(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: ,WO02/ (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 16/46 ( ) C07K 16/30 ( ) C12N 15/09 ( ) (54) Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego (30) Pierwszeństwo: , US, 60/274,096 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/05 (73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH, Darmstadt, DE (72) Twórca(y) wynalazku: STEPHEN D. GILLIES, Carlisle, US JEFFREY WAY, Cambridge, US KIN-MING LO, Lexington, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Łukaszyk Szymon Kancelaria Patentowa Łukaszyk PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy ogólnie sposobów i kompozycji dotyczących przeciwciał z jednostkami pochodzącymi z dwóch lub większej liczby izotypów oraz pochodzących od nich białek fuzyjnych, w tym białek zawierających jednostkę przeciwciała ze zmienioną funkcją efektorową, zwiększoną ekspresją białka i/lub obniżonym stopniem oligomeryzacji. Wynalazek dotyczy szczególnie przeciwciał i białek fuzyjnych, w których region zawiasowy pochodzi od jednego izotypu, a domena CH2 pochodzi od innego izotypu. Zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa ze zgłoszenia U.S. 60/274,096 z dnia 7 marca 2001, które włączone jest do niniejszego opisu poprzez odesłanie. Wydajność ekspresji białek z komórek opracowanych genetycznie jest ważnym problemem komercyjnym. W celu zapewnienia właściwego formowania i glikozylacji, niektóre komercyjnie ważne białka są wytwarzane korzystnie z komórek eukariotycznych, takich jak komórki ssaków, roślin czy drożdży. Ze względu na wysokie koszty utrzymania ogromnych kultur komórek eukariotycznych, białka wytwarzane w taki sposób są drogie w produkcji, dlatego też istnieje praktyczna potrzeba maksymalizacji poziomu ekspresji białek z komórek eukariotycznych. Pokrewnym problemem jest to, iż białka terapeutyczne wytwarzane z komórek eukariotycznych muszą ulegać ekspresji we właściwym stanie konformacyjnym. Generalnie mechanizmy transkrypcji i translacji zapewniają, że genetycznie opracowana komórka będzie wytwarzała białko, którego sekwencja jest określona przez kwas nukleinowy kodujący to białko. Po transkrypcji i translacji białko może jednak kształtować się niewłaściwie i może ulegać rozkładowi. Alternatywnie, białko może być wytwarzane w postaci agregatów w taki sposób, że jego aktywność jest ograniczona. Nawet jeśli białko w formie agregatu jest aktywne, może nie być ono farmakologicznie tolerowane z powodu zwiększonej immunogeniczności w porównaniu do białka nie tworzącego agregatów. Dlatego też preparat farmakologicznie tolerowanych białek powinien być ogólnie pozbawiony agregatów białek. Ilość białka, które ulega ekspresji z genetycznie opracowanej komórki eukariotycznej, jest funkcją poziomu transkrypcji kodującego genu, wydajności procesu splatania (ang. splicing) mrna i wydajności transportu z jądra oraz wydajności translacji. Rola, jaką odgrywają te procesy w ekspresji białka jest wystarczająco dobrze poznana, tak że każdy ekspert w dziedzinie inżynierii genetycznej i ekspresji białek może ogólnie wbudować właściwą sekwencję kwasu nukleinowego w model konstrukcji ekspresyjnej o wydajnej transkrypcji, splicingu, eksportu mrna oraz translacji. Jednakże ilość właściwie ukształtowanego, nietworzącego agregatów białka, które jest wytwarzane z komórek eukariotycznych, jest także funkcją sekwencji aminokwasów białka, jak również sekwencji kwasu nukleinowego, która określa transkrypcje, splicing, eksport mrna, translację i modyfikację po-translacyjną. Na przykład uważa się, że znacząca frakcja białek syntetyzowanych w komórce jest degradowana. Cechy białka, które określają, czy białko powinno, czy nie powinno być degradowane są współcześnie przedmiotem intensywnych badań, ale obecnie nie można przewidzieć wydajności kształtowania się białka, degradacji, czy tworzenia agregatów poprzez proste badanie sekwencji białka. Niektóre naturalnie występujące białka kształtują się wydajnie, są oporne na proteolizę oraz nie tworzą agregatów. Inne białka z kolei nie kształtują się wydajnie, są gwałtownie degradowane i tworzą agregaty. Przeciwciała i sztuczne białka zawierające fragment przeciwciała, białka fuzyjnego zakończonego przeciwciałem lub białka fuzyjne Ig są użyteczne do różnych celów związanych z selektywnymi właściwościami zmiennych domen przeciwciała jak i zdolności stałych regionów do wiązania różnych innych białek. Preparaty przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał są szczególnie korzystne kiedy są one właściwie ukształtowane i nie tworzą agregatów. Dlatego istnieje zapotrzebowanie na praktyczne sposoby i kompozycje wytwarzania preparatów przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał o obniżonym stopniu tworzenia agregatów. Przeciwciała i białka fuzyjne przeciwciał są również korzystne ponieważ ich zdolność do wiązania z innymi białkami umożliwia im, na przykład, wywoływanie specyficznych funkcji efektorowych. W niektórych) przypadkach specyficzne efektorowe funkcje są pożądane, ale często korzystna jest utrata funkcji efektorowych. Składnik białka fuzyjnego będący przeciwciałem może być zmieniony, aby zredukować bądź wykluczyć funkcje efektorowe poprzez wykorzystanie zmodyfikowanego przeciwciała. Preparaty przeciwciała i białka fuzyjnego przeciwciała są także korzystne, gdy są one zmodyfikowane w sposób zmieniający ich funkcyjność. Istnieje zatem zapotrzebowanie na praktyczne sposoby

