ ID NO: 11) lub regionie stałym gamma 4 IgG (SEQ ID NO: 12). Składnik Ig białka fuzyjnego może także zawierać mutacje w regionie stałym, w taki sposób, że IgG ma obniżone powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego z FcγRI, FcγRII lub FcγRIII. Białka fuzyjne według wynalazku mogą zawierać mutacje w regionach stałych IgG w celu usunięcia potencjalnych) miejsc glikozylacji i epitopów limfocytu T. Na przykład różne stałe regiony