(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 260991 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 19.04.11 11714990.6 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 14/74 (06.01) A61K 38/36 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 19.08.1 Europejski Biuletyn Patentowy 1/34 EP 260991 B1 (4) Tytuł wynalazku: Wzbogacone w fosfolipidy pęcherzyki zawierające czynnik tkankowy mający aktywność hemostatyczną i ich zastosowania () Pierwszeństwo: 19.04. EP 388 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.02.13 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 13/09 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.01.16 Wiadomości Urzędu Patentowego 16/01 (73) Uprawniony z patentu: Thrombotargets Europe, S.L., Castelldefels, ES (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 260991 T3 JESÚS MURAT MORENO, Castelldefels, ES JUAN RAMÓN RODRÍGUEZ FERNÁNDEZ - ALBA, Castelldefels, ES (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Naperty SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SKR. POCZT. 6 00-96 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-7161/VAL EP 2 60 991 B1 Opis 1 2 3 4 DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy ogólnie leczenia krwotoków i gojenia ran u pacjentów wykorzystujących środek prozakrzepowy oparty na czynniku tkankowym (TF). Konkretniej wynalazek dotyczy mikropęcherzyków zawierających czynnik tkankowy (mikropęcherzyki z TF) zawierający błonę pochodzącą z komórki eukariotycznej w postaci mikropęcherzyka oraz białko czynnika tkankowego i ujemnie naładowany fosfolipid (NCP) oraz ich zastosowanie jako środka prozakrzepowego użytecznego w leczeniu krwotoków u pacjentów oraz ułatwiania angiogenezy i migracji komórek. Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania mikropęcherzyków zawierających TF. TŁO WYNALAZKU [0002] Hemostaza to mechanizm, dzięki któremu organizmy żywe reagują na krwotok i obejmuje udział dwóch procesów, które stają się funkcjonalne bezpośrednio po zmianie i pozostają aktywne przez długi czas. Pierwszy z nich jest znany jako hemostaza pierwotna i cechuje się występowaniem zwężenia naczynia w miejscu zmiany i powstaniem agregacji płytek krwi. Drugi jest znany jako hemostaza wtórna i jest fazą, kiedy powstaje skrzep fibryny wskutek działania innej kaskady krzepnięcia enzymów proteolitycznych. [0003] W drugiej fazie procesu krzepnięcia krwi bierze udział kilka kofaktorów i enzymów proteolitycznych, wszystkie są określane jako czynniki krzepnięcia i obejmuje ona kilka faz kończących się tworzeniem fibryny z hydrolizy fibrynogenu wskutek działania trombiny. Trombina jest wcześniej tworzona podczas proteolitycznej hydrolizy apoenzymu protrombiny. Proteoliza ta jest przeprowadzana przez aktywowany czynnik krzepnięcia X (FXa), który wiąże się do powierzchni aktywowanych płytek krwi i tylko w obecności jego kofaktora, aktywowanego czynnika krzepnięcia V (FVa) i jonów wapnia i jest w stanie hydrolizować protrombinę. Aktywacja czynnika krzepnięcia X (FX) może występować w dwóch różnych szlakach, szlaku wewnątrzpochodnym i szlaku zewnątrzpochodnym. [0004] Szlak wewnątrzpochodny składa się z serii reakcji, gdzie w każdej proenzym ulega hydrolizie dając jego aktywną formę proteazy. W każdym etapie nowo powstały enzym proteolityczny będzie katalizował aktywację kolejnego proenzymu dając jego formę aktywną. [000] W zewnątrzpochodnym szlaku krzepnięcia krwi czynnik tkankowy (TF) wystawiony na komórki przydanki naczynia w miejscu zmiany, wiąże się z krążącym czynnikiem krzepnięcia VII/aktywowanym czynnikiem krzepnięcia VII (FVII/FVIIa) tworząc kompleks TF::FVIIa i, w obecności wapnia, działa jako substrat, dzięki któremu ma miejsce aktywacja FX. Szlak zewnątrzpochodny jest obecnie uznawany za najbardziej istotny szlak krzepnięcia krwi i przyjmuje się, że w razie krwotoku w zmianie naczyniowej, krzepnięcie jest wyzwalana wskutek aktywacji szlaku zewnątrzpochodnego obejmując interakcję TF z jego ligandem FVII/FVIIa. [0006] Było szeroko przyjęte, że TF jest głównym elementem odpowiedzialnym za szybkość inicjowania krzepnięcia i jest wymagany do aktywacji FX, co z kolei rozpoczyna hydrolizę protrombiny. [0007] Donoszono o oczyszczaniu TF z różnych tkanek takich jak: mózg ludzki, mózg bydlęcy, łożysko ludzkie, mózg owczy i płuco. Jest szeroko przyjęte, że chociaż istnieją różnice w strukturze białka TF między gatunkami to nie ma różnic funkcjonalnych mierzonych za pomocą oznaczeń krzepnięcia w warunkach in vitro. [0008] Jest szeroko przyjęte, że dla wykazania aktywności biologicznej, TF musi być w warunkach in vitro powiązany z fosfolipidami. Wykazano, że usunięcie fosfolipidowego składnika TF, na przykład przez użycie fosfolipazy, powoduje utratę jego aktywności biologicznej w warunkach in vitro.

2 1 2 3 4 0 [0009] Mikropęcherzyki zawierające TF były wcześniej uzyskiwane przez włączanie oczyszczonego TF, które może być rekombinowanym TF, do syntetycznych pęcherzyków fosfolipidowych (patrz WO9848283, WO0349, US0608824, US060469, Bach R et al., (1986) Biochemistry, American Chemical Society 2:07, Bach R et al., (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87:699 6999 oraz Brucato et al., (02), Protein Expression and Purification 26:386 393). [00] WO08080989 opisuje pochodzące z drożdży mikropęcherzyki zawierające czynnik tkankowy zawierające błonę drożdżową oraz białko czynnika tkankowego oraz ich zastosowanie jako środków prozakrzepowych w leczeniu krwotoków u pacjenta. [0011] WO0600467 opisuje ekspresję czynnika tkankowego w komórkach roślinnych, surowe ekstrakty uzyskane z roślin eksprymujących TF i sztucznych pęcherzyków zawierających rekombinowany TF uzyskany z komórek roślinnych. [0012] EP193902 opisuje ekspresję czynnika tkankowego w komórkach owadów oraz ponownie lipidowany TF, który zawiera rekombinowany TF eksprymowany w komórkach owadów. [0013] Jednak w dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe preparaty prozakrzepowe oparte na TF. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0014] W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu przygotowywania mikropęcherzyków z TF mającego aktywność prozakrzepową, która obejmuje (i) eksprymowanie TF lub jego wariantu mającego aktywność prozakrzepową w komórce eukariotycznej, (ii) odzyskiwanie mikropęcherzyków zawierających TF z komórek z etapu (i) oraz (iii) zetknięcie pęcherzyków uzyskanych w etapie (ii) z ujemnie naładowanym fosfolipidem bez detergentów w warunkach odpowiednich do włączania fosfolipidu do pęcherzyków, gdzie mikropęcherzyki są tworzone przez błony lipidowe lub ich fragmenty z komórek eukariotycznych. [001] W innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyka zawierającego TF uzyskanego przy użyciu sposobu według wynalazku. [0016] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej mikropęcherzyk zawierający TF według wynalazku oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. [0017] W innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej (i) mikropęcherzyk uzyskany sposobem według wynalazku, (ii) przynajmniej promotor krzepnięcia oraz (iii) skuteczny farmaceutycznie nośnik [0018] W innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyka zawierającego TF według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do stosowania jako lek. [0019] W innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyka zawierającego TF według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do stosowania w leczeniu krwotoku, do ułatwiania gojenia ran lub do leczenia choroby związanej z angiogenezą. [00] W innym aspekcie wynalazek dotyczy stosowania mikropęcherzyka zawierającego TF według wynalazku do oznaczania czasu protrombinowego w próbce. [0021] W innym aspekcie wynalazek dotyczy zestawu do oznaczania czynnika terapii środkiem przeciw krzepliwości zawierającym mikropęcherzyki według wynalazku. KRÓTKI OPIS FIGUR [0022] Fig. 1 Ekspresja rtf przez ekstrakty TT-173. Analizy Western-blot ekstraktów z oczyszczonego TT-173 (MFR 0.1) z czterech niezależnych filtracji przepływu

3 1 2 3 4 0 stycznego. Blot poddano reakcji z oczyszczonym ludzkim przeciwciałem mysim (BD Biosciences Pharmingen). Markery masy cząsteczkowej w kda przedstawiono po lewej stronie figury. Fig. 2. Aktywność prozakrzepowa TT-173 po inkubacji z PS. A.- Dla zbadania wpływu PS na aktywność biologiczną TT-173, PS (0,1 mm) dodano do TT-173 (1 ml) i wymieszany roztwór utrzymywano w temperaturze pokojowej podczas doświadczenia. W różnych punktach czasowych przedstawionych na figurze, jedna porcja mieszaniny ( µl) była dodawana do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego. Natychmiast dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru (Stago). Doświadczenie zatrzymywano po 0 sekundach (zlewane osocze od dawców). B.- Wyniki uzyskane w części A przedstawiono także w jednostkach/ml. 1 jednostka jest definiowana jako ilość TT-173 wymagana do krzepnięcia prawidłowego zlewanego osocza w sekundach w standardowym oznaczeniu koagulometrycznym (1 µl osocza, µl chlorku wapnia (0 mm) i µl produktu). Fig. 3. Aktywność prozakrzepowa TT-173 lub lipidowanego rtf po inkubacji z różnymi stężeniami PS. Dla zbadania wpływu PS na aktywność biologiczną TT- 173 lub ponownie lipidowanego rtf, PS (w stężeniach podanych na figurze) dodawano do TT-173 (1 ml) lub ponownie lipidowanego rtf. Oba wymieszane roztwory utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po tym czasie jedna porcja każdej mieszaniny ( µl) była dodawana do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru (Stago). Doświadczenie zatrzymywano po 0 sekundach (zlewane osocze od dawców). Uzyskane wyniki przedstawiono jako jednostki/ml. Fig. 4. Aktywność prozakrzepowa rtf po zamknięciu w odpowiednich pęcherzykach fosfolipidowych. Dostępny w handlu oczyszczony rtf poddano ponownej lipidacji do pęcherzyków zawierających fosfatydylocholinę/fosfatydyloserynę (PC/PS) zgodnie ze standardowym sposobem opisanym przez Mimms et al. (Biochemistry, 833. 1981). W skrócie, 0 ng of rtf (American Diagnostica Inc. Stanford, CT, USA) inkubowano z: PC/PS (Sigma Aldrich Inc, Saint Louis, MO, USA) we wskazanych proporcjach PC:PS (0:0, 9:, 90:, 80:, 70:) (stężenie końcowe 2,6 mm) i detergentem (N-oktylo-β- D-galaktopiranozyd, stężenie końcowe mm). Mieszaninę homogenizowano i długo dializowano (przez 48 godzin z kilkoma zmianami buforu). Dzięki tej procedurze detergent był powoli usuwany i spontanicznie powstawały micele lipidu zawierające rtf. Po tej procedurze ponownej lipidacji micele zawierające rtf testowano pod kątem aktywności prozakrzepowej (niebieskie paski). Równolegle różne micele zawierające rtf inkubowano przez 2 godziny z PS w stężeniu końcowym 0,1 mm. Po tym czasie micele zawierające dodatkowy PS także badano pod kątem aktywności prozakrzepowej. Analizy koagulometryczne przeprowadzono w następujący sposób: Porcje ( µl) ponownie lipidowanego rtf z PC/PS były dodawane do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru (Diagnostica Stago, Inc. NJ, USA). Fig.. Wpływ dodawania PS na różne nośniki zawierające rtf. Dwie porcje (po 2 ml) z i) ponownie lipidowanym rtf w stosunku stężeń PC:PS wynoszącym 80:, ii) ponownie lipidowanym rtf w stosunku stężeń PC:PS wynoszącym 70: lub iii) nośnikami TT-173 izolowanymi z rekombinowanych drożdży

4 1 2 3 4 0 eksprymujących TF przygotowywano w temperaturze 4 C. PS w stężeniu 0,1 mm dodawano do jednej porcji każdego pęcherzyka zawierającego rtf i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. W tym czasie drugą porcję przechowywano w temperaturze 4 C. Następnie obie porcje z każdego pęcherzyka zawierającego rtf badano pod kątem aktywności prozakrzepowej zgodnie z opisem w legendzie fig. 1. Fig. 6. Aktywność prozakrzepowa ponownie lipidowanego rtf po inkubacji z PS i różnymi stężeniami TT-0. Porcje ( µl) ponownie lipidowanego rtf (0,3 µg/ml) inkubowanego przez 2 godziny z PS (0,1 mm) i różnymi stężeniami TT-0 (0, 0,03, 0,1, 0,3 i 0,36 mg/ml) były dodawane do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru. Fig. 7. Aktywność amidolityczna FVIIa. Dla ilościowej oceny aktywności enzymatycznej kompleksu katalitycznego TF:FVIIa, przeprowadzono standardowe oznaczenie chromogeniczne wykorzystujące substrat S-2238. Aktywność TF:FVIIa jest mierzona jako różnica w absorbancji (gęstości optycznej) między substratem S- 2238 i uzyskanym produktem przetwarzania p-nitroaniliny (pna). Szybkość powstawania pna jest proporcjonalna do aktywności enzymatycznej i można ją wygodnie oznaczać za pomocą fotometru. W tym doświadczeniu, różne stężenia TT-173, zawierające lub nie PS, były badane pod kątem zdolności oddziaływania z FVIIa i obecności S-2238 dla wytwarzania wykrywalnego pna. Fig. 8. Aktywność krzepnięcia TT-173 we krwi pełnej i wpływ PS. Badano zdolność TT 173 zawierającego lub nie PS (0,1 mm) do krzepnięcia próbek zdrowego osocza i krwi pełnej. A) Porcje ( µl) TT 173 i TT 173 inkubowanego przez 2 godziny z PS (stężenie końcowe 0,1 mm) były dodawane do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i za pomocą koagulometru określano czas krzepnięcia (w sekundach). (Pule osocza od dawców). B) Porcje (0 µl) TT-173 lub TT-173+PS (0,1 mm) zawierającego podaną na figurze ilość rtf dodawano do porcji (800 µl) krwi niedawno pobranej od zdrowych dawców. Czas krzepnięcia mierzono za pomocą chronometru od początku pobierania krwi, aż pojawił się stabilny i dobrze skonsolidowany skrzep. N=3. Fig. 9. Postulowany mechanizm działania TT-173 Fig.. Aktywność krzepnięcia TT-173 w osoczu ubogim w czynniki krzepnięcia VIII, IX lub XI. (A) Porcje ( µl) TT 173 lub TT 173+PS (0,1 mm) dodawano do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl prawidłowego osocza ubogopłytkowego, następnie bezpośrednio po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas koagulacji (w sekundach) za pomocą koagulometru. (Pule osocza od dawców). (B) Porcje ( µl) podobne do opisanych w części A dodawano do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl osocza pozbawionego czynnika VIII, czynnika IX lub czynnika XI. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru. (N=3). Fig. 11. Aktywność krzepnięcia TT-173 w osoczu ubogim w czynniki krzepnięcia V lub VII. Porcje ( µl) TT 173 lub TT 173+PS (0,1 mm) dodawano do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl osocza pozbawionego czynnika V lub czynnika VII. Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru. (N=3). Fig. 12. Aktywność krzepnięcia TT-173 w osoczu traktowanym warfaryną. Porcje ( µl) TT 173 lub TT 173+PS (0,1 mm) dodawano do ogrzanych kuwet zawierających 1 µl osocza pozbawionego czynnika V lub czynnika VII.

1 2 3 4 0 Natychmiast po tym dodawano µl chlorku wapnia (0 mm) i określano czas krzepnięcia (w sekundach) za pomocą koagulometru. (N=3). Fig. 13. Wpływ odtwarzania TT-173 na aktywność prozakrzepową. Gdy pęcherzyki TT-173 z lub bez dodanego PS rozrywano przez traktowania dializowalnym detergentem, a następnie odtwarzano w warunkach in vitro przez dializę, tracono około 0% początkowej aktywności (panel A). Gdy jednak podobne doświadczenie przeprowadzono wykorzystując pęcherzyki ponownie lipidowanego rtf, nie obserwowano wyraźnej różnicy przed i po dializie (panel B). Fig. 14. Wpływ dodawania PS na różne pęcherzyki zawierające rtf. Dwie porcje (po 2 ml) z i) ponownie lipidowanym rtf w stosunku stężeń PC:PS wynoszącym 80:, ii) ponownie lipidowanym rtf w stosunku stężeń PC:PS wynoszącym 70:, iii) pęcherzykami TT-173 izolowanymi z rekombinowanych drożdży eksprymujących TF lub iiii) pęcherzykami TT-173 izolowanymi z komórek owadów zakażonych rekombinowanym bakulowirusem przygotowywano w temperaturze 4 C. PS w stężeniu 0,1 mm dodawano do jednej porcji każdego pęcherzyka zawierającego rtf i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. W tym czasie drugą porcję przechowywano w temperaturze 4 C. Następnie obie porcje z każdego pęcherzyka zawierającego rtf badano pod kątem aktywności prozakrzepowej zgodnie z opisem w legendzie fig. 1. Fig. 1. Działanie PS zapewnia stabilność pęcherzykom TT-173. W tym badaniu użyto czterech porcji po ml z trzech niezależnych serii TT-173. Dwie porcje z każdej serii inkubowano z PS (0,1 mm) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i resztę porcji przechowywano w temperaturze 4 C. Po tym czasie µl z każdej spośród dwunastu próbek TT-173 użyto do określenia aktywności krzepnięcia (czas 0) po procedurze opisanej w legendzie fig. 1. Bezpośrednio po tym połowę porcji (3 TT-173-PS i 3 TT-173+PS, gdzie każda z nich odpowiadała jednej z trzech serii) utrzymywano w temperaturze 4 C przez resztę trwania doświadczenia, a pozostałe (3 TT-173 -PS i 3 TT-173+PS) utrzymywano w temperaturze C. W czasach wskazanych na figurze, µl z każdej porcji używano do określenia aktywności krzepnięcia w porcjach utrzymywanych w temperaturze 4 C (A) lub C (B). Wyniki wykreślono z odchyleniem standardowym. Przedstawiono także średnie minimalnej stabilności między różnymi partiami w temperaturach 4 C (C) i C (D). Fig. 16. Dodanie FVII, FVIIa, FX i FXa wzmacnia działanie prozakrzepowe TT-173. Do TT-173+PS (0,1 mm) dodano różne stężenia FVII ( nm i 60 nm), FVIIa ( nm i 60 nm), FX (00 nm i 00 nm) oraz FXa (00 nm). Porcje mieszanin TT-173+PS (0,1 mm)/fvii, TT-173+PS (0,1 mm)/fviia, TT-173+PS (0,1 mm)/fx i TT-173+PS (0,1 mm)/fxa sprawdzono pod kątem aktywności krzepnięcia w standardowym teście koagulometrycznym w stężeniu końcowym TF w osoczu wynoszącym 4 ng/ml. Jak pokazano, dodanie FVII, FVIIa i FX skraca czas krzepnięcia o około 2 s, a dodanie FXa skraca czas krzepnięcia o około 7 s. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0023] Twórcy stwierdzili, że dodanie dodatkowej fosfatydyloseryny (PS) bez detergentów do uzyskanych z komórek drożdży mikropęcherzyków zawierających TF i już zawierających PS, zaskakująco powoduje poprawę właściwości prozakrzepowych pęcherzyków oraz ich zwiększoną stabilność. Zwiększone właściwości prozakrzepowe można obserwować, na przykład w doświadczeniach przedstawionych w przykładach 2 i 3 wynalazku, gdzie wyraźnie pokazano, że dodanie fosfatydyloseryny do pochodzących z drożdży mikropęcherzyków zawierających TF daje pęcherzyki wykazujące zwiększone właściwości prozakrzepowe (skrócony czas krzepnięcia) w porównaniu z pęcherzykami, które nie miały styczności z fosfolipidem (patrz np. fig. 2 i Tabela 2). Bez ograniczania się jakąkolwiek teorią, uważa się, że PS oddziałuje z mikropęcherzykami zawierającycmi TF