3 PL B1 3 i kompozycje wytwarzania zmodyfikowanych przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał o zmienionych funkcjach efektorowych. Leki białkowe mogą być degradowane przez proteazy w taki sposób, że ich dostępność i właściwości farmakokinetyczne są poniżej poziomu optymalnego. Istnieje więc zapotrzebowanie na leki białkowe, które posiadają praktyczne właściwości pewnych białek, a przy tym większą oporność na proteazę. Wynalazek dotyczy korzystnych sposobów i kompozycji do wytwarzania całych przeciwciał, immunocytokin, immunofuzyn, immunoligandów oraz innych białek fuzyjnych przeciwciała i Fc, które polepszają ekspresję, właściwą oligomeryzację, oczyszczanie oraz oporność na proteazę pożądanego białka fuzyjnego opcjonalnie ze zmodyfikowanymi, połączonymi lub obniżonymi funkcjami efektorowymi Fc. W szczególności wynalazek dostarcza jednostek przeciwciał z hybrydą izotypów, opcjonalnie z zastosowaniem składników zmutowanej Ig do użycia w całym przeciwciele i w białkach fuzyjnych zawierających jednostkę przeciwciała. Istotą wynalazku jest immunoglobulinowe białko fuzyjne będące hybrydą izotypów składające się z jednostki immunoglobuliny połączonej z jednostką nie będącą immunoglobuliną, które charakteryzuje się tym, że jednostka immunoglobuliny zawiera pierwszą domenę z pierwszego izotypu przeciwciała i drugą domenę z drugiego izotypu przeciwciała, przy czym pierwsza domena z pierwszego izotypu przeciwciała jest regionem zawiasowym lgg1, zaś druga domena z drugiego izotypu przeciwciała jest domeną lgg2 CH2 i CH3 lub domeną lgg4. W korzystnej realizacji wynalazku cysteina leżąca najbliżej końca N regionu zawiasowego lgg1 jest zmutowana. Miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką niebędącą Ig w białku fuzyjnym według wynalazku jest korzystnie zmutowane natomiast jednostka niebędąca immunoglobuliną jest korzystnie połączona do końca C jednostki immunoglobuliny. Dodatkowo miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką niebędącą Ig jest zmutowane poprzez korzystną zmianę lizyny na końcu C jednostki immunoglobuliny na alaninę lub leucynę. W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku jednostka immunoglobuliny zawiera domenę CH1, przy czym szczególnie korzystnie jest, gdy jednostka immunoglobuliny zawiera region zawiasowy lgg1, domenę CH1, CH2 i CH3 lgg2 i miejsce wiążące antygen. Korzystną strukturą białka według wynalazku jest struktura X - Fc, Fc - X lub X - Fc - Y, gdzie Fc oznacza jednostkę immunoglobuliny, a X, Y oznacza jednostkę niebędącą immunoglobuliną. Jednostka niebędąca immunoglobuliną jest w korzystnym przykładzie białka fuzyjnego cytokiną lub cząsteczką erytropoetyny, przy czym szczególnie korzystne jest, gdy cytokina jest przyłączona do końca C jednostki immunoglobuliny zawierającej regiony V, które rozpoznają antygen EPCAM (przeciwciało KS) oraz region CH1 - CH2 - CH3 lgg2 i region zawiasowy lgg1 zmutowany z cysteiny na serynę w miejscu najbliższym końcowi N, przy czym miejsce połączenia pomiędzy jednostką immunoglobuliny, a jednostką niebędącą immunoglobuliną jest zmutowane poprzez zmianę lizyny C końca jednostki immunoglobuliny na alaninę. Istotą wynalazku jest także kwas nukleinowy kodujący immunoglobulinowe białko fuzyjne według wynalazku, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy oraz eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresji według wynalazku. Istotą wynalazku jest wreszcie sposób zwiększania ekspresji immunoglobulinowego białka fuzyjnego specyficznego izotypu Ig typu dzikiego mającego niepoprawną strukturę z powodu niewłaściwie utworzonego wiązania disulfidowego w czasie homomodernizacji ciężkiego łańcucha przeprowadzany w warunkach in vitro. Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje zastąpienie regionu zawiasowego immunoglobulinowego białka fuzyjnego regionem zawiasowym z innego izotypu Ig mającego zredukowaną liczbę reszt cysteinowych, prowadzące do utworzenia białka fuzyjnego będącego hybrydą izotypów zdefiniowanego w dowolnym z zastrz Hybryda izotypów IgG/lgG Immunoglobulinowe białka fuzyjne mają korzystnie obniżoną funkcję efektorową i ulepszone formowanie. Takie białka fuzyjne są szczególnie korzystne, gdy jednostka Ig służy do zwiększenia ekspresji i polepszenia okresu półtrwania w surowicy, ale wówczas, kiedy nie są potrzebne immunologiczne funkcje jednostki Ig. W takich realizacjach białko fuzyjne korzystnie zawiera domeny CH1, CH2 i/lub CH3 z lgg2 lub lgg4 połączone zawiasowym regionem z IgG1 lub zawiasowym regionem z lgg4, drugi region zawiasowy

4 4 PL B1 korzystnie zawiera mutację, która polepsza właściwe powstawanie wiązań disulfidowych pomiędzy jednostkami pochodzącymi od ciężkich łańcuchów (Angal S, et al. Mol Immunol 1993 Jan;30(1): 105-8). Białka fuzyjne według tej realizacji ułatwiają ekspresję na wysokim poziomie i polepszają właściwe formowania całego przeciwciała i białek fuzyjnych Ig zawierających regiony Fc. W bardziej korzystnej realizacji, białka fuzyjne także zawierają jedną lub większą liczbę mutacji w jednostce Ig. Na przykład jednostka Ig jest zmutowana w celu dalszej redukcji jakiejkolwiek pozostałej funkcji efektorowej, która nie jest pożądana. Na przykład zmutowane jest wiążące miejsce C1q w domenie CH2 w lgg2. Przykładowo zwykła lgg4 nie wiąże dopełniacza, ponieważ zawiera serynę zamiast odpowiadającej proliny w pozycji 331 w IgG1 (nomenklatura Eu) (Tao, MA et al. (1993) J.Exp.Med. 178: ; Brekke, OH et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: ); podobna mutacja w lgg2 redukuje wiązanie C1q. Inne reszty, które jak wiadomo biorą udział w wiązaniu C1q mogą być zmodyfikowane w taki sposób jak reszty w pozycjach 318, 320, 322 i 297 (Duncan AR (1988) Naturę: 322: ), co skutkuje zmniejszeniem się wiązania C1q. Immunoglobulinowe białka fuzyjne według wynalazku mogą także zawierać mutację w regionie zawiasowym. Na przykład, gdy występuje także lekki łańcuch przeciwciała, korzystna jest forma regionu zawiasowego IgG1 z resztą cysteiny w zwykłej ilości w jej zwykłych pozycjach. Jednakże w przypadkach, gdy lekki łańcuch przeciwciała nie występuje jako osobny łańcuch peptydowy, korzystny jest obszar zawiasowy IgG1, w którym pierwsza cysteina jest zmutowana na inną resztę. Na przykład korzystne jest wykorzystanie takiego zmutowanego regionu w białkach typu Fc-X, typu X-Fc i w przeciwciałach złożonych z pojedynczych łańcuchów, w których region zmienny lekkiego łańcucha jest przyłączony do ciężkiego łańcucha za pomocą łącznika polipetydowego. W tym kontekście pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IgG1 jest korzystnie zmutowana na serynę. W drugiej klasie realizacji wykorzystujących zmutowany region zawiasowy, stosowana jest zmutowana forma regionu zawiasowego lgg4, która umożliwia wydajne tworzenie wiązania disulfidowego między dwoma ciężkimi łańcuchami. W trzeciej klasie realizacji wykorzystujących zmutowany region zawiasowy wykorzystana została, w przeciwciele będącym hybrydą izotypów lub w białku fuzyjnym Ig, zmutowana forma regionu zawiasowego lgg2, w której każda z dwóch pierwszych cystein jest zmutowana na inny aminokwas. Korzystne jest także stosowanie takiego zmutowanego regionu zawiasowego w przeciwciele lub białku fuzyjnym Ig, który całkowicie pochodzi z lgg2. Na przykład, zmodyfikowany