6 1 2 3 4 0 dając pęcherzyki o zwiększonej możliwości rekrutowania czynników plazmatycznych zaangażowanych w tworzenie kompleksów zarówno protrombinazy jak i Xazy, co z kolei prowadzi do zwiększonego wytwarzania trombiny. Zwiększona stabilność pęcherzyków jest wykazana, na przykład w przykładzie 4 według wynalazku, gdzie wykazano, że pęcherzyki wstępnie traktowane PS wykazują zwiększoną stabilność w temperaturze zarówno C jak i 4 C. Sposób według wynalazku [0024] W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu przygotowywania mikropęcherzyków zawierających TF mających aktywność prozakrzepową, który obejmuje: (i) eksprymowanie TF lub jego wariantu mającego aktywność prozakrzepową w komórce eukariotycznej, (ii) odzyskiwanie mikropęcherzyków zawierających TF z komórek z etapie (i) oraz (iii) zetknięcie mikropęcherzyków uzyskanych w etapie (ii) z ujemnie naładowanym fosfolipidem (NCP) bez detergentów w warunkach odpowiednich do włączania fosfolipidu do mikropęcherzyków, gdzie mikropęcherzyki są tworzone przez błony lipidowe lub ich fragmenty z komórek eukariotycznych. [002] Stosowane tu określenie mikropęcherzyki zawierające TF dotyczy dowolnego mikropęcherzyka lipidowego, który zawiera TF zintegrowany w tym mikropęcherzyku lipidowym i który pochodzi z komórki eukariotycznej. Mikropęcherzyk lipidowy dotyczy małych i zamkniętych przedziałów, które zasadniczo składają się z mono- i dwuwarstw lipidowych. Wielkość mikropęcherzyków zawierających TF według wynalazku może różnić się we względnie szerokim zakresie, gdzie rozmiar jest równy lub mniejszy niż µm, zazwyczaj mniejszy lub równy 0, µm. W określonym przykładzie wykonania wielkość pochodzących z drożdży mikropęcherzyków zawierających TF według wynalazku waha się od do 0,01 µm. [0026] Mikropęcherzyki są tworzone przez błony lipidowe lub ich fragmenty z komórek eukariotycznych. Błony odnoszą się ogólnie do zorganizowanej warstwy grubości kilku cząsteczek (lipidów i białek) tworzącej granicę komórki (tj. błona komórkowa lub plazmatyczna) lub granice organelli wewnątrzkomórkowych. Zazwyczaj błona składa się z dwóch zorientowanych warstw lipidowych (tj. dwuwarstwy lipidowej), w której mogą być związane białka. Dwuwarstwa lipidowa, która jest podstawową strukturą błony komórkowej, jest zazwyczaj tworzona przez cząsteczki amfifilowe (np. fosfolipidy, kwasy tłuszczowe, itd.) w środowisku wodnym, każda cząsteczka jest ustawiana grupą hydrofilową na zewnątrz warstwy i grupą hydrofobową do wnętrza warstwy. [0027] Pierwszy etap sposób według wynalazku obejmuje ekspresję TF lub jego wariantu mającego aktywność prozakrzepową w komórce eukariotycznej. [0028] Komórka eukariotyczna w ramach wynalazku to dowolne komórki, które zawierają złożone struktury zamknięte w błonach jak jądro. Przykłady komórek eukariotycznych, które mogą być użyte w sposobie według wynalazku to komórki grzybów, komórki drożdży, komórki roślin i komórki zwierząt (jak komórki ssaków, komórki ryb, komórki gadów, komórki owadów, itd.). [0029] Stosowane tu określenie komórki drożdży obejmują dowolne drożdże aksosporogenne (Endomycetaceae), drożdże podstawczakogenne oraz drożdże należące do grzybów niedoskonałych (Blastomycetes). Ponieważ w przyszłości klasyfikacja drożdży może ulec zmianie, do celów wynalazku drożdże będą definiowane zgodnie z opisem Skinner, F. et al, (Biology and Activities of Yeast, Soc. App. Bacteriol. Symp. Series No. 9). Odpowiednie szczepy drożdży to bez ograniczeń dowolne gatunki drożdży Torula, drożdży piekarniczych, drożdży browarnianych, gatunki Saccharomyces takie jak S.cerevisiae, gatunki Schizosaccharomyce, gatunki Pichia jak Pichia pastoris, gatunki Candida, gatunki Hansenula jak Hansenula polymorpha oraz gatunki Klyuveromyces jak

7 1 2 3 4 0 Klyuveromyces lactis oraz różne szczepy z wyżej wymienionych gatunków drożdży jak szczep S. cerevisiae T73. Można także stosować mieszaniny dowolnych z tych gatunków i szczepów. [00] Stosowane tu określenie komórki roślin obejmuje komórki roślin, w tym między innymi glony, jednoliścienne, dwuliścienne, a zwłaszcza zboża (np. kukurydza, ryż, owiec, itd.), strączkowe (np. soja, itd.), krzyżowe (np. Arabidopsis thaliana, rzepak, itd.) lub psiankowate (np. ziemniak, pomidor, tytoń, itd.). Komórki roślinne obejmują zawiesiny hodowlane, zarodki, obszary merystemalne, tkankę kalusową, liście, korzenie, pędy, gametofity, sporofity, pyłek, nasiona i mikrospory. Znawca będzie rozumiał, że komórka roślinna może być częścią rośliny lub całą rośliną dlatego należy określać ją mianem systemu gospodarza roślinnego. System gospodarza roślinnego lub izolowane komórki roślinne mogą być na różnym stadium dojrzałości. System gospodarza roślinnego dotyczy także dowolnego klonu takiej rośliny, nasiona, potomstwa samozapyleniowego lub hybrydowego, propaguli powstałej na drodze płciowej lub bezpłciowej i ich potomków takich jak sadzonki lub nasiona. [0031] Stosowane tu określenie komórka zwierzęca obejmuje dowolną komórkę zwierzęcą. Komórki zwierzęce obejmują komórki ssaków, komórki ryb, komórki gadów, komórki owadów, itd. Komórki zwierzęce można uzyskać z dowolnych tkanek zwierzęcych (pierwotne hodowle komórek) lub mogą być komórkami unieśmiertelnionymi. Komórki unieśmiertelnione można uzyskać z tkanek nowotworowych lub unieśmiertelnić stosując techniki znane znawcy jak zakażenie wirusami (np. EP12124) lub fuzja komórek prawidłowych z unieśmiertelnioną linią komórkową. [0032] Komórki owadów to między innymi komórki Sf9, komórki SF21, komórki SF+, komórki Hi-Five lub komórki larw owadów. [0033] Ssaki, z których można uzyskać komórki to szczury, myszy, małpy, ludzie, itd. Komórki ssaków odpowiednie dla wynalazku to linie komórek nabłonka, linie komórek kostniakomięsaka, linie komórek nerwiaka, nowotwory nabłonkowe, komórki glejowe, linie komórek wątroby, komórki CHO (jajnika chomika chińskiego), komórki COS, komórki BHK, komórki HeLa, komórki 911, komórki AT80, komórki A49, komórki 293 lub komórki PER.C6, ludzkie komórki ECC NTERA-2, komórki D3 linii mesc, komórki NIH3T3, komórki REH oraz komórki MCF-7. [0034] Stosowane tu określenia czynnik tkankowy lub TF znane także jako tromboplastyna, czynnik tkankowy płytek krwi, CD 142 lub czynnik krzepnięcia III odnoszą się do integralnej glikoproteiny błonowej, która jest szeroko rozpowszechniona w królestwie zwierząt, występuje w tkance podśródbłonkowej, płytkach krwi i leukocytach i jest niezbędna do rozpoczęcia tworzenia trombiny z zymogenu protrombiny. Odpowiednie polipeptydy TF do stosowania według wynalazku to natywne lub typu dzikiego (wt) TF dowolnych gatunków zwierząt, w tym ludzi. Przykładowe białka TF, które można użyć według wynalazku to TF człowieka (numer dostępowy UniProtKB P13726), TF myszy (numer dostępowy UniProtKB P32), TF szczura (numer dostępowy UniProtKB P4233), TF świni (numer dostępowy NCBI Prot NP _99890), TF wołu (numer dostępowy NCBI Prot AAB7), TF psa (numer dostępowy NCBI Prot BAD9868), TF świnki morskiej (numer dostępowy NCBI Prot AAF3623) oraz białka TF różnych organizmów. [003] Ponieważ natywne TF zawierają kilka miejsc glikozylacji, warianty TF wykazujące różny stopień glikozylacji można uzyskać przez eksprymowanie TF u gospodarzy zdolnych do przeprowadzania reakcji N-glikozylacji. Dojrzałe TF zawierają trzy potencjalne miejsca glikozylacji połączone atomem N mające konsensusową sekwencję Asn-Xaa-Ser/Thr zlokalizowane przy Asn11 (sekwencja Asn11-Leu12-Thr13), Asn124 (sekwencja Asn124-Val12-Thr126) i Asn137 (sekwencja Asn137-Asn138-Thr139). Dlatego cząsteczki TF do stosowania według wynalazku zawierają warianty TF mające

8 1 2 3 4 0 zmienny stopień miejsc glikozylacji połączonych atomem N w jednym lub więcej miejscach N-glikozylacji. U drożdży glikozylacja zazwyczaj obejmuje wewnętrzny rdzeń około dziesięciu reszt mannozy połączonych z asparaginą przez dwie reszty GlcNAc i rozgałęziony zewnętrzny łańcuch 0 0 reszt mannozy. Dlatego N-połączona glikozylacja może potencjalnie dodać nawet 0 reszt mannozy i zwiększyć masę cząsteczkową o około 60 kda. Ponadto jest możliwe, że kilka reszt mannozy może być przyłączonych do różnych (ponad 2) miejsc glikozylacji połączonych atomem O. W określonym przykładzie wykonania pochodzący z drożdży mikropęcherzyk zawierający TF według wynalazku zawiera glikozylowane białko TF. Stosowane tu określenie glikozylowany oznacza dowolny stopień glikozylacji. [0036] Określenie wariant TF mający aktywność prozakrzepową dotyczy związków wykazujących taką samą aktywność biologiczną jak TF i powstających wskutek insercji, delecji lub substytucji jednego lub więcej reszt aminokwasowych. Odpowiednie oznaczenia funkcjonalne, których można użyć do oceny, czy dany polipeptyd jest funkcjonalnie równoważnym wariantem TF to oznaczenia oparte na oznaczaniu zdolności wariantu TF do swoistego wiązania FVIIa lub oparte na oznaczaniu w warunkach in vitro czasu krzepnięcia w osoczu lub krwi pełnej, przez oznaczenie w warunkach in vivo w kilku zwierzęcych modelach krwotoku lub oznaczenie in vivo w modelu zwierzęcym krwotoku śmiertelnego. Procedury przeprowadzania tych oznaczeń zostały opisane w dziedzinie i są podsumowane w przykładach wynalazku (Część Sposoby ) oraz w zgłoszeniuwo08080989. [0037] Warianty według wynalazku zawierają sekwencje aminokwasowe, które są w przynajmniej 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 96% podobne lub identyczne do wyżej wymienionych natywnych cząsteczek TF. Ponieważ znane w dziedzinie podobieństwo między dwoma białkami jest określane przez porównanie sekwencji aminokwasowej i ich konserwatywne aminokwasy zastępują jedno białko sekwencją drugiego białka. Stopień identyczności między dwoma białkami jest określany przy użyciu algorytmów komputerowych i sposobów, które są szeroko znane znawcom. Identyczność między dwoma sekwencjami aminokwasowymi jest korzystnie określana za pomocą algorytmu BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 21: 3 4 (1990)]. [0038] Białko TF ma dobrze zdefiniowaną strukturę domenową, która zawiera (1) peptyd sygnałowy lub region z 32 aminokwasową sekwencją liderową, która jest przetwarzana potranslacyjnie, gdy białko jest przetwarzane z niedojrzałego do dojrzałego; (2) N- glikozylowaną hydrofilową domenę zewnątrzkomórkową zawierającą około 219 końcowych aminokwasów; (3) fragment około 23 aminokwasów, głównie hydrofobowych, które jak się sądzi stanowią aminokwasy domeny transbłonowej; oraz (4) 21- aminokwasowy koniec karboksylowy, który jak się uważa jest aminokwasem tworzącym część fragmentu cytoplazmatycznego białka. Struktura domenowa białka htf umożliwia wytwarzanie na przykład domeny zewnątrzkomórkowej białka lub jego fragmentów funkcjonalnych. [0039] W określonym przykładzie wykonania fragment TF mający aktywność prozakrzepową zawiera dojrzałe białko TF. Stosowane tu określenie dojrzała TF dotyczy białka TF, którego sekwencja aminokwasowa jest pozbawiona peptydu sygnałowego. W korzystnym przykładzie wykonania dojrzałe białko TF zawiera ludzkie dojrzałe białko TF. Ponadto w określonym przykładzie wykonania ludzkie dojrzałe białko TF ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1. [00] Fragment białka TF mający aktywność prozakrzepową może być glikozylowany, częściowo glikozylowany lub nieglikozylowany. Dlatego, w określonym przykładzie wykonania, mikropęcherzyk lipidowy według wynalazku zawierający TF zawiera nieglikozylowany fragment białka TF mający aktywność prozakrzepową, natomiast w innym określonym przykładzie wykonania pochodzący z drożdży mikropęcherzyk

9 1 2 3 4 0 zawierający TF według wynalazku zawiera glikozylowany fragment białka TF mającego aktywność prozakrzepową. Jak wspomniano wyżej, określenie glikozylowany oznacza dowolny stopień glikozylacji. W korzystnym przykładzie wykonania TF lub jego funkcjonalny fragment mający aktywność prozakrzepową zawiera przynajmniej jedno niefunkcjonalne miejsce N-glikozylacji. [0041] W korzystnym przykładzie wykonania miejsce lub miejsca N-glikozylacji odpowiadają miejscom N-glikozylacji NLT w pozycjach 11 13, NVT w pozycjach 124 126 lub NNT w pozycjach 137 139 w dojrzałym ludzkim TF. W korzystniejszym przykładzie wykonania TF zawiera jedną lub więcej substytucji reszt Asn na reszty, które nie są akceptorami N-glikozylacji. W jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania, wariant TF zawiera jedną lub więcej mutacji Asn na Ala w resztach Asn w pozycjach odpowiadających pozycjom 11, 124 lub 137 w dojrzałym ludzkim TF. [0042] Glikozylacja będzie różnić się w zależności od układu ekspresyjnego używanego do produkcji pęcherzyków lipidowych zawierających TF. Dlatego wynalazek zapewnia rekombinowane białko czynnika tkankowego ssaków, które zawiera przynajmniej jeden glikan swoisty dla roślin, glikan swoisty dla drożdży lub glikan swoisty dla zwierząt. [0043] Ponadto, jak w przypadku białka TF, fragment białka TF mającego aktywność prozakrzepową użyty do wykonania wynalazku może być członkiem białka fuzyjnego, gdzie białko fuzyjne zawiera pierwszy region zawierający jego fragment białka TF mającego aktywność prozakrzepową związany z drugim regionem zawierającym inny peptyd lub białko. Drugi region może być związany z regionem końca aminowego fragmentu białka TF lub alternatywnie drugi region może być związany z regionem końca karboksylowego fragmentu białka TF. Zarówno pierwszy jak i drugi region mogą być związane bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera polipeptydowego między regionami pierwszym i drugim. [0044] W określonym przykładzie wykonania białko fuzyjne zawiera fragment białka TF mający aktywność prozakrzepową i znacznik związany z domeną końca C lub końca N fragmentu białka TF. Znacznik to ogólnie peptyd lub sekwencja aminokwasowa, którą można użyć do izolacji lub oczyszczania białka fuzyjnego. Ilustracyjne, nieograniczające przykłady znaczników odpowiednich do wytwarzania tego białka fuzyjnego to wymienione wcześniej w związku z białkiem fuzyjnym, gdzie pierwszy region był białkiem TF. W określonym przykładzie wykonania znacznik to znacznik His związany z domeną końca C białka TF lub jego fragmentem mającym aktywność prozakrzepową. W innym przykładzie wykonania znacznik to znacznik His związany z domeną końca N białka TF lub jego fragmentem mającym aktywność prozakrzepową. W określonym przykładzie wykonania białko fuzyjne zawiera dojrzałe białko TF, korzystnie ludzkie dojrzałe białko TF. To białko fuzyjne także ma aktywność prozakrzepową, którą można oznaczyć jak wspomniano wcześniej np. dowolnym oznaczeniem krzepnięcia wymienionym w Przykładzie 2. [004] Ponadto białko TF może tworzyć białko fuzyjne, gdzie białko fuzyjne zawiera pierwszy region zawierający białko TF połączone z drugim regionem zawierającym inny peptyd lub białko. Drugi region może być związany z regionem końca aminowego białka TF lub alternatywnie drugi region może być związany z regionem końca karboksylowego białka TF. Zarówno pierwszy jak i drugi region mogą być związane ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera polipeptydowego między regionami pierwszym i drugim. [0046] W określonym przykładzie wykonania białko fuzyjne zawiera białko TF i znacznik, zazwyczaj znacznik peptydowy, związany z domeną końca C lub końca N białka TF. Znacznik to ogólnie peptyd lub sekwencja aminokwasowa, której można użyć do izolacji lub oczyszczania białka fuzyjnego. Dlatego znacznik jest zdolny do związania jednego lub więcej ligandów takich jak na przykład jeden lub więcej ligandów matrycy powinowactwa takiej jak nośnik chromatograficzny lub kulki o wysokim powinowactwie. Przykład znacznika to znacznik histydynowy (znacznik His lub HT) taki jak znacznik zawierający 6

1 2 3 4 0 reszt histydyny (His6 lub H6), który może związać się z wysokim powinowactwem z kolumną niklową (Ni2+) lub kobaltową (Co2+). Znacznik His, jak przedstawiono w Przykładzie 1 (fig. 4), ma pożądaną cechę polegającą na możliwości związania jego ligandów w warunkach, które są denaturujące dla większości białek i niszczące większość oddziaływań białko-białko. Dlatego może być ono użyte do usuwania białka przynęty oznaczonego H6 po zniszczeniu oddziaływań białko-białko, w których bierze udział przynęta. [0047] Dodatkowe ilustracyjne, nieograniczające przykłady znaczników użytecznych w izolacji lub oczyszczaniu białka fuzyjnego to znacznik Arg, znacznik FLAG, znacznik Strep, epitop zdolny do rozpoznawania przez przeciwciało jak znacznik c-myc (rozpoznawany przez przeciwciało anty-c-myc), znacznik SBP, znacznik S, peptyd wiążący kalmodulinę, domena wiążąca celulozę, domena wiążąca chitynę, znacznik S- transferazy glutationu, białko wiążące maltozę, NusA, TrxA, DsbA, znacznik Avi, itd. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (03), 60:23-2), sekwencja aminokwasowa taka jak Ala-His-Gly-His-Arg-Pro (SEQ ID NO:2); Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His- Leu-Val-Ile-His-Ser (SEQ ID NO:3); Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys (SEQ ID NO:4); β- galaktozydaza i podobne. [0048] W określonym przykładzie wykonania znacznik to znacznik His związany z domeną końca C białka TF. W innym przykładzie wykonania znacznik to znacznik His związany z domeną końca N białka TF. [0049] W określonym przykładzie wykonania białko fuzyjne zawiera ludzkie TF pozbawione sekwencji sygnałowej lub jego wariant mający aktywność prozakrzepową, który ma mutację N124A w miejscu glikozylacji i znacznik heksahistydyny na końcu C i jest określony przez (SEQ ID NO: ) [000] Białko fuzyjne może być uzyskane sposobami konwencjonalnymi np. Przez ekspresję genu sekwencji nukleotydowej kodującej białko fuzyjne w odpowiedniej komórce drożdży. Ewentualny znacznik może być użyty, w razie potrzeby, do izolacji lub oczyszczania białka fuzyjnego. [001] W innym określonym przykładzie wykonania pierwszy etap sposobu według wynalazku obejmuje ekspresję w komórce eukariotycznej fragmentu TF mającego aktywność prozakrzepową. Według wynalazku, część białka TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową jest zintegrowany w błonie lipidowej. Normalnie część ta zawiera region lipofilowy białka lub fragmentu (tj. domena centralna TF), natomiast jego regiony hydrofilowe (tj. region końca aminowego i region końca karboksylowego białka TF) stykają się z egzo- lub endoplazmatyczną stroną błony. Informacje dotyczące regionów lipofilowych lub hydrofilowych białka TF można uzyskać z WO08080989. W określonym przykładzie wykonania, N-końcowa domena białka TF lub jego fragmentu mającego aktywność prozakrzepową styka się z egzoplazmatyczną stroną błony, natomiast w innym określonym przykładzie wykonania N-końcowa domena białka TF lub jego fragmentu mającego aktywność prozakrzepową styka się z endoplazmatyczną stroną błony. [002] Sposób ekspresji TF lub jego wariantu zależy od zastosowanej komórki eukariotycznej. Ogólnie komórka eukariotyczna jest transformowana za pomocą wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową, związany funkcjonalnie z funkcjonalnym promotorem w dowolnej komórce, która może być użyta według wynalazku: komórce grzybowej, drożdżowej, roślinnej lub zwierzęcej (ryba, gad, ssak, owad, itd.). [003] cdna kodujące białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową może być poddany amplifikacji za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem biblioteki cdna jako szablonu i odpowiednich primerów. Przykład 1 ujawnia amplifikację cdna kodującego dojrzałe białko htf z 18 dodatkowymi nukleotydami (kodującymi sześć histydyn) na końcu 3'.