region zawiasowy lgg2 o sekwencji ERKSSVECPPCP (SEQ ID NO: 1) zastosowany jest w kontekście przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig. Kolejny korzystny typ regionu zawiasowego jest hybrydą pomiędzy obszarem zawiasowym lgg2, a obszarem zawiasowym lgg4, z taką sekwencją jak ESKYG-VECPPCP (SEQ ID NO: 2), w której pięć aminokwasów przed myślnikiem pochodzi z lgg4, a pozostałe aminokwasy z lgg2. Realizacje te są szczególnie korzystne w kontekście przeciwciał i białek fuzyjnych ulegających ekspresji i wydzielanych przez komórki eukariotyczne ponieważ rzeczone realizacje obszarów zawiasowych zapoczątkowują właściwe formowanie tych białek. Realizacje te mogą zostać zastosowane jako alternatywa do regionu zawiasowego IgG1. Kluczową cechą realizacji regionów zawiasowych przeciwciała jest to, iż posiadają one tylko dwie reszty cysteiny. Jeszcze jedna klasa realizacji obejmuje mutacje w jednostce Ig białek fuzyjnych składających się z hybrydy izotypów Ig, w miejscu połączenia pomiędzy jednostką Ig a jednostką innego pochodzenia. W jednej realizacji, zmiany w sekwencji aminokwasów w białku fuzyjnym występują korzystnie w połączeniu jednostki Ig i jednostki innego pochodzenia i korzystnie leżą w obrębie 10 aminokwasów w miejscu połączenia. Bardziej korzystnie, zmiany aminokwasów pociągają za sobą zmianę C-terminalnej lizyny w jednostce przeciwciała na hydrofobowy aminokwas taki jak alanina czy leucyna. Alternatywna realizacja jest praktyczna w okolicznościach, w których pożądane jest skrócenie okresu półtrwania białka fuzyjnego. IgG3 ma względnie krótki okres półtrwania w porównaniu do innych izotypów IgG ze względu na modyfikację w wiążącym miejscu FcRn/FcRp zlokalizowanego w domenie CH3(H435 do R) (patrz Ward, ES. i Gheti, V (1995) Therapeutic Immunology 2:77-94). Białko fuzyjne z CH2 i CH3 domenami IgG3 może być zastosowane, gdy pożądany jest krótki okres narażenia. Według tej realizacji, praktyczne jest zastosowanie CH3 domeny IgG3 w połączeniu z regionem zawiasowym IgG1; tego rodzaju białko fuzyjne IgG1 (region zawiasowy)-lgg3(ch3) posiada lepszą ekspresję i właściwości formowania w porównaniu z białkiem fuzyjnym zawierającym obszar zawiasowy IgG3 i CH3 domenę IgG3. W bardziej korzystnej realizacji białka fuzyjnego lg zaprojektowanej tak, aby posiadało krótki czas półtrwania w surowicy, ograniczono funkcje efektorowe oraz wydajne formowanie, zastosowano

5 PL B1 5 hybrydę regionów Ig, w której region zawiasowy pochodzi z IgG1, CH2 domena pochodzi z lgg2 i CH3 domena pochodzi z IgG3. Hybryda izotypów IgG/lgA Wynalazek dotyczy również białka fuzyjnego będącego hybrydą izotypów Ig o ulepszonej oporności na proteazę i ulepszonym okresie półtrwania w surowicy. Realizacja ta jest szczególnie korzystna w sytuacjach, gdy białko fuzyjne Ig jest narażone na środowisko bogate w proteazy, takie jak jelito lub inna tkanka śluzowa, na przykład podczas doustnego podawania leku zawierającego białko fuzyjne Ig. Według tej realizacji dostarczane jest białko fuzyjne Ig zawierające fragmenty stałych regionów IgG i IgA. W korzystnej realizacji zastosowano region zawiasowy z lga1 oraz domeny CH2 i CH3 z IgG. W konkretnej korzystnej realizacji, segmenty aminokwasów kodujące miejsca glikozylacji przez atomy O w Fc regionie IgA są wszczepione w Fc region IgG. Hybryda izotypów IgG/IgM Kolejna realizacja wynalazku dostarcza przeciwciał hybrydy izotypów i białek fuzyjnych Ig z cechami oligomeryzacji IgA lub IgM, ale z funkcjami efektorowymi charakterystycznymi dla IgG. Na przykład, opracowano białko zawierające region zawiasowy i domenę CH2 z IgG1 lub lgg3 połączone z domeną CH3 i CH4 z IgM. W bardziej korzystnej realizacji, opracowano przeciwciało zawierające zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha i także zawierające region zawiasowy oraz CH2 z IgG połączone z domeną CH3 i CH4 z IgM. W alternatywnej, bardziej korzystnej realizacji, opracowano białko fuzyjne typu X-Fc, w którym X jest korzystnie ligandem dla receptora powierzchniowego komórki, a jednostka Fc zawiera domenę CH3 i CH4 z IgM. Cząsteczka taka łączy funkcję efektorową ADCC IgG z wysoką wartościowością IgM. W korzystnej realizacji hybrydy izotypów z zastosowaniem domeny CH4 z IgM lub IgA, C-terminalna cysteina w domenie CH4 jest zmutowana, aby zablokować disulfidowe wiązanie z łańcuchem J. Redukuje to wydzielanie białka fuzyjnego Ig do jelita. Korzystne jednostki niebędące jednostkami Ig Korzystnym typem jednostek nie będących jednostkami Ig w białkach fuzyjnych według wynalazku jest białko lub jednostka, która jest normalnie pozabłonowa, kiedy nie jest częścią białka fuzyjnego Ig. Na przykład hormon, cytokina, chemokina, wydzielany enzym lub pozabłonowa część transmembranowego receptora. W korzystnej realizacji składnik niebędący immunoglobuliną jest takim białkiem jak białko przeciwko otyłości. Na przykład składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest leptyna, CNTF, CLC/CLF-1 lub fragment Acrp30. W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest białko takie jak erytropoetyna czy EPO. W alternatywnej realizacji, składnikiem białka fuzyjnego, który nie jest immunoglobuliną, jest hormon. Na przykład składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest insulina, hormon wzrostu albo peptyd 1 glukagonopodobny (GLP-1). W kolejnej realizacji składnik białka fuzyjnego, który nie jest immunoglobuliną, jest cytokiną. Termin cytokina oznacza według wynalazku naturalnie występujące lub rekombinowane białka, ich analogi oraz ich fragmenty, które wywołują specyficzną odpowiedź w komórce, która posiada receptor dla tej cytokiny. Korzystnie cytokinami są białka, które mogą być wytwarzane i wydzielane przez komórkę. Korzystnie cytokiny obejmują interleukiny takie jak interleukinę-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 i IL-18, czynniki krwiotwórcze takie jak czynnik stymulujący wzrost koloni granulocytów i makrofagów (GM-CSF), G-CSF i erytropoetynę, czynniki śmierci nowotworu (TNF - tumor necrosis factor), takie jak TNFa, limfokiny, takie jak limfotoksyna, regulatory procesów metabolicznych takie jak leptyna, interferony, takie jak interferon α, interferon β i interferon γ i chemokiny. Korzystnie białko fuzyjne Ig-cytokina według wynalazku wykazuje biologiczną aktywność cytokiny. W alternatywnej korzystnej realizacji, składnikiem białka fuzyjnego niebędącym immunoglobuliną, jest białko wiążące ligand o aktywności biologicznej. Takie białka wiążące ligand mogą, na przykład, (1) blokować oddziaływanie receptor - ligand na powierzchni komórki; lub (2) znosić aktywność biologiczną cząsteczki (na przykład cytokiny) w płynnej fazie krwi, tym samym zapobiegając osiągnięciu przez nią celu znajdującego się na błonie. Korzystne białka wiążące ligandy obejmują CD4, CTLA-4, receptory TNF, receptory interleukiny takie jak receptor dla IL-1 albo receptor dla IL-4. Korzystnie białko fuzyjne typu przeciwciało-receptor według wynalazku wykazuje biologiczną aktywność białka wiążącego ligand. Jedna wysoce korzystna realizacja obejmuje pozabłonowy fragment domeny receptora

6 6 PL B1 TNF stosowany w leku białkowym Enbrel, w postaci TNFR-obszar zawiasowy-ch2-ch3 lub region zawiasowy-ch2-ch3-tnfr, w których domeny CH2 i CH3 pochodzą z lgg2 lub lgg4 i każdy z dwóch zawiasowych regionów w dimerycznym Fc posiada trzy lub mniejszą liczbę cystein, a bardziej korzystnie dwie lub mniejszą liczbę cystein. Kolejny rodzaj korzystnego białka wiążącego ligand ma zdolność wiązania z małymi cząsteczkami bardziej niż z białkami. Na przykład, korzystnie łączy się awidynę z jednostką będącą hybrydą izotypów Ig, taką jak przeciwciało. Połączenie awidyny z hybrydą izotypów przeciwciała jest następnie podawane ssakowi takiemu jak mysz lub człowiek i ulega koncentracji w tkance docelowej w organizmie, jak zostało to określone przez specyficzność regionu V przeciwciała. Po tym jak białko fuzyjne przeciwciało-awidyna zostanie dostatecznie usunięte z organizmu, podaje się połączenie biotyny i cząsteczki terapeutycznej. Połączenie biotyny ulega koncentracji w docelowej tkance za pomocą wiązania z awidyną, co skutkuje zmniejszeniem efektów ubocznych, które mogłyby powstać w wyniku koncentracji cząsteczki terapeutycznej w innej niż docelowa tkance. Strategia ta może być stosowana z innymi parami ligand/białko wiążące ligand. Kolejnym rodzajem korzystnej jednostki, która nie jest immunoglobuliną, jest enzym. Na przykład, enzym z określoną specyficznością może być połączony z jednostką będącą hybrydą izotypów Ig, taką jak przeciwciało. Połączenie hybrydy izotypów przeciwciała i enzymu jest następnie podawane ssakowi takiemu jak mysz lub człowiek i ulega koncentracji w tkance docelowej, jak zostało to określone przez specyficzność regionu V przeciwciała. W jednym korzystnym sposobie leczenia według wynalazku, po tym jak białko fuzyjne przeciwciało-enzym zostanie dostatecznie usunięte z organizmu, podaje się prolek, który może być transformowany przez enzym do jego aktywnej formy. Aktywowany lek ulega koncentracji w tkance docelowej, co skutkuje zmniejszeniem efektów ubocznych, które mogłyby powstać w wyniku koncentracji aktywnej cząsteczki leku w innej niż docelowa tkance. W wysoce korzystnej odmianie tej realizacji, aktywowany lek jest lekiem przeciwrakowym, takim jak czynnik cytotoksyczny. W alternatywnej wysoce korzystnej realizacji, sam enzym ma aktywność terapeutyczną. Na przykład RNAza, taka jak Onconaza jest sparowana z białkiem fuzyjnym hybrydy izotypów przeciwciał i ukierunkowana na guz przez region V przeciwciała. Kwasy nukleinowe Wynalazek dotyczy także nowych sekwencji kwasu nukleinowego, które umożliwiają ekspresję i wydzielanie białek fuzyjnych Ig i całych przeciwciał z hybrydą izotypów. Rozważane są również sposoby konstruowania takich kwasów nukleinowych. Szczególnie korzystną cechą sekwencji genowych kodujących białka przeciwciała jest to, iż region zmienny, CH1, region zawiasowy, regiony CH2, CH3, oraz CH4 są kodowane przez osobne egzony. Cecha ta umożliwia opracowanie białek fuzyjnych hybrydy izotypów Ig poprzez przetasowanie egzonów (ang. exon shuffling ) (Zuckier et al, Cancer Research [1998] 58:3905-8; Poon et al, J.BIol.Chem. [1995] 270:8571-7; Jefferis R, et al, Mol. Immunol. [1990] 27: ; Chappel MS, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. [1991] 88: ; Senior BW, et al, Infect. Immun. [2000] 68:463-9). W przypadku białek fuzyjnych Fc, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą kodować białko w różnych konfiguracjach. W korzystnym zestawie realizacji, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje, seryjnie w kierunku od 5' do 3', (i) sekwencję sygnałową, region Fc immunoglobuliny i sekwencje białka docelowego lub (ii) sekwencję sygnałową, docelowe białko i region Fc immunoglobuliny, albo (iii) sekwencję sygnałową, pierwsze białko docelowe, region Fc immunoglobuliny oraz drugie białko docelowe. Otrzymana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje zatem strukturę typu Fc-X, X-Fc lub X-Fc-Y, gdzie X i Y jest białkiem lub białkami docelowymi. Na przykład, X i Y mogą same być białkami docelowymi. Łączniki są opcjonalnie zakodowane między tymi jednostkami. Podobnie, według wynalazku, kwasy nukleinowe kodujące całe białko fuzyjne przeciwciała Ig są przypisane do kodowania sekwencji sygnałowej w końcu N każdej jednostki ciężkiego łańcucha i każdej jednostki lekkiego łańcucha. Kwas nukleinowy według wynalazku może być wbudowany jako funkcjonalna całość do replikującego wektora ekspresji, który może być wprowadzony do eukariotycznej komórki gospodarza odpowiedniego do produkcji białka fuzyjnego. Otrzymane białka fuzyjne Ig są wytwarzane z wydajnością i wydzielane z eukariotycznych komórek gospodarza. Wydzielane białka fuzyjne Ig mogą być zbierane z nośnika kultury bez przeprowadzania lizy eukariotycznych komórek gospodarza. Produkt białkowy może być badany w kierunku aktywności i/lub oczyszczany z zastosowaniem powszechnych odczynników koniecznych dla tego etapu, i/lub odczepiany od drugiego składnika połączenia, wszystkie procesy wykorzystują konwencjonalne techniki. Alternatywnie kwas nukleinowy według wynalazku, może