11 1 2 3 4 0 [004] Stosowany tu termin wektor dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona. Stosowane tu określenie drożdżowy wektor ekspresyjny dotyczy konstruktów ekspresyjnych DNA np. odcinków kwasu nukleinowego, plazmidów, kosmidów, fagów, wirusów lub cząstek wirusowych zdolnych do syntetyzowania przedmiotowych białek kodowanych przez ich odpowiednie geny rekombinowane (tj. białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową) przenoszone przez wektor w drożdżach. Alternatywnie odcinki kwasu nukleinowego mogą być używany do tworzenia transgenicznych komórek drożdży wykorzystując rekombinację niekierunkową lub homologiczną, gdzie interesujący gen lub geny są stabilnie integrowane z genomem drożdży. Normalnie drożdżowy wektor ekspresyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową połączony funkcjonalnie z promotorem, który jest funkcjonalny w komórkach drożdży (tj. funkcjonalny promotor drożdżowy). Wektory do stosowania według wynalazku to na przykład wektory zdolne do autonomicznej replikacji i (lub) eksprymowania kwasów nukleinowych, z którymi są połączone w komórkach drożdży. W opisie określenia plazmid oraz wektor są używane zamiennie, ponieważ plazmid jest najpowszechniej stosowaną formą wektora. Ponadto wynalazek ma zawierać takie inne formy wektorów ekspresyjnych, które pełnią równoważne funkcje i które następnie stały się znane w dziedzinie. Drożdżowy wektor ekspresyjny może być drożdżowym episomalnym wektorem ekspresyjnym lub drożdżowym integralnym wektorem ekspresyjnym i mogą być one uzyskane technikami konwencjonalnymi znanymi znawcy. [00] Dlatego w przykładzie wykonania drożdżowy wektor ekspresyjny to drożdżowy episomalny wektor ekspresyjny. Stosowane tu określenie drożdżowy episomalny wektor ekspresyjny dotyczy wektora ekspresyjnego, który jest utrzymywany jako pozachromosomalna cząsteczka DNA w cytoplazmie drożdży. W określonym przykładzie wykonania drożdżowy episomalny wektor ekspresyjny, oprócz sekwencji nukleotydowej kodującej białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową połączony funkcjonalnie z funkcjonalnym promotorem drożdżowym zawiera także: (i) drożdżowy gen selekcji; (ii) drożdżowe miejsce początku replikacji; (iii) bakteryjny gen selekcji; oraz (iv) drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji. Korzystnie drożdżowy episomalny wektor ekspresyjny zawiera także unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania wybranego genu (białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową) pod kontrolą funkcjonalnego promotora drożdżowego, za którym znajduje się drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji. [006] Praktycznie dowolny funkcjonalny promotor drożdżowy, drożdżowy gen selekcji, drożdżowe miejsce początku replikacji, bakteryjny gen selekcji, drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji i miejsce restrykcyjne do klonowania można użyć do wytwarzania drożdżowego episomalnego wektora ekspresyjnego; niemniej jednak w określonym przykładzie wykonania jako funkcjonalny promotor drożdżowy stosowany jest promotor dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanu (pgpd); w innym określonym przykładzie wykonania jako drożdżowy gen selekcji stosowany jest gen URA3 (URA3); w innym określonym przykładzie wykonania jako miejsce początku replikacji stosowane jest drożdżowe miejsce początku replikacji 2 mikronów (2µ); w innym określonym przykładzie wykonania jako bakteryjny gen selekcji stosowany jest gen ampicyliny (Amp) i w innym określonym przykładzie wykonania jako swoisty drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji stosowany jest sygnał zakończenia transkrypcji kinazy fosfoglicerynianu (PGKt). Dlatego w określonym przykładzie wykonania (Przykład 1-2), drożdżowy episomalny wektor ekspresyjny zawiera (i) gen URA3; (ii) gen Amp do selekcjonowania i propagacji wektora w E. coli; (iii) drożdżowe miejsce replikacji 2µ; (iv) the pgpd; (v) swoisty drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji PGKt oraz (vi) unikalne miejsce restrykcyjne BamHI, które umożliwia klonowanie wybranych genów pod kontrolą pgpd, a następnie sekwencję PGKt. W innym przykładzie wykonania drożdżowy wektor

12 1 2 3 4 0 ekspresyjny to drożdżowy zintegrowany wektor ekspresyjny. Stosowane tu określenie drożdżowy zintegrowany wektor ekspresyjny dotyczy wektora, który jest zdolny do integracji z genomem drożdży. W określonym przykładzie wykonania drożdżowy zintegrowany wektor ekspresyjny zawiera: (i) bakteryjny gen selekcji oraz (ii) kasetę ekspresyjną wstawioną do drożdżowego genu selekcji, gdzie kaseta ekspresyjna zawiera dodatkowo funkcjonalny promotor drożdżowy, drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji oraz unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania wyselekcjonowanego genu (białka TF lub jego fragmentu mającego aktywność prozakrzepową). [007] Praktycznie dowolny bakteryjny gen selekcyjny, kaseta ekspresyjna wstawiona w drożdżowy gen selekcyjny, funkcjonalny promotor drożdżowy, drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji i unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania wyselekcjonowanego genu można użyć do wytwarzania drożdżowego zintegrowanego wektora ekspresyjnego; niemniej jednak w określonym przykładzie wykonania jako bakteryjny gen selekcyjny jest stosowany gen oporności na ampicylinę (Amp); w innym określonym przykładzie wykonania jako kaseta ekspresyjna stosowana jest kaseta ekspresyjna pgpd-bamhi-pgkt wstawiona w centralnym regionie genu URA3 zawierająca funkcjonalny promotor drożdżowy (pgpd), drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji (PGKt) oraz unikalne miejsce restrykcyjne (BamHI) do klonowania wyselekcjonowanego genu w centralnym regionie genu URA3. [008] W ramach wynalazku może być użyta praktycznie dowolna komórka drożdży podatna na transformację drożdżowym wektorem ekspresyjnym zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową połączony funkcjonalnie z promotorem. Transformacja komórki drożdżowej drożdżowym wektorem ekspresyjnym może być przeprowadzona sposobami konwencjonalnymi przez znawcę (Sambrook et al., 01, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). [009] W określonym przykładzie wykonania drożdże to drożdże nie kłaczkujące (tj. komórki drożdży, które w procesie fermentacji nie tworzą kłaczków (nie agregują)). Korzystnie komórka drożdży to komórka drożdży GRAS. Ilustracyjne, nieograniczające przykłady komórek drożdży, które można stosować w sposobie według wynalazku to tak zwane gatunki drożdży alkoholowe (drożdży stosowanych do wytwarzania alkoholu), które wytwarzają alkohol, gazowy kwas węglowy, drożdże piekarniane i podobne metabolizujące ciekły materiał piwowarski. Szczególnie korzystne są wybrane z S.cerevisiae. Przykłady takich drożdży alkoholowych to komórki drożdży piwowarskich, komórki drożdży winiarskich oraz komórki drożdży sake. W korzystnym przykładzie wykonania komórki drożdży to komórki drożdży winiarskich takie jak S. cerevisae T73 ura3- (Przykład 1). [0060] Stosowane tu określenie roślinny wektor ekspresyjny dotyczy konstruktów ekspresyjnych DNA np. odcinków kwasu nukleinowego, plazmidów, kosmidów, fagów, wirusów lub cząstek wirusowych zdolnych do syntetyzowania przedmiotowych białek kodowanych przez ich odpowiednie geny rekombinowane (tj. białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową) przenoszony przez wektor w roślinach. Alternatywnie odcinki kwasu nukleinowego mogą być używany do tworzenia transgenicznych komórek roślinnych wykorzystując rekombinację niekierunkową lub homologiczną, gdzie interesujący gen lub geny są stabilnie integrowane z genomem rośliny. Normalnie roślinny wektor ekspresyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową połączony funkcjonalnie z promotorem, który jest funkcjonalny w komórkach roślin (tj. funkcjonalny promotor roślinny). Funkcjonalne promotory roślinne, które można stosować z wynalazku można wybrać z grupy składającej się z syntetazy sacharozy 1 kukurydzy, dehydrogenazy alkoholowej 1 kukurydzy, kompleksu zbierającego światło kukurydzy, białka szoku cieplnego kukurydzy, małej podjednostki karboksylazy RuBP grochu, plazmidu Ti syntazy mannopiny, plazmidu Ti syntazy nopaliny, izomerazy chalkonu petunii, bogatego w glicynę białko 1 fasoli,

13 1 2 3 4 0 patatyny ziemniaka, lektyny, CaMV 3S i małej podjednostki S-E9 RuBP promotora karboksylazy. Transformacja układów gospodarzy roślinnych można przeprowadzić wykorzystując sposoby konwencjonalne. Przegląd genetycznego transferu do roślin można znaleźć w podręczniku zatytułowanym Ingenieria genética and transferencia génica, Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), zwłaszcza Rozdział 9 Transferencia génica a plantas, strony 283 316. [0061] Wektory do stosowania według wynalazku to na przykład wektory zdolne do autonomicznej replikacji i (lub) eksprymowania kwasów nukleinowych, z którymi są połączone w komórkach drożdży. W przedstawianej specyfikacji określenia plazmid oraz wektor są używane zamiennie, ponieważ plazmid jest najpowszechniej stosowaną formą wektora. Ponadto wynalazek ma zawierać takie inne formy wektorów ekspresyjnych, które pełnią równoważne funkcje i które następnie stały się znane w dziedzinie. Drożdżowy wektor ekspresyjny może być roślinnym episomalnym wektorem ekspresyjnym lub roślinnym integralnym wektorem ekspresyjnym i mogą być one uzyskane technikami konwencjonalnymi znanymi znawcy. Do wytwarzania roślinnego episomalnego wektora ekspresyjnego można użyć praktycznie każdego funkcjonalnego promotora roślinnego, roślinnego genu selekcyjnego, roślinnego miejsca początku replikacji, bakteryjnego genu selekcyjnego, roślinnego sygnału zakończenia transkrypcji i miejsca restrykcyjnego do klonowania. [0062] Opracowano dużą liczbę określonych roślinnych układów produkcyjnych. Obejmują one eksprymowanie białka w ciałach oleistych (Rooijen et al., (199) Plant Physiology 9:133 61; Liu et al., (1997) Molecular Breeding 3:463 70), przez wydzielanie kłączami (Borisjuk et al., (1999) Nature Biotechnology 17:466 69), w nasionach (Hood et al., (1997) Molecular Breeding 3:291 6; Hood et al., (1999) In Chemicals via Higher Plant Bioengineering (ed. Shahidi et al.) Plenum Publishing Corp. s. 127-148; Kusnadi et al., (1997) Biotechnology and Bioengineering 6:473-84; Kusnadi et al., (1998) Biotechnology and Bioengineering 60:44-2; Kusnadi et al., (1998) Biotechnology Progress 14:149-; Witcher et al., (1998) Molecular Breeding 4:1-12), jako epitopy na powierzchni wirusa (Verch et al., (1998) J. Immunological Methods 2:69-7; Brennan et al., (1999) J. Virology 73:9-38; Brennan et al., (1999) Microbiology 14:211-) i przez stabilną ekspresję białek w bulwach ziemniaka (Arakawa et al., (1997) Transgenic Research 6:3-13; Arakawa et al., (1998) Nature Biotechnology 16:292-97; Tacket et al., (1998) Nature Medicine 4:607-09). Rekombinowane białka mogą być także kierowane do nasion, chloroplastów lub wydzielane dla identyfikacji lokalizacji, która daje najwyższy poziom akumulacji białka. Każdy z nich może być przystosowany do eksprymowania czynnika tkankowego lub jego fragmentu w odpowiednim gospodarzu roślinnym. [0063] Donoszono także o dodatkowych ogólnych sposobach eksprymowania białek w roślinach. Patrz PCT/US02/23624 to Bascomb, N. et al.; i PCT/US02/17927 to Hall, G. et al. Mogą być one łatwo dostosowane do eksprymowania czynnika tkankowego lub jego fragmentu, na przykład w Arabadopsis oraz różnych innych roślinach. [0064] Donoszono także o innych sposobach eksprymowania białek heterologicznych w roślinach jednoliściennych i dwuliściennych. Obejmują one podejścia dające stabilną i konstytucyjną ekspresję interesującego białka: 1) Transfer genu za pośrednictwem Agrobacterium; 2) bezpośredni wychwyt DNA obejmujący sposoby bezpośredniego wychwytu DNA do protoplastów; 3) wychwyt DNA indukowane przez krótki szok elektryczny komórek roślinnych, 4) wstrzyknięcie DNA do komórek lub tkanek roślinnych przez bombardowanie cząstkami, przez użycie systemu mikropipet lub przez bezpośrednią inkubację DNA z kiełkującym pyłkiem; oraz ) użycie wirusów roślinnych jako wektorów genowych. Jeden z tych sposobów lub ich kombinacja może być użyta do utworzenia rośliny, która eksprymuje czynnika tkankowego i jego funkcjonalnych fragmentów.

14 1 2 3 4 0 [006] Transfer genów za pomocą poddanych inżynierii szczepów Agrobacterium stała się rutynowa dla większości roślin dwuliściennych i niektórych jednoliściennych. Patrz np. Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803. Kolejne wektory do stosowania według wynalazku to superbinarne ujawnione na przykład w U.S. Pat. No.,91,616 i EPA 0604662A1. Patrz np. Hood et al. (1984) Biotechnol. 2:702 709; Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:1283 1290; Komari et al. (1986) J. Bacteriol. 166:88 94; Jin et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4417 442; Komari T. (1989) Plant Science 60:223 229; ATCC Accession No. 37394). [0066] Stosowane tu określenie zwierzęcy wektor ekspresyjny dotyczy konstruktów ekspresyjnych DNA np. odcinków kwasu nukleinowego, plazmidów, kosmidów, fagów, wirusów lub cząstek wirusowych zdolnych do syntetyzowania przedmiotowych białek kodowanych przez ich odpowiednie geny rekombinowane (tj. białko TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową) przenoszony przez wektor w komórce zwierzęcej. Alternatywnie odcinki kwasu nukleinowego mogą być używane do tworzenia transgenicznych komórek zwierzęcych wykorzystując rekombinację niekierunkową lub homologiczną, gdzie interesujący gen lub geny są stabilnie integrowane z genomem zwierzęcym. Normalnie zwierzęcy wektor ekspresyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą TF lub jego fragment mający aktywność prozakrzepową połączony funkcjonalnie z promotorem, który jest funkcjonalny w komórkach zwierząt (tj. funkcjonalny promotor zwierzęcy). [0067] W określonym przykładzie wykonania komórki zwierzęce to komórki owadów. Przykłady owadzich układów transfekcji to wirusy swoiste wobec owadów takie jak rekombinowane bakulowirusy używane w ramach wynalazku (patrz przykłady) i inne takie jak opisane we patencie USA US61074A. [0068] W tych przykładach wykonania, gdzie TF lub jego wariant ma być eksprymowany jest komórką drożdżową, drożdże są manipulowane przy użyciu standardowych technik manipulacji drożdży i genetyki drożdży. Patrz na przykład Bacila et al., eds. (1978, Biochemistry and Genetics of Yeast, Academic Press, New York); and Rose and Harrison. (1987, The Yeasts (2.sup.nd ed.) Academic Press, London). Sposoby wprowadzania egozennego DNA do gospodarzy drożdżowych są znane w dziedzinie. Istnieje szeroki wybór sposobów transformacji drożdży. O transformacji sferoplastów piszą Hinnen et al (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7:1919 1933); Beggs, (1978, Nature 27(676):4 9); and Stinchcomb et al., (EPO Publication No. 4,73; wymieniono w piśmiennictwie), o elektroporacji piszą Becker and Gaurante, (1991, Methods Enzymol. 194:182-187), Lithium acetate is taught by Gietz et al. (02, Methods Enzymol. :87-96) and Mount et al. (1996, Methods Mol. Biol. 3:139 14). Przegląd układów transformacji u drożdży innych niż Saccharomyces, patrz Wang et al. (Crit. Rev Biotechnol. 01; 21(3):177 218). Ogólne procedury inżynierii genetycznej drożdży, patrz Barr et al., (1989, Yeast genetic engineering, Butterworths, Boston). [0069] Po transformacji komórki eukariotycznej wybranym wektorem ekspresyjnym TF, kolejny etap to wzrost hodowli rekombinowanych komórek eukariotycznych, które eksprymują białko TF lub jego fragment mający właściwości prozakrzepowe w warunkach umożliwiających ekspresję białka TF lub jego fragmentu mającego właściwości prozakrzepowe. W określonym przykładzie wykonania komórka eukariotyczna jest hodowana w odpowiednim podłożu, gdzie komórka eukariotyczna może eksprymować żądany produkt heterologiczny (białko TF lub jego fragment mający właściwości prozakrzepowe). Odpowiednie podłoża hodowlane do hodowania komórek drożdży, roślin, owadów, ryb, ssaków lub innych komórek eukariotycznych są dobrze znane w dziedzinie i będą wybrane zależnie od rodzaju hodowanych komórek eukariotycznych. Można zastosować dowolny materiał do przygotowania produktu do fermentacji lub wzrostu dopóki jest on odpowiedni do fermentacji lub wzrostu spowodowanego przez zastosowane

1 1 2 3 4 0 komórki eukariotyczne i można dowolnie stosować znane materiały. Następnie w razie potrzeby można dodać odpowiednie składniki odżywcze i podobne substancje. [0070] Zasadniczo warunki fermentacji lub hodowli komórek nie różnią się od znanych warunków i mogą być dostosowane przez znawcę. Warunki wzrostu, które powinny być regulowane to skład gazu (tlen, itd.), temperatura, ph, itd. Dokumenty US618676, US818, US86123 i US91961 opisują techniki i odczynniki odpowiednie do ekspresji rekombinowanych białek przy użyciu promotorów drożdżowych. W określonym przykładzie wykonania, po fermentacji komórek drożdży następuje kontrolowanie rozwoju głównych parametrów podczas całego procesu fermentacji i jest on zatrzymywana, gdy ciśnienie tlenu (PO 2 ) osiągnie stan stacjonarny. [0071] W drugim etapie sposób według wynalazku obejmuje odzyskiwanie mikropęcherzyków zawierających TF z komórek, które uzyskano w etapie (i). [0072] Stosowane tu określenie odzyskiwanie dotyczy aktu oddzielania mikropęcherzyków zawierających TF od nienaruszonych lub poddanych lizie oraz innych składników komórkowych takich jak DNA, białka, itd. i tym samym uzyskanie częściowo lub całkowicie oczyszczonych mikropęcherzyków zawierających TF. W korzystnym przykładzie wykonania odzyskana frakcja to przynajmniej 0%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, przynajmniej 99% i 0%. [0073] Odzysk wymaga lizy komórek przy braku detergentów lub, w przypadku stosowania detergentów, użycia stężeń detergentów poniżej krytycznych stężeń micelarnych (CMC). W przypadku, gdy komórki są uzyskane z całego organizmu takiego jak roślina transgeniczna lub zwierzę transgeniczne, odzysk może obejmować etap redukowania tkanki do zawiesiny komórkowej przy użyciu sposobów mechanicznych lub enzymatycznych. [0074] Zawiesina komórkowa lub komórki z hodowli komórkowej, w przypadku mikropęcherzyków zawierających TF są odzyskiwane z hodowli komórkowych, mogą być granulowane sposobami konwencjonalnymi jak wirowanie i ponownie zawieszane w odpowiednim buforze litycznym przed poddaniem produktu do homogenizacji. [007] Komórki roślinne i grzybów mają ściany zawierające celulozę i chitynę. Dlatego przed homogenizacją może być wymagany dodatkowy etap dla usunięcia ściany komórkowej. Etap ten może być przeprowadzony sposobami mechanicznymi (np. przy użyciu moździerza i tłuczka, prasy francuskiej, blendera i podobnych) lub enzymatycznymi (np. przy użyciu celulazy, chitynazy, itd.) w obecności dopuszczalnego farmaceutycznie roztworu buforu litycznego (woda, sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), itd.). [0076] Ponadto przed homogenizacją pozostałości można usunąć za pomocą filtracji lub delikatnego wirowania, zazwyczaj około 00 x g lub mniej przez około minut, korzystnie od około do około minut. [0077] Sposoby odzyskiwania mikropęcherzyków zawierających TF z komórek uzyskanych w pierwszym etapie według wynalazku mogą różnić się zależnie od użytych komórek eukariotycznych i obejmują między innymi wirowanie, chromatografię żelową, filtrację przepływu stycznego lub ich kombinacje. [0078] W korzystnym przykładzie wykonania komórki są poddawane lizie sposobami mechanicznymi i jądro, niezniszczone komórki oraz pozostałości są usuwane za pomocą wirowania z niewielką prędkością zapewniając supernatant postjądrowy (PNS). Dlatego w korzystnym przykładzie wykonania preparat mikropęcherzyków lipidowych to supernatant postjądrowy. [0079] W określonym przypadku, gdy komórki drożdży są stosowane jako komórki gospodarza do przygotowywania mikropęcherzyków zawierających TF, komórki drożdży mogą być homogenizowane sposobami konwencjonalnymi takimi jak wysokie ciśnienie w homogenizatorze, aby uzyskać homogenat fermentacji. Homogenat fermentacji jest następnie poddawany separacji sposobami konwencjonalnymi takimi jak wirowanie, aby

16 1 2 3 4 0 uzyskać peletkę i klarowany ekstrakt drożdżowy (CYE) zawierający mikropęcherzyki zawierające TF mające aktywność prozakrzepową (tj. zawierające TF pochodzące z drożdży mikropęcherzyki według wynalazku), które można oddzielnie zbierać. [0080] Obecność białka TF lub jego fragmentu wykazującego aktywność prozakrzepową można określić sposbami konwencjonalnymi takimi jak analiza Western-blot z użyciem swoistego przeciwciała monoklonalnego (mab) białka anty-tf. Ponadto aktywność prozakrzepowa CYE może być określona za pomocą dowolnego konwencjonalnego testu takie jak dowolne oznaczenia krzepnięcia wymienione w Przykładzie 4 np. zazwyczaj za pomocą oznaczenia krzepnięcia w warunkach in vitro w osoczu lub krwi pełnej bez dodatku środka przeciw krzepliwości, itd. [0081] Dodatkowe badanie próbek CYE za pomocą mikroskopii immunoelektronowej ze znakowanym mab anty-tf można zastosować dla identyfikacji obecności TF w mikropęcherzykach pochodzących z drożdży lub innych komórek eukariotycznych. Takie mikropęcherzyki, które zawierają białko TF lub jego fragment mający właściwości prozakrzepowe, mają także aktywność prozakrzepową i odpowiadają mikropęcherzykom zawierającym TF pochodzenia eukariotycznego według wynalazku. [0082] Opcjonalnie, w razie potrzeby pochodzące z komórek eukariotycznych mikropęcherzyki zawierające TF (takie jak mikropęcherzyki pochodzące z drożdży) mające aktywność prozakrzepową mogą być zagęszczane, izolowane lub oczyszczane sposobami konwencjonalnymi znanymi znawcy. W ramach ilustracji, oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa białek zawierających znacznik peptydowy (np. znacznik His, itd.) na końcu C lub N to dobrze ustandaryzowany sposób stosowany do otrzymania wysoce oczyszczonych preparatów dużej liczby białek. Jak w przypadku każdego sposobu chromatograficznego, można łatwo zwiększyć jego skalę. Można przeprowadzić alternatywne procedury oczyszczania takie jak chromatografia immunopowinowactwa, chociaż wymagałoby to dostępności dobrze ustandaryzowanych zapasów swoistych mono- lub poliklonalnych przeciwciał anty-tf, zwłaszcza do produkcji na większą skalę. [0083] Dlatego sposób izolacji i oczyszczania będzie zależny, między innymi od charakteru białka TF lub jego fragmentu mającego właściwości prozakrzepowe tj. czy jest to białko fuzyjne mające znacznik do wiązania jednego lub więcej ligandów matrycy powinowactwa jak nośnik chromatograficzny lub kulki o wysokim powinowactwie (np. znacznik His, itd.) lub epitop, który może być rozpoznawany przez przeciwciało takie jak znacznik c-myc (rozpoznawany przez przeciwciało anty-c-myc), itd. [0084] W korzystnym przykładzie wykonania znakowane histydyną, pochodzące od drożdży mikropęcherzyki zawierajace TF według wynalazku są otrzymywane z klarowanego ekstraktu drożdżowego (CYE) według ujawnionego wcześniej sposobu. Zazwyczaj CYE jest filtrowany (np. przez filtr o porach 0,2 µm stosując filtrację z przepływem stycznym) przed załadowaniem na odpowiednią kolumnę powinowactwa (np. kolumna powinowactwa HiTrap); następnie po naniesieniu próbki, przepływ jest odzyskiwany (materiał niezwiązany) i kolumna jest podawana kilku przemywaniom i po ostatnim przemywaniu pochodzące z drożdży mikropęcherzyki zawierające (białko TFznacznik His) są wymywane przez dodanie do kolumny odpowiedniego buforu (np. bufor zawierający imidazol) i frakcje elucji są zbierane i dializowane, aby izolować lub oczyszczać pochodzące z drożdży mikropęcherzyki zawierające (białko TF-znacznik His). [008] Ponadto w innym przykładzie wykonania mikropęcherzyki zawierające TF według wynalazku mogą być oczyszczane za pomocą sprzętu ÄKTA. Sprzęt ÄKTA to zautomatyzowany system do chromatografii cieczowej firmy General Electric Healthcare, który może być używany do opracowywania standardowych protokołów oczyszczania wykorzystujących chromatografię wykluczenia, którą można łatwo skalować do produkcji na dużą skalę. W innym przykładzie wykonania można użyć filtracji z przepływem stycznym lub wysokowydajnym przepływem stycznym (HPTFF).

17 1 2 3 [0086] W określonym przykładzie wykonania mikropęcherzyki zawierające TF są odzyskiwane przy użyciu połączenia jednego lub więcej etapów filtracji z przepływem stycznym i (lub) jednego lub więcej etapów chromatografii wykluczenia. [0087] W określonym przykładzie wykonania drożdżowe mikropęcherzyki zawierające TF są odzyskiwane przy użyciu jednego etapu filtracji z przepływem stycznym, a następnie jedną chromatografią sita molekularnego i inną filtracją z przepływem stycznym. W korzystnym przykładzie wykonania wielkość porów w pierwszej filtracji z przepływem stycznym jest większa niż wielkość porów w drugiej (i kolejnych) filtracji z przepływem stycznym. W korzystniejszym przykładzie wykonania wielkość porów pierwszej filtracji z przepływem stycznym wynosi od 0, do 0,1 µm, a wielkość porów w drugiej filtracji z przepływem stycznym wynosi od 0,2 µm. [0088] W trzecim etapie sposób według wynalazku obejmuje zetknięcie pęcherzyków uzyskanych w etapie (ii) z ujemnie naładowanym fosfolipidem w obecności detergentów w warunkach odpowiednich do włączania fosfolipidu do mikropęcherzyków. [0089] Stosowane tu określenie fosfolipid dotyczy lipidu, który zawiera jedną lub więcej grup fosforanowych. Fosfolipidy mają charakter amfifilowy, czyli każda cząsteczka zawiera część hydrofilową (lubiącą wodę) i część hydrofobową (nienawidzącą wody). Określenie fosfolipid obejmuje tu dopuszczalne farmaceutycznie sole i pochodne estrowe takich związków. [0090] Fosfolipidy mogą być klasyfikowane według rodzaju alkoholu w fosfoglicerydach (lub glicerofosfolipidach), gdy zawierają one szkielet glicerolu oraz sfingolipidy, gdy lipidy zawierają sfingozynę. W błonach biologicznych występują obie klasy. Fosfoglicerydy to najczęściej występująca klasa fosfolipidów występujących w przyrodzie i obejmuje między innymi fosfatydylocholinę (lecytynę), fosfatydyloetanoloaminę, fosfatydyloserynę, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloglicerol i kardiolipinę. Różnorodność strukturalna w obrębie każdego rodzaju fosfoglicerydu wynika ze zmienności długości łańcucha i stopnia nasycenia grup estrowych kwasu tłuszczowego. [0091] Sfingomielina to główny fosfolipid zawierający sfingozynę. Jego ogólna struktura składa się z kwasu tłuszczowego przyłączonego do sfingozyny wiązaniem amidowym. [0092] Określenie ujemnie naładowany fosfolipid lub NCP dotyczy fosfolipidów, które zawierają ładunek ujemny netto w fizjologicznych wartościach ph tj. w zakresie ph od około 7,3 do 7,. Przykłady ujemnie naładowanych fosfolipidów, których można użyć według wynalazku to fosfatydyloseryna (PS), kwas dipalmitoilo- i distearoilofosfatydowy (DPPA), DSPA), dipalmitoilo- i distearoilofosfatydyloseryna (DPPS, DSPS), dipalmitoiloi distearoilofosfatydyloglicerol (DPPG, DSPG), fosfatydyloglicerol, fosfatydyloinozytol, kardiolipina, sfingolipidy (ceramido-1-fosforan; glikozylowana fosfatydyloetanoloamina; sulfatydy (hydroksylowane lub nie); gangliozydy), fosfatydyloinozytolofosforany i kwas fosfatydowy. [0093] W korzystnym przykładzie wykonania ujemnie naładowany fosfolipid to fosfatydyloseryna (PS), gdzie fosfolipid jest tworzony przez estryfikację między grupą fosforanową w cząsteczce kwasu fosfatydowego i grupą hydroksylową w serynie i ma strukturą przedstawioną za pomocą wzoru 4 gdzie R oznacza kwas tłuszczowy. Stosowane tu określenie kwas tłuszczowy dotyczy długołańcuchowych kwasów alifatycznych (kwasów alkanowych) o różnej długości łańcucha od około C 12 do C 22, zawierających zero, jedną lub więcej niż jedno wiązanie

18 1 2 3 4 0 nasycone. Korzystnie kwas tłuszczowy jest wybrany z grupy kwasu stearynowego (18:0 lub kwasu oktadekanowego), kwasu oleinowy (18:1 cis-9 lub kwasu (9Z)-oktadek-9- enowego), kwasu palmitynowego (16:0 lub kwasu heksadekanowego), kwasu linolowego (18:2(ω-6) lub kwasu cis, cis-9,12-oktadekadienowego), kwasu arachidonowego (:4 (ω- 6) lub kwas wszystkie-cis-,8,11,14-eikozatetraenowego), kwasu dokozaheksaenowego (22:6 (n-3 lub (4Z,7Z,Z,13Z,16Z,19Z)-dokoza-4,7,,13,16,19-heksaenowego). [0094] Ujemnie naładowane fosfolipidy do stosowania według wynalazku mogą być oczyszczane lub izolowane lub zasadniczo czyste. Związek jest zasadniczo czysty, gdy jest oddzielony od związków, które towarzyszą mu w przyrodzie. Zazwyczaj związek jest zasadniczo czysty, gdy stanowi przynajmniej 60%, ogólniej 7% lub ponad 90% wagowo masy całkowitej próbki. Zasadniczo czysty fosfolipid można uzyskać na przykład przez ekstrakcję ze źródła naturalnego lub syntezę chemiczną. Dlatego na przykład fosfolipid, który jest syntetyzowany chemicznie będzie ogólnie wolny od składników towarzyszących mu w przyrodzie. Czystość można zmierzyć za pomocą odpowiedniego sposobu takiego jak chromatografia kolumnowa, elektroforeza w żelu, HPLC, itd. Jednak ujemnie naładowany fosfolipid nie musi być koniecznie oczyszczony przed użyciem według wynalazku pod warunkiem, że fosfolipid nie jest związany ze składnikami, które znacznie zakłócają jego użyteczność. Znawca doceni, że naturalne źródło lub częściowo oczyszczone źródło ujemnie naładowanego fosfolipidu może być stosowane w ramach wynalazku i że ujemnie naładowany składnik fosfolipidowy może stanowić mały odsetek (na przykład %, ale korzystnie przynajmniej %, %, 0% lub więcej) całkowitego materiału uzyskanego z takiego źródła. [009] Sposób zetknięcia mikropęcherzyków uzyskanych w drugim etapie (ii) sposobu według wynalazku z ujemnie naładowanym fosfolipidem odbywa się w warunkach adekwatnych do włączania ujemnie naładowanego fosfolipidu w mikropęcherzykach lipidowych. Zmienne, które można zoptymalizować podczas etapu inkubacji to temperatura, ph, odpowiednie bufory, wilgotność, stężenie składników, roztwory, etapy przemywania, itd. Te zmienne mogą być w razie potrzeby dostosowane dla uzyskania optymalnego stosunku mikropęcherzyk/fosfolipid. [0096] Jak opisano wcześniej, preparat pęcherzyków uzyskany w etapie (i) sposobu według wynalazku składa się z lipidów błony oraz białek, które zawierają czynnik tkankowy lub jego wariant eksprymowany w komórkach gospodarza oraz jako białka związane z błoną, które występują endogennie u gospodarza. Jednak do celów oceny ilościowej wydajności mikropęcherzyków zazwyczaj wygodniejsze jest wyrażanie stężenia mikropęcherzyków jako mikrogramy białka na jednostkę objętości. Stężenie białka w próbce mikropęcherzyków można określić za pomocą standardowych technik ilościowego oznaczania białka jak oznaczenie Bradforda, oznaczenie BCA, reakcja biuretowa i podobne. [0097] Po określeniu stężenia białka w mikropęcherzykach, etap zetknięcia można przeprowadzić wykorzystując dowolny stosunek fosfolipidu do mikropęcherzyków. Znawca doceni, że stosunek fosfolipidu do pęcherzyków w etapie zetknięcia może się różnić zależnie od potrzeb dla osiągnięcia preparatu pęcherzyków wykazujących najlepsze właściwości. Korzystnie odpowiednie stężenie końcowe ujemnie naładowanego fosfolipidu można obliczyć wykorzystując oznaczenie krzywej nasycenia przez mieszanie użytego określonego ujemnie naładowanego fosfolipidu i zwiększanie stężenie mikropęcherzyków uzyskanych w etapie (ii) oraz oznaczanie czasów krzepnięcia w uzyskanych pęcherzykach do określenia optymalnego stężenia obu składników. Chociaż ten stosunek stężeń zazwyczaj odpowiada stosunkowi stężeń, który powoduje zasadniczo brak wolnego ujemnie naładowanego fosfolipidu (tj. niewłączonego do mikropęcherzyków), wynalazek rozważa także stosunek obu składników, które prowadzą do nadmiaru niewłączonego fosfolipidu, który można usunąć sposobami konwencjonalnymi. Znawca będzie także rozumiał, że ujemnie naładowany fosfolipid

19 1 2 3 4 0 będzie włączony do dwuwarstwy lipidowej mikropęcherzyka uzyskanego w etapie (ii) przy różnych prędkościach zależnie od charakteru ujemnie naładowanego fosfolipidu i charakteru mikropęcherzyka uzyskanego w etapie (ii) (tj. mikropęcherzyka pochodzącego z drożdży, mikropęcherzyka pochodzącego z owadów, itd.). [0098] W korzystnym przykładzie wykonanie etap zetknięcia jest prowadzony przy użyciu stężenia białka od około 0,1 do 00 µg/ml, 1 do 0 µg/ml, 90 µg/ml, 80 µg/ml, 70 µg/ml, 60 µg/ml, 4 µg/ml lub µg/ml. Stężenie fosfolipidu w etapie zetknięcia to korzystnie wynosi 0,001 1 mm, 0,00 0, mm, 0,1 0,4 mm, 0,2 0,3 mm. [0099] W korzystnym przykładzie wykonania etap zetknięcia jest prowadzony przy użyciu stosunku białko/fosfolipid około X µg białka do około 0,00 1 µmol fosfolipidu, gdzie X to około,,,, 0, 60, 70, 80, 90 lub 0. W jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania, etap zetknięcia jest prowadzony przy uzyciu 0,0 µmol fosfolipidu dla preparatu pęcherzyka mającego 0 lub mniej niż 0 µg białka lub 1 µmol fosfolipidu dla preparatu pęcherzyka mającego przynajmniej 0 µg białka. [00] Chociaż etap zetknięcia jest zazwyczaj przeprowadzany w warunkach odpowiednich do włączania większości fosfolipidów do pęcherzyków bez pozostawiania żadnego znacznego nadmiaru fosfolipidów, nie musi tak być, jeżeli zostanie przeprowadzony dodatkowy etap, gdzie nadmiar ujemnie naładowanych fosfolipidów jest usuwany z preparatu mikropęcherzyków wzbogaconych w fosfolipidy uzyskanych w etapie (ii). Znawcy znają różne sposoby usuwania nadmiaru takie jak dodatkowe etapy przemywania, oddzielanie warstw, wirowanie, chromatografia, itd. [01] Nadmiar fosfolipidów można usunąć z wzbogaconych w fosfolipidy mikropęcherzyków za pomocą szeregu sposobów zapewniających stabilną kompozycję mikropęcherzyków zawierających TF i mających czynnik tkankowy związany i umieszczony przez dwuwarstwę lipidową. Odpowiednie sposoby usuwania detergentu obejmują dializę, diafiltrację z przepływem stycznym, filtrację przez kapilary z przepływem krzyżowym, traktowanie hydrofobową żywicą chromatograficzną i proste rozcieńczenie. Mikropęcherzyki według wynalazku [02] Sposób według wynalazku daje mikropęcherzyki zawierające TF, które wykazują poprawione właściwości prozakrzepowe i zwiększoną stabilność w porównaniu z mikropęcherzykami, które nie były stykane z ujemnie naładowanymi fosfolipidami. Dlatego w innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyków, które został przygotowany przy użyciu sposobu według wynalazku. [03] Określenie mikropęcherzyki zostało szczegółowo opisane powyżej i zasadniczo dotyczy zamkniętego przedziału zawierającego zasadniczo monowarstwę lub dwuwarstwę lipidową. Mikropęcherzyki mogą mieć średnicę wahającą się w szerokim zakresie. Zazwyczaj wielkość jest równa lub mniejsza niż µm, zazwyczaj równa lub mniejsza niż 0, µm. W określonym przykładzie wykonania wielkość pochodzących z drożdży mikropęcherzyków zawierających TF według wynalazku waha się od do 0,01 µm. Ponieważ mikropęcherzyki uzyskane sposobami według wynalazku pochodzą z komórek eukariotycznych, ich skład białkowy i lipidowy będzie odzwierciedlał błony organizmu, z którego pochodzi. [04] W konkretnym przypadku, gdy mikropęcherzyki pochodzą z komórek drożdży, zazwyczaj zawierają fosfolipidy swoiste dla drożdży takie jak ergosterol i kardiolipina. [0] Gdy mikropęcherzyki pochodzą z komórek roślinnych, zawierają lipidy swoiste dla błon komórek roślinnych jak fitosterol, stanole, stanolestry, tokoferole, d-alfa tokoferole, d, I-alfa tokoferole, tokotrienole, fitosterol lub triterpen zawierający beta-sitosterol, kampesterol, stigmasterol, stigmastanol, beta-sitostanol, sitostanol, desmosterol, chalinasterol, poriferasterol, klionasterol lub brassicasterol. [06] Gdy mikropęcherzyki pochodzą z komórek zwierzęcych, zawierają lipidy błonowe swoiste dla zwierząt jak cholesterol lub typową kompozycję lipidów błony ssaków.