7 PL B1 7 być wprowadzony do komórki bakteryjnej, a otrzymane białko fuzyjne Ig oczyszczane według standardowych technik. Wynalazek może także służyć do ulepszania poziomu przeciwciał i białek fuzyjnych Ig wytwarzanych w komórkach, które może znaleźć zastosowanie w przypadku wytwarzania produktów w komórkach eukariotycznych, korzystnie komórkach ssaków. Na przykład wytwarzanie wyjściowego przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig może być udoskonalone poprzez wymianę sekwencji kwasu nukleinowego kodującą domeny jednostki Ig na odpowiednie sekwencje kodujące domeny z izotypów innego przeciwciała, lub na sekwencje zmutowane, porównując poziom ekspresji poprzez analizowanie wytwarzania zmienionych białek, jak tutaj opisano oraz wybierając daną konstrukcję ekspresji, która daje najwyższe poziomy. Proces ten może być stosowany powtórnie. Jest on szczególnie korzystny przy wymianie regionów zawiasowych. Leczenie Wynalazek dotyczy także sposobów leczenia z zastosowaniem zmodyfikowanych przeciwciał i białek fuzyjnych Ig. Szczególnie odpowiednie według wynalazku są sposoby, które są zarówno wydajne i niedrogie tak samo jak białka, które są mniej immunogenne. Powyższe i inne cele, cechy i zalety wynalazku staną się bardziej widoczne w nawiązaniu do następującego szczegółowego opisu, rysunku i zastrzeżeń. Na rysunku fig 1 A-D przedstawiono schematyczne ilustracje hybrydy izotypów IgG stosowanych do sporządzania białek fuzyjnych według wynalazku; gruba linia przedstawia wiązania disulfidowe łączące reszty cysteiny; domeny przeciwciała są zaznaczone na rysunku fig. 1; domeny IgG1 są przedstawione jako czarne, domeny lgg2 są przedstawione jako białe, a domeny zmiennego i lekkiego łańcucha są przedstawione jako paskowane; fig. 1A przedstawia izotyp IgG1; fig. 1B przedstawia izotyp lgg2; fig. 1C przedstawia hybrydę lgg2 i obszaru zawiasowego IgG1 posiadającego mutacje w pozycji pierwszej cysteiny; fig. 1D przedstawia γ1(ch1-h) γ2(ch2-ch3) hybrydę IgG; rysunek fig. 2A-C przedstawia schematyczne ilustracje białka fuzyjnego Ig zawierającego regiony Fc, które zawierają hybrydę izotypów; X i Y mogą być dowolną jednostką niebędącą Ig; fig. 2A przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji Fc-X, zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu C jednostki Fc znajduje się jednostka białka X ; fig. 2B przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji X-Fc, zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu N jednostki Fc znajduje się jednostka białka X ; fig. 2C przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji X-Fc-Y zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu N jednostki Fc znajduje się jednostka X, która może być dowolnym białkiem oraz w końcu C jednostki Fc znajduje się jednostka białka Y ; rysunek fig. 3A-D przedstawia schematyczne ilustracje białek fuzyjnych Ig, które zawierają zmienne regiony i które zawierają hybrydę izotypów; X i Y mogą być dowolną jednostką niebędącą Ig; fig. 3A przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CHS pochodzących z innego izotypu; białko X niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha; fig. 3B przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko X niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha; strzałki wskazują podzbiór możliwych miejsc mutacji w jednostce przeciwciała, jak zostało opisane; fig. 3C przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego i region CH1 pochodzący od jednego typu przeciwciała (czarny), regionów CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko X nie będące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, rozgałęziona struktura wychodząca z regionu zawiasowego przedstawia jednostkę glikozylacji; fig. 3D przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko X niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, drugie białko Y niebędące Ig jest przyłączone na końcu N lekkiego łańcucha;

8 8 PL B1 fig. 3E przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko X niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, drugie białko Y niebędące Ig jest przyłączone na końcu N ciężkiego łańcucha; rysunek fig. 4 jest schematyczną ilustracją białka fuzyjnego Ig, które składa się ze zmiennych regionów obejmujących wiele izotypów i które ma zwiększoną wartościowość w porównaniu do IgG; czarne owale przedstawiają domeny CH3 i CH4 z IgM; białe owale przedstawiają domeny CH1, zawiasową i CH2 z IgG; paskowane owale przedstawiają zmienne domeny i lekki łańcuch stałej domeny; grube linie przedstawiają wiązania disulfidowe normalnie występujące w IgG1; cienkie linie oznaczone literą 's' przedstawiają wiązania disulfidowe normalnie występujące w IgM. Definicje Termin izotyp według wynalazku oznacza klasę ciężkich łańcuchów stałego regionu (C) immunoglobuliny, która określa funkcjonalną aktywność przeciwciała. Istnieje pięć głównych klas obejmujących IgA, IgG, IgM, IgD i IgE. Przez IgA rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch α. Przez IgD rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch δ. Przez IgE rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch ε. Przez IgM rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch μ. Przez IgG rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch γ. Terminy gamma1 lub γ1 odnoszą się do ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu pochodzącego z IgG1. Podobnie, gamma2 lub γ2 pochodzą z lgg2, i tak dalej. Termin allotyp, według wynalazku oznacza polimorfizm alleli tego samego genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Wyznaczniki te występują u niektórych, ale nie wszystkich członków gatunków. Termin idiotyp, według wynalazku oznacza wyznaczniki antygeniczności znajdujące się w zmiennych (V) regionach przeciwciał i odpowiadające szczególnie zmienionym genom V H i V L. Termin FcRn, znany także jako FcRp oznacza według wynalazku noworodkowy jelitowy receptor transportujący, zawierający beta-2-mikroglobulinę, który reguluje usuwanie IgG i jest ważny ze względu na czas półtrwania przeciwciał w krążeniu in vivo. Termin FcγR, według wynalazku oznacza receptory na powierzchni komórki, w tym FcγRI, RM, RIII, które wiążą się z fragmentem Fc cząsteczek IgG i wywołują komórkowe funkcje efektorowe. FcγR ulegają ekspresji na fagocytach, limfocytach B, komórkach NK i komórkach dendrycznych. Terminy IgG1 lub lgg2 lub inne cząsteczki Ig według wynalazku, oznaczają całe przeciwciało w tym ciężki i lekki łańcuch lub ich fragmenty. Termin biwalentny monomer, według wynalazku oznacza przeciwciało, połączenie Fc lub połączenie przeciwciała, które ulega normalnie dimeryzacji poprzez tworzenie wiązań disulfidowych, które występują w normalnym przeciwciele. Tworzenie się takich wiązań disulfidowych wynika powszechnie ze zdolności do migracji białka zawierającego Fc w denaturującym, nieredukującym żelu SDS w postaci osobnego pasma z pozorną masą cząsteczkową około dwukrotnie