1 2 3 4 0 [07] Gdy mikropęcherzyki pochodzą z komórek owadzich, zawierają lipidy błonowe swoiste dla owadów lub typową kompozycję lipidów błony owadów jak duże ilości diacyloglicerolu. (Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry, and Biology Book by David W. Stanley-Samuelson, Dennis R. Nelson; University of Nebraska Press, 1993). [08] Chociaż jest korzystne, że mikropęcherzyki według wynalazku nie zawierają innych cząstek, działanie prozakrzepowe jest obserwowane w szerokim zakresie czystości mikropęcherzyków. Dlatego mikropęcherzyki według wynalazku mogą być zapewnione w preparacie zawierającym, względem cząstek substancji innej niż mikropęcherzyki, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej 0%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% lub przynajmniej 90% mikropęcherzyków. Liofilizowane kompozycje według wynalazku [09] Jak będzie wiedział znawca, wszystkie kompozycje mikropęcherzyków według wynalazku mogą być liofilizowane dla przechowywania i odtwarzania, na przykład nośnikiem wodnym (takim jak woda jałowa, roztwór buforowany fosforanem lub wodny roztwór soli fizjologicznej) z pomocą energicznego wytrząsania. [01] Określenia liofilizacja, suszenie sublimacyjne lub ich gramatycznie równoważne warianty odnoszą się do sposobu odwadniania zazwyczaj stosowanego do konserwowania materiału nietrwałego lub uczynienia materiału wygodniejszym w transporcie, co następuje przez zamrożenie materiału, a następnie zmniejszenie ciśnienia otoczenia i dodanie tyle ciepła, aby umożliwić sublimację wody zamrożonej w materiale bezpośrednio z fazy stałej do gazowej. [0111] Znawca zna różne procedury liofilizacji i zamrażania, które można zastosować. Liofilizację można przeprowadzić przy użyciu standardowego wyposażenia takiego jak wyparki rotacyjne, liofilizatory wielokomorowe i liofilizatory tacowe. W określonym przykładzie wykonania, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być zamrażane na suchym lodzie, następnie liofilizowane przy użyciu cyklu rozpoczynającego się przy - C i kończącego w temperaturze pokojowej po okresie 48 godzin. Uzyskany odczynnik może być odtwarzany do stężenia roboczego przez dodanie 0,1M Tris, ph 7,, mm trehalozy dla uzyskania roztworu zawierającego pęcherzyk według wynalazku w stężeniu około µg/ml. [0112] Aby zapobiec aglutynacji lub fuzji lipidów i (lub) pęcherzyków wskutek liofilizacji, może być użyteczne dodanie krioprotektantów, które zapobiegają wystąpieniu takiej fuzji lub aglutynacji. Określenie krioprotektant dotyczy środka, który chroni cząsteczkę lipidu poddawaną odwadnianiu/ponownemu uwadnianiu, zamrażaniu/rozmrażaniu lub liofilizacji/ponownemu uwadnianiu z fuzji pęcherzyków i/lub wycieku zawartości pęcherzyków i zawiera między innymi sorbitol, mannitol, chlorek sodu, glukozę, trehalozę, poliwinylopirolidon i glikol polietylenowy (PEG), na przykład PEG 0. Te i inne dodatki są opisane w piśmiennictwie takim jak U.S. Pharmacopeia, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, Md. 82. Preparaty liofilizowane ogólnie mają zaletę większej trwałości. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku [0113] W innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych według wynalazku, które zawierają pęcherzyki uzyskane sposobem według wynalazku w postaci roztworu/zawiesiny lub postaci liofilizowanej i farmaceutycznie aktywnym nośniku. Kompozycja farmaceutyczna jest następnie poddawana formulacji w farmaceutycznej postaci podawania odpowiedniej do podawania pacjentowi. [0114] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają mikropęcherzyki według wynalazku zawierające ludzkie białko TF lub jego dowolne warianty mające aktywność prozakrzepową i które zostały szczegółowo opisane powyżej, w tym dojrzałe ludzkie TF, skrócone ludzkie TF, glikozylowane warianty TF, znakowane TF i warianty

21 1 2 3 4 0 zawierające więcej niż jedną powyższą modyfikację takie jak dojrzałe TF zawierające znacznik heksahistydyny na końcu C i mutację N124A. [011] Stosowane tu określenie dopuszczalny farmaceutycznie nośnik dotyczy dowolnej substancji odpowiedniej do dostarczania kompozycji farmaceutycznej użytecznej w sposobie według wynalazku do odpowiedniego miejsca w warunkach in vivo lub ex vivo bez powodowania działań niepożądanych takich jak toksyczność, podrażnienie, reakcja alergiczna lub inny problem lub powikłanie o uzasadnionym ryzyku wystąpienia. W kompozycjach według wynalazku można zastosować praktycznie dowolny nośnik, który nie ma niepożądanego wpływu na mikropęcherzyk według wynalazku. W przykładzie wykonania nośnik to zasadniczo podłoże ciekłe takie jak podłoże otaczające mikropęcherzyk zawierający TF według wynalazku uzyskany przez wykonanie sposobu według wynalazku. Dlatego w określonym przykładzie wykonania kompozycja według wynalazku zawiera klarowany ekstrakt drożdżowy uzyskany przez wykonanie sposobu według wynalazku, gdzie dodano ujemnie naładowany fosfolipid. [0116] Informacje na temat nośników i substancji pomocniczych oraz postaci podawania odpowiednich do podawania produktu według wynalazku można znaleźć w galenicznych traktatach farmaceutycznych. Przegląd różnych farmaceutycznych postaci podawania ogólnie leków i sposobów ich wytwarzania można znaleźć w podręczniku zatytułowanym Tratado de Farmacia Galénica, by C. Faulí i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzán, S.A. of Ediciones. [0117] W określonym przykładzie wykonania kompozycja farmaceutyczna zawierająca mikropęcherzyk zawierający TF według wynalazku może być formułowana razem z promotorem krzepnięcia. [0118] Według wynalazku promotor krzepnięcia można uważać za dowolny środek ułatwiający proces tworzenia skrzepów krwi. [0119] Środki użyteczne jako promotory krzepnięcia to adsorbenty chemiczne takie jak zeolina; trombina; składniki kaskady krzepnięcia takie jak czynniki krzepnięcia I, II, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, itd.; kofaktory takie jak wapń, witamina K i podobne. W korzystnym przykładzie wykonania stosowany promotor krzepnięcia jest wybrany z grupy czynnika VII (jako prekursor lub postać czynna), czynnik X (jako prekursor lub postać czynna) i ich kombinacje. [01] Chociaż jest korzystne, aby kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierały oczyszczone mikropęcherzyki, możliwe jest także, że kompozycja zawiera zasadniczo oczyszczone mikropęcherzyki. Mikropęcherzyki według wynalazku można oczyszczać dowolnym wymienionym wyżej sposobem dla uzyskania preparatu zawierającego, względem cząstek substancji innej niż mikropęcherzyki, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej %, przynajmniej 0%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% lub przynajmniej 90% mikropęcherzyków. [0121] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają terapeutycznie skuteczną ilość mikropęcherzyków zawierających TF. Wymieniona ilość może różnić się w szerokim zakresie zależnie od dawki, drogi podania i podobnych. Zazwyczaj kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać od około µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml do 0 µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml, korzystnie od µg aktywnego białka/ml do 0 µg aktywnego białka/ml i jeszcze korzystniej od około 0 µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml do 0 µg aktywnego mikronośnika według wynalazku/ml. [0122] Dawka do podania pacjentowi może wahać się w bardzo szerokim zakresie, na przykład od około 1,0 pg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml do 1,0 mg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml, korzystnie od 0,0 µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml do 0 µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml i jeszcze korzystniej od około 0,1 µg aktywnego mikropęcherzyka według

22 1 2 3 4 0 wynalazku/ml do 0 µg aktywnego mikropęcherzyka według wynalazku/ml. Dawka mikropęcherzyka według wynalazku do podania będzie zależna od kilku czynników, w tym między innymi cech zastosowanego białka TF lub jego fragmentu mającego aktywność prozakrzepową, jak na przykład jego aktywności i półtrwania biologicznego, stężenia białka TF lub jego fragmentu mającego aktywność prozakrzepową w formulacji, stanu klinicznego pacjenta, leczonego zaburzenia krwotocznego, itd. Z tego powodu wymienione dawki muszą być uznawane jedynie jako wskazówki dla znawcy i osoba ta musi dostosować dawki zgodnie z wcześniej wymienionymi zmiennymi. Niemniej jednak kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana jeden lub wiele razy na dobę w celach zapobiegawczych lub terapeutycznych. [0123] Jeżeli mikropęcherzyki zawierające TF są liofilizowane, mogą być ponownie zawieszane w rozpuszczalniku dla ponownego montażu przed podaniem zwierzęciu. W przypadku podawania w stanie liofilizowanym, mikropęcherzyków spontanicznie formują się ponownie, gdy kompozycja jest narażona na środowisko hydrofilowe wewnątrz ciała zwierzęcia. Terapeutyczne zastosowania wynalazku Zastosowania związane z krzepnięciem krwi [0124] Różne oznaczenia wykazały, że mikropęcherzyki według wynalazku, które zawierają mikropęcherzyki zawierające TF traktowane ujemnie naładowanym fosfolipidem o zwiększonej aktywności prozakrzepowej i stabilności. Przykład 2 pokazuje oznaczenia in vitro wykazujące, że mikropęcherzyki według wynalazku powodują tworzenie skrzepów fibryny zarówno u osób zdrowych i chorych, w tym osocza i krwi osób zdrowych, osocza ubogiego w FVIII, FIX lub FXI (oznaczenia krzepnięcia w osoczu); krwi od pacjentów wykazujących nabyty niedobór płytek krwi (oznaczenia krzepnięcia we krwi trombocytopenicznej), osocza ubogiego w FXI w obecności przeciwciał anty-fvii (oznaczenia krzepnięcia w osoczu) oraz krwi pacjentów chorych na hemofilię, chorobę von Willebranda i otrzymujących warfarynę. Wyniki te jasno pokazują, że drożdżowe mikropęcherzyki zawierające TF według wynalazku są środkami prozakrzepowymi lub przeciwkrwotocznymi użytecznymi w miejscowym leczeniu krwotoków u pacjenta. [012] Dlatego w innym aspekcie mikropęcherzyki według wynalazku i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być stosowane jako lek czyli jako środek prozakrzepowy lub środek przeciwkrwotoczny, zwłaszcza jako środek przeciwkrwotoczny do stosowania miejscowego w leczeniu u pacjenta krwotoków. Dlatego w innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyków według wynalazku do stosowania jak lek. W kolejnych aspektach wynalazek dotyczy sposobów leczenia krwotoków u pacjenta, który obejmuje podawanie mikropęcherzyków lub kompozycji według wynalazku pacjentowi, do stosowania mikropęcherzyków lub kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia krwotoków u pacjenta oraz jako mikropęcherzyków lub kompozycje według wynalazku do stosowania w leczeniu krwotoków. [0126] Mikropęcherzyki według wynalazku mogą być bezpośrednio stosowane miejscowo do leczenia krwotoku u pacjenta tj. bez łączenia z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, ponieważ mikropęcherzyki są zasadniczo nieszkodliwe dla pacjenta. Jednak ogólnie korzystne jest, aby mikropęcherzyki według wynalazku były formułowane w farmaceutycznej postaci podawania odpowiedniej do podawania, korzystnie do podawania miejscowego dla miejscowego leczenia krwotoku. [0127] Dlatego mikropęcherzyki według wynalazku mogą być formułowane w farmaceutyczną postać dawkowania, korzystnie farmaceutyczną postać dawkowania odpowiednią do podawania miejscowego, w którą będą włączane farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze odpowiednie do przygotowywania żądanej farmaceutycznej postaci dawkowania. Informacje na temat nośników i substancji pomocniczych oraz postaci podawania odpowiednich do podawania produktu według

23 1 2 3 4 0 wynalazku można znaleźć w galenicznych traktatach farmaceutycznych. Przegląd różnych farmaceutycznych postaci podawania ogólnie leków i sposoby ich wytwarzania można znaleźć w podręczniku zatytułowanym Tratado de Farmacia Galénica ( Galeniczne traktaty farmaceutyczne ), by C. Faulí i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzán, S.A. of Ediciones. [0128] Chociaż można stosować różne farmaceutyczne postaci dawkowania mikropęcherzyków według wynalazku, w praktyce najkorzystniejsze jest podawanie produktu miejscowo; dlatego mikropęcherzyki według wynalazku będą formułowane w postać farmaceutyczną odpowiednią do podawania miejscowego. Ilustracyjne, nieograniczające przykłady postaci farmaceutycznych obejmują aerozole, roztwory, zawiesiny, emulsje, żele, maści, kremy, opatrunki, plastry, płyny do płukania ust, itd. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku będzie zawierała farmaceutycznie dopuszczalne ciecze nośne, nośniki i (lub) substancje pomocnicze wymagane do przygotowania farmaceutycznej postaci dawkowania mikropęcherzyków według wynalazku do podawania miejscowego. [0129] Dlatego w określonym przykładzie wykonania kompozycje farmaceutyczne według wynalazku to kompozycje farmaceutyczne do podawania miejscowego mikropęcherzyków według wynalazku zawierających produkt i dopuszczalną farmaceutycznie ciecz nośną, nośnik lub substancję pomocniczą odpowiednią do podawania miejscowego mikropęcherzyka według wynalazku. [01] Ilustracyjne, nieograniczające przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych cieczy nośnych, nośników i substancji pomocniczych odpowiednich do podawania miejscowego mikropęcherzyków według wynalazku można znaleźć w galenicznych traktatach farmaceutycznych. [0131] Mikropęcherzyki według wynalazku i ich kombinacje oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku lub ich kombinacje można stosować razem z innymi dodatkowymi lekami użytecznymi w zapobieganiu i/lub leczeniu skazy krwotocznej (np. czynniki krzepnięcia, osocze ludzkie, itd.) dla zapewnienia terapii skojarzonej. Dodatkowe leki mogą być częścią samej kompozycji farmaceutycznej lub alternatywnie mogą być podawane w postaci oddzielnej kompozycji do jednoczesnego lub kolejnego (w czasie) podawania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. [0132] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być także umieszczone na podłożu. Dlatego w innym aspekcie wynalazek dotyczy produktu zawierającego kompozycję farmaceutyczną według wynalazku lub jej kombinacje oraz podłoże. Stosowane tu określenie podłoże dotyczy substratu lub odpowiedniego materiału umożliwiającego odkładanie na nim kompozycji farmaceutycznych według wynalazku, jego transportowania i uwalniania w żądanym miejscu, gdzie kompozycje farmaceutyczne według wynalazku wywierają działanie terapeutyczne. Podłoże może być podłożem stałym lub niestałym, na przykład ciekłym lub gazowym. Ilustracyjny, nieograniczające przykłady podłoży stałych to opatrunki, bandaże, kompresy, plastry, itd. Ilustracyjny, nieograniczające przykłady podłoży ciekłych to żele, aerozole, płyny do płukania ust, itd. Ilustracyjny, nieograniczające przykłady podłoży gazowych to powietrze, gazy pędne, itd. Produkt zawierający mikropęcherzyki według wynalazku lub kompozycje według wynalazku mogą być uzyskany sposobami konwencjonalnymi, na przykład przez mieszanie mikropęcherzyków według wynalazku i podłoża. Oddziaływanie między mikropęcherzykami według wynalazku i podłożem mogą być oddziaływaniami fizycznymi lub chemicznymi zależnie od charakteru składników pęcherzyków, kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej według wynalazku i użytego podłoża. [0133] W innym aspekcie wynalazek dotyczy mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku lub ich kombinacji do leczenia krwotoków u pacjenta, zwłaszcza do miejscowego leczenia krwotoków u osób zdrowych lub cierpiących na skazę krwotoczną.

24 1 2 3 4 0 [0134] Stosowane tu określenie leczenie miejscowe dotyczy stosowania leczenia bezpośrednio w miejscu, gdzie jest wymagane, na przykład nieciągłych częściach skóry (rozcięcia, itd.) i tkance naczyniowej (rozerwane naczynia, itd.) w krwotokach żylnych i tętniczych z powodu otwartych ran, zabiegów chirurgicznych, itd. oraz w krwotokach śluzówkowo-skórnych i mikronaczyniowych. [013] Według wynalazku i jak przedstawia to Przykład 2, mikropęcherzyki według wynalazku mogą działać jako środek prozakrzepowy lub przeciwkrwotoczny i w konsekwencji produkt można stosować do leczenia lub korygowania zaburzeń krwotocznych, zwłaszcza zaburzeń krwotocznych związanych ze skazami krwotocznymi. [0136] Określenie skaza krwotoczna dotyczy procesu powodowania zaburzenia hemostazy, co z kolei powoduje występowanie zespołu krwotocznego i może niekiedy powodować długotrwałe i rozległe krwawienie. Skaza krwotoczna może być spowodowana przez wrodzoną lub nabytą koagulopatię i (lub) wrodzone lub nabyte zaburzenie płytkowe. [0137] Określenie koagulopatia dotyczy zaburzenia czynników krzepnięcia. Zaburzenie może być spowodowane niedoborem lub deficytem swoistego czynnika krzepnięcia, czego konsekwencją będzie wystąpienie zespołu krwotocznego lub spowodowane zaburzeniem czynników krzepnięcia. Koagulopatia może być ogólnie koagulopatią wrodzoną lub nabytą. [0138] Jako ilustracyjne, nieograniczające przykłady można wymienić koagulopatie wrodzone, niedobory czynników krzepnięcia wybrane spośród czynnika krzepnięcia V (FV), czynnika krzepnięcia VII (FVII), czynnika krzepnięcia VIII (FVIII), których deficyt lub niedobór powoduje hemofilię A, czynnika krzepnięcia IX (FIX), którego deficyt lub niedobór powoduje hemofilię B, czynnika krzepnięcia X (FX), czynnika krzepnięcia XI (FXI), którego deficyt lub niedobór powoduje hemofilię C, czynnika krzepnięcia XII (FXII), czynnika krzepnięcia XIII (FXIII) i ich kombinacje. [0139] Koagulopatie nabyte mogą mieć inną etiologię. Ilustracyjne przykłady to niedobory syntezy czynnika krzepnięcia w ciężkiej niewydolności wątroby, terapia środkami przeciw krzepliwości (taka jak heparyną, heparyną drobnocząsteczkowe, warfaryna, pochodną kumaryny, dikumaryną, itd.). Alternatywny mechanizm opiera się na nasilonym zużyciu czynników krzepnięcia wskutek czego nie są one dostępne do krzepnięcia zmiany krwotocznej. Mechanizm ten występuje w zespole rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego lub koagulopatii spowodowanej zużyciem występującym w wielu schorzeniach takich jak ciężka sepsa uszkadzająca śródbłonek mikrokrążenia aktywujący płytki krwi i czynniki krzepnięcia z tworzeniem wielu mikrozakrzepów; w inwazji krwi przez TF jak uwalnianie łożyskowe; w zatrzymywaniu martwego płodu; w wielu obrażeniach z miażdżeniem tkanek; w ukąszeniach jadowitych węży, itd. W zapaleniu naczyń uszkodzenie kości ciemieniowej i śródbłonka powoduje uwolnienie aktywatorów krzepnięcia. Zużycie czynników krzepnięcia jest pogarszane przez lizę fibryny licznych mikrozakrzepów wskutek działania plazminy z uwalnianiem PDF, które działają przeciwpłytkowo i przeciwkrzepliwie. [01] Określenie zaburzenie płytkowe dotyczy zaburzenia zarówno liczby jak i zdolności funkcjonalnych płytek krwi, czego rezultatem jest występowanie zespołu krwotocznego. Zaburzenie płytkowe może być wrodzone lub nabyte. [0141] W określonym przykładzie wykonania zaburzenie płytkowe jest wrodzonym zaburzeniem płytkowym. Ilustracyjne, nieograniczające przykłady wrodzonych zaburzeń płytkowych to choroba Glanzmanna, choroba Bernarda Souliera, zespół Bolina-Jamiesona, zespół Wiskotta-Aldricha, zespół Parisa-Trousseau-Jacobsena, trombocytopenia chromosomu X, zespół płytkowy Graya, zespół Sebastiana i niedokrwistość Fanconi. [0142] W innym przykładzie wykonania zaburzenie płytkowe jest nabytym zaburzeniem płytkowym. Ilustracyjne, nieograniczające przykłady nabytych zaburzeń płytkowych to zaburzenia mieloproliferacyjne takie jak trombocytopenia, policytemia, przewlekła

2 1 2 3 4 0 białaczka szpikowa, itd.; występują funkcjonalne zaburzenia płytkowe w metaplazji szpikowej o wydłużonym czasie krwawienia, wady retencji perełek szklanych, wady agregacji płytek, nieprawidłowe uwalnianie i wada czynnika III płytek. Funkcjonalne wady płytek występowały w dysproteinemiach w szkorbucie oraz wrodzonej wadzie serca i marskości wątroby. [0143] Określenia nabyta koagulopatia oraz nabyte zaburzenie płytkowe odnoszą się do pochodzenia zaburzenia, które może być jatrogenne lub wtórne do innych chorób. [0144] Stosowane tu określenie pacjent obejmuje dowolnych członków królestwa zwierząt, w tym ludzi. Jako ilustracyjny, nieograniczający przykład pacjent może być ssakiem, takim jak naczelny, zwierzę domowe, gryzoń, itd. Korzystnie pacjent jest mężczyzną lub kobietą w dowolnym wieku i dowolnej rasy. W określonym przykładzie wykonania pacjent jest człowiekiem bez zaburzenia hemostazy w wywiadzie takim jak osoba bez koagulopatii lub zaburzeń płytkowych. W innym określonym przykładzie wykonania pacjent jest człowiekiem z zaburzeniem hemostazy takim jak osoba ze skazą krwotoczną, na przykład koagulopatią lub zaburzeniem płytkowym takim jak wrodzone lub nabyte zaburzenie płytkowe. [014] Dlatego w określonym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku dla wytwarzania leku do leczenia miejscowego krwotoków u ludzi bez skaz krwotocznych w wywiadzie. W innym określonym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy stosowania mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku dla wytwarzania leku do leczenia miejscowego krwotoków u ludzi ze skazami krwotocznymi. Zastosowanie związane z gojeniem ran [0146] Oprócz roli w krzepnięciu krwi, TF ułatwia naprawę i gojenie ran (Nakagawa, et al. (1998) Seminars in Thromb. and Hemostasis 24:7 2; Philippart, et al. (03) The Internatl. J. of Oral and Maxillofacial Implants 3:411 416). [0147] Dlatego w innym określonym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy stosowania mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku dla wytwarzania leku do gojenia ran. Alternatywnie wynalazek dotyczy stosowania mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych do stosowania w wytwarzaniu leki do gojenia ran. Alternatywnie wynalazek dotyczy sposobu gojenia ran u pacjenta, który obejmuje podawanie pacjentowi mikropęcherzyków według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku. [0148] Wyrażenie gojenie ran dotyczy gojenia ran wszelkiego rodzaju w dowolnym miejscu. Może być to prawidłowe lub upośledzone gojenie ran. To ostatnie występuje zwłaszcza w przypadku chorób takich jak cukrzyca, zapalenie naczyń, zarostowa choroba tętnic, przewlekłe żylne i/lub zakażone wrzody oraz słabo gojące się wrzody żołądka. Upośledzone gojenie ran występuje także w przypadku upośledzenia unerwienia takiego jak paraplegia, lepra, neuropatia, itd. oraz zgorzel odleżynowa osób wymagających opieki. Upośledzone gojenie ran będzie także występować, jeżeli zastosowano słabe szwy oraz po operacjach, zwłaszcza jelit i przeszczepach skóry oraz innych narządów. Upośledzone gojenie ran występuje także w przypadku złamań kości, oparzeń i leczenia z użyciem steroidów. [0149] Według wynalazku gojenie ran lub naprawa ran dotyczy skomplikowanego procesu, gdzie skóra (lub inny narząd) ulega samonaprawie. Stosowane tu określenie rana obejmuje obrażenia dowolnej tkanki, w tym na przykład rany o opóźnionym lub trudnym gojeniu oraz rany przewlekłe. Przykłady ran to zarówno rany otwarte jak i zamknięte. Określenie rana może także wskazywać na przykład obrażenia skóry i tkanki podskórnej inicjowane w różny sposób (np. odleżyny spowodowane długotrwałym odpoczynkiem w łóżku i rany indukowane przez obrażenia) oraz o różnorodnej charakterystyce. Zależnie od głębokości rany mogą być klasyfikowane do jednego z

26 1 2 3 4 0 czterech stopni: i) rany I stopnia ograniczone do nabłonka; ii) rany II stopnia sięgające do skóry właściwej; iii) rany III stopnia sięgające do tkanki podskórnej; oraz iv) rany IV stopnia (lub rany pełnej głębokości), gdzie odsłonięta jest kość (np. kościsty punkt uciskowy taki jak krętarz większy lub kość krzyżowa). [0] Określenie rana przewlekła dotyczy niezagojonej rany. Rany niezagojone na przykład przez trzy miesiące są uznawane za przewlekłe. Rany przewlekłe to owrzodzenia żylne, wrzody zastoinowe żylne, owrzodzenia tętnicze, wrzody uciskowe, wrzody cukrzycowe, wrzody stopy cukrzycowej, wrzody zapalenia naczyń, odleżyny, wrzody oparzeniowe, wrzody indukowane oparzeniem, wrzody zakaźne, wrzody mieszane i piodermia zgorzelinowa. Rana przewlekła może być wrzodem żylnym, który zawiera owrzodzenia wynikające z całkowitego lub częściowego zablokowania tętnicy. Rana przewlekła może być żylna lub owrzodzeniem żylnym zawierającym owrzodzenia powstałe wskutek nieprawidłowego działania zastawki żylnej i związanego z chorobą naczyniową. W określonych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się jednym lub więcej spośród następujących stadiów AHCPR owrzodzenia uciskowego: stadium 1, stadium 2, stadium 3 i/lub stadium. [011] Stosowane tu określenie rana przewlekła może dotyczyć na przykład rany, która cechuje się przynajmniej częściowo jednym lub więcej (1) przewlekłym stanem samoutrzymującego się stanu zapalnego rany, (2) niedobór lub wada macierzy zewnątrzkomórkowej rany, (3) słabo reagujące (starzejące się) komórki rany, zwłaszcza fibroblasty, ograniczające wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej i/lub (4) brak ponownej epitelizacji częściowo z powodu braku wymaganej organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej i braku szkieletu do migracji. Rany przewlekłe mogą się także charakteryzować 1) wydłużonym stanem zapalnym i aktywnością proteolityczną prowadzącą do zmian wrzodziejących, w tym na przykład wrzodów cukrzycowych, uciskowych (odleżynowych), żylnych i tętniczych; 2) progresywnym odkładaniem się macierzy w danym obszarze, 3) dłuższymi czasami naprawy, 4) mniejszymi skurczami rany, ) wolniejszą ponowną epitelizacją oraz 6) zwiększoną grubością tkanka ziarninowej. [012] Przykładowe rany przewlekłe to wrzody uciskowe. Przykładowe wrzody uciskowe można klasyfikować na 4 stadia na podstawie wytycznych AHCPR (Agency for Health Care Policy and Research, U.S. Department of Health and Human Services). Wrzód uciskowy stadium I to możliwa do zaobserwowania zmiana nienaruszonej skóry, której wskaźniki w porównaniu do okolicy lub przeciwległej strony ciała obejmuje jedne lub więcej spośród następujących zmian: temperatura skóry (ciepła lub zimna), spójność skóry (uczucie jędrności lub grząskości) i/lub odczucie (ból, swędzenie). Wrzód wygląda jak wyraźny obszar o utrzymującym się zaczerwienieniu jasno pigmentowanej skóry, natomiast w ciemniejszych odcieniach wrzód może mieć zabarwienie czerwone, niebieskie lub fioletowe. Owrzodzenie stadium 1 może obejmować niemożliwy do wybielenia rumień nienaruszonej skóry oraz wyraźną zmianę zwiastującą owrzodzenie skóry. U osób o ciemniejszej skórze odbarwienie skóry, ocieplenie, obrzęk, zgrubienie lub stwardnienie także mogą być wskaźnikami owrzodzenia stadium 1. Owrzodzenie stadium 2 może charakteryzować się częściową utratą grubości skóry obejmującą naskórek, skórę właściwą lub obie te warstwy. Wrzód jest powierzchniowy i ma cechy kliniczne zadrapania, pęcherza lub krótkiego zagłębienia. Owrzodzenie stadium 3 może charakteryzować się utratą całej grubości skóry obejmującą uszkodzenie lub martwicę tkanki podskórnej, które może sięgać nawet do powięzi, ale nie przekracza jej. Wrzód wygląda klinicznie jak głębokie zagłębienie z lub bez podminowaniem przylegającej tkanki. Owrzodzenie stadium 4 cechuje się pełną utratą grubości skóry z rozległym zniszczeniem, martwicą tkanki lub uszkodzeniem mięśni, kości lub struktury podtrzymujących (np. ścięgna, torebki stawowej). W określonych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się jednym lub więcej spośród następujących

27 1 2 3 4 0 stadiów AHCPR owrzodzenia uciskowego: stadium 1, stadium 2, stadium 3 i (lub) stadium 4. [013] Przykładowe rany przewlekłe to także wrzody uciskowe. Przykładowe wrzody uciskowe mogą powstać wskutek długotrwałego i nieleczonego ucisku na wyniosłość kostną, co prowadzi do niedokrwienia. Rany mają tendencje do występowania u pacjentów, którzy nie są w stanie sami zmienić pozycji odciążenia z powodu paraliżu, utraty przytomności lub ciężkiego osłabienia. Zgodnie z definicją the U.S. Department of Health and Human Services, główne środki zapobiegawcze obejmują identyfikację pacjentów wysokiego ryzyka; częste oceny; oraz środki profilaktyczne takie jak zaplanowane zmiany pozycji, odpowiednie łóżko zmniejszające ucisk, bariery wilgoci oraz odpowiednie żywienie. Opcje leczenia mogą na przykład obejmować zmniejszenie ucisku, chirurgiczne i enzymatyczne opracowanie rany, pielęgnacja rany wilgotnej oraz kontrola obciążenia bakteryjnego. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się owrzodzeniem lub wrzodem uciskowym wynikającym z długotrwałego, niezmniejszanego ucisku na wyniosłości kostne, co prowadzi do niedokrwienia. [14] Rany przewlekłe to także wrzody tętnicze. Przewlekłe wrzody tętnicze są ogólnie rozumiane jako owrzodzenia, którym towarzyszy choroba miażdżycowa tętnic lub nadciśnienie sercowo-naczyniowe. Są one bolesne, mają ostre granice i często występują na bocznych dolnych kończynach i palcach nóg. Wrzody tętnicze mogą cechować się całkowitą lub częściową blokadą tętniczą, co może prowadzić do martwicy i (lub) owrzodzenia tkanki. Oznaki wrzodu tętniczego to na przykład brak tętna w kończynie; bolesne owrzodzenie; niewielkie, punktowe wrzody, które zazwyczaj są dobrze określone; chłodna lub zimna skóra; opóźniony czas zwrotu kapilarnego (krótko pchnij na końcu palec u nogi i puść, prawidłowy kolor palca u nogi powinien powrócić po około 3 sekundach lub krócej), skóra wyglądająca atroficznie (na przykład lśniąca, cienka, sucha); utrata owłosienia palców i stopy. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami tętniczymi z powodu całkowitego lub częściowego zablokowania tętniczego. [1] Przykładowe rany przewlekłe to wrzody żylne. Przykładowe wrzody żylne to najczęstszy rodzaj wrzodów dotykających kończyny dolne i mogą one charakteryzować się nieprawidłowym działaniem zastawki żylnej. Prawidłowe żyły mają zastawki, które zapobiegają przepływowi wstecznemu. Gdy zastawki staną się niedomykalne, przepływ wsteczny krwi żylnej powoduje zastój żylny. Hemoglobina z krwinek czerwonych ucieka i wycieka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej powodując często obserwowane brązowawe zabarwienie. Wykazano, że przezskórne ciśnienie tlenu skóry otaczającej wrzód żylny jest zmniejszone sugerując, że wstępują siły blokujące prawidłowe unaczynienie obszaru. W tych wrzodach rolę odgrywa także drenaż i przepływ limfatyczny. Wrzód żylny może występować w pobliżu kostki przyśrodkowej i zazwyczaj występuje w połączeniu z obrzękniętą i stwardniałą kończyną dolną; może być płytki, niezbyt bolesny i może występować z sączącym się wysiękiem z owrzodzonego miejsca. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami żylnymi z powodu nieprawidłowego działania zastawki żylnej i powiązanej choroby naczyniowej. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami tętniczymi z powodu całkowitego lub częściowego zablokowania tętniczego. [016] Przykładowe rany przewlekłe to wrzody zastoinowe żylne. Wrzody zastoinowe to zmiany związane z niewydolnością żylną i częściej występują nad kostką przyśrodkową zazwyczaj z obrzękiem limfatycznym, żylakowatością, nakrapianą pigmentacją, rumieniem i niewyczuwalnymi wybroczynami i plamicą. Zastoinowe zapalenie skóry i

28 1 2 3 4 0 wrzody są ogólnie raczej swędzące niż bolesne. Przykładowe wrzody zastoinowe żylne mogą cechować się przewlekłym pasywnym przekrwieniem żylnym kończyn dolnych powodującym miejscowe niedotlenienie. Jeden z możliwych mechanizmów patogenezy tych ran obejmuje utrudnienie dyfuzji tlenu do tkanki przez grube okołonaczyniowe mankiety fibryny. Inny mechanizm polega na tym, że wyciekające makrocząsteczki do tkanki okołonaczyniowej wychwytują czynniki wzrostu niezbędne do utrzymania integralności skóry. Dodatkowo przepływ dużych białych krwinek jest spowolniony z powodu zastoju żylnego, blokowania kapilar, aktywacji i uszkadzania śródbłonka naczyniowego co predysponuje do tworzenia wrzodów. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami żylnymi z powodu nieprawidłowego działania zastawki żylnej i powiązanej choroby naczyniowej. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami zastoinowymi żylnymi z powodu przewlekłego pasywnego zastoju żylnego kończyn dolnych i (lub) wynikającego z miejscowego niedotlenienia. [017] Przykładowe rany przewlekłe to wrzody cukrzycowe. Pacjenci z cukrzycą są podatni na owrzodzenia, w tym owrzodzenia stopy, z powodu powikłań neurologicznych oraz naczyniowych. Neuropatia obwodowa może powodować zmienioną lub całkowitą utratę czucia w stopie i (lub) nodze. Pacjenci z cukrzycą z zaawansowaną neuropatią tracą całą zdolność do rozróżniania uczucia ostrego/tępego. U pacjenta z neuropatią wszelkie skaleczenia lub obrażenia stopy mogą być całkowicie niezauważone przez dni lub tygodnie. Nie jest niczym niezwykłym, że pacjent z neuropatią zauważy, że wrzód po prostu pojawił się, gdy w istocie wrzód istniał już przez pewien czas. Wykazano, że u pacjentów z neuropatią ścisła kontrola glukozy spowalnia postęp choroby. Wskutek zmniejszenia czucia może także występować stopa Charcota. Osoby z normalnym czuciem w stopach mogą automatycznie wyczuwać, gdy wobec stopy zostanie zastosowany zbyt silny ucisk. Po jego stwierdzeniu nasze ciało instynktownie zmienia pozycję, aby zwolnić nacisk. Pacjent z zaawansowaną neuropatią traci swą zdolność do wyczuwania utrzymującego się ucisku i w wyniku tego może wystąpić niedokrwienie tkanki oraz martwica prowadząc na przykład do owrzodzeń podeszwy. Dodatkowo mikrozłamania kości stopy, jeżeli są niezauważone i nieleczone, mogą powodować oszpecenie, przewlekły obrzęk i dodatkowe wyniosłości kostne. Choroba mikronaczyniowa to jedno z głównych powikłań cukrzycy, co może także prowadzić do owrzodzeń. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami i/lub owrzodzeniami stopy cukrzycowej z powodu neurologicznych i naczyniowych powikłań cukrzycy. [018] Przykładowe rany przewlekłe to wrzody urazowe. Powstawanie wrzodów urazowych może występować wskutek obrażeń urazowych ciała. Obrażenia te obejmują na przykład pogorszenie układów tętniczego, żylnego lub limfatycznego; zmiany architektury kostnej szkieletu; utrata warstw tkanki naskórka, skóry właściwej, miękkiej tkanki podskórnej, mięśni lub kości; uszkodzenie części ciała lub narządów oraz utrata części ciała lub narządów. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami związanymi z obrażeniami urazowymi ciała. [019] Przykładowe rany przewlekłe mogą obejmować wrzody oparzeniowe, w tym oparzenia pierwszego stopnia (tj. powierzchniowy, zaczerwieniony obszar skóry); oparzenia drugiego stopnia (pęcherzowe obrażenie, które może goić się samoistnie po usunięciu płynu z pęcherza); oparzenia trzeciego stopnia (oparzenie przez całą skórę i zazwyczaj wymagające interwencji chirurgicznej dla gojenia rany); oparzenie (może być spowodowane gorącą wodą, smarem lub płynem chłodniczym); termiczne (może być spowodowane płomieniami, zazwyczaj głębokie oparzenia); chemiczne (może być spowodowane kwasami i zasadami, zazwyczaj głębokie oparzenia); elektryczne (niskim

29 1 2 3 4 0 napięciem w domu lub wysokim napięciem w pracy); wybuchowe (zazwyczaj oparzenia powierzchniowe); i oparzenia kontaktowe (zazwyczaj głębokie i mogą być spowodowane rurami wydechowymi, gorącymi żelazkami i piecami). W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami związanymi z oparzeniami ciała. Przykładowe rany przewlekłe to wrzody zapalenia naczyń. Wrzody zapalenia naczyń występują także na kończynach dolnych i są to bolesne, wyraźnie rozgraniczone zmiany, które mnogą być związane z wyczuwalnymi plamicami i pęcherzami krwotocznymi. Przyczyną tego ciężkiego, ostrego schorzenia mogą być choroby kolagenowe, posocznice i różne zaburzenia hematologiczne (np. trombocytopenia, dysproteinemia). Przykładowe rany przewlekłe to piodermia zgorzelinowa. Piodermia zgorzelinowa występuje jako pojedyncze lub wielokrotne, bardzo tkliwe uciskowo wrzody dolnej części nóg. Głęboko czerwone do fioletowych, nieokreślone granice otaczają centralną zmianę ropną. Biopsja zazwyczaj nie jest w stanie ujawnić zapalenia naczyń. U połowy pacjentów jest związana z chorobą układową taką jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba Leśniowskiego-Crohna lub białaczka. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami związanymi z piodermią zgorzelinową. Przykładowe rany przewlekłe to wrzody zakaźne. Wrzody zakaźne ulegają bezpośredniemu zaszczepieniu przez różnorodne organizmy i mogą wiązać się ze znaczną adenopatią miejscową. Przykładami są zakażenia mykobakteriami, wąglikiem, błonicą, blastomykoza, grzybica sporotrychowa, tularemia oraz gorączka po zadrapaniu przez kota. Wrzody narządów płciowych kiły pierwotnej zazwyczaj nie są tkliwe uciskowo i mają czystą, mocną podstawę. Te z wrzodem miękkim i ziarniniakiem pachwinowym mają tendencje do nierówności, zabrudzeń i bardziej wybujałe zmiany. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran przewlekłych, gdzie rana przewlekła cechuje się wrzodami lub owrzodzeniami związanymi z zakażeniem. Stosowanie tu określenie rana z rozejściem się brzegów dotyczy rany, zazwyczaj rany chirurgicznej, która pękła lub otwarła się. W pewnych przykładach wykonania zapewniany jest sposób leczenia ran niegojących się z oczekiwaną szybkością, gdzie rana cechuje się rozejściem brzegów rany. [0160] Odpowiednie nośniki, których można użyć zostały opisane wcześniej. Lek zawierający mikropęcherzyki według wynalazku może także zawierać inne związki stosowane do gojenia ran. Zastosowania związane z angiogenezą [0161] Oprócz roli w krzepnięciu krwi, TF odgrywa rolę w angiogenezie. Zostało to odkryte, gdy stwierdzono, że mysz z genetycznym nokautem TF była niezdolna do rozwoju po dniu embrionalnym 9 z powodu niemożności rozwoju naczyń krwionośnych (Carmeliet, et al., 1996, Nature 383:73 7; Bugge et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93: 628 6263; Toomey, et al., 1996, Blood 88: 183 187). Dalsze badania wykazały, że aktywacja proteaz krzepnięcia może prowadzić do aktywacji receptorów aktywowanych przez proteazy prowadząc do zwiększonej produkcji naczyniowych czynników wzrostu śródbłonka, które stymulują angiogenezę (Richard, et al., 02, Oncogene : 16 162; Milia, et al., 02, Circ. Res. 91:346 32). Dodatkowo nadekspresja TF w komórkach nowotworowych ułatwia wzrost guza, rozrost naczyń i przerzuty (Mueller, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89: 11832 11836). [0162] Dlatego w innym określonym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy stosowania mikropęcherzyków według wynalazku, kompozycji według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznych według wynalazku dla wytwarzania leku do leczenia choroby związanej z niedoborem angiogenezy. [0163] Angiogeneza to proces, dzięki któremu nowe naczynia krwionośne lub naczynia limfatyczne powstają z wcześniej istniejących naczyń. Stosowane tu określenie choroba związana z niedoborem angiogenezy dotyczy chorób, które można wyleczyć aktywując