większą niż pozorna masa cząsteczkowa obserwowana w warunkach redukujących. Obecność biwalentnego monomeru wynika również z występowania piku w chromatografii sączenia molekularnego, który odpowiada właściwej masie cząsteczkowej. Inne sposoby określania rozmiaru białka mogą także być zastosowane do określenia występowania biwalentnych monomerów. Termin białko fuzyjne Ig, według wynalazku oznacza białko fuzyjne, które zawiera część lub całe przeciwciało połączone z drugą jednostką, która korzystnie jest częścią lub całym białkiem nie będącym ani przeciwciałem, ani immunoglobuliną. Immunocytokiny, białka Fc-X, białka X-Fc i białka X-Fc-Y są przykładami białek fuzyjnych. Podobnie, białka fuzyjne, w których jednostka nie będąca Ig jest umiejscowiona pomiędzy dwiema jednostkami Ig lub domenami, tworząc rodzaj białka fuzyjnego Ig. Termin formowanie, według wynalazku oznacza właściwe ukształtowanie białka i oligomeryzację do właściwego stanu polimerycznego. Formowanie może być obserwowane na wiele sposobów, znanych ze stanu techniki. W praktyce, właściwe formowanie białka, ze względu na wiązania disulfidowe, może być konwencjonalnie monitorowane poprzez porównanie migracji na nieredukującym i redukującym SDS żelu: jeśli dana forma białka tworzy wielokrotne pasma na nieredukującym żelu, ale tworzy pojedyncze pasmo na redukującym SDS żelu, można wywnioskować, że tylko jedno z pasm na nieredukującym SDS żelu jest właściwie uformowaną formą. Alternatywnie, chromatografia sączenia molekularnego może zostać zastosowana do rozróżnienia pojedynczych jednostek białek od

9 PL B1 9 oligomerów wysokiego rzędu i agregatów, które mogą tworzyć się z niewłaściwego wiązania disulfidowego lub oddziaływań niekowalencyjnych. Termin domena jednostki przeciwciała, według wynalazku oznacza strukturalną domenę, która odpowiada segmentowi aminokwasów kodowanemu przez pojedynczy egzon w genach przeciwciał u ludzi. Na przykład, stałymi domenami IgG są domeny CH1, region zawiasowy, CH2 i CH3. W niektórych przypadkach, domeny: zawiasowa i CH2 są kodowane przez ten sam egzon. W takich przypadkach, połączenie pomiędzy domenami zawiasową a CH2 jest określone przez zestawienie z innymi połączeniami rejon zawiasowy/ch2 (patrz Paul, op cit., strony 46-49). Terminy domena, białko, region albo cząsteczka, według wynalazku oznaczają całą domenę, białko, region albo cząsteczkę, lub ich fragment, mutację lub ich sztucznie opracowaną formę, bądź formę zasadniczo pochodzącą od nich. Fragment, mutacja lub forma sztucznie otrzymana korzystnie mają właściwości funkcyjne, charakterystyczne dla całej domeny, białka, regionu albo cząsteczki. Termin zasadniczo pochodzące, według wynalazku oznacza mające przynajmniej 95% swoich aminokwasów pochodzących od poszczególnej sekwencji naturalnie występującego białka lub domeny. Na przykład sekwencja, która zasadniczo pochodzi od CH2 domeny ludzkiej lgg2 jest przynajmniej w 95% identyczna z domeną CH2 ludzkiej lgg2 pod względem ustawienia aminokwasów. Termin zmodyfikowany region zawiasowy IgG1, według wynalazku oznacza region zawiasowy z IgG1, w którym cysteina, korzystnie pierwsza cysteina jest zmutowana do innego aminokwasu. Cysteina ta normalnie tworzy wiązania disulfidowe z łańcuchem lekkim przeciwciała. Zmodyfikowany region zawiasowy IgG1 jest szczególnie praktyczny w białkach, w których albo brakuje łańcucha lekkiego, albo posiadają inną cysteinę, która może wiązać się z lekkim łańcuchem. Termin cząsteczka erytropoetyny według wynalazku oznacza cząsteczkę, która ma zasadniczo taką samą strukturę i podobną sekwencję aminokwasów jak erytropoetyna występująca u kręgowców, opcjonalnie zawierającą mutację. Przykład 18 opisuje zastosowanie ludzkiej erytropoetyny bez mutacji i odmiany ludzkiej erytropoetyny z czterema mutacjami. Wynalazek dotyczy sposobów i kompozycji do ulepszenia produkcji in vivo i in vitro białek fuzyjnych immunoglobulin. W szczególności wynalazek dotyczy praktycznych sposobów polepszenia ekspresji, agregacji i/lub właściwości kształtowania białek fuzyjnych immunoglobulin. Wynalazek jest w części oparty na nieoczekiwanej obserwacji, że białko fuzyjne immunoglobulin ulega ekspresji na wyższym poziomie, z mniejszymi problemami przy agregacji i/lub kształtowaniu, gdy zastosowano hybrydę immunoglobulin jako składnika połączenia zamiast immunoglobuliny typu dzikiego. Ulepszone właściwości wytwarzania białek fuzyjnych skojarzonych z hybrydami immunoglobulin nie są wymagane, gdyż immunoglobuliny typu dzikiego, takie jak IgG1 i lgg2 są uważane za dobrze ukształtowane białka, które ulegają wydajnej ekspresji zarówno in vivo jak i in vitro. Odpowiednio, jeden aspekt wynalazku obejmuje sposoby i kompozycje korzystne do ekspresji białek fuzyjnych immunoglobulin, do których zalicza się jednostkę hybrydy immunoglobuliny (lub hybrydy Ig). Korzystne hybrydy immunoglobulin obejmują region zawiasowy IgG1 z CH2 i CH3 domenami lgg2. Inne korzystne hybrydy obejmują domeny IgG1 z lgg4. Struktura przeciwciała Przeciwciała są cząsteczkami o kształcie litery Y i składają się z dwóch ciężkich (heavy-h) i dwóch lekkich (light-l) łańcuchów. Każdy ciężki łańcuch jest połączony z lekkim łańcuchem wiązaniem disulfidowym i opiera się na kowalencyjnych i niekowalencyjnych oddziaływaniach właściwie zorientowanych łańcuchów względem siebie. Domena zmienna na końcu aminowym obu tych łańcuchów zawiera miejsce wiążące antygen i, łącznie z domenami CH1, określa koniec Fab cząsteczki. Cztery łańcuchy wykorzystują hydrofobowe wiązanie pomiędzy ciężkimi łańcuchami i jedno lub większą liczbę wewnątrz łańcuchowych wiązań disulfidowych w celu stabilizacji kompleksu. Stąd cała immunoglobuliną jest biwalentna z dwoma identycznymi miejscami wiążącymi antygen. Pewne immunoglobuliny normalnie ulegają dodatkowej polimeryzacji, tak jak IgM i IgA. Każdy łańcuch polipeptydowy posiada od dwóch do pięciu domen; lekkie łańcuchy zawierają dwie domeny, podczas gdy ciężkie łańcuchy zawierają cztery lub pięć. Pojedyncza domena na końcu aminowym każdego łańcucha jest różnie zakończona z powodu szerokiego zróżnicowania sekwencji, podczas gdy kilka domen na końcu C jest określanych jako stałe regiony. Regiony ciężkiego łańcucha są numerowane jako cm, region zawiasowy, CH2, CH3, CH4 i są odpowiedzialne za wiele ważnych funkcji przeciwciała w tym za wiązanie receptora Fc (FcR) i wiązania dopełniacza.

10 10 PL B1 Istnieje pięć głównych izotypów klas regionów ciężkiego łańcucha klasyfikowanych jako IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, każdy o charakterystycznej funkcji efektorowej (IgG jest osobno podzielona na cztery γ podklasy izotypów: γ1, γ2, γ3, γ4). Stałe regiony lekkiego łańcucha posiadają jedynie jedną domenę C, która może należeć do jednej z dwóch klas, Ck i Cλ, i która nie posiada żadnych atrybutów funkcjonalności (patrz W.E. Paul, red., 199S, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, N.Y.). Wszystkie immunoglobuliny posiadają region zawiasowy zlokalizowany przy domenie CH1 w kierunku końca ich ciężkich łańcuchów, oddzielający regiony cząsteczki Fab i Fc. W większości przypadków, region zawiasowy umożliwia ogromy stopień elastyczności pomiędzy komponentami cząsteczki wiążącej antygen (koniec Fab) a komponentami oddziaływania z efektorem (Fc), łącząc w ten sposób dwa funkcjonalne elementy przeciwciała. W izotypach IgG wewnątrz cząsteczkowe wiązania disulfidowe tworzą się typowo w obrębie regionu zawiasowego, tworząc końcową tetrameryczną cząsteczkę. Z wyjątkiem IgM, region zawiasowy jest zdominowany przez prolinę, serynę i treoninę, aminokwasy, które dążą do zapobieżenia tworzeniu drugorzędowej struktury i które jak się uważa, nadają regionowi zawiasowemu elastyczność. Izotop IgG1, często stosowany w białkach fuzyjnych, posiada dwa disulfidowe wiązania w regionie zawiasowym, które łączą ze sobą dwa łańcuchy ciężkie. W przeciwieństwie, izotyp lgg2 posiada cztery wiązania disulfidowe (rysunek fig. 1). Według wynalazku, rzeczone wiązania disulfidowe dążą do zapoczątkowania niewłaściwego uformowania przeciwciała i białek fuzyjnych Ig, jak wykazano w nieoczekiwanych odkryciach w przykładach. Korzystne konfiguracje białek fuzyjnych Ig Immunocytokiny są tylko jednym z przykładów terapii z zastosowaniem białek fuzyjnych ukierunkowanych na nowotwór, dla których sposoby i kompozycje według wynalazku znajdują zastosowanie. Inne cząsteczki toksyczne dla nowotworu mogą także być ukierunkowane na nowotwory przez złączenie ze specyficznymi dla nowotworu przeciwciałami według wynalazku. Dodatkowo, inne typy komórek chorobowych, takie jak komórki zainfekowane wirusem, mogą być atakowane przez białka fuzyjne przeciwciała według wynalazku. Sposoby i kompozycje według wynalazku są także korzystne w kombinacji z zastosowaniem technologii Fc-X i X-Fc. Według wynalazku, zastosowanie hybrydy izotypów przeciwciała w białku fuzyjnym polepsza wytwarzanie i zbieranie docelowego białka lub polipeptydu, który jest połączony z fragmentem Fc immunoglobuliny. Dla białek fuzyjnych typu Fc-X, pojedynczy peptyd, poprzedzony przez fragment Fc według genu immunoglobuliny, jest częścią połączenia z docelowym białkiem poprzez koniec N. Białko fuzyjne ulega następnie ekspresji w komórce gospodarza, na przykład komórce ssaka, takiej, w której immunoglobuliną ulega ekspresji naturalnie. Fragment sygnałowy peptyd-fc na końcu N składnika połączenia kieruje białko docelowe przez ścieżkę wydzielania, w taki sposób, że białko fuzyjne jest z łatwością wydzielane. Dodatkowo, zastosowanie fragmentu Fc, który normalnie jest zglikolizowany i o wysokim ładunku w obojętnym ph, umożliwia rozpuszczenie bardziej hydrofobowych białek. Ukierunkowanie białek fuzyjnych typu Fc-X na drodze wydzielania ułatwia także rozwiązanie problemów związanych z toksycznością białka wewnątrz komórki i umożliwia izolację stabilnych linii komórkowych. Wytwarzane białko fuzyjne jest łatwo poddawane analizie i oczyszczane, jako że jest bez problemu zbierane z pożywki w jego natywnej konformacji z zachowaniem zarówno biologicznej jak i enzymatycznej aktywności. Wydajność tej technologii została przedstawiona przy użyciu Fc-leptyny i Fc-erytropoetyny. Niektóre z tych zalet są także przypisane białkom X-Fc. Według wynalazku przykłady korzystnych połączeń jednostek przeciwciała obejmują białka typów Fc-X, X-Fc i X-Fc-Y. Białka takie zawierają region Fc z białkiem nie będącym przeciwciałem lub fragmentem białka przyłączonym na końcu N, końcu C lub na obu tych końcach. Jednym korzystnym efektem połączenia jest to, że okres półtrwania w surowicy składnika połączenia może być znacząco zwiększony. Drugim korzystnym efektem jest to, że 'X' może efektywnie ulegać dimeryzacji poprzez przyłączenie do Fc. Na przykład, Enbrel jest białkiem fuzyjnym składającym się z fragmentu receptora TNF i regionu Fc IgG1. W niektórych realizacjach wynalazku, szczególnie korzystne jest opracowanie białka fuzyjnego z hybrydą izotypów o orientacji X-Fc. W tej konstrukcji białko docelowe znajduje się na końcu N białka fuzyjnego, a fragment Fc występuje za nim. Dla niektórych białek takie podejście może być praktyczne, na przykład z powierzchniową glikoproteiną komórek limfocytarnych (LHR) (patrz opis patentowy US 5,428,130).

11 PL B1 11 Według wynalazku, użyteczność białek fuzyjnych opartych na rekombinowanym przeciwciele, nawet lepsza niż zastosowanie osobno białka czy cytokiny, może być ograniczona przez ich gwałtowną eliminację in vivo z krążenia, gdyż białka fuzyjne przeciwciała mają znacząco niższy czas półtrwania in vivo w krążeniu niż wolne przeciwciało. Ten spadek okresu półtrwania w krążeniu jest prawdopodobnie wynikiem zwiększonego usuwania przez receptor Fc (FcR). Zostało udowodnione, że wyłączenie izotypu jest jednym mechanizmem, za pomocą którego cechy takie jak okres półtrwania mogą zostać zmienione. Ulepszenia w okresie półtrwania dwóch immunocytokin zostały przedstawione (Cancer Research 59(9): , 1999) poprzez zamianę izotypu regionu C ludzkiego łańcucha ciężkiego z IgGγ1 lub IgGγ3 na lggγ4 - izotyp o obniżonym wiązaniu FcR. Oparte na lgg4 immunocytokiny i białka fuzyjne mają dziesięciokrotnie obniżone wiązanie FcR i zredukowane funkcje efektorowe receptora Fc takiego jak ADCC, ale w dalszym ciągu wykazują podobną lub lepszą efektywność w modelach mysich nowotworów niż te białka fuzyjne, które są oparte na oryginalnej IgGγ1. Jednakże wynalazek dotyczy białek opartych na hybrydzie przeciwciał, która łączy funkcjonalne i strukturalne właściwości różnych typów przeciwciał w jednej cząsteczce. Odpowiednio, dla pewnych zastosowań, izotyp lgg2 nadaje lepsze właściwości białkom fuzyjnym przeciwciała, gdyż izotyp lgg2 posiada znacznie obniżone wiązanie receptora Fc (Hulett et al., [1994] Adv. Immunol. 