1 2 3 4 0 tworzenie naczyń. Wyrażenie tworzenie naczynia dotyczy tworzenia naczynia jakiegokolwiek rodzaju i w dowolnym miejscu. Ułatwianie tworzenia naczynia może być użyteczne w szeregu schorzeń klinicznych. Na przykład proangiogeniczne mikropęcherzyki zawierające TF według wynalazku mogą być stosowane do ułatwiania angiogenezy naczyń pomocniczych w tkance mięśnia sercowego podczas lub po chorobie niedokrwiennej, zawale mięśnie sercowego lub po zabiegu pomostowania wieńcowego. Inne choroby lub schorzenia, które można leczyć za pomocą mikropęcherzyków zawierających TF według wynalazku to choroba naczyniowa i (lub) choroba naczyniowe i/lub choroba niedokrwienna powodująca patologię obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego. Takie schorzenia/choroby mogą obejmować zdarzenia mózgowo-naczyniowe np. powodowane przez skrzep okluzje lub rozerwanie tętniaka lub ogólne/miejscowe niedokrwienie powodujące śmierć neuronalną lub obwodowe upośledzenie czynnościowe takie jak w funkcjach motorycznych lub sensorycznych lub upośledzenie mowy, kardiomiopatię niedokrwienną lub obwodową chorobę tętniczą taką jak przewlekłe chromanie niedokrwienne kończyny (mięsień szkieletowy), ból spoczynkowy/owrzodzenie niedokrwienne/zgorzel. Ponadto ułatwianie tworzenia naczyń jest odpowiednie do wymiany upośledzonych, np. starych, naczyń krwionośnych. Mogą one występować np. w mózgu lub sercu, dzięki czemu można zapobiec lub leczyć udar lub zawał mózgu. Można także podjąć środki ostrożności przeciwko starzeniu głosu. Dodatkowo dotyczy ono tworzenia naczyń w celu leczenia miażdżycy, choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, retinopatii cukrzycowej i zakrzepicy żył głębokich nóg/owrzodzenia podudzi oraz zapobieganiu nawrotom. [0164] Pacjent cierpiący na chorobę związaną z niedoborem angiogenezy może być leczony mikropęcherzykami według wynalazku lub kompozycją farmaceutyczną według wynalazku lub ich skojarzeniem w połączeniu z terapią przeciwangiogeniczną, terapią przeciwnowotworową lub inną terapią do leczenia choroby lub schorzenia. [016] Stosowane tu określenie terapia obejmuje między innymi znany lek. Nowotwory możliwe do wyleczenia sposobami według wynalazku obejmują wszystkie guzy lite i nowotwory przerzutowe, w tym między innymi wybrane z grupy składającej się z raka pęcherza, piersi, wątroby, kości, nerki, okrężnicy, jajnika, gruczołu krokowego, trzustki, płuc, mózgu i skóry. Wynalazek obejmuje między innymi leczenie nowotworu mikropęcherzykami według wynalazku pojedynczo, w skojarzeniu z chemioterapią lub w skojarzeniu z radioterapią sposobami znanymi w dziedzinie (patrz U.S. Patent 6,96,712). Zestawy według wynalazku [0166] W innym aspekcie wynalazek dotyczy zestawu zawierającego mikropęcherzyki według wynalazku oraz do stosowania mikropęcherzyków do oznaczania w próbce czynnika terapii przeciwzakrzepowej. [0167] Stosowane tu określenie zestaw jest stosowany w odniesieniu do połączenia wyrobów, które ułatwiają proces, sposób, oznaczanie, analizę lub manipulację próbką. Zestawy te zapewniają materiały niezbędne do wykonania sposobów opisanych w ramach wynalazku. [0168] Stosowane tu określenie czynnik terapii przeciwzakrzepowej dotyczy parametru, który jest użyteczny w podejmowaniu decyzji, czy pacjent wymaga terapii przeciwzakrzepowej. Czynniki terapii przeciwzakrzepowej obejmują między innymi czas protrombinowy (PT), międzynarodowy współczynnik znormalizowany (INR), zmodyfikowany ATF (MATF), skorygowany ATF (CATF), współczynnik protrombiny (PR) oraz współczynnik transformacji fibrynogenu (FTR). [0169] Stosowane tu określenie czas protrombinowy, PT lub ich gramatyczne odpowiedniki oznaczają testy czasu krzepnięcia krwi, które są użyteczne w monitorowaniu leczenia osób, które są narażone na ryzyko nadmiernego krzepnięcia krwi (zakrzepica). Czas protrombinowy dotyczy czasu obliczonego na podstawie dodawania czynnika tkankowego wapnia do próbki w punkcie, kiedy rozpoczyna się konwersja fibrynogenu

31 1 2 3 4 0 do fibryny. Czas protrombinowy zazwyczaj jest określany przez zetknięcie różnych rozcieńczeń prawidłowego osocza ludzkiego (korzystnie rozcieńczania 1:2, 1:4, 1:, 1: i 1: w 0,1 M NaCl) dając próbki mające zmniejszoną aktywność czynnika (odpowiednio 0, 2,, i 2,%). Pęcherzyki według wynalazku są dodawane do próbek i optycznie mierzony jest czas krzepnięcia próbki. [0170] Stosowany tu współczynnik protrombiny (PR) dotyczy innego pomiaru krzepnięcia krwi, które jest obliczane przez podzielenie PT osocza pacjenta przez PT puli osoczy od osób zdrowych. [0171] Zestawy i zastosowania według wynalazku mogą być stosowane w laboratorium krzepnięcia. Warianty tego testu mają szereg zastosowań (White, et al., Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman, et al., eds., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, s. 48 60, 1987). Jedno zastosowanie to ocena niedoborów zewnątrzpochodnego szlaku krzepnięcia (czynniki VII, X, V i protrombina). Drugie zastosowanie to monitorowanie pacjentów poddawanych długoterminowej doustnej terapii przeciwzakrzepowej zaburzeń takich jak nawracająca zakrzepica żylna i rak (Hirsh, J., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 12:1 11, 1986). Trzecie zastosowanie to ocena dysfunkcji wątroby. [0172] Zakres terapeutyczny terapii przeciwzakrzepowej opiera się na unikaniu powikłań krwotocznych i zakrzepowych. Podczas monitorowania doustnej terapii przeciwzakrzepowej oraz z szeregu innych warunków testu PT, dwukrotne wydłużenie czasu protrombinowego jest najbardziej pożądane w terapii długoterminowej (O'Reilly, Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman, et al., eds., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, s. 1367 1372, 1987). Współczynnik wydłużenia jest definiowany jako współczynnik protrombiny (PR) i jest obliczany przez podzielenie PT osocza pacjenta przez PT puli osoczy od osób zdrowych. Wyższy PR wskazuje bardziej czuły odczynnik PT. Korzyści bardziej czułego odczynnika do monitorowania terapii przeciwzakrzepowej to stosowanie mniejszych dawek leku przeciwzakrzepowego. Te niższe dawki nadal zapewniają odpowiednią ochronę przed chorobą zakrzepowo-zatorową jednocześnie ograniczając powikłania krwotoczne. [0173] Zestaw może dodatkowo zawierać opakowanie umożliwiające utrzymanie odczynników w określonych granicach. Odpowiednie materiały do przygotowywania takich opakowań to szkło, plastik (polietylen, polipropylen, poliwęglan i podobne), butelki, fiolki, papier, saszetki i podobne. Zestaw według wynalazku może dodatkowo zawierać instrukcje do stosowania odczynnika lub odczynników w sposobie według wynalazku. Instrukcje mogą znajdować się w formie materiału drukowanego lub w formie nośnika elektronicznego, który może przechowywać instrukcje w taki sposób, że mogą być one odczytane przez pacjenta jak elektroniczne nośniki magazynujące (dyski magnetyczne, taśmy i podobne), nośniki optyczne (CD-ROM, DVD) i podobne. Nośniki mogą dodatkowo lub alternatywnie zawierać witryny internetowe zapewniające instrukcje. PRZYKŁADY SPOSOBY Oznaczenia krzepnięcia w osoczu [0174] Spontaniczna aktywność prozakrzepowa (niestymulowana) w osoczu była mierzona za pomocą dwuetapowego oznaczenia krzepnięcia w 4-kanałowym koagulometrze (Start 4, Diagnostica Stago). W skrócie 0 µl osocza ubogopłytkowego dodano do przygotowanych kuwet i dodano 0 µl próbki (TF lub woda destylowana jako kontrola). Mieszaninę tę pozostawiono dla inkubacji przez 60 sekund w temperaturze 37 C i natychmiast dodano 0 µl 2 mm chlorku wapnia i określono czas koagulacji w sekundach w koagulometrze, co zweryfikowano przez tworzenie skrzepu. Osocza ubogopłytkowe uzyskano przez wirowanie i płytki policzono na aparacie Coulter.

32 1 2 3 4 [017] Prozakrzepowy wpływ TF na osocza ubogie w czynniki krzepnięcia (FVIII, FIX lub FXI) odpowiadające odpowiednio hemofilii A, B lub C był badany przy użyciu dostępnych w handlu osoczy (Dade Behring Marburg GmbH) zubożonych technikami powinowactwa immunologicznego. W każdym przypadku końcowa zawartość czynników krzepnięcia wynosiła poniżej 1%. [0176] Prozakrzepowe działanie w schorzeniach podobnych do trombocytopenii było badane w osoczu pozbawionym płytek za pomocą kolejnego wirowania. Oznaczenia krzepnięcia w krwi pełnej [0177] Aktywność prozakrzepową we krwi pełnej bez środków przeciw krzepnięciu była oznaczana sposobem krzepnięcia. Różne środki (mtf) do badania dodawano w objętości końcowej od 0,2 ml do 0,8 ml krwi pełnej bez środków przeciw krzepnięciu i czasy krzepnięcia mierzono za pomocą chronometru od początku ekstrakcji do pojawienia się stabilnego i skonsolidowanego skrzepu krwi. Wpływ różnych środków oceniano jako skracanie lub wydłużanie czasów krzepnięcia krwi. [0178] Próbki krwi pełnej uzyskano od pacjentów lub zdrowych ochotników. PRZYKŁAD 1 Wytwarzanie produktu prozakrzepowego na podstawie ekspresji pełnej długości białka TF modyfikowanego znacznikiem his u drożdży (TT-173). [0179] Drożdżowy wektor episomalny opisany w WO08080989 i zawierający gen URA3, gen oporności na ampicylinę, drożdżowe miejsce rozpoczęcia replikacji 2 µ, promotor dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanu (GPD) promotor oraz drożdżowy sygnał zakończenia transkrypcji kinazy fosfoglicerynianowej użyto do klonowania pod kontrolą promotora GPD cdna kodującego dojrzałe białko htf (aa 33-29 o SEQ ID NO:1) z 18 dodatkowymi nukleotydami (kodowanie sześciu histydyn) na końcu 3' i mutacji Asn124A1a, która inaktywuje jedno z potencjalnych miejsc N-glikozylacji w natywnej sekwencji htf (SEQ ID NO:6). [0180] Po transformacji szczepu drożdży T73 ura3-, szczepy zdolne do wzrostu na podłożu bez uracylu zbierano i testowano pod kątem ich zdolności do ekspresji htf za pomocą analizy Western-blot ekstraktów drożdżowych zasadniczo zgodnie z opisem w publikacji WO08080989. [0181] Dla oceny możliwości skalowania na poziomie przed przemysłowym produkcji ekstraktów drożdżowych, przeprowadzono fermentacje w bioreaktorze o pojemności 2 litrów (Biostat B-2L. BRAUN) hodując komórki w temperaturze C z prędkością mieszania 0 obr./min, ph 4, i przepływie powietrza 6 l/m. Podłożem hodowlanym był CSM-URA:0,78 g/l; YNB: 6,7 g/l; sacharoza: g/l. Fermentacja była zatrzymywana, gdy hodowla osiągnęła OD 8,0. [0182] Produkt uzyskany z fermentacji zbierano przez wirowanie przy 00 obr./min (10 x g) przez min i ponownie zawieszano w 0 ml buforu litycznego (bufor fosforanowy mm (ph 7,4), 0 mm NaCl). Drożdże homogenizowano pod wysokim ciśnieniem (00 bar ( 8 Pa)) (homogenizator NIRO SOAVIS. Panda 2K) i homogenat wirowano przy 13 000 obr./min (13 000 x g) przez min przy 4 C. Peletkę odrzucano i zbierano supernatant zwany klarowanym ekstraktem drożdżowym (CYE). [0183] Ten CYE zawierający rtf frakcjonowano w kolejnych etapach filtracji z przepływem stycznym w systemie filtracji krzyżowej (Sartorius sartoflow Slice 0 Benchtop) używając filtrów ze stopniową redukcją wielkości porów (membrany 0,4 µm, 0,2 µm i 0,1 µm (Sartorius, polysulfone). [0184] Aktywność prozakrzepowa różnych retentatów i permeatów uzyskanych z czterech niezależnych CYE po kolejnych etapach filtracji przedstawiono w Tabeli 1. Obecność TF w każdej z czterech frakcji MFR 0.1 przedstawia fig. 1.

33 1 2 3 Tabela 1. Średnia aktywność prozakrzepowa retentatów mikrofiltratów (MFR) i permeatów mikrofiltratów (MFP) z czterech niezależnych CYE po filtracji z przepływem stycznym. Procedura oznaczania krzepnięcia jest zdefiniowana w części Metody. Aktywność s CYE 23, MFR 0.4 23,6 MFP 0.4 24,0 MFR 0.2 24,3 MFP 0.2 24,9 MFR 0.1 18,1 MFP 0.1 >0 [018] W ten sposób uzyskano oczyszczony preparat pęcherzyków drożdży (określany dalej jako TT-173) mający właściwości prozakrzepowe jak określono używając różnych oznaczeń in vitro i in vivo zasadniczo zgodnie z opisem w dokumencie WO08080989. Wynik ten wskazuje, że stosowanie procedur filtracji z przepływem stycznym stosowanych do oczyszczania produktu TT-173 umożliwia odzysk biologicznie czynnego htf, który jest związany z mikropęcherzykami pochodzącymi z błon drożdży. PRZYKŁAD 2 Zwiększanie aktywności biologicznej TT-173 przez dodanie PS. 2.1 Wpływ fosfatydyloseryny (PS) na aktywność biologiczną TT-173 [0186] PS (0,1 mm) dodano do TT-173 i mieszaninę inkubowano przez maksymalnie 4 godziny. W różnych punktach czasowych począwszy od czasu dodania PS (czas 0) porcję mieszaniny TT-173/PS sprawdzano pod kątem aktywności krzepnięcia w standardowym oznaczeniu koagulometrycznym. Wyniki przedstawione na fig. 2 wyraźnie pokazują, że dodanie PS skraca czas krzepnięcia o około s (Panel A), co odpowiada sześciokrotnemu zwiększeniu aktywności właściwej (panel B) i to wzmocnienie jest zależne od czasu osiągając maksimum 1 do 2 godzin po dodaniu PS. [0187] Pomijalny wpływ samego PS na czas krzepnięcia (nie przedstawiono) oraz wzrost obserwowanego efektu wzmacniającego podczas pierwszej godziny po jej dodaniu do TT- 173 sugerowały, że wystąpiło pewne oddziaływanie między TT-173 i PS i oddziaływanie to było ważne w przyspieszeniu czasu krzepnięcia. [0188] Działanie to było swoiste dla ujemnie naładowanych fosfolipidów, ponieważ dodanie nienaładowanych lub dodatnio naładowanych fosfolipidów w podobnych stężeniach (0,1 mm) nie indukowało wykrywalnego zwiększenia aktywności krzepnięcia TT-173. Zwłaszcza ani fosfatydyloseryna (PS), fosfatydyloetanoloamina (PE), sfingomielina (SM) ani fosfatydylocholina (PC) nie indukowały wykrywalnego zwiększenia aktywności krzepnięcia. [0189] Badano, czy oddziaływanie PS/TT-173 było ograniczone do struktur pochodzenia drożdżowego lub czy mogło być powtórzone w pęcherzykach przygotowanych sztucznie. Dla przetestowania tego, PS dodawano w różnych stężeniach (od 0,0 do 1 mm) do porcji o równoważnej aktywności krzepnięcia TT-173 lub rtf ponownie lipidowanego w warunkach in vitro. Po inkubacji mieszaniny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, próbki obu produktów zawierających rtf badano pod kątem ich aktywności krzepnięcia. Wyniki przedstawia fig. 3. Jak zaobserwowano wcześniej, dodanie PS do TT- 173 wyraźnie zwiększa jego aktywność około sześciokrotnie. Działanie to było obserwowane w zakresie stężeń od 0,0 do 0, mm PS. Przy wyższych stężeniach (1 mm) PS dawał wyraźne działanie hamujące krzepnięcie. Co zaskakujące, dodanie PS do ponownie lipidowanego rtf nie powodowało wyraźnego zwiększenia aktywności prozakrzepowej przy żadnym ze stosowanych stężeń PS. Ponownie przy wyższych

34 1 2 3 4 0 testowanych stężeniach PS (1 mm) stwierdzano wyraźne działanie hamujące. To działanie hamujące przy wyższym stężeniu PS na próbki TT-173 lub ponownie lipidowanego rtf można wyjaśnić, jeżeli pęcherzyki PS przy wysokich stężeniach wydajnie oddziałują z rozpuszczalnymi czynnikami krzepnięcia oddzielając je i w ten sposób ograniczając ich oddziaływanie z pęcherzykami zawierającymi rtf. [0190] Zostało to dodatkowo potwierdzone przez badanie wpływu na aktywność krzepnięcia wskutek dodania rosnących stężeń PS do już istniejących miceli zawierających rtf mających różne stosunki PC do PS. Optymalne stężenie fosfolipidów do przywrócenia pełnej aktywności rtf jest dobrze ustalone i odpowiada stosunkom fosfatydylocholiny (PC) do fosfatydyloseryny (PS) wynoszącym od 80: do 70:. Fig. 4 (czarne paski) przedstawia typowe doświadczenie krzepnięcia, gdzie rtf ponownie lipidowano samym PC (stężenie PC:PS równe 0:0) lub z rosnącymi stosunkami stężeń PS względem PC (stężenia PC:PS równe odpowiednio 9:, 90: i 80:). Wynik jasno pokazuje, że dodanie większych ilość PS powoduje skrócenie czasów krzepnięcia. Jednak po dodaniu dodatkowe PS do istniejących miceli, każde badane stosunki PC:PS nie wykazywały żadnego zwiększenia aktywności krzepnięcia (fig. 4, szare paski). [0191] Dla zapewnienia dodatkowych dowodów, że obserwowany efekt ogranicza się do struktur pochodzenia eukariotycznego i nie może być odtworzony w pęcherzykach przygotowanych sztucznie przez ponowną lipidację, PS dodano w stężeniu 0,1 mm do mających równoważną aktywność krzepnięcia porcji pęcherzyków TT-173 wytworzonych w komórkach drożdży lub ponownie lipidowanych w warunkach in vitro rtf w stosunku PC:PS wynoszącym 80: i 70:. Po inkubacji różnych pęcherzyków z PS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, próbki produktów zawierających rtf badano pod kątem ich aktywności krzepnięcia. Wyniki przedstawia fig.. Jak obserwowano, dodanie PS do TT-173 pochodzenia drożdżowego wyraźnie skracało czas krzepnięcia, natomiast zgodnie z oczekiwaniem dodanie PS do ponownie lipidowanego rtf nie powodowało wyraźnego zwiększenia aktywności prozakrzepowej przy żadnym ze stosowanych stosunków PC:PS użytych do ponownej lipidacji. [0192] Dla zbadania, czy dodanie PS było skuteczne jedynie w związku z pęcherzykami pochodzącymi z drożdży, przeprowadzono doświadczenie wykorzystujące ponownie lipidowane pęcherzyków rtf i TT-0 (mikropęcherzyki uzyskane z rekombinowanych drożdży transformowanych plazmidem bez sekwencji białka TF), uzyskane z nierekombinowanych drożdży zgodnie z tą samą procedurą produkcyjną jak TT-173. Porcje ponownie lipidowanego rtf mieszano z różnymi stężeniami pęcherzyków TT-0, które wcześniej inkubowano z PS (0,1 mm) przez 2 godziny. Po minutach określano aktywność krzepnięcia każdej porcji. Wyniki (fig. 6) jasno pokazują, że niezależnie od użytej ilości TT-0, mieszanina TT-0/PS nie ma wykrywalnego wpływu na ponownie lipidowany rtf. [0193] Wynik ten pokazuje, że wpływ PS na aktywność krzepnięcia jest zależny od jego związku z pęcherzykami pochodzenia drożdżowego i pęcherzyki te muszą zawierać rtf. [0194] Z punktu widzenia powyższych wyników, indukowane przez PS przyspieszanie aktywności krzepnięcia w TT-173 (parz fig. 2, 3 i ) może być wyjaśnione, jeżeli: i) PS ułatwia oddziaływania między rtf i FVII, indukując bardziej odpowiedni szkielet do oddziaływań; ii) dodana PS indukuje skutki strukturalne w pęcherzykach generujących obszary wzbogacone w PS, jak w aktywowanych płytkach, bardziej odpowiednie do powstania kompleksu protrombinazy; lub iii) oba działania są łączne. [019] Dla przetestowania możliwego wpływu PS na oddziaływania rtf:fvii, zastosowano standardowe oznaczenie amidolityczne zdefiniowane do ilościowej oceny aktywności enzymatycznej kompleksu TF:FVII. Do tego doświadczenia trzy stężenia TT- 173 z lub bez dodanego PS inkubowano z różnymi stężeniami oczyszczonego FVIIa dostępnego w handlu. Po dodaniu FVIIa do TT-173, aktywność TF/FVIIa wykrywano jako zdolność kompleksu do enzymatycznego przekształcania określonego substratu

3 1 2 3 4 0 chromogennego S-2288. Jak przedstawiono na Fig., nie było istotnych różnic aktywności amidolitycznej między TT-173 z lub bez PS przy trzech testowanych stężeniach TT-173 i przy obu użytych stężeniach FVIIa, 0 nm (nie przedstawiono) lub 00 nm (fig. 7). Wyniki te jasno pokazują, że dodanie PS do TT-173 nie wywiera znaczącego skutku na początkowe oddziaływania rtf-fvii. [0196] Gdy jednak takie same próbki TT-173 badano pod kątem aktywności prozakrzepowej w osoczu prawidłowym (fig. 8, panel A) lub prawidłowej krwi pełnej (fig. 8, panel B), obserwowano bardzo znaczący wzrost aktywności krzepnięcia po powiązaniu PS z TT-173. [0197] Dlatego stymulujący wpływ PS na aktywność TT-173 nie można przypisać wpływowi na kolejne elementy kaskady krzepnięcia inne niż początkowe oddziaływania TF:FVII. Nasza interpretacja jest taka, że PS modyfikuje powierzchnię pęcherzyka TT-173 zapewniając zależne od PS rusztowanie podobne do obserwowanego w aktywowanych płytkach. 2.2. Mechanizm działania TT-173 i TT-173 PS [0198] Podczas prawidłowej hemostazy czas wymagany do osiągnięcia stadium aktywacji (czas wymagany do osiągnięcia stężenia trombiny wymaganego do aktywacji FV, FVIII i płytek krwi) to około 4 minuty. Jest to czas wymagany do umożliwienia oddziaływań między cząsteczkami TF i FVII, gdzie obie są obecne we względnie niskich stężeniach w osoczu lub błonach uszkodzonych komórek. Kolizje cząsteczkowe i wynikające z tego oddziaływania między TF i FVII prowadzą do transformacji FX do FXa, co z kolei daje trombinę. [0199] Dlatego zwiększenie stężenia TF włączonego do odpowiedniej błony, na przykład dodając TT-173 do osocza lub krwi, zwiększy szanse zajścia oddziaływań między TF i FVII. Daje to znacznie szybszą i wyższą produkcję FXa i tym samym szybsze wytwarzanie trombiny wymaganej do aktywacji płytek krwi, FVIII i FV. [00] W TT-173, TF jest umieszczany w przedziale błonowym zawierającym także oddzielne plamy PS. Dlatego dodanie TT-173 do osocza lub krwi zapewnia nie tylko inicjatora kaskady krzepnięcia w wyższych stężeniach, ale także odpowiednią powierzchnię zapewniającą odpowiedni, zawierający PS szkielet fizjologiczny do tworzenia aktywnych kompleksów protrombinazy. Fig. 9 podsumowuje proponowany mechanizm działania TT-173. [01] Podczas prawidłowego krzepnięcia krwi aktywacja krzepnięcia trwa około cztery minuty. Jest to konsekwencja względnie niskiego stężenia białka TF w uszkodzonych tkankach przylegających do naczyń krwionośnych i rzadkiego występowania FVIIa krążącego w krwiobiegu. [02] Ten model, gdzie wytwarzanie FXa jest zwiększone, wyjaśnia dramatyczne skrócenie czasu krzepnięcia obserwowanego, gdy TT-173 z lub bez PS jest dodawana do prawidłowego osocza (fig., po lewej). Ponadto przez tworzenie kompleksów protrombinazy, model wyjaśnia czasy krzepnięcia obserwowane, gdy FVIII lub FIX (niedobory w hemofilii A i B) są nieobecne lub występują w bardzo niskich stężeniach (fig., po prawej). W przypadku niedoborów czynników krzepnięcia, dodanie PS do TT- 173 wyraźnie zmniejsza czas krzepnięcia. Działanie to jest wyraźniejsze w osoczach, gdzie stężenie FVII lub FV jest mniejsze niż 1% (fig. 11). [03] Jak przewiduje to model, czas krzepnięcia osocza z nabytymi niedoborami FVII i FX wskutek leczenia warfaryną jest także normalizowany przez dodanie TT-173 (fig. ). 2.3. Rola błon drożdży w aktywności TT-173 [04] Składniki pęcherzyków drożdżowych same z siebie wykazywały ograniczoną aktywność prozakrzepową ale wszystkie powinny być niezbędne do utrzymania integralności tych mikrocząstek. Gdy pęcherzyk TT-173 z lub bez dodanego PS rozrywano przez traktowania dializowalnym detergentem, a następnie odtwarzano w warunkach in vitro przez dializę, tracono około 0% początkowej aktywności (fig. 13, panel A). Gdy

36 1 2 3 jednak podobne doświadczenie przeprowadzono wykorzystując pęcherzyki ponownie lipidowanego rtf, nie obserwowano wyraźnej różnicy przed i po dializie (fig. 13, panel B). [0] Wynik ten wskazuje, że aktywność krzepnięcia zależy nie tylko od względnych ilości rtf, białek drożdży i lipidów drożdży, ale także rozkładu przestrzennego/orientacji wszystkich tych składników. Gdy pęcherzyki wytwarzano spontanicznie w warunkach in vitro, wszystkie składniki błonowe TT-173 były losowo włączane do nowo powstałych błon i nie przybierały konformacji kompleksu, który może być przyjęty jedynie w kontekście możliwym do zapewnienia przez komórkę eukariotyczną. PRZYKŁAD 3 Wytwarzanie produktu prozakrzepowego na podstawie ekspresji pełnej długości białka TF w komórkach owadów. 3.1 Konstrukcja rekombinowanych bakulowirusów [06] Konstrukcję rekombinowanych bakulowirusów (rbv) eksprymujących pełnej długości dojrzały ludzki czynnik tkankowy (TF) przeprowadzono w następujący sposób: cdna kodujący dojrzałe ludzkie białko TF (aminokwas 33 29) amplifikowano jako fragment 816 pz w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Do tej reakcji PCR plazmid ptt-3 zawierający gen kodujący TF był stosowany jako szablon, a jako primerów użyto oligonukleotydów A '- CCGCTCGAGCGGTTATGAAACATTCAGTGGGGAGTTCTC-3'(SEQID NO: 7) i B '-CCGCTCGAGCGGTTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTC-3 ' (SEQ ID NO: 8), hybrydyzując odpowiednio na końcu ' lub 3' genu TF. Uzyskany fragment DNA trawiono NcoI oraz HindIII i wstawiano do wektora transferowego bakulowirusa pfastbac1-mav-mcs trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskany plazmid pfb-tf poddawano sekwencjonowaniu nukleotydów dla oceny poprawności wstawionej sekwencji TF, a następnie stosowano go do uzyskania odpowiedniego rbv używając układu Bac-to-Bac i przestrzegając instrukcji producenta (Invitrogen). Do produkcji i oczyszczania aktywnych pęcherzyków zawierających TF, pięć komórek owadów zakażano rbv eksprymującym TF w ilości PFU/komórkę. Komórki zbierano 72 godziny po zakażeniu, dwukrotnie przemywano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, ponownie zawieszano w buforze litycznym (0 nm Tris-HCl, ph 8,0, 00 mm NaCl). Następnie ekstrakty komórek rozrywano przy użyciu homogenizatora Dounce. Porcje ekstraktów komórkowych testowano pod kątem aktywności krzepnięcia zgodnie z protokołem opisanym wcześniej w Przykładzie 2. Tabela 2 pokazuje aktywność krzepnięcia wywoływaną przez ekstrakty. Tabela 2: Czas krzepnięcia i stężenie białka TF w pęcherzykach kontrolnych, rekombinowany TF, TF lipidowany w warunkach in vitro i TT-172 (pochodzące z komórek owadów mikropęcherzyki zawierające wt-tf). Czas krzepnięcia Białko TF (sekundy) (ng/ml) Kontrola >0 >0 0 rtf >0 >0 Lipidowany rtf 60,8 60,8 TT-172,9,3 3.2. Wpływ fosfatydyloseryny (PS) na aktywność biologiczną pochodzących z komórek owadów mikropęcherzyków TT-173 zawierających wt-tf [07] Dla zapewnienia dodatkowych dowodów, że obserwowany i zastrzegany w tym patencie efekt ogranicza się do struktur pochodzenia eukariotycznego i nie może być

37 1 2 odtworzony w pęcherzykach przygotowanych sztucznie przez ponowną lipidację, PS dodano w stężeniu 0,1 mm do mających równoważną aktywność krzepnięcia porcji pęcherzyków TT-173 wytworzonych w komórkach drożdży, pęcherzyków TT-172 wytworzonych w komórkach owadów lub ponownie lipidowanych w warunkach in vitro rtf w stosunku PC:PS wynoszącym 80: i 70:. Po inkubacji różnych pęcherzyków z PS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, próbki produktów zawierających rtf badano pod kątem ich aktywności krzepnięcia. Wyniki przedstawia fig. 14. Jak obserwowano, dodanie PS do TT-170 z komórek owadów powodowało skrócenie czasu krzepnięcia podobne do uzyskanego w komórkach drożdży, wyraźnie skrócony czas krzepnięcia. Jednak zgodnie z oczekiwaniem, dodanie PS do ponownie lipidowanego rtf nie powodowało wyraźnego zwiększenia aktywności proazkrzepowej przy żadnej z proporcji PC:PS użytych do ponownej lipidacji. PRZYKŁAD 4 [08] Innym nieoczekiwanym skutkiem dodania PS był jej wpływ na stabilność pęcherzyków TT-173. Dla przetestowania tego działania, porcje z trzech niezależnych serii TT-173 inkubowane lub nie z PS jak opisano w przykładzie 2 utrzymywano przez dłuższy czas w dwóch różnych temperaturach (4 C i C). W różnych punktach czasowych porcję z każdej próbki analizowano pod kątem aktywności krzepnięcia. Wynik tego doświadczenia przedstawia fig. 1. Jak pokazano powyżej, dodanie PS do próbek TT-173 przyspiesza krzepnięcie do sekund w czasie 0 i nieoczekiwanie wydłuża stabilność próbek zawierających PS w porównaniu z próbkami bez PS. To działanie stabilizujące było szczególnie widoczne w temperaturze C, natomiast próbki TT-173 bez dodatkowego PS traciły ponad 0% aktywności po godzinach, próbki z dodanym PS zachowywały stabilność przez przynajmniej 4 dni. [09] Średnia minimalnej stabilności różnych partii TF-173 z lub bez dodanej PS była następnie oznaczana w temperaturach C i 4 C. Stabilność w temperaturze C (godziny) Partia TT-173 TT-173 + PS (0,1 mm) TT-173 612-61 1 96 TT-173 644-647 1 48 TT-173 660-663 1 24 TT-173 702-70 1 48 Średnia minimalnej stabilności 1 4 Stabilność w temperaturze 4 C (godziny) Partia TT-173 TT-173 + PS (0,1 mm) TT-173 612-61 <1 2 TT-173 628-631 4 <7 TT-173 644-647 <1 <28 TT-173 660-663 <1 TT-173 702-70 <1 >11 Średnia minimalnej stabilności 1,6 28,2 [02] Średnia minimalna stabilność jest przedstawiona na fig. 1 (panele C i D). PRZYKŁAD Zwiększenie prozakrzepowego działania TT-173 przez środki prozakrzepowe.

38 1 [0211] Do TT-173 dodano różne stężenia FVII ( nm i 60 nm), FVIIa ( nm i 60 nm), FX (00 nm i 00 nm) oraz FXa (00 nm). W różnych punktach czasowych począwszy od czasu dodania PS (czas 0) porcje mieszanin TT-173/FVII i TT-173/FX sprawdzano pod kątem aktywność krzepnięcia w standardowym oznaczeniu koagulometrycznym. Wyniki przedstawione na fig. 16 pokazują jasno, że dodanie FVII, FVIIa i FX skraca czas krzepnięcia o około 2 s, a dodanie FXa skraca czas krzepnięcia o około 7 s. LISTA SEKWENCJI [0212] <1> Thrombotargets S.L. <1> WZBOGACONE W FOSFOLIPIDY BŁONY ZAWIERAJĄCE CZYNNIK TKANKOWY MAJĄCE WŁAŚCIWOŚCI HEMOSTATYCZNE I ICH ZASTOSOWANIA <1> PPC00 <> EP388 < 11> -04-19 <160> 8 <170> Wersja 3. PatentIn <2> 1 < 211> 263 < 212> PRT < 213> Homo sapiens

39 <0> 1 <2> 2 < 211> 6 < 212> PRT <213> Sztuczna <2> < 223> Epitop AHGHRP

<0> 2 1 <2> 3 < 211> 14 < 212> PRT <213> Sztuczna <2> < 223> Epitop PIHDHDHPHLVIHS <0> 3 <2> 4 < 211> 7 < 212> PRT <213> Sztuczna <2> < 223> Epitop GMTCXXC <2> < 221> misc_feature < 222> ().. (6) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <0> 4 2 <2> < 211> 269 < 212> PRT <213> Sztuczna <2> < 223> Dojrzały ludzki TF z mutacją N124A i C-końcowym znacznikiem heksahistydynowym

41 <0> <2> 6 < 211> 813 < 212> DNA <213> Sztuczna

42 <2> < 223> DNA kodujący dojrzały ludzki TF z N124A i C-końcowym znacznikiem heksahistydynowym <0> 6 1 <2> 7 < 211> 39 < 212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> Oligonukleotyd A <0> 7 ccgctcgagc ggttatgaaa cattcagtgg ggagttctc 39 <2> 8 < 211> 36 < 212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> Oligonukleotyd B <0> 8 ccgctcgagc ggttattctc tgaattcccc tttctc 36

43 Zastrzeżenia patentowe 1 2 3 4 0 1. Sposób przygotowywania mikropęcherzyka zawierającego czynnik tkankowy mający aktywność prozakrzepową, który obejmuje (i) eksprymowanie czynnika tkankowego lub jego wariantu mającego aktywność prozakrzepową w komórce eukariotycznej, (ii) odzyskiwanie mikropęcherzyków zawierających czynnik tkankowy z komórek w etapie (i) oraz (iii) zetknięcie pęcherzyków uzyskanych w etapie (ii) z ujemnie naładowanym fosfolipidem w obecności detergentów w warunkach odpowiednich do włączania fosfolipidu do pęcherzyków, przy czym mikropęcherzyki są tworzone przez błony lipidowe lub ich fragmenty z komórek eukariotycznych. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, gdzie komórka eukariotyczna to komórka drożdży. 3. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 2, gdzie etap zetknięcia jest przeprowadzany przy użyciu 0.0 µmol ujemnie naładowanych fosfolipidów, gdzie zawartość białka mikropęcherzyków wynosi poniżej 0 µg i 0,1 µmol ujemnie naładowanych fosfolipidów, gdzie zawartość białka mikropęcherzyków wynosi ponad 0 µg. 4. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 3, gdzie ujemnie naładowany fosfolipid jest wybrany z grupy fosfolipidu zawierającego sfingozynę lub fosfolipidu zawierającego glicerol.. Sposób według zastrzeżenia 4, gdzie fosfolipid zawierający glicerol to fosfatydyloseryna. 6. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do, gdzie czynnik tkankowy lub jego wariant mający aktywność prozakrzepową jest glikozylowany. 7. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 6, gdzie czynnik tkankowy to dojrzałe białko czynnika tkankowego, korzystnie ludzkie dojrzałe białko czynnika tkankowego. 8. Sposób według zastrzeżenia 7, gdzie czynnik tkankowy zawiera mutację N124A i znacznik heksahistydynowy na końcu C. 9. Mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy uzyskany sposobem według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 8.. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy według zastrzeżenia 9 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia zawierająca także przynajmniej środek ułatwiający proces tworzenia skrzepów krwi. 12. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego zastrzeżenia albo 11, gdzie kompozycja jest liofilizowana. 13. Mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy taki jak zdefiniowany w zastrzeżeniu 9 lub kompozycja farmaceutyczna taka jak zdefiniowana w zastrzeżeniu albo 11 do stosowania jako lek. 14. Mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy taki jak zdefiniowany w zastrzeżeniu 9 lub kompozycja farmaceutyczna taka jak zdefiniowana w zastrzeżeniu albo 11 do stosowania w leczeniu krwotoku, do ułatwiania gojenia ran lub leczenia choroby związanej z angiogenezą. 1. Mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy taki jak zdefiniowany w zastrzeżeniu 9 lub kompozycja farmaceutyczna taka jak zdefiniowana w zastrzeżeniu albo 11 do stosowania w leczeniu krwotoku, gdzie krwotok jest leczony u pacjenta wybranego z grupy osób zdrowych i pacjenta ze skazą krwotoczną, gdzie skaza krwotoczna jest wybrana z grupy wrodzonej koagulopatii, nabytej koagulopatii, zaburzenia płytek krwi lub ich kombinacji.

44 16. Mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy taki jak zdefiniowany w zastrzeżeniu 9 lub kompozycja farmaceutyczna taka jak zdefiniowana w zastrzeżeniu albo 11 do stosowania według dowolnego zastrzeżenia 14 albo 1, gdzie mikropęcherzyk zawierający czynnik tkankowy lub kompozycja farmaceutyczna są podawane miejscowo. 17. Zastosowanie mikropęcherzyka zawierającego czynnik tkankowy taki jak zdefiniowany w zastrzeżeniu 9 do określania czasu protrombinowego w próbce. 18. Zestaw do oznaczania czasu protrombinowego zawierający mikropęcherzyk taki jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 9. Uprawniony: Thrombotargets Europe, S.L. Pełnomocnik: mgr Katarzyna Naperty Rzecznik patentowy

4

46

47

48

49

0

1

2

3

4