57:1127). Dla białek fuzyjnych całego przeciwciała jest czasem korzystnie zastosować izotyp γ2 w białkach fuzyjnych zawierających tylko region Fc. Uzasadnienie to jest identyczne w przypadku całego przeciwciała: często jest pożądane uniknięcie wiązania receptorów Fc, które jest osiągnięte przez regiony Fc pochodzące od innych izotypów. Jednakże zastosowanie izotypu lgg2 w białku fuzyjnym ogólnie wywołuje pewien poziom niewłaściwego uformowania, jak zostało to opisane. Sposoby i kompozycje według wynalazku dostarczają białek fuzyjnych przeciwciała, które posiadają zmniejszone funkcje efektorowe izotypu lgg2, ale które nie posiadają właściwości tworzenia agregatów charakterystycznych dla tego izotypu. Według wynalazku, nowe hybrydy izotypów przeciwciał i białek fuzyjnych wykazują lepszą ekspresję i polepszone formowanie niż te w przypadku białka fuzyjnego opartego na lgg2. Dodatkowo, hybryda izotypów przeciwciał i białek fuzyjnych może posiadać zwiększoną wydajność w terapeutykach, w przypadku których funkcje efektorowe Fc nie są pożądane. Rodzaje regionów zawiasowych Hybryda izotypów przeciwciała według wynalazku obejmuje także przeciwciała, w których region zawiasowy jest zmutowanym regionem zawiasowym, korzystnie regionem zawiasowym o zmniejszonej liczbie reszt cysteiny, na przykład zmodyfikowany region zawiasowy IgG1, w którym pierwsza cysteina jest zmutowana na serynę. Pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IgG1 normalnie wiąże się z lekkim łańcuchem. W białku typu Fc-X lub X-Fc lub w każdym innym białku fuzyjnym przeciwciała z brakującym łańcuchem lekkim, cysteina ta nie spełnia swej naturalnej funkcji i dlatego może zostać zmutowana. Jednakże, według wynalazku, hybryda izotypów przeciwciała z regionem zawiasowym IgGI o brakującej pierwszej cysteinie i z CH1 domeną lgg2 może łączyć się z lekkim łańcuchem, gdyż lekki łańcuch normalnie tworzy wiązanie disulfidowe z cysteina w obrębie CH1 domeny lgg2. Uważa się, że cztery cysteiny w regionie zawiasowym lgg2 tworzą między sobą wiązania disulfidowe. Według wynalazku, cysteiny w regionie zawiasowym przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig, które biorą udział w homodimeryzacji ciężkich łańcuchów (ciężki łańcuch - ciężki łańcuch), mogą wywierać znaczący wpływ na ekspresję i uformowanie białek fuzyjnych przeciwciała lub Ig. W szczególności, większa liczba cystein może prowadzić do niewłaściwego formowania białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig, z powodu niewłaściwego tworzenia się wiązania disulfidowego. Wynalazek ujawnia zatem mutację jednej lub większej liczby cystein zaangażowanych w homodimeryzację ciężkich łańcuchów, która może spowodować polepszenie ekspresji lub uformowanie białka fuzyjnego przeciwciała albo Ig. W korzystnej realizacji, cysteina biorąca udział w homodimeryzacji ciężkich łańcuchów, może zostać zmutowana, korzystnie na serynę, alaninę, treoninę, prolinę, kwas glutaminowy, lizynę, histydynę, argininę, asparaginę, kwas asparaginowy, glicynę, metioninę, walinę, izoleucynę, leucynę, tyrozynę, fenyloalaninę, tryptofan lub selenocysteinę. W szczególności korzystne jest zastosowanie regionu zawiasowego IgG1, który jest zmutowany w pierwszej, leżącej najbliżej końca N cysteinie. Przewagą tego regionu zawiasowego jest to, że jako jedyny posiada dwie cysteiny. Pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IIgG1 normalnie tworzy wiązanie disulfidowe z cysteina w lekkim łańcuchu. Jednakże, w białkach fuzyjnych Ig o brakującym

12 12 PL B1 łańcuchu lekkim, takich jak białka typu Fc-X, X-Fc i X-Fc-Y, cysteina leżąca najbliżej końca N w regionie zawiasowym IgG1 nie służy do tego celu i dlatego może zostać zmutowana (Lo et al. Protein Engineering 11: [1998]). Jak opisano w przykładach region zawiasowy IgG1 posiadający dwie cysteiny może także zostać użyty w całym przeciwciele lub białku fuzyjnym całego przeciwciała, w którym domena CH1 pochodzi z lgg2, gdyż CH1 domena lgg2 posiada cysteinę, która może tworzyć wiązanie disulfidowe z lekkim łańcuchem. Receptory Fc Cząsteczki IgG oddziałują z wieloma klasami receptorów błonowych, w tym z trzema klasami receptorów Fcγ (FcγR) specyficznych dla klasy przeciwciał IgG, mianowicie FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Receptory te są odpowiedzialne za wychwyt kompleksów antygen-przeciwciało. Miejsce wiążące receptor Fc na Fc znajduje się na domenie CH2 w pobliżu regionu zawiasowego i uważa się, że wiązanie się regionów V z antygenem wspomaga przesunięcie regionu stałego łańcucha lekkiego ze sterycznie zablokowanego regionu zawiasowego. W ten sposób przeciwciała wiązane przez antygen są korzystnie wiązane przez receptor Fc. Czwarty receptor, alternatywnie zwany receptorem ochrony (FcRp) lub receptorem noworodkowym (FcRn) jest odpowiedzialny za odzyskiwanie przeciwciał z endosomu po endocytozie kompleksu przeciwciało-antygen i ich rozdzieleniu w endosomie. Wiążące miejsce dla FcRp znajduje się na połączeniu pomiędzy domenami CH2 a CH3 w trójwymiarowej strukturze przeciwciała. Okres półtrwania przeciwciał IgG w surowicy zależy od produktywnych oddziaływań z funkcjonalnym FcRp. Inne typy przeciwciał, takie jak IgM, IgD, IgE oraz IgA nie wiążą się z FcRp. Kolejnym wiążącym się składnikiem z pewnymi przeciwciałami jest C1q, który pośredniczy w wiązaniu dopełniacza. Oddziaływania z receptorami Fc i FcRp także wywierają wpływ na aktywność biologiczną i metabolizm białek fuzyjnych zawierających jednostkę Fc. Na przykład, białka fuzyjne o słabym wiązaniu z FcR mają dłuższy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne o dobrym wiązaniu z FcR. Białka fuzyjne o słabym wiązaniu z FcRp mają krótszy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne o dobrym wiązaniu z FcRp. Na przykład, białko fuzyjne Ig zawierające domeny CH2 i CH3 lgg2 posiada dłuższy okres półtrwania w surowicy niż białko fuzyjne zawierające IgG1 Podobnie, białko fuzyjne zawierające region Fc pochodzący od lgg3 posiada krótszy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające mu białko fuzyjne zawierające IgG1 albo lgg2. Białka fuzyjne zwierające domeny CH2 i CH3 pochodzące z IgM, IgD, IgE i IgA posiadają nawet krótszy czas półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne pochodzące od IgG. W celu zilustrowania zastosowań według wynalazku, korzystne jest pogrupowanie przeciwciał i białek fuzyjnych Ig na dwie ogólne klasy: białka, w których immunologiczne funkcje efektorowe są pożądane oraz białka, w których jednostka Ig służy jako immunologicznie obojętny nośnik i pozbawiona jest funkcji efektorowych. Odnośnie poprzedniej kategorii białek korzystnie jest opracować białka z hybrydą izotypów, w której stworzono szczególne zestawienie funkcji efektorowych. Odnośnie drugiej kategorii korzystne jest opracowanie białek z hybrydą izotypów wykorzystującą regiony pewnych izotypów o nieznacznych funkcjach efektorowych i regiony z innych izotypów, które polepszają uformowanie białka jak tutaj opisano. Formowanie przeciwciał i białek fuzyjnych Ig Wynalazek ujawnia, że region zawiasowy przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig odgrywa kluczową rolę we właściwym formowaniu i braku agregacji białka fuzyjnego, takiego jak białko fuzyjne wydzielane przez komórkę ssaka. Na przykład, bez wnikania w teorię, uważa się, że uformowanie przeciwciała i białka fuzyjnego Ig obejmuje etapy, w których dwa ciężkie łańcuchy najpierw asocjują niekowalencyjnie przez hydrofobowe połączenie w domenie CH3. Po tej asocjacji regiony zawiasowe dopasowywują się tworząc wewnątrz-łańcuchowe wiązanie disulfidowe. Region zawiasowy znajduje się około 50 Angstremów od hydrofobowego połączenia w domenie CH3. Projektując konstrukcję białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig, praktycznym jest zróżnicowanie regionu zawiasowego. Na przykład, korzystne jest zastąpienie DNA kodującego region zawiasowy w danej konstrukcji ekspresyjnej przez DNA kodujący inny region zawiasowy, taki jak region zawiasowy z IgG1, lgg2, lgg3, lgg4, IgM, IgA, IgD, IgE albo IgY. Według wynalazku, na przykład białka fuzyjne przeciwciał i Ig zawierające regiony zawiasowe o większej liczbie cystein nie formują się tak wydajnie jak odpowiadające im białka o mniejszej